KR101708541B1 - 인간화 마우스 - Google Patents
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Abstract
Rag2 유전자 및 Jak3 유전자가 함께 결손된 면역 부전 마우스의 배아를 GSK3 저해제 및 MEK 저해제의 존재하에서 배양하여 얻어지는 배성 줄기 세포, 및 상기 배성 줄기 세포를 이용하여 작출된 트랜스제닉 마우스를 제공한다.
Description
본 발명은 면역 부전 마우스로부터 채취된 배성 줄기 세포 (ES 세포) 및 간장이 인간화된 마우스에 관한 것이다.
간장은 대사, 배출, 해독, 체액의 항상성의 유지 등에 있어서 체내의 중심적 역할을 담당하는 장기이다. 간장은 생체 내에서 유일하게 재생하는 장기이며, 전체 중량의 약 80 ％ 를 절제해도 원래의 중량으로까지 재생하는 능력을 갖는 것이 알려져 있다.
간장의 기능은 다방면에 걸치기 때문에, 간장에서는 다수의 유전자가 발현하지만, 그 만큼, 간장에서 발현하는 유전자의 이상에 의한 유전병이 다수 존재한다.
간질환 등에 의해 간 기능에 이상이 발생한 경우, 간장 이식 이외에 유효한 치료법이 없는 경우도 있다. 이 때문에, 발증 초기 단계에서 사람 혈중 대사 산물의 예측 필요성이 높아졌다. 혈중 대사 산물이나 간 기능을 적절히 예측하기 위해서는, 간장을 인간화한 동물의 개발이 필요하다.
종래, 사람 간장의 모델 마우스의 제조에 관하여, 예를 들어, Heckel 등은 알부민 (Alb) 프로모터에 urokinase 형 플라스미노겐 액티베이터 (Plau) 유전자를 연결한 컨스트럭트 (Alb-Plau) 가 도입된 트랜스제닉 마우스 (Tg(Alb-Plau) 에 대해 보고하였다 (비특허문헌 1：Heckel et al. Cell 62：447-456, 1990)). 그러나, 이 마우스는 생후 4 일째까지 장관 등의 출혈로 사망하기 때문에 실험에 사용할 수 없다. 이에 대해, Tg(Alb-Plau) 중에서, 살아 남은 개체의 계통 수립에 성공하여, 간 세포가 분열 중에 Alb-Plau 유전자를 결손한 간 세포에 의해 간장이 재생된 예가 보고되어 있다 (비특허문헌 2：Sandgren et al. Cell 66：245-256, 1991). 또, 메탈로티오네인 프로모터에 lacZ 유전자를 연결한 컨스트럭트가 도입된 마우스, 즉, 도너가 되는 간 세포를 마커 유전자인 lacZ 로 표지한 트랜스제닉 마우스 (Tg(MT-nLacZ) 마우스) 의 성체 간 세포를 Tg(Alb-Plau) 에 이식하여, 성공한 예가 있다 (비특허문헌 3：Rhim et al. Science 263：1149-1152, 1994).
또한 면역 부전 마우스에 사람 간 세포의 이식을 실시한 예가 있다. 예를 들어, Rag2-/- 유전자 결손 면역 부전 마우스에 대해 간 세포를 이식하여, B 형 간염 바이러스 (HBV) 의 감염 실험을 실시한 예 (비특허문헌 4：Dandri et al. Hepatology 33：981-988, 2001), 혹은 Tg(Alb-Plau) 와 면역 부전 마우스인 SCID 를 교배하고, 면역 부전이 된 SCID 마우스 (Tg(Alb-Plau)) 에 사람 간 세포를 이식하여 (Tg(Alb-Plau) ; SCID)), C 형 간염 바이러스의 감염 실험을 실시한 예 (비특허문헌 5：Mercer et al. Nature Med. 7：927-933, 2001) 등이 있다.
또한, Tateno 등은, 간장에 장애를 갖는 알부민 인핸서/프로모터 우로키나아제 플라스미노겐 액티베이터 트랜스제닉 마우스 (uPA 마우스) 와 SCID 마우스를 교배시켜, 어느 쪽의 형질도 호모 접합체인 uPA/SCID 트랜스제닉 마우스를 제조하였다 (비특허문헌 6：Tateno et al. Amer. J. Pathol 165：901-912, 2004). 이 보고에서는, 사람 간 세포의 Tg(Alb-Plau ; SCID) 로의 이식법의 개량에 대해 기재되어 있으며, Futhan 처리에 의해 사람 간 세포로부터의 보체 (補體) 의 영향을 배제하여 고키메라이어도 사망률을 저하시키고 있다.
또한, Rag2 유전자를 결손한 면역 부전 마우스를 모델로 하여 유전자 치료에 대한 가능성을 실증한 연구도 보고되어 있다 (비특허문헌 7：정형·재해 외과 「분자 레벨에서 본 정형 외과 질환 시리즈 IV 체세포 클론 기술과 재생 의료」 Vol. 45, NO. 11, PAGE. 1040-1041, 2002).
그러나, 이들 모델 마우스에서는, 숙주인 마우스의 간장 세포가 남아, 100 ％ 의 세포가 사람 유래의 세포로 치환된 간 세포 모델은 아니다. 또, 반드시 사람 유래 세포가 재생되는 것은 아니어서, 사람 유래의 세포를 이식하지 않을 수 없다. 또한, 마우스 유래의 간장 세포가 잔존하고 있으면, 사람의 간 기능의 검증이 불충분해진다.
한편, 생식 계열로 전달하는 NOG 마우스 유래 ES 세포주의 수립을 위해, 분화 시그널 저해제 (PD0325901, CHIR99021) 를 사용함으로써, ES 세포를 수립하는 시도도 이루어져 있다 (비특허문헌 8：일본 실험 동물 학회 총회 강연 요지집 Vol. 58 th, Page 210, 2011).
그러나, NOG 마우스는 번식이 어려운 점에서, 실험용으로 다수의 마우스를 얻는 것이 곤란하다.
Heckel et al. Cell 62：447-456, 1990
Sandgren et al. Cell 66：245-256, 1991
Rhim et al. Science 263：1149-1152, 1994
Dandri et al. Hepatology 33：981-988, 2001
Mercer et al. Nature Med. 7：927-933, 2001
Tateno et al. Amer. J. Pathol 165：901-912, 2004
정형·재해 외과 「분자 레벨에서 본 정형 외과 질환 시리즈 IV 체세포 클론 기술과 재생 의료」 Vol. 45, NO. 11, PAGE. 1040-1041, 2002
일본 실험 동물 학회 총회 강연 요지집 Vol. 58 th, Page 210, 2011
본 발명은 면역 부전 마우스로부터 채취된 배성 줄기 세포 (ES 세포) 및 간장이 인간화된 마우스를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자는 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구를 실시한 결과, Rag2 유전자 및 Jak3 유전자가 함께 결손된 면역 부전 마우스의 배아로부터, 사람 간 세포 이식에 최적인 마우스를 작출 (作出) 하는 것이 가능한 배성 줄기 세포가 얻어지는 것을 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
(1) Rag2 유전자 및 Jak3 유전자가 함께 결손된 면역 부전 마우스의 배아를 GSK3 저해제 및 MEK 저해제의 존재하에서 배양하여 얻어지는 배성 줄기 세포.
(2) 수령 번호가 NITE ABP-1297 로 나타내어지는, (1) 에 기재된 배성 줄기 세포.
(3) 에스트로겐 수용체 유전자 및 디프테리아톡신 유전자가 도입된, (1) 또는 (2) 에 기재된 배성 줄기 세포.
(4) 세포 중에 내재하는 성장 호르몬 유전자가 사람 유래의 것으로 치환된, (3) 에 기재된 배성 줄기 세포.
(5) 또한, 세포 중에 내재하는 약물 대사 효소 유전자가 사람 유래의 것으로 치환된, (4) 에 기재된 배성 줄기 세포.
(6) 세포 중에 내재하는 약물 대사 효소 유전자가 Cyp3a11, Cyp3a13, Cyp3a25, 및 Cyp3a41 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나인 (5) 에 기재된 배성 줄기 세포.
(7) 상기 (1) 또는 (2) 에 기재된 배성 줄기 세포를 이용하여 작출된 마우스.
(8) 상기 (3) ∼ (6) 중 어느 한 항에 기재된 배성 줄기 세포를 이용하여 작출된, 트랜스제닉 마우스.
(9) 항에스트로겐제의 투여에 의해 간 세포 장애를 일으키는, (8) 에 기재된 마우스.
(10) 상기 (7) 에 기재된 마우스에 사람 유래 간 세포를 이식함과 함께, 항에스트로겐제를 투여하여 당해 마우스 유래 간 세포를 제거한 것을 특징으로 하는, 간장이 인간화된 마우스.
(11) 사람 유래 간 세포가 간장 질환을 갖는 환자 유래의 것인 (9) 에 기재된 마우스.
(12) 상기 (10) 에 기재된 마우스로 이루어지는, 사람 간장 질환 모델 마우스.
(13) Rag2 유전자 및 Jak3 유전자가 함께 결손된 면역 부전 마우스의 배아를 GSK3 저해제 및 MEK 저해제의 존재하에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 면역 부전 마우스 유래의 배성 줄기 세포의 제조 방법.
(14) 상기 (8) 에 기재된 마우스에 항에스트로겐제를 투여하는 것을 특징으로 하는, 간장 장애 모델 마우스의 작출 방법.
(15) 상기 (8) 에 기재된 마우스에 사람 유래 간 세포를 이식함과 함께, 항에스트로겐제를 투여하여 마우스 유래 간 세포를 제거하는 것을 특징으로 하는, 간장이 인간화된 마우스의 작출 방법.
(16) 사람 유래 간 세포가 간장 질환을 갖는 환자 유래의 것인, (15) 에 기재된 방법.
본 발명에 의해, 사람 간 세포 이식에 최적인 마우스의 확립을 위한 배성 줄기 세포가 제공된다. 본 발명의 배성 줄기 세포는 간 기능에 관한 각종 사람 유전자를 도입할 수 있어, 인간화 간장 모델 마우스를 수립시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 배성 줄기 세포로부터 수립된 마우스는 사람 간 세포 이식에 이용할 수 있고, 100 ％ 의 인간화를 가능하게 하는 점에서 매우 유용하다.
도 1 은 변이형 lox 를 나타내는 도면이다.
도 2 는 Dre/rox 시스템을 나타내는 도면이다.
