KR101703555B1

KR101703555B1 - 사람 또는 동물 체표면 감염의 치료

Info

Publication number: KR101703555B1
Application number: KR1020117025908A
Authority: KR
Inventors: 파울 데이비스; 앤드류 오스틴
Original assignee: 인센스 리미티드
Priority date: 2009-05-01
Filing date: 2010-04-30
Publication date: 2017-02-07
Also published as: CN102405065A; EP2424578B1; BR122016023717B1; ES2586851T3; DK2424578T3; EP2424578A2; WO2010125398A3; AU2010243349A1; KR20160110561A; BRPI1009976B1; CA2758471C; CA2758471A1; US8815234B2; RU2011148938A; WO2010125398A2; RU2527341C2; GB0907553D0; BRPI1009976A2; KR101723534B1; KR20120013358A

Abstract

본 발명은 수성 액체를 감염된 체표면, 예를 들어 조갑(nail) 부위에 적용한 후 과산화수소 공급원을 포함하는 드레싱을 적용하는 것을 포함하는 사람 또는 동물 체표면 감염, 특히 진균 감염의 치료 방법을 제공한다. 또한, 상기 방법에 사용하기 위한 액체와 드레싱의 조합물이 제공된다.

Description

사람 또는 동물 체표면 감염의 치료{TREATMENT OF HUMAN OR ANIMAL BODY SURFACE INFECTION}

본 발명은 사람 또는 동물 체표면 감염, 특히 사람 조갑(nail) 부위의 진균 감염의 치료에 관한 것이다.

눈으로 봐서 양호한 상태의 건강한 조갑은 사람 외관의 중요하고 높게 평가되는 측면이다. 자주 조갑의 외관, 강도 및 건강은, 전형적으로 트리코피톤(Trychophyton) 속의 병원성 진균 세포의 감염에 의해 악영향을 받을 수 있으며, 감염성 진균의 제거에 의해 이환된 조갑의 외관을 개선하는 치료에 대한 강한 요망이 있다. 시판되고 있는 다수의 치료약이 있기는 하지만, 이용가능한 기술 및 제품에 대한 불만이 널리 퍼져 있다.

전신적으로 전달되는 제제는 혈류를 통하여 조갑 부위에 도달할 수 있지만, 순환으로부터 조갑 부위 내로의 불량한 침투 및 심각한 부작용은 이 접근법의 유용성을 제한한다.

진균에 의해 감염된 조갑은 침입성(invading) 진균의 작용에 의해 흔히 다공성이 되거나 벌어지게 된다. 따라서, 흔히 조갑에는 세균이 동시-정착되며(co-colonised), 이는 추가의 파괴 효소 및 국소적으로 활성인 독소를 방출함으로써 진균의 손상 효과를 악화시킬 수 있다.

진균 조갑 감염이 공지된 치료법에 의해 감소된다 하더라도, 그것은 거의 완전히 제거되지 않으며 통상 치료를 중단하자마자 곧 감염이 재발됨이 잘 인식되어 있다.

본 발명자들은 활성 성분이 조갑을 용이하게 침투하지 못하고, 상부 표면에 적용된 물질이 진균 세포가 비교적 안전하게 정주할 수 있는 하부(underlying) 구조에 거의 도달하지 못함을 발견하였다.

제 1 태양에서, 본 발명은 수성 액체를 감염된 체표면, 예를 들어 조갑 부위에 적용한 후 과산화수소 공급원을 포함하는 드레싱을 적용하는 것을 포함하는 사람 또는 동물 체표면 감염, 예를 들어 진균 감염의 치료 방법에 관한 것이다.

제 2 태양에서, 본 발명은 사람 또는 동물 체표면 감염, 예를 들어 진균 감염, 특히 이로 한정되지는 않지만 사람 또는 동물 조갑 부위의 감염의 치료에 있어서의 수성 액체 및 과산화수소 공급원을 포함하는 드레싱의 조합물에 관한 것이다.