도 3 은 사람 성장 호르몬 유전자를 ES 세포에 도입하기 위한 치환 벡터의 구축도이다.
도 4 는 사람 약물 대사 효소 유전자를 ES 세포에 도입하기 위한 치환 벡터의 구축도이다.
도 5 는 디프테리아톡신 유전자의 ES 세포로의 도입으로부터 마우스 간 세포사까지의 경과를 설명하는 도면이다.
도 6 은 사람 간 세포를 마우스의 배아에 이식하는 부위를 나타내는 도면이다.
도 7 은 사람 간 세포를 이식한 마우스의 배아를 나타내는 도면이다.
S1：마취약의 복강 내 투여를 나타내는 도면, S2：복부를 절개하여 태아를 복강 외에 노출한 도면
A：세포를 주입하고자 하는 난황낭 정맥, B：세포 주입 부위 (황색 화살표), C：청색 색소를 주입한 후의 간장 (푸르게 보인다), D：적출한 간장 (왼쪽은 청색 색소 주입 후의 간장, 오른쪽은 색소를 주입하지 않은 간장)
도 8 은 iPS 세포로부터 분화 유도된 간 세포를 나타내는 도면이다.
도 9 는 iPS 세포로부터 분화 유도된 간 세포를 나타내는 도면이다.
도 2 는 Dre/rox 시스템을 나타내는 도면이다.
도 3 은 사람 성장 호르몬 유전자를 ES 세포에 도입하기 위한 치환 벡터의 구축도이다.
도 4 는 사람 약물 대사 효소 유전자를 ES 세포에 도입하기 위한 치환 벡터의 구축도이다.
도 5 는 디프테리아톡신 유전자의 ES 세포로의 도입으로부터 마우스 간 세포사까지의 경과를 설명하는 도면이다.
도 6 은 사람 간 세포를 마우스의 배아에 이식하는 부위를 나타내는 도면이다.
도 7 은 사람 간 세포를 이식한 마우스의 배아를 나타내는 도면이다.
S1：마취약의 복강 내 투여를 나타내는 도면, S2：복부를 절개하여 태아를 복강 외에 노출한 도면
A：세포를 주입하고자 하는 난황낭 정맥, B：세포 주입 부위 (황색 화살표), C：청색 색소를 주입한 후의 간장 (푸르게 보인다), D：적출한 간장 (왼쪽은 청색 색소 주입 후의 간장, 오른쪽은 색소를 주입하지 않은 간장)
도 8 은 iPS 세포로부터 분화 유도된 간 세포를 나타내는 도면이다.
도 9 는 iPS 세포로부터 분화 유도된 간 세포를 나타내는 도면이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
1. 개요
본 발명은 Rag2 유전자 및 Jak3 유전자를 함께 결손한 면역 부전 마우스로부터 수립된 배성 줄기 세포이며, 이 배성 줄기 세포로부터, 간장이 인간화된 마우스를 확립하였다고 하는 것이다.
본 발명에 있어서는, 면역 부전 마우스로부터 채취한 배아를 GSK3 저해제 및 MEK 저해제의 존재하에서 배양함으로써, ES 세포를 수립하는 것에 성공하였다.
Rag2 및 Jak3 을 결손한 BALB/c 마우스 (BALB/c ; Rag2-/- ; Jak3-/-：「BRJ 마우스」 라고 한다) 는 T 세포, B 세포, NK 세포 및 NKT 세포를 결손하여, BALB/c 의 유전적 배경을 갖는 면역 부전 마우스이다. 이 마우스에 사람의 세포를 이식하면, 그 세포는 마우스 체내에서 생착하기 때문에, 제조된 마우스는 세포 레벨에서는 인간화된 마우스라는 것이 된다.
그러나, 이와 같은 인간화 마우스는, 숙주인 마우스 유래의 세포가 잔존하기 때문에, 장기가 사람 유래의 것으로 모두 치환된 것이 아니어서, 당해 장기의 기능 해석이나 연구를 실시하는 데에 있어서는 반드시 최적화된 마우스라고는 할 수 없다. 또, 최적화 마우스를 제조하려면, 각종 유전자 개변을 실시할 필요가 있는데, 마우스 개체를 이용하여 실시할 수는 없다.
그래서 본 발명에 있어서는, 100 ％ 의 세포가 인간화된 간장을 갖는 마우스를 수립하기 위해서, 인간화에 최적인 유전자 개변 마우스를 수립한다. 이 유전자 개변 마우스는 개체 발생 초기부터 인간화를 목표로 하기 위해 예의 검토를 실시한 결과, BRJ 마우스로부터 배성 줄기 세포 (이하 「ES 세포」 라고 한다) 를 수립하는 것에 성공하였다. 그 ES 세포를 이용하여 키메라 마우스를 제조하고, 생식 계열에 전달되는 생식 키메라 마우스의 제조에도 성공하였다. 다음으로, 장기간에 걸쳐 간장 기능을 유지시킴과 함께 안전성을 확인하기 위해서, 사람 정상 간장을 갖는 마우스를 수립한다. 또한, 간장 질환을 갖는 사람 환자와 동일한 증상의 질환 모델을 수립함과 함께 병태를 해석하기 위해서, 사람 변이 간장을 갖는 마우스를 수립한다. 또한, 범용성이 높은 신규 치료법을 개발하기 위해서 사람 질환에 대해 최적화된 모델 마우스를 수립한다.
2. BRJ 마우스의 제조
사용되는 면역 부전 마우스는 Rag2 유전자 및 Jak3 유전자가 함께 녹아웃된 마우스이며, 이미 확립된 마우스이다 (Ono A, Hattori S, Kariya R, Iwanaga S, Taura M, Harada H, Suzu S, Okada S. Comparative study of human hematopoietic cell engraftment into BALB/c and C57BL/6 strain of rag-2/jak3 double-deficient mice. J Biomed Biotechnol 2011：539748, 2011).
이 마우스는 Rag2 유전자 결손 마우스와 Jak3 유전자 결손 마우스의 교배에 의해 얻을 수 있다.
Rag (Recombination activating gene) 2 유전자는 미숙한 임파구에 발현하여 면역 글로블린 유전자 및 T 세포 수용체의 재구성에 필수 기능을 가지며, T 세포 및 B 세포의 성숙에 불가결한 유전자이다.
이 Rag2 유전자가 녹아웃된 마우스의 제조 수법 및 당해 유전자에 대한 상세한 내용은 Shinkai Y. et al., Cell. 1992 Mar 6 ; 68 (5)：855-67, Chen J. et al., Curr Opin Immunol. 1994 Apr ; 6 (2)：313-9 등에 기재되어 있지만, 일반적으로는 해당 분야에 있어서 주지의 방법, 예를 들어, 타겟팅 벡터를 이용하는 방법에 의해 제조할 수 있다 (Capecchi, M. R., Science, (1989) 244, 1288-1292). 이 방법은 마우스 ES 세포에 있어서의 Rag2 유전자와 타겟팅 벡터 상의 유전자와의 상동 재조합을 이용한 것이다.
Jak3 (Janus kinase 3) 은 비수용체형 티로신 키나아제이며, IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21 수용체에 공통되는 공통 γ 사슬의 세포 내 영역에 회합하여 공통 γ 사슬을 개재한 시그널을 세포 내에 전달한다는 기능을 갖는 단백질이다. 공통 γ 사슬, Jak3 을 개재하는 시그널은 NK 세포에 필수 시그널이므로, 이 경로가 상해되면, NK 세포가 결손되게 된다. 즉, Jak3 유전자를 녹아웃하면, NK 활성을 소실시킬 수 있다.
Jak3 유전자 및 공통 γ 사슬 유전자에 대한 상세한 내용은 Park SY. et al., Immunity. 1995 Dec ; 3 (6)：771-82, Suzuki K. et al., Int Immunol. 2000 Feb ; 12 (2)：123-32 등에 기재되어 있으며, 이들 문헌을 참조하여, Jak3 유전자가 결손하고, NK 활성이 소실된 마우스를 얻을 수 있다.
또한, Rag2 결손 (-/-) 마우스 및 Jak3 결손 (-/-) 마우스는 쿠마모토 대학 생명 자원 연구·지원 센터로부터 입수할 수도 있다. 이들 마우스와 시판되는 BALB/c 마우스를 여교배함으로써, Balb/c 마우스와 동일 계통의 유전적 배경을 갖는 BALB/c Rag2 결손 (-/-) 마우스 및 BALB/c Jak3 결손 (-/-) 마우스를 각각 얻을 수 있다.
Rag2 유전자 및 Jak3 유전자의 양자가 결손된 더블 녹아웃 마우스의 제조는, 먼저, BALB/c Rag2 결손 마우스와 BALB/c Jak3 결손 마우스를 교배하여 F1 을 얻고, 다음으로 F1 끼리를 교배하여 F2 마우스를 얻는다. 그리고, 이 중에서 Rag2 결손 (-/-) 및 Jak3 결손 (-/-) 의 양 결손 마우스 (BRJ 마우스) 를 선택하면 된다. BRJ 마우스의 선택 수법으로서, 예를 들어 Rag2 및 Jak3 의 양방의 유전자를 결손하고 있는 것을 PCR 법 또는 서든 블롯법으로 확인할 수 있다.
3. ES 세포의 수립
본 발명의 ES 세포는 상기와 같이 하여 얻어진 BRJ 마우스로부터 채취한 배아를 GSK3 저해제 및 MEK 저해제의 존재하에서 배양함으로써 얻을 수 있다.
먼저, 수정 후의 BRJ 암컷 마우스로부터 수정란 또는 2 세포기배를 배양함으로써 얻거나, 혹은 배반포를 직접 얻는다. 수정은 자연 교배 또는 체외 수정법에 의한다. 체외 수정에서는, 암컷 마우스를 과잉 배란시켜 얻은 난자와, 수컷 마우스로부터 채취한 정자를 배양함으로써 실시한다.
다음으로, 채취한 배반포 또는 내부 세포괴를, 동물 세포의 배양용 배지 중, GSK-3 저해제 및 MEK 저해제의 존재하에서 약 1 ∼ 3 주간, 바람직하게는 14 - 18 일 배양한다.
GSK-3 (글리코겐 신타아제 키나아제 3) 은 세린/트레오닌 프로테인 키나아제이며, 글리코겐의 산생이나 아포토시스, 줄기 세포의 유지 등에 관련된 많은 시그널 경로에 작용하는 효소이다. GSK-3 저해제로는, CHIR99021 (입수처：와코 쥰야쿠), 6-Bromoindirubin-3-oxime (BIO) (입수처：와코 쥰야쿠) 등을 들 수 있다. GSK-3 저해제의 배지 중으로의 첨가량은 0.1 ∼ 10 μM (마이크로몰), 바람직하게는 0.3 ∼ 3 μM 이다. GSK-3 저해제의 배지 중으로의 첨가 시기는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 배반포의 배양 개시시부터 첨가하는 것이 바람직하다.
MEK 저해제는 MAP Kinase Kinase (MEK) 활성을 저해하고, ERK1/ERK2 의 활성화를 억제하는 프로테인 키나아제 저해제이다. MEK 저해제로는, 예를 들어 PD0325901 (입수처：와코 쥰야쿠), U0126 (입수처：Promega) 등을 들 수 있다. PD0325901 저해제의 배지 중으로의 첨가량은 한정되는 것은 아니고, 예를 들어 3 μM 이다.
배양 조건은 한정되는 것은 아니고, 예를 들어 약 37 ℃, 5 ％ CO2 의 분위기 중에서 실시한다. 계대 배양은 3 ∼ 4 일 간격으로, 마우스 배아 섬유아세포 (MEF) 피더 상 또는 콜라게나아제 I 로 코팅한 플레이트 상에서 실시해도 된다.
배지로는, 예를 들어 GMEM 배지 (Glasgow's Minimal Essential Medium), DMEM (다르벡코의 개변 이글 배지), RPMI1640 배지 등을 들 수 있다. 배양 배지에는, KSR (Knockout Serum Replacement), 소 태아 혈청 (FBS), 염기성 섬유아세포 증식 인자 (bFGF), β-메르캅토에탄올, 비필수 아미노산, 글루탐산, 피루브산나트륨 및 항생 물질 (예를 들어 페니실린, 스트렙토마이신 등) 등에서 선택하여, 적절히 첨가할 수 있다.
소정 기간 배양 후, EDTA 또는 콜라게나아제 IV 를 포함하는 배지에서 인큐베이트함으로써 ES 세포를 회수한다. 회수된 ES 세포는 필요에 따라 피더 세포의 존재 또는 비존재하에서 배양함으로써 복수 회 계대할 수도 있다. 또한, 피더 불포함 조건에서의 내부 세포괴의 배양은 MEF 로 순화 (馴化) 된 배지 중에서 실시할 수 있다.
배양된 ES 세포는 일반적으로 그들의 마커 유전자를 이용하여 동정할 수 있다. ES 세포의 마커 유전자로는, 예를 들어 Oct3/4, 알칼리성 포스파타아제, Sox2, Nanog, GDF3, REX1, FGF4 등을 들 수 있다. 마커 유전자 또는 유전자 산물의 존재는 PCR 이나 웨스턴 블롯팅 등의 임의의 수법에 의해 검출하면 된다.
또, 본 발명의 ES 세포가 목적으로 하는 것인지의 여부는, BALB/c 인지 여부를 SNP 마커의 검출에 의해, Rag2 결손 및 Jak3 결손일지 여부는 PCR 또는 서든 블롯법에 의한 해석에 의해 확인할 수도 있다. 예를 들어, 마우스의 SNP 의 데이터베이스가 http：//www.broadinstitute.org/snp/mouse 에 공표되어 있어, 이 데이터베이스를 이용하여 SNP 정보를 대조하면 BALB/c 인 것을 확인할 수 있으며, Rag2 및 Jak3 유전자가 결손되어 있으면, 본 발명의 ES 세포라고 판단한다.
이와 같이 하여 얻어진 ES 세포는 「BRJ8」 이라고 칭하고, 2012년 3월 23 일자 (수령일) 로, 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터 ((우) 292-0818 치바현 키사라즈시 카즈사 카마타리 2-5-8 NITE 바이오 테크놀러지 본부 특허 미생물 기탁 센터) 에 부다페스트 조약에 기초하여 국제 기탁하였다. 그 수령 번호는 「NITE ABP-1297」 이다.
상기 ES 세포의 상세 정보는 이하와 같다.
GSK 저해제 및 MEK 저해제에 의한 ES 세포의 수립법에 대해서는 이미 논문이 공표되어 있지만, 얻어진 ES 세포는, 원래 계통의 유전적 성질을 계승하고 있어, 각각 특유의 특징을 포함하고 있다. 면역 부전 마우스는 각종 계통이 존재하지만, 원래의 유전적 배경에 더하여 각각 상이한 유전자 변이를 갖고 있으므로, 계통마다 고유한 특징을 갖고 있다. 예를 들어, 보고가 있는 NOG 마우스는, NOD 계통에, SCID 및 IL2 receptor 의 common gamma (IL2R-γ) 유전자의 결손을 갖는 것이다. NOD 마우스는 원래 보체를 결손하고 있다. SCID 의 원인 유전자는 Prkdc (DNA-dependent protein kinase, catalytic subunit) 이며, 이 유전자는 면역 글로블린 유전자나 T 세포 리셉터의 재구성에 필요한 유전자이다. 따라서, 이 유전자에 변이가 있으면, B 임파구나 T 임파구가 생기지 않게 된다. 또, IL2R-γ 는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21 등의 인터류킨의 리셉터를 구성하는 공통 분자이다. 따라서, 이 분자가 결손되면, 이들 인터류킨을 개재한 시그널이 전달되지 않게 되어, 면역 응답을 할 수 없게 된다. 종합하면, 보체, B 임파구, T 임파구의 결손에 더하여, 매크로파지나 수상 (樹狀) 세포의 기능 저하도 보여, 면역 부전 상태가 보다 중증이 된다. 그러나, 중증의 면역 부전이기 때문에 정상 마우스에서는 전혀 문제가 되지 않는 기회 감염 병원체조차 경우에 따라 치사적으로 작용하거나, 흉선종이 높은 비율로 일어난다.
한편, BRJ 마우스는 BALB/c 마우스라는 계통에 Rag2 및 Jak3 의 유전자가 결손된 것으로, 이식한 세포의 생착율이 좋은 것으로 알려져 있다. Rag2 는 Prkdc 와 마찬가지로 면역 글로블린 유전자나 T 세포 리셉터의 재구성에 필요한 유전자이고, 또, Jak3 은 IL2R-γ 의 하류에 존재하는 유전자이며, 따라서, 이들 유전자의 결손에 의해 중증의 면역 부전 상태가 된다. 단, BRJ 는 사육 및 번식이 비교적 용이하다.
예비 실험에 있어서, 종래 사용되는 GMEM-KSR 배지를 이용하여 ES 세포의 수립을 시도했지만, 증식이 매우 나쁜 주 밖에 수립할 수 없고, 이 주를 사용하여 키메라 마우스를 제조해도 50 ％ 정도의 키메리즘밖에 얻어지지 않아, germline 에도 기여하지 않았다. 이에 반해, 본 발명에 있어서는, ES 의 미분화 상태 유지를 위해서 유효하다고 여겨지는 GSK3 의 인히비터와 MEK 의 인히비터를 배지에 첨가함으로써, 목적으로 하는 ES 세포를 수립할 수 있었다. 본 발명의 ES 세포는 증식력이 높고, 키메리즘도 높다. 그 이유는, 종래법을 이용하여 제조된 ES 세포와 비교하여, 미분화 상태를 잘 유지하고 있기 때문이다. ES 세포 분화에 작용하는 중요한 시그널 중 하나는 FGF4 로부터 FGF 리셉터를 개재하는 ERK/MEK 의 경로이다. 즉, ERK 는 분화의 시그널로서 작용한다. 또, GSK-3 은 b-카테닌을 인산화함으로써 Wnt 시그널을 자극하여, 분화를 유도한다. 따라서, 강력한 MEK 인히비터인 PD0325901 과 GSK3 인히비터의 2 개의 인히비터 (2i) 를 사용함으로써, 본 발명의 ES 세포는 분화를 억제하여 다분화능을 유지할 수 있다.
4. 유전자 개변
인간화에 최적인 유전자 개변 마우스를 수립하려면, 성체가 된 마우스가 아니라, ES 세포의 단계에서 내재 유전자를 인간형으로 치환하거나, 혹은 사람 유전자를 ES 세포에 도입한 후, 그 유전자 개변 및/또는 유전자 도입 ES 세포로부터 마우스를 작출할 필요가 있다.
그래서 본 발명에 있어서, ES 세포에 목적으로 하는 유전자를 도입하고, 혹은 ES 세포에 내재하는 유전자를 사람의 유전자로 치환하기 위해서, 박테리오 파지 유래의 재조합 시스템인 Cre-loxP 시스템, 비브리오균 유래의 재조합 시스템인 VCre-Vlox 시스템, Cre 의 호모로그를 이용한 재조합 시스템인 Dre/rox 시스템, 혹은 이들 재조합 시스템을 개변한 시스템에 의한 상동 재조합을 이용한다.
1oxP (locus of crossing (X-ring) over, P1) 는 34 염기 (5'- ATAACTTCGTATA GCATACAT TATACGAAGTTAT-3') 로 이루어지는 배열이며 (배열 번호 1), 5' 말단으로부터 13 염기 (역반복 배열 1 이라고 한다), 및 3' 말단으로부터 13 염기의 배열 (역반복 배열 2 라고 한다) 이, 각각 역반복 배열을 구성하고, 「GCATACAT」 에 의해 나타내어지는 8 염기의 스페이서로 불리는 배열이 상기 역반복 배열 1 및 2 에 끼워져 있다 (도 1). 「역반복 배열」 이란, 스페이서를 경계로 하여 일방 측의 배열이 타방 측의 배열과 서로 마주보는 방향으로 상보적인 배열을 의미한다.
Cre (causes recombination) 란, 유전자 재조합을 일으키게 하는 재조합 효소 (리콤비나아제라고도 한다) 를 의미하며, 상기 반복 배열을 인식하여, 스페이서부의 「cataca」 를 점착 말단으로 하는 절단 양식으로 절단한다.
그런데, 박테리아 중에서는, 2 개소의 1oxP 사이에서 재조합이 일어나, 삽입 또는 삭제 반응이 일어난다 (도 1). 포유류 세포로 삽입 반응을 일으킬 수 있으면, 후에 임의의 유전자를 삽입할 수 있으므로, 응용성은 현격히 넓어진다. 포유류 세포에서는 핵이 크기 때문에, 일단 삭제된 loxP 를 갖는 고리형 DNA 는 확산되어 버려, 삽입 반응은 거의 관찰되지 않는다.