제 3 태양에서, 본 발명은 사람 또는 동물 체표면 감염, 예를 들어 진균 감염, 특히 이로 한정되지는 않지만 사람 또는 동물 조갑 부위의 감염을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의 수성 액체 및 과산화수소 공급원을 포함하는 드레싱의 조합물의 용도에 관한 것이다.

수성 액체를 감염된 체표면에 적용함으로써, 체표면은 부드러워지고 더 다공성으로 된다. 예를 들어, 이는 존재하는 기공을 통하여 액체가 조갑 부위의 내부 안으로 들어갈 수 있게 한다. 따라서, 액체는 체표면, 예를 들어 조갑 부위의 내부로의 수성 유동 경로를 제공한다.

따라서, 이어서 행해지는 과산화수소 공급원을 포함하는 드레싱의 적용은 체표면, 예를 들어 조갑 부위의 안쪽의 덜 접근가능한 부분 안으로 생성된 수성 유동 경로를 따라 과산화수소의 효과적인 확산을 가져와서 과산화수소가 깊게 침투할 수 있게 하며, 이는, 예를 들어 조갑 부위의 모든 구성요소에서의 감염, 예를 들어 진균 감염의 상당한 감소 또는 제거를 가능하게 한다.

조갑은 독특한 해부학 및 조성을 갖는데, 이는 조갑판(nail plate) 및 하부의 조갑상(nail bed)뿐만 아니라 관련 구조를 겨냥한 치료에의 새로운 접근법을 고려할 때 이해되어야 한다. 조갑의 가장 두드러진 부분인 조갑판은 조갑의 기부(base)에서 기질(matrix)로부터 밀어올려진 죽은 각화 세포(각질세포)로부터 형성된 단단한 각질화 구조로 이루어진다. 조갑판의 대부분은 반투명하여 이를 통하여 진피 내의 혈액 공급의 색을 볼 수 있게 하며, 분홍색을 띤 색을 제공한다. 조갑 그 자체는 상대적으로 수분이 없지만, 물에 노출될 때, 그것은 상대적으로 수화될 수 있어서 부드럽고 유연한 상태를 나타낸다.

조갑의 측면에 겹쳐지는 피부의 주름인 조벽(nail wall)은 조갑판을 제자리에 유지시키며 그의 가장자리를 보호한다. 조갑의 유일하게 살아있는 재생되는 부분은 큐티클의 바로 아래에 위치한 조갑 기질이다. 새로운 세포가 이 지점에서 형성되고, 그것이 성숙함에 따라 연속해서 앞으로 나아가서 조갑판을 생성한다. 기질에는 또한 신경뿐만 아니라 풍부한 혈관이 공급되어 세포에 영양분 및 산소를 제공한다.

조갑판은 기질과 연속된 조갑상에 얹혀 있다. 조갑상에도 또한 혈관 및 신경이 풍부하게 공급된다. 조갑상의 표면은 수많은 평행한 능선(ridge)으로 형성되며, 이들 리지는 조갑판의 하면 상의 리지들과 정확하게 들어맞는다. 큐티클은 조갑에 겹쳐지는 피부 표피 부분이다. 큐티클은 침입성 세균 및 물리적 손상으로부터 기질을 보호한다.

진균 세포는 이들 구조의 임의의 부분에 정주하고 성장할 수 있으며, 어떠한 치료에 있어서도 임의의 잔류하는 감염 병소(focus)를 제거하기 위해서뿐만 아니라 조갑판의 주요 부위에서의 감염을 제거하기 위하여 모든 부위를 침투하는 것이 중요하다.

용어 "조갑 부위"는 본 명세서에서 조갑판, 조갑상, 조갑 기질, 조벽 및 큐티클을 포함하는 것으로 정의된다.