그래서, 본 발명자는, 삽입 반응을 일으키기 위해서 1oxP 배열에 변이를 도입하고, 일단 유전자가 게놈에 삽입되면 삽입된 유전자는 삭제할 수 없도록 (게놈으로부터 탈리하지 않도록) 하는 것을 생각하여, 이를 위해 복수 종류의 변이형 1oxP (lox66, lox71, lox511, lox2272) 를 설계하였다 (도 1). 이들 변이형 1oxP 는 공지이다 (WO 01/005987호, 일본 공개특허공보 2007-100호).
또 본 발명에 있어서는, Vlox 라 불리는 시스템도 이용할 수 있다. Vlox 란, 비브리오균 유래의 재조합 시스템인 VCre-Vlox 이며 (Suzuki, E., Nakayama, M. VCre/VloxP and SCre/CloxP：new site-specific recombination systems for genome engineering. Nucleic Acid Res. 2011, 1-11), Vlox43L, Vlox43R, Vlox2272 등이 이용 가능하다 (도 1).
1oxP 및 변이형 1oxP 그리고 Vlox 시스템의 염기 배열을 이하에 나타낸다 (도 1).
또한 본 발명에 있어서는, Dre/rox 시스템을 채용할 수 있다 (도 2).
Dre 란, D6-부위 특이적 DNA 리콤비나아제이며, 하기 rox 부위의 배열을 인식하는 효소이다 (Sauer, B. and McDermott, Nucic Acid. Res. 32：6086-6095, 2004). 이 리콤비나아제 및 rox 인식 배열을 이용한 재조합 시스템을 Dre/rox 시스템이라고 부른다. 이 시스템은 Cre-lox 시스템과 밀접하게 관계하고 있는데, 인식하는 DNA 특이성이 상이하다.
lox 및 rox 의 염기 배열을 이하에 나타낸다 (도 2).
본 발명에 있어서는, 상기한 바와 같이 사람 정상 간장을 갖는 마우스를 수립하는 것을 목적으로 하고 있으며, 또한, 간장 질환 모델 마우스를 수립하는 것도 목적으로 한다. 그래서, 본 발명에 있어서는 마우스 간 세포의 세포질에 있어서 독소를 발현시켜 마우스 간 세포사를 유도할 수 있도록, ES 세포에 유전자 조작을 실시한다. 또, 사람 정상 간장을 갖는 마우스를 작출하려면 사람 간 세포를 이식하여 증식시킬 필요가 있기 때문에, ES 세포에 있어서, 마우스 성장 호르몬 유전자를 사람의 성장 호르몬 유전자로 치환한다. 또, 약물 대사 등의 기능을 해석하기 위해서, 마우스 약물 대사 효소 유전자를 사람의 약물 대사 효소 유전자로 치환한다.
간 세포사를 도입한 마우스는 간 기능을 소실하므로, 이 마우스는 간장 장애 모델로서 이용할 수 있는 것 외에, 사람 정상 간 세포를 이식함으로써, 간장이 인간화된 마우스를 얻을 수 있다.
도 3 은 마우스 성장 호르몬 (GH) 유전자를 사람 GH 유전자로 치환하기 위한 상동 재조합 벡터의 구축도이다.
또, 도 4 는 약물 대사 효소 유전자인 Cyp 유전자를 사람 Cyp 유전자로 치환하기 위한 상동 재조합 벡터의 구축도이다.
마우스 유전자로부터 상기 사람 유전자로의 치환은 WO 01/005987호에 기재된 유전자 트랩법에 준하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기한 바와 같이 제조된 벡터를 이용하여, 2 단계의 유전자 트랩을 실시한다.
제 1 단계는 통상적인 유전자 트랩법이다. 이 통상적인 유전자 트랩에서는, ES 세포에 상기 트랩 벡터를 도입하여, ES 세포 내에 본래적으로 존재하는 내재성 유전자를 트랩한다. 이에 따라, ES 세포 중의 내재성 유전자는 파괴된다. 다음으로, 사람 유전자를 플라스미드 (치환 벡터) 상에서 lox 배열 (예를 들어 1ox66 등) 의 하류에 이어, 제 2 단계의 유전자 트랩을 실시한다 (도 3, 4).
제 2 단계의 유전자 트랩에서는, 1ox66 의 하류에 연결된 사람 유전자 (hGH, hCyp 등) 를 ES 세포에 도입한다. 이에 따라, 제 1 단계에서 도입된 트랩 벡터의 1ox71 부위가 제 2 단계에서 도입한 벡터의 lox66 과의 사이에서 재조합을 일으켜, 「(lox71/66)-(사람 유전자)-(loxP)」로 구성되는 카세트를 포함하는 개변된 유전자를 도입할 수 있다. 또한, 사람 유전자와 loxP 사이에는, 퓨로마이신 내성 유전자 (puro) 를 연결할 수 있다.
이 방법에 의하면, 내재성 마우스 유전자를 사람 유전자로 치환할 수 있다. 도 3 및 4 에 치환 알레르의 도면을 나타낸다.
여기서, 도 3 및 4 에 있어서, Ex1, Ex2, Ex3 및 Ex4 는 각각 마우스 성장 호르몬 유전자 및 마우스 Cyp3a13 유전자의 엑손 1 ∼ 4 를 나타내고, pA 는 폴리 A 배열을 나타내며, Frt 는 FLP 의 인식 부위, PGK-neo 는 PGK 프로모터가 연결된 네오마이신 내성 유전자, P-puro 는 PGK 프로모터가 연결된 퓨로마이신 내성 유전자를 나타낸다.
5. 키메라 마우스의 제조
키메라 마우스의 제조는 표준적인 방법으로 실시할 수 있다.
먼저, 상기 수립된 ES 세포 또는 유전자가 도입 혹은 치환된 ES 세포를 8 세포기배와 응집시키거나, 혹은 배반포에 주입한다. 이와 같이 하여 제조된 배아를 키메라 배아라고 하는데, 이 키메라 배아를 가짜 임신 양부모의 자궁 내에 이식하여 출산시킴으로써 키메라 마우스를 제조한다.
예를 들어, 키메라 배아의 제조는, 먼저, 호르몬제에 의해 과배란 처리를 실시한 암컷 마우스를 수컷 마우스와 교배시킨다. 그 후, 소정 날짜 후에 난관 또는 자궁으로부터 초기 발생 배아를 회수한다. 회수한 배아에 ES 세포를 응집 또는 주입하여, 키메라 배아를 제조한다.
여기서, 「배아」 란, 개체 발생에 있어서의 수정으로부터 출생까지의 단계의 개체를 의미하며, 2 세포기배, 4 세포기배, 8 세포기배, 상실기배, 배반포 등을 포함한다. 8 세포기배를 사용하는 경우에는 수정으로부터 2.5 일째에, 배반포를 사용하는 경우에는 수정으로부터 3.5 일째에 각각 난관 또는 자궁으로부터 초기 발생 배아를 회수할 수 있다.
ES 세포와 배아를 사용하여 집합체를 제조하는 방법으로서, 마이크로 인젝션법, 응집법 등의 공지 수법을 이용할 수 있다. 「집합체」 란, ES 세포 및 배아가 동일 공간 내에 모여 형성하는 집합체를 의미하며, ES 세포가 배아에 주입된 형태, 배아를 개개의 세포로 분해하여, ES 세포와 함께 응집하는 형태 모두 의미한다.
마이크로 인젝션법을 채용하는 경우에는, 회수한 배아에 ES 세포를 주입하여 세포의 집합체를 제조한다. 또, 응집법을 채용하는 경우에는, ES 세포를 투명대를 제거한 정상 배아에 뿌려 응집시키면 된다.
한편, 양부모로 하기 위한 가짜 임신 암컷 마우스는 정상성 주기의 암컷 마우스를 정관 결찰 등에 의해 거세한 수컷 마우스와 교배함으로써 얻을 수 있다. 작출한 가짜 임신 마우스에 대해, 상기 서술한 방법에 의해 제조한 키메라 배아를 자궁 내에 이식하고, 그 후 출산시킴으로써 키메라 마우스를 제조할 수 있다.
이와 같은 키메라 마우스 중에서, ES 세포 이식 배아 유래의 수컷 마우스를 선택한다. 선택한 수컷의 키메라 마우스가 성숙한 후, 이 마우스를 순계 마우스 계통의 암컷 마우스와 교배시킨다. 그리고, 탄생한 새끼 마우스에 ES 세포에서 유래하는 마우스의 피모색이 나타남으로써, 다능성 줄기 세포가 키메라 마우스의 생식 계열에 도입된 것을 확인할 수 있다.
6. 인간화 마우스의 제조
(1) 인간화에 최적인 유전자 개변 마우스의 제조
유전자가 도입 또는 치환된 ES 세포를 이용하여 수립된 트랜스제닉 마우스, 즉 유전자 개변 마우스는, 후술하는 바와 같이, 100 ％ 인간화된 간장을 갖는 마우스의 수립을 위한 기본이 되는 마우스이다.
거절 반응의 회피를 위해서는, NOJ 마우스의 ES 세포 또는 BRJ 마우스의 ES 세포를 이용한다.
(i) NOJ (NOD/SCID/Jak3-/-) 마우스：C3, T, B, NK, NKT 결손
NOJ 마우스의 제조는, NOD 마우스와 SCID 마우스를 교배하여, NOD 의 유전적 배경에 SCID 유전자 변이를 도입한다. 또한, Jak3 결손 마우스와도 교배함으로써, NOD 의 유전적 배경에 SCID 및 Jak3 유전자 결손을 갖는 마우스 (NOJ 마우스) 가 얻어진다. 이 마우스에서는, 보체인 C3 이 결손되고, 또 T 세포, B 세포, NK 세포, NKT 세포도 결손되어 있는 마우스이다.
(ii) BRJ (BALB/c ; Rag2-/- ; Jak3-/-) 마우스：T, B, NK, NKT 결손
본 발명에 있어서는, 상기 NOJ 마우스 외에 BRJ 마우스를 사용할 수 있다. BRJ 마우스는 BALB/c 마우스의 유전적 배경에 Rag2 및 Jak3 유전자 결손을 도입한 마우스이며, T 세포, B 세포, NK 세포, NKT 세포가 결손되어 있다. NOJ 마우스와 비교하여, 번식이 용이하여, 다수의 마우스를 생산할 수 있다.
(2) 간장 장애 모델 마우스의 제조
간장 장애 모델 마우스는, 항에스트로겐제의 투여에 의해, 독소를 발현시켜 마우스 간 세포를 제거함 (사멸시킴) 으로써, 간 기능이 소실된 장애 모델 마우스를 제조할 수 있다.
마우스 간 세포의 사멸을 위해서, 또, 마우스 간 세포의 세포질에 있어서 Dre-ERT2 를 발현시키기 위해서, 이하의 컨스트럭트 1 및 2 를 제조한다. Dre-ERT2 란, Dre 재조합 효소 유전자와, 포유류 체내에서 산생되는 에스트로겐이 결합하지 않도록 개변된 변이형 에스트로겐 리셉터 유전자를 연결한 벡터이다.
컨스트럭트 1：
CAG-ATG-rox-EGFP-rox-DT-A
컨스트럭트 2：
SAP-Dre-ERT2
컨스트럭트 1 은, CAG 프로모터의 바로 아래에, (i) ATG, (ii) rox 로 끼인 EGFP, 및 (iii) DT-A (diphtheria toxin fragment A) 를 접속한 것이다.
EGFP 의 개시 코돈과 rox 상류의 ATG 는 프레임이 맞도록 설계한다. 또, DT-A 의 개시 코돈은 제거하고, rox 상류의 ATG 와 프레임이 맞도록 설계한다.
컨스트럭트 2 는, 간 세포 특이적인 혈청 아밀로이드 P 성분 (serum amyloid P component：SAP) 의 프로모터 바로 아래에, Dre-ERT2 를 접속한 것이다.
이들 컨스트럭트 1 및 2 를 본 발명의 ES 세포에 함께 도입함으로써, 타목시펜 투여 후 부위 특이적 재조합이 일어나, 간 세포 특이적으로 디프테리아 독소가 발현하여 세포사를 유도할 수 있다.
즉, 비스테로이드성 항에스트로겐제로서, 예를 들어 타목시펜 (Tamoxifen) 은, 에스트로겐 리셉터에, 에스트로겐과 경합적으로 결합하여, 항에스트로겐 작용을 나타냄으로써 항종양 활성을 갖는 물질이다. Dre-ERT2 를 발현시킨 인간화 마우스에 타목시펜을 투여하면, 타목시펜에 의해 Dre-ERT2 가 핵으로 이행한다. 2 개의 rox 사이에 있어서의 재조합이 일어나, 디프테리아톡신 유전자의 프로모터가 기능한다. 이에 따라, 독소 DT-A 가 발현하여, 마우스의 간 세포가 사멸한다 (도 5).
타목시펜의 투여 횟수 및 투여 시기는 간 세포를 사멸할 수 있는 한 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 이하와 같이 실시한다.
타목시펜을 에탄올 용해하고, 그 용액을 sun flower oil (S5007, Sigma) 로 희석하여, 농도를 7 ㎎/㎖ 로 조정한다. 이 용액을 사용하여, 성체에게 105 ㎎/㎏ body weight 가 되도록 4 일간 연속 복강 내 투여한다.
(3) 간 세포가 사람 간 세포로 치환된 인간화 마우스의 제조
간 세포가 사람 간 세포로 치환된 마우스는, 상기와 같이 항에스트로겐제 투여에 의해 마우스 간 세포를 제거함과 함께, 사람 간 세포를 마우스에 이식함으로써, 간 세포가 사람 간 세포로 치환된 인간화 마우스를 얻을 수 있다.
사람 정상 간장을 갖는 마우스를 수립하는 것은 장기간에 걸친 간장 기능의 유지와, 안전성을 확인하기 위해서 필요하다.
(i) 마우스 성장 호르몬 유전자가 사람 유전자로 치환된 ES 세포의 제조
이식 후의 사람 간 세포를 증식할 수 있도록 하기 위해서, 마우스 성장 호르몬 유전자를 ES 세포의 단계에서 사람 유전자로 치환한다.
구체적으로는, 상기한 바와 같이 ES 세포의 유전자 치환을 2 개의 단계로 실시한다.
제 1 단계에 있어서, SAP-Dre-ERT2 및 CAG-rox-EGFP-rox-DT-A 를 도입한 BRJ ES 세포 (BRJ ES：SAP-Dre-ERT2 ; CAG-rox-EGFP-rox-DT-A 라고 부른다) 를 이용하여 상동 재조합을 실시하고, 마우스 성장 호르몬 유전자를 개시 코돈 부위에서 파괴함과 함께, 이 영역에 lox71-PGK-neo-loxP 가 삽입된 ES 세포 (BRJ ES：：SAP-Dre-ERT2 ; CAG-rox-EGFP-rox-DT-A ; Ghneo) 를 수립한다.
제 2 단계에 있어서, 이 ES 세포와 치환 벡터를 이용하여, neo 유전자 대신에 사람 성장 호르몬 유전자 cDNA 가 삽입된 ES 세포 (BRJ ES：SAP-Dre-ERT2 ; CAG-rox-EGFP-rox-DT-A ; GhhGH) 를 수립할 수 있다.
이와 같이 하여 수립된 ES 세포를 이용하여, 사람 성장 호르몬을 산생하는 마우스를 얻을 수 있다.
(ii) 마우스 간 세포 및 미분화 간 세포의 제거
타목시펜의 투여 횟수 및 투여 시기는 상기와 동일하다.
(iii) 이식하는 사람 간 세포의 제조
이식하는 사람 간 세포는 iPS 세포로부터 유도할 수 있다.
사람 간 세포는, 사람 iPS 세포로부터, 상피 세포나 세포 외 매트릭스를 이용하여 효율적인 내배엽 및 간장 분화 유도 방법을 확립할 수 있다.
iPS 세포는 Oct, Sox, Klf, Myc, Nanog, Lin 등의 패밀리 멤버를 포함하는 3 ∼ 6 개의 전사 인자 (핵초기화 인자) 를 코드하는 유전자를 체세포에 도입함으로써 유도할 수 있다 (Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat. Protoc. 2, 3081-9 (2007) ; Fusaki N, Ban H, Nishiyama A, Saeki K, Hasegawa M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2009 ; 85 (8)：348-62.).
Oct 패밀리 멤버로는, 예를 들어 Oct3/4, Oct1A, Oct6 등을 들 수 있고, Oct3/4 가 바람직하다.
Sox (SRY 관련 HMG 박스) 패밀리 멤버로는, 예를 들어 Sox1, Sox2, Sox3, Sox7, Sox15 등을 들 수 있고, Sox2 가 바람직하다.
Klf (Kruppel 형 인자) 패밀리 멤버로는, 예를 들어 Klf1, Klf2, Klf4, Klf5 등을 들 수 있고, Klf4 가 바람직하다.
Myc 패밀리 멤버로는, c-Myc, N-Myc, L-Myc 등을 들 수 있고, c-Myc 가 바람직하다.
Nanog 는 배반포의 내부 세포괴에서 가장 높게 발현하고, 분화 세포에서는 발현하지 않는 호메오박스 단백질이다.
Lin 패밀리 멤버로는, 예를 들어 미분화 사람 ES 세포의 마커인 Lin28 을 들 수 있다.
보다 구체적으로는, 전사 인자로는, Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 의 조합이 바람직하지만 (Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell 126, 663-676 (2006)), 그 외에도, Oct3/4, Sox2 및 Klf4 의 조합, 혹은 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 L-Myc 의 조합도 사용할 수 있다.
체세포로는, 예를 들어 피부 세포, 간장 세포, 섬유아세포, 임파구 등을 들 수 있다.
체세포로의 유전자 도입법은, 예를 들어 리포펙션, 일렉트로포레이션, 마이크로 인젝션, 바이러스 벡터에 의한 도입 등을 들 수 있으며, 특별히 한정되는 것은 아니다. 바이러스 벡터로는, 예를 들어 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터, 센다이 바이러스 등을 들 수 있다. 시판되는 벡터, 예를 들어 센다이 바이러스 (DNAVEC) 를 이용할 수도 있다.
벡터를 이용하는 경우, 도입하는 유전자가 발현할 수 있도록, 프로모터 및 인핸서 등의 조절 배열과 기능할 수 있는 형태로 연결할 수도 있다. 프로모터로는, 예를 들어 CMV 프로모터, RSV 프로모터, SV40 프로모터 등이 있다. 이들 벡터는 또한 약제 내성 유전자 (예를 들어, 퓨로마이신 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자 등) 등의 포지티브 선택 마커, 네거티브 선택 마커 (예를 들어, 디프테리아 독소 A 프래그먼트 유전자 또는 티미딘 키나아제 유전자 등), IRES (internal ribosome entry site), 터미네이터, 복제 기점 등을 포함할 수 있다.
체세포 (예를 들어, 0.5×104 ∼ 5×106 세포/100 ㎜ 디쉬) 를, 약 37 ℃ 에서, MEF 피더 상 또는 피더 불포함의 조건으로, 상기 핵초기화 인자를 포함하는 벡터를 트랜스펙트로서 배양하면, 약 1 ∼ 4 주일 후에 iPS 세포가 유도된다.
배지로는, 예를 들어 GMEM 배지 (Glasgow's Minimal Essential Medium), DMEM (다르벡코의 개변 이글 배지), RPMI1640 배지, OPTI-MEMI 배지 등을 들 수 있다. 배양 배지에는, KSR (Knockout Serum Replacement), 소 태아 혈청 (FBS), activin-A, 염기성 섬유아세포 증식 인자 (bFGF), 레티노인산, 덱사메사존, β-메르캅토에탄올, 비필수 아미노산, 글루탐산, 피루브산나트륨 및 항생 물질 (예를 들어, 페니실린, 스트렙토마이신 등) 등에서 선택하여, 적절히 첨가할 수 있다.
소정 기간 배양 후, ES 세포의 배양시와 마찬가지로, EDTA 또는 콜라게나아제 IV 를 포함하는 배지에서 인큐베이트함으로써 세포를 회수한다. 피더 불포함 조건으로는, 세포를 매트리겔 코팅 플레이트 상, MEF 로 순화된 배지 중에서 실시할 수 있다.
iPS 세포로부터 사람 간 세포로는 3 개의 단계를 거쳐 분화 유도하는 것이 일반적이다. 원칙적으로,
(a) 다능성 줄기 세포로부터 내배엽계로의 유도,
(b) 내배엽계로부터 미숙 간 세포로의 유도, 및
(c) 미숙 간 세포로부터 성숙 간 세포로의 유도이다.