본 발명은 또한 본 명세서에 정의된 수성 액체를 감염된 세포에 적용한 후 본 명세서에 정의된 과산화수소 공급원을 포함하는 드레싱을 적용하는 것을 포함하는, 사람 유두종 바이러스에 감염된 세포의 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 사람 유두종 바이러스에 감염된 세포의 치료에 있어서 본 명세서에 정의된 수성 액체 및 본 명세서에 정의된 과산화수소 공급원을 포함하는 드레싱의 조합물에 관한 것이다.

바람직한 실시 형태에서, 수성 액체는 퍼옥시다아제 효소를 포함한다. 퍼옥시다아제는 체표면, 예를 들어 조갑 부위의 내부 안으로 확산된다.

퍼옥시다아제 효소는, 일단 체표면, 예를 들어 조갑의 안쪽 부위를 침투하면, 과산화수소가 드레싱으로부터 수성 경로를 거쳐 확산될 때까지 본질적으로 불활성인 상태를 유지한다. 퍼옥시다아제의 존재 하에서, 과산화수소의 산화 효과는 향상된다.

따라서, 퍼옥시다아제는 과산화수소의 활성, 특히 항진균 활성을 실질적으로 향상시키는 것으로 밝혀졌는데, 그 이유는 퍼옥시다아제가 진균 세포의 세포막 및/또는 세포질과 접해 있거나 이들 안에 있는 취약하지만 필수적인 진균 분자의 산화를 촉매하기 때문이다.

임의의 적합한 퍼옥시다아제가 이용될 수 있는데, 이에는 락토퍼옥시다아제, 고추냉이 퍼옥시다아제, 요오다이드 퍼옥시다아제, 클로라이드 퍼옥시다아제 및 미엘로퍼옥시다아제가 포함된다. 그러나, 락토퍼옥시다아제 및 고추냉이 퍼옥시다아제가 현재 바람직하다.

수성 액체 중의 퍼옥시다아제 효소의 농도는 바람직하게 1 내지 1000 ㎍/ml, 바람직하게는 50 내지 1000 ㎍/ml, 더 바람직하게는 100 내지 500 ㎍/ml의 범위이다.

수성 액체는 또한 바람직하게 계면활성제 및/또는 용매를 포함하는데, 이들은 체표면, 예를 들어 조갑 내로의 액체의 침투를 향상시키는 것으로 밝혀졌다.

드레싱은 바람직하게 수화된 상태인데, 이는 일단 드레싱이 적용되면 과산화수소가 조갑 부위 내로 효과적으로 확산될 수 있도록 하기 위해서이다. 조갑 부위와 드레싱 사이에 액간 접촉(contact liquid junction)을 형성하기 위하여 드레싱에는 충분한 물을 필요로 한다.

바람직하게 수성 액체의 삼투력(osmotic strength)은 원하는 유체 및 용질 유동을 향상시키기 위하여 드레싱 내의 액체의 것과 동일하거나 유사하다.

드레싱은 바람직하게 사용시 조갑 부위에 물을 제공하는데, 이는 공지된 방법으로 적절한 삼투압 특성을 선택함으로써 달성된다.

드레싱의 재료는 하이드로겔, 스폰지, 발포체 형태 또는 드레싱과 조갑 부위 사이의 제어된 확산 경로를 가능하게 하기에 충분한 물을 유지할 수 있는 친수성 매트릭스의 어떠한 다른 형태일 수 있다. 바람직하게 드레싱은, 예를 들어 수소 결합에 의해 과산화수소의 통과를 조절하는 역할을 할 수 있는 용질을 함유할 것이며, 이는 중합체, 예를 들어 다당류(글리코사미노글리칸을 포함함)의 적절한 농도에 의해 달성될 수 있다.

드레싱은 습윤 면 드레싱(moist cotton dressing)을 포함할 수 있거나, 습윤 성분을 갖는 구조용 심지 물질(structural wick material)을 포함할 수 있다. 그러나 바람직하게 드레싱은 하나 이상의 수계 또는 수성 겔(수화된 하이드로겔으로도 지칭됨)을 포함한다. 그러한 겔은 하기에 논의되는 바와 같이 다양한 물질로 형성될 수 있고 다양한 시약을 함유할 수 있다.