상기 (a) 에 있어서는 activin A 나 Wnt 시그널이, (b) 에 있어서는 FGF 나 BMP 가, 그리고 (c) 에 있어서는 Hepatocyte growth factor, Oncostatin, Dexamethasone 이 중요한 것으로 생각되고 있다.
단, 상기 (b) 및 (c) 의 단계는 적절히 DMSO 나 레티노인산, FGF4 나 hydrocortisone 으로 대체하는 것이 가능하다.
사람 간 세포의 이식 시기는 태생 15.5 일째, 또는 생후 8 주 전후의 성체 마우스이다.
사람 간 세포의 이식 세포수는 105 내지 106 개인 것이 바람직하다.
사람 간 세포의 이식 루트는 배아의 경우에는 난황낭 정맥 (yolk sac vessel) 으로부터 주입하여 이식한다 (도 6, 7). 성체의 경우에는, 비장 내에 주입한다.
(iv) 사람 간 세포의 증식
마우스 성장 호르몬 유전자가 사람 성장 호르몬 유전자로 치환된 ES 세포를 이용하여 수립된 마우스는 사람 성장 호르몬을 산생할 수 있다. 이 사람 성장 호르몬이 이식한 사람 간 세포에 작용하여, 그 성장을 재촉하여, 정상적인 사이즈의 사람 간장을 갖는 인간화 간장 마우스를 수립할 수 있다.
마우스 간 세포가 모두 (100 ％) 사람 간 세포로 치환된 것의 확인, 즉 마우스 간 세포가 존재하지 않는 것의 확인은 마우스 간장에서 발현하는 유전자의 발현을 RT-PCR 법 등에 의해 해석함으로써 실시할 수 있다.
(4) 인간화 간장 마우스의 평가
간장이 인간화된 것은 이하의 사항을 단독으로 또는 적절히 조합하여 검사함으로써 확인할 수 있다.
(i) 간 기능의 검증
간 기능을 검증하기 위한 검사 항목으로는, 예를 들어 이하의 항목을 들 수 있다. 검사 기간은 한정되는 것은 아니지만, 1 년 이상 실시하는 것이 바람직하다.
단백 관련：총 단백, ALB, TTT, ZTT, CRP, Haptoglobin, C3, C4
비단백성 질소 성분：전체 빌리루빈, 직접 빌리루빈
당질：글루코오스
지질：트리글리세리드, 총 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, ApoAI, ApoCII
효소：락트산 탈수소 효소 (LDH), 아스파르트산아미노기 전이 효소 (AST (GOT)), 알라닌아미노기 전이 효소 (ALT (GPT)), γ-글루타밀 트랜스페라아제 (GGT), 크레아틴 키나아제 (CK), 알칼리 포스파타아제 (AP), 아밀라아제 (AML)
기타：칼슘, Fe, 무기 인산
ICG 검사：인도시아닌·그린 (ICG) 을 경정맥적으로 투여하고, 혈중의 ICG 농도를 시간 경과적으로 측정하여, 간장의 색소 배설 기능을 검사한다. ICG 는 혈중의 리포 단백에 결합하여 간에 수송되고, 유동 (類洞) 을 통과하는 동안에 간 세포에 섭취되어, 포합을 받는 일 없이 담즙에 배설되므로, 간 세포가 아니라, 간장 전체의 장기로서의 기능을 해석할 수 있다.
CT 검사：간장의 형태적인 변화를 검사한다.
(ii) 약물 대사
PCR array 법을 이용하여, 이하의 약물 대사 관련 효소를 해석한다
(iii) 간 세포 기능의 in vitro 에서의 검증
간 세포는 내배엽 유래이므로, 내배엽계 및 간 세포에서 발현하는 유전자의 시간 경과적인 발현, 글리코겐의 축적, 시토크롬 효소의 발현 등을 조사함으로써, 사람 간장의 기능을 갖는지 여부를 검증할 수 있다.
내배엽계 및 간 세포에서 발현하는 유전자의 시간 경과적인 발현은 Oct3/4, T, Gsc, Mixl1, Foxa2, Hex, Hnf4a, Hnf6, Afp, Alb, Ttr, αAT 등에서 검증할 수 있다. 그 검증 수법은 예를 들어 일반적인 노던 블롯법, RT-PCR 법, 웨스턴 블롯법이다.
간 세포의 분비 능력은 ALB, transferrin, alpha1-antitrypsin, fibrinogen 의 배양액 중의 농도 측정으로 검증할 수 있다. 그 검증 수법은 예를 들어 일반적인 웨스턴 블롯법 혹은 EIA (enzyme-immuno assay) 법이다.
글리코겐의 축적은 PAS (periodic acid-Schiff) 염색으로 검증할 수 있다. 과요오드산은 글루코오스 잔기를 선택적으로 산화하여 알데히드를 생성하고, 시프 시약에 의해 적자색으로 변색된다.
시토크롬 효소의 발현은 주요한 5 개인 CYP3A4, CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19 및 CYP2D6 의 해석으로 검증할 수 있다. 그 검증 수법은 예를 들어 일반적인 노던 블롯법, RT-PCR 법, 웨스턴 블롯법이다.
(5) 사람 환자 유래의 간 세포에 의해 치환된 간장 질환 모델 마우스의 제조
본 발명의 마우스에 사람 환자 유래의 간 세포를 이식함과 함께, 항에스트로겐제를 투여하여 마우스 유래 간 세포를 제거함으로써, 사람 간장 질환 모델 마우스를 얻을 수 있다.
사람 변이 간장을 갖는 마우스를 수립하는 것은 사람 환자와 동일한 증상의 질환 모델의 수립과 병태 해석을 위해서 필요하다. 그리고, 사람 질환 최적화 모델이 수립되어, 범용성이 높은 새로운 치료법을 개발하기 위해서 이용할 수 있다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. 또한, iPS 세포로부터의 간 세포의 유도, 사람 가족성 아밀로이드 폴리뉴로파시 환자, 사람 프로피온산 혈증 환자로부터의 iPS 세포의 수립, 유도한 사람 간 세포를 이용한 마우스로의 이식 실험 등에 관해서, 윤리 위원회, 동물 실험 위원회, 제 2 종 재조합 DNA 실험 안전 위원회에 신청하여, 모두 인가받았다.
[실시예 1]
ES 세포의 수립
본 실시예에서는, 사람 간 세포 이식에 최적인 인간화 최적 마우스의 확립을 위해, BRJ 마우스 배아로부터 ES 세포주의 수립을 실시하고, 마우스 계통도 확립하였다.
(1) BALB/c ; Rag2-/- ; Jak3-/- (BRJ) 마우스의 수립과 그 ES 세포주의 수립
Rag2 결손 및 Jak3 결손 마우스를 교배하여, 더블 결손 마우스 BRJ 를 수립하였다 (Ono A, et al. J Biomed Biotechnol 2011 ; 539748, 2011. doi：10.1155/2011/5397481)). 수립된 BRJ 마우스를 이용하여 체외 수정을 실시하고, 64 개의 배반포배를 얻고, 종래 이용하고 있는 GMEM-KSR 배지 (14 ％ KSR, 1 ％ FBS, 1000 U/㎖ LIF in GMEM) 에서 배양을 실시하고, 수립을 시도했지만, 증식이 매우 나쁜 2 계통 밖에 수립할 수 없었다.
이들을 사용하여 키메라 마우스를 제조했지만, 50 ％ 정도의 키메리즘 밖에 얻어지지 않고, germline 에도 기여하지 않았다. 그래서, ES 의 미분화 상태 유지를 위해서 유효한 것으로 여겨지는 GSK3 의 인히비터의 CHIR99021 과 MEK 의 인히비터의 PD0325901 을 배지에 첨가하고 (GMEM-KSR-2i 배지), 재차 ES 수립을 시도하였다.
구체적으로는, 체외 수정으로 BRJ 의 배아를 채취하였다. 배반포 64 개를 KSOM 배지에서 배반포가 될 때까지 4 일간 배양하여, 48 well (젤라틴 코트만) 에 1 개씩 배아를 넣었다. 사용 배지는 KSR-GMEM-2i 배지이다. 그 배지 조성으로서, G-MEM (Glasgow minimum essential medium) 중에, 1 X MEM nonessential amino acids, 0.1 mM β-mercaptoethanol, 1 mM Sodium pyruvate, 1 ％ Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone), 14 ％ KnockoutTM SR (KSR), 1100 uints/㎖ Leukemia inhibitory factor (LIF), 2 μM PD0325901 및 3 μM CHIR99021 이 포함되어 있다. 배양 기간은 14 일간 실시하고, 도중에 배지를 2 회 교환하였다. 14 일 후 내지 18 일 후에 걸쳐, ICM 이 늘어난 well 로부터 피더 세포가 포함된 24 well 에 서브컬쳐를 실시하였다. 추가로, 순차, 12 well, 6 well, 6-cm dish 로 서브컬쳐를 실시하고, 최종적으로, 증식 속도 및 형태와도 전혀 문제가 없는 ES 주를 28 계통 수립할 수 있었다.
(2) BRJ ES 세포주를 사용한 키메라 마우스 제조와 BRJ Rag2-/- ; Jak3-/-마우스 계통의 수립
수립된 ES 주 중 8 개의 셀 라인을 이용하여 B6 암컷과 BDF1 수컷의 교배에 의해 얻어진 모룰라 배아와 애그리게이션을 실시함으로써, 키메라 마우스 제조를 실시하였다 (표 1).
3 개의 ES 라인 (BRJ-5, BRJ-6 및 BRJ-8) 에서 얻어진 100 ％ 키메라로부터 생식 계열로의 전달을 확인하였다 (표 2).
또한, 얻어진 ES 세포 중, 8 번째의 셀 라인을 「BRJ8」 이라고 칭하고, 2012년 3월 23 일자 (수령일) 로, 독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터 ((우) 292-0818 치바현 키사라즈시 카즈사 카마타리 2-5-8 NITE 바이오 테크놀러지 본부 특허 미생물 기탁 센터) 에 부다페스트 조약에 기초하여 국제 기탁하였다. 그 수령 번호는 「NITE ABP-1297」 이다.
[실시예 2] 마우스 간 세포사의 유도
(1) 마우스 간 세포사의 유도를 위한 컨스트럭트의 제조
간 세포를 특이적으로 사멸할 수 있는 유전자 개변 마우스를 제조하기 위해서, 2 종류의 컨스트럭트를 제조하였다.
컨스트럭트 1 (CAG-ATG-rox-EGFP-rox-DT-A) 은 CAG promoter 의 바로 아래에, ATG, rox 로 끼인 EGFP, 및 DT-A (diphtheria toxin fragment A) 를 접속하고 있다.
EGFP 의 개시 코돈과 rox 상류의 ATG 는 프레임이 맞도록 설계하였다. 또, DT-A 의 개시 코돈은 제거하여 rox 상류의 ATG 와 프레임이 맞도록 설계하였다.
컨스트럭트 2 (SAP-DreERT2) 는 간 세포 특이적 혈청 아밀로이드 P 성분 (serum amyloid P component：SAP) 의 프로모터 바로 아래에 Dre-ERT2 를 접속하고 있다. 게다가, SAP promoter 의 상류에는 puromycin 내성 유전자를 접속하고 있다.
구체적 수법은 이하와 같다.
(1-1) 컨스트럭트 1
컨스트럭트 1 은 이하와 같이 제조하였다.
(i) p6SEAZ 를 PstI, pSP-rox2 를 KpnI 로 제한 효소 처리하고, T4 Polymerase (TaKaRa) 로 블런트 엔드로 하였다. 그 후, EcoRI 로 제한 효소 처리를 실시하고, 라이게이션하여, pSP-rox-EGFP-rox 를 제조하였다.
(ii) pSP-rox-EGFP-rox 와 pBSK-atg-rox2 (합성 DNA, Biomatik 사) 를 EcoRI 와 SmaI 로 제한 효소 처리를 실시하고, 라이게이션하여, pBSK-atg-rox-EGFP-rox 를 제조하였다.
(iii) pBSK-atg-rox-EGFP-rox 와 P71hAXC-DT 를 BamHI 와 PstI 로 제한 처리를 실시하고, 라이게이션하여, pBSK-atg-rox-EGFP-rox-DT-A 를 제조하였다.
(iv) pCAGGS-EGFP 를 KpnI 로, pBSK-atg-rox-EGFP-rox-DT-A 를 SpeI 로 제한 효소 처리하고, T4 Polymerase (TaKaRa) 로 블런트 엔드로 하였다. 그 후, Hind III 으로 제한 효소 처리를 실시하고, 라이게이션을 하여 CAG-atg-rox-EGFP-rox-DT-A 를 제조하였다.
(1-2) 컨스트럭트 2
컨스트럭트 2 는 이하와 같이 제조하였다.
(i) pkSAP-DrePP 를 template 로 하고, 개시 코돈으로부터 스톱 코돈 앞까지를 PCR 로 증폭하였다. Reverse Primer 에는 BamHIsite 를 부가하였다.
PCR kit TaKaRa Ex Taq
Fw Primer CCATGGCCCCCAAGAAGAAAA (배열 번호 14)
Re Primer CGGGATCCATGAGCCTGCTGTT (배열 번호 15)
pGEM-T Easy Vector 와 상기 PCR 산물을 라이게이션하여, T easy-Dre 를 제조하였다.
(ii) pkSAP-DrePP 와 T easy-Dre 를 SalI 와 EcoRI 로 제한 효소 처리를 하고, 라이게이션을 실시하여, T Easy SAP 를 제조하였다
(iii) 상기 T Easy Dre 와 T easy-SAP 를 SacII 와 NotI 로 제한 효소 처리를 하고, 라이게이션을 실시하여, T easy-SAP-Dre 를 제조하였다.
(iv) T Easy-SAP-Dre 와 pkSA-CremERT2PP 를 사용하여, BamHI 와 NotI 로 제한 효소 처리하고, 라이게이션을 실시하여, T easy-SAP-DremERT2 를 제조하였다.
(v) pkSAP-DrePP 와 T easy-SAP-DremERT2 를 SalI 와 NotI 로 제한 효소 처리하고, 라이게이션을 실시하여, pKSAP-DreERT2 를 제조하였다.
(vi) pKSAP-DreERT2 를 SpeI 로, pFPacpaF2 를 KpnI 로 제한 효소 처리를 실시하고, T4 polymerase (TaKaRa) 로 블런트 엔드로 하였다. 그 후, pKSAP-DreERT2 를 SalI, pFPacpaF2 를 XhoI 로 제한 효소 처리를 실시하고, 라이게이션을 하여 Puro-SAP-DreERT2 를 제조하였다.
(2) 에스트로겐 수용체 유전자 및 디프테리아톡신 유전자의 ES 세포로의 도입
사람 유전자를 삽입시에, 효율적으로 발현시키기 위한 조건 검토를 실시하였다 (Li, Z. et al., Transgenic Res. 20：191-200, 2011. DOI 10. 1007/s11248-010-9389-22).
PGK-puromycin 카세트 및 IRES 의 유무에 의해, 어느 조합일 때가 가장 발현 효율이 좋은지를 해석하였다.
상동 재조합 벡터를 이용하여, 통상적인 방법 (Zhao, G., Li, Z., Araki, K., Haruna, K., Yamaguchi, K., Araki, M., Takeya, M., Ando, Y. and Yamamura, K. Inconsistency between hepatic expression and serum concentration of transthyretin in mice humanized at the transthyretin locus. Genes Cells 13：1257-1268, 2008.) 에 의해 미리 마우스 transthyretin (Ttr) 유전자의 제 1 엑손을 파괴하였다. 이 때 제 1 엑손의 ATG 가 파괴되고, 그 부분에 lox71-PGK-beta-geo-loxP-poly A-lox2272 가 삽입된 표적 재조합 클론을 얻었다.
이어서, 2 종류의 치환 벡터를 제조하였다. 치환 벡터 1 은 lox66-hTTR cDNA-polyA-Frt-PGK-puro-Frt-loxP 를 포함하고 있다. 치환 벡터 2 는 lox66-IRES-hTTR cDNA-polyA-Frt-PGK-puro-Frt-loxP 를 포함하고 있다. 이들 치환 벡터를 각각 표적 재조합 클론에, Cre 발현 벡터와 함께 전기 천공법으로 도입하였다.
그 결과, lox71/66-hTTR cDNA-polyA-Frt-PGK-puro-Frt-loxP 클론 (I(-)P(+) 라고 약칭) 및 lox71/66-IRES-hTTR cDNA-polyA-Frt-PGK-puro-Frt-loxP 클론 (I(+)P(+) 라고 약칭) 을 얻었다. 이 2 개의 클론은 모두 PGK-puro 를 갖지만, I(-)P(+) 는 IRES 를 갖고 있지 않다.
이 2 개의 클론에 CAG-FLP 를 전기 천공법으로 도입하고, Frt 사이의 PGK-puro 를 삭제하여, I(-)P(-) 및 I(+)P(-) 클론을 제조하였다.
상기 4 개의 ES 클론으로 마우스를 제조하고, 발현 해석을 실시한 결과, I(-)P(+) 에서의 발현이 가장 높고, I(-)P(-), I(+)P(+), I(+)P(-) 의 순서로 발현이 저하되는 것을 알 수 있었다. 또, I(-)P(+) 의 경우에는, 간장에서의 사람 TTR (트랜스티레틴) 의 발현은 컨트롤 마우스에 있어서의 마우스 Ttr (트랜스티레틴) 의 발현 레벨과 거의 동일한 것을 알 수 있었다.
그 결과, PGK-puromycin 이 존재하고, IRES 가 존재하지 않는 조합이 삽입한 사람 유전자의 발현 효율이 가장 좋은 것을 분명히 하였다.
[실시예 3] 사람 성장 호르몬 유전자에 의한 치환
상동 재조합 벡터를 이용하여, 실시예 2 와 동일하게 통상적인 방법에 의해 미리 마우스 growth hormone (Gh) 유전자의 제 1 엑손을 파괴하였다. 이 때 제 1 엑손의 ATG 가 파괴되고, 그 부분에 lox71-PGK-beta-geo-loxP-poly A-lox2272 가 삽입된 표적 재조합 클론을 얻었다. 이어서, 치환 벡터를 제조하였다. 치환 벡터는 lox66-hGH cDNA-polyA-Frt-PGK-puro-Frt-loxP 를 포함하고 있다. 이 치환 벡터를 표적 재조합 클론에, Cre 발현 벡터와 함께 전기 천공법으로 도입하였다.
그 결과, 마우스의 Gh 유전자가 사람 GH 유전자로 치환된 ES 클론을 얻었다.
[실시예 4] 사람 약물 대사 효소 유전자에 의한 치환
통상적인 방법에 의해 미리 상동 재조합 벡터를 이용하여, 마우스 Cyp3a13 유전자의 제 1 엑손을 파괴하였다. 이 때 제 1 엑손의 ATG 가 파괴되고, 그 부분에 lox71-PGK-beta-geo-loxP-poly A-lox2272 가 삽입된 표적 재조합 클론을 얻었다. 이어서, 치환 벡터를 제조하였다. 치환 벡터는 lox66-hCYP3A4 cDNA-polyA-Frt-PGK-puro-Frt-loxP 를 포함하고 있다. 이 치환 벡터를 표적 재조합 클론에, Cre 발현 벡터와 함께 전기 천공법으로 도입하였다.
그 결과, 마우스의 Cyp3a13 유전자가 사람 CYP3A4 유전자로 치환된 ES 클론을 얻었다.
[실시예 5] 간장 인간화 마우스의 제조
사람 iPS 세포로부터의 사람 간 세포의 분화 유도 방법을 거의 확립하고, 마우스 간 세포사의 유도를 위한 컨스트럭트의 제조도 실시하였다.
(1) 사람 iPS 세포로부터의 간 세포의 분화 유도
사람 iPS 세포로부터, 상피 세포나 세포 외 매트릭스를 이용하여 효율적인 내배엽 및 간장 분화 유도 방법을 구축하였다.
분화 간장 세포의 순화 및 분화 유도 효율의 평가를 위해서, 알부민-리포터 유전자 도입 사람 iPS 세포주를 수립하고, 분화 유도 방법의 개발에 이용하였다. 배양 기재에 관해서는, 상피 세포 (피더 세포) 인 M15 세포, 인공 기저막 (synthesized Basement Membrane：sBM), Cell-able 등을 이용하였다.
iPS 세포로부터 사람 간 세포로 분화시키기 위해서, 첫날부터 9 일째까지는 4,500 ㎎/ℓ glucose DMEM 배지를 이용하여 배양하였다. 이 DMEM 배지는 이하를 포함한다：insulin (10 ㎎/ℓ), transferrin (5.5 ㎎/ℓ), sodium selenite (6.7 ㎎/㎖), ALBUMAX II (2.5 ㎎/㎖), 100 mM nonessential amino acids, 2 mM L-Glutamine, 50 ㎎/㎖ streptomycin, 100 μM β-mercaptoethanol, activin A (20 ng/㎖), bFGF (50 ng/㎖).
이어서, 9 일째부터 11 일째까지는 레티노인산 (10-6 M) 을 첨가하여 배양하였다.
마지막으로, 11 일째부터 30 일째까지 2,000 ㎎/ℓ glucose DMEM 배지로 옮겨 담아 배양함으로써 간 세포로 분화시켰다. 이 때 사용한 DMEM 배지에는 이하를 포함한다：10 ％ KSR, 100 mM nonessential amino acids, 2 mM L-Glutamine, 50 ㎎/㎖ streptomycin, 100 μM β-mercaptoethanol, Hepatocyte growth facor (10 ng/㎖), Dexamethasone (1 mM), Dimethylsulfoxide (1 ％), and Nicotinamide (1 mM).
(2) iPS 유래 사람 간 세포의 이식 방법의 검토
간장을 인간화하기 위해서 필요한, 마우스 간장에 효율적으로 iPS 유래 간 세포를 도입하는 방법의 확립을 목적으로 하여, iPS 유래 사람 간 세포를 태생기 17 일째 마우스 태자 (胎仔) 의 양막 (羊膜) 상에 존재하는 혈관 (yolk sac vessel) 을 경유하여 도입하는 방법의 예비 실험을 실시하였다 (도 6, 7).
(A) 색소 (blue-dye) 및 (B) GFP 발현 벡터를 봉입한 글리세롤 미셀을 태생기 17 일째의 양막 상에 존재하는 혈관에 도입하고, 그 도입 효율을 확인하였다.
그 결과, 주입물은 간장에 집중하여 국재하고, 또한 간장 전체에 산재하는 것을 확인하였다. 또, 이 처치를 실시한 후에도 태아의 생존이나 분만에 영향은 없고, (A), (B) 모두 간장에 효율적으로 도입된 신생아 마우스가 탄생하였다.
상기 (1) 의 항에서 제조한 간 세포를 이식에 사용하였다.
M15 상 및 sBM 상에서 분화 유도한 간 세포를 도 8 에 나타낸다.
다음으로, 대량의 간 세포를 유도하기 위해서, Cell-able (토요 합성, 토쿄) 이라고 하는 배양 플레이트를 이용하여 배양하였다.
그 결과, 역시 30 일간의 배양으로, 대량으로 간 세포로 분화 유도할 수 있고, 또, 스페로이드 형성이 실시되었다 (도 9).
어느 배양 방법에 있어서도, 배양 10 일째에 Sox17 양성의 내배엽이, 배양 20 일째에 AFP 양성의 미숙한 간장 세포가, 배양 30 일째에는 ALBUMIN 양성의 성숙 간 세포가 분화 유도되었다.
분화 유도된 성숙 간 세포의 기능 평가로서, 글리코겐의 축적을 PAS 염색으로, 해독능을 인도시아닌 그린 (ICG) 염색을 실시하였다.
그 결과, 분화 유도한 간장 세포가 목적으로 하는 기능을 갖고 있는 것을 알 수 있었다.
또, 간장 세포는 마우스 특이적 프라이머를 이용한 RT-PCR 해석에 의해 마우스 유전자의 발현을 확인하지 않는 것으로부터, 100 ％ 가 사람 유래의 것임을 알 수 있었다.
[실시예 6] 변이 인간화 간장 마우스의 수립
본 실시예에서는 FAP 및 PA 의 모델 마우스의 번식을 실시하였다.
(1) 사람 환자로부터의 변이 간 세포의 유도
(i) 가족성 아밀로이드 폴리뉴로파시 (FAP)：수립이 끝남
FAP 는 트랜스사이레틴 (transthyretin：TTR) 유전자의 점돌연변이에 의해 야기되는 상염색체 우성 유전병이다. 예를 들어, FAP 에서는, 트랜스사이레틴의 아미노산 배열에 있어서, 30 번째의 아미노산이 발린으로부터 메티오닌으로 치환되어 있다 (Val30Met). 이 Val30Met 변이를 갖는 환자로부터 채취한 선유아세포를 이용하여 iPS 세포를 수립하였다.
그리고, 이 iPS 세포로부터, 지금까지 서술한 방법과 동일한 방법으로, 간 세포로 분화 유도할 수 있는 것을 알 수 있었다.
(ii) 사람 프로피온산 혈증 (PA) 환자로부터의 iPS 세포의 수립
PA 는 프로피오닐 CoA 카르복실라아제 (propionyl CoA carboxylase：PCCA) 유전자의 이상에 의해 야기되는 상염색체 열성 유전병이다. 예를 들어, PA 에서는, PCCA 의 아미노산 배열에 있어서, 52 번째의 아르기닌이 트립토판으로 치환되어 있다 (Arg52Trp). 이 변이를 갖는 환자로부터 채취한 선유아세포를 이용하여 iPS 세포를 수립하였다. 그리고, 이 iPS 세포로부터, 지금까지 서술한 방법과 동일한 방법으로, 간 세포로 분화 유도할 수 있는 것을 알 수 있었다.
(2) 변이 인간화 간장 마우스 (FAP 및 PA 의 모델 마우스) 의 수립
변이 인간화 간장 마우스의 수립은, 인간화 간장 마우스 (정상인 유래의 iPS 로부터 유도한 간 세포를 이식하여 제조한 마우스) 의 제조 방법과 동일하게, FAP 및 PA 환자 유래의 iPS 세포로부터 분화 유도하여 얻은 간 세포를 본 발명의 마우스에 이식함으로써 수립할 수 있다.
산업상 이용가능성
본 발명에 의해 면역 부전 마우스 유래의 ES 세포가 제공된다. 본 발명의 ES 세포를 이용하여 제조된 배아에 사람 간 세포 이식함으로써, 간장이 인간화된 마우스를 작출할 수 있고, 사람의 간 기능을 조사할 수 있다.
수탁 번호
미생물의 표시：「BRJ8」
수령 번호：NITE ABP-1297
원기탁일 (수령일)：2012년 3월 23일
국제 기탁 당국：독립 행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터
(우) 292-0818 치바현 키사라즈시 카즈사 카마타리 2-5-8 NITE 바이오 테크놀러지 본부 특허 미생물 기탁 센터
배열표 프리 텍스트
배열 번호 1 ∼ 15：합성 DNA
SEQUENCE LISTING
<110> Trans Genic Inc.
Kumamoto University
<120> Humanized mouse
<130> PCT12-0010
<160> 15
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 1
ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 2
taccgttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 3
ataacttcgt atagcataca ttatacgaac ggta 34
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 4
ataacttcgt atagtataca ttatacgaag ttat 34
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 5
ataacttcgt ataggatact ttatacgaag ttat 34
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 6
tcaatttctg agaactgtca ttctcggaaa ttga 34
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 7
cgtgattctg agaactgtca ttctcggaaa ttga 34
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 8
tcaatttctg agaactgtca ttctcggaat acct 34
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 9
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<213> Artificial
<220>
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<400> 10
taactttaaa taatgccaat tatttaaagt ta 32
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 11
taactttaaa taattggcat tatttaaagt ta 32
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 12
ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttat 34
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 13
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Claims (16)
- Rag2 유전자 및 Jak3 유전자가 함께 결손된 면역 부전 마우스의 배아를 GSK3 저해제 및 MEK 저해제의 존재하에서 배양하여 얻어지는 배성 줄기 세포로서, 간세포 특이적 프로모터(SAP)의 조절하에서 발현하는 에스트로겐 수용체 유전자와 CAG 프로모터의 조절하에서 발현하는 디프테리아톡신 유전자가 도입된 배성 줄기 세포.
- 제 1 항에 있어서,
수탁 번호가 NITE BP-1297 로 나타내어지는 배성 줄기 세포. - 삭제
- 제 1 항에 있어서,
Cre-loxP 시스템을 이용하여 세포 중에 내재하는 성장 호르몬 유전자가 사람 유래의 것으로 치환된 배성 줄기 세포. - 제 4 항에 있어서,
또한, 세포 중에 내재하는 약물 대사 효소 유전자가 사람 유래의 것으로 치환된 배성 줄기 세포로서, 세포 중에 내재하는 약물 대사 효소 유전자가 Cyp3a11, Cyp3a13, Cyp3a25 및 Cyp3a41 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나인 배성 줄기 세포. - 삭제
- 제 1 항, 제 2 항, 제 4 항 및 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 배성 줄기 세포를 이용하여 작출된 트랜스제닉 마우스.
- 제 7 항에 있어서,
항에스트로겐제의 투여에 의해 간 세포 장애를 일으키는 마우스. - 제 7 항에 기재된 마우스에 사람 유래 간 세포를 이식함과 함께, 항에스트로겐제를 투여하여 당해 마우스 유래 간 세포를 제거한 것을 특징으로 하는 간장이 인간화된 마우스.
- 제 9 항에 있어서,
사람 유래 간 세포가 간장 질환을 갖는 환자 유래의 것인 마우스. - 제 10 항에 기재된 마우스로 이루어지는 사람 간장 질환 모델 마우스.
- Rag2 유전자 및 Jak3 유전자가 함께 결손된 면역 부전 마우스의 배아를, GSK3 저해제 및 MEK 저해제의 존재하에서 배양함과 함께, 간세포 특이적 프로모터(SAP)의 조절하에서 발현하는 에스트로겐 수용체 유전자와 CAG 프로모터의 조절하에서 발현하는 디프테리아톡신 유전자를 도입하는 것을 특징으로 하는 면역 부전 마우스 유래의 배성 줄기 세포의 제조 방법.
- 제 7 항에 기재된 마우스에 항에스트로겐제를 투여하는 것을 특징으로 하는 간장 장애 모델 마우스의 작출 방법.
- 제 7 항에 기재된 마우스에 사람 유래 간 세포를 이식함과 함께, 항에스트로겐제를 투여하여 마우스 유래 간 세포를 제거하는 것을 특징으로 하는 간장이 인간화된 마우스의 작출 방법.
- 제 14 항에 있어서,
사람 유래 간 세포가 간장 질환을 갖는 환자 유래의 것인 방법. - 삭제
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