전형적으로, 드레싱은 시트, 층 또는 필름의 형태일 것이다. 대안적으로 드레싱은 무정형 겔 또는 로션, 바람직하게는 하이드로겔의 형태일 수 있는데, 이들 형태는 노즐을 통하여 짜내어지는 것을 포함하여 3차원으로 변형되고 형상화될 수 있는 고정된 형태 또는 형상을 갖지 않는다. 무정형 겔은 전형적으로 가교결합되지 않거나 낮은 수준의 가교결합을 갖는다. 전단-박화(shear-thinning) 무정형 겔이 사용될 수 있다. 그러한 겔은 전단 응력이 가해질 때에는 (예를 들어, 노즐을 통하여 주입되어나 짜내어질 때에는) 액체이지만 정적 상태일 때에는 응고된다.

적합한 수화된 하이드로겔이 국제특허 출원 WO 제03/090800호에 개시되어 있다. 수화된 하이드로겔은 편리하게 친수성 중합체 물질을 포함한다. 적합한 친수성 중합체 물질에는 폴리아크릴레이트 및 메타크릴레이트(예를 들어, 시트 하이드로겔 형태로 First Water Ltd에 의해 공급됨, 폴리 2-아크릴아미도-2-메틸프로판 설폰산(폴리AMPS) 또는 이의 염(예를 들어, 국제특허 출원 WO 제01/96422호에 기재됨)을 포함함), 다당류(예를 들어, 다당류 검, 특히 잔탄 검(예를 들어, 상표명 Keltrol으로 입수가능함)), 각종 당류, 폴리카르복실산(예를 들어, ISP Europe으로부터 상표명 Gantrez AN-169 BF로 입수가능함), 폴리(메틸 비닐 에테르 코-말레산 무수물) (예를 들어, 상표명 Gantrez AN 139로 입수가능함, 분자량이 20,000 내지 40,000의 범위임), 폴리비닐 피롤리돈(예를 들어, PVP K-30 및 PVP K-90으로서 알려진 구매가능한 등급의 형태임), 폴리에틸렌 옥사이드(예를 들어, 상표명 Polyox WSR-301로 입수가능함), 폴리비닐 알코올(예를 들어, 상표명 Elvanol로 입수가능함), 가교결합된 폴리아크릴 중합체(예를 들어, 상표명 Carbopol EZ-1로 입수가능함), 셀룰로오스 및 개질된 셀룰로오스(하이드록시프로필 셀룰로오스(예를 들어, 상표명 Klucel EEF로 입수가능함), 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스(예를 들어, 상표명 Cellulose Gum 7LF로 입수가능함) 및 하이드록시에틸 셀룰로오스(예를 들어, 상표명 Natrosol 250 LR로 입수가능함)를 포함함)가 포함된다.

친수성 중합체 물질의 혼합물이 겔에 사용될 수 있다.

친수성 중합체 물질의 수화된 하이드로겔에서, 친수성 중합체 물질은 바람직하게 겔의 총 중량을 기준으로 적어도 0.1 중량%, 바람직하게는 적어도 0.5 중량%, 바람직하게는 적어도 1 중량%, 바람직하게는 적어도 2 중량%, 더 바람직하게는 적어도 5 중량%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 10 중량%, 또는 적어도 20 중량%, 바람직하게는 적어도 25 중량%, 그리고 더욱 더 바람직하게는 적어도 30 중량%의 농도로 존재한다. 심지어 겔의 총 중량을 기준으로 최대 약 40 중량%까지 더 높은 양이 사용될 수 있다.

바람직한 수화된 하이드로겔은 폴리 2-아클리아미도-2-메틸프로판 설폰산(폴리 AMPS) 또는 그의 염을, 바람직하게는 겔의 총 중량의 약 20 중량%의 양으로 포함한다.

과산화수소 공급원은 과산화수소 그 자체를 포함할 수 있거나, 다른 실체(entity)와 조합되거나 복합된 과산화수소를 포함할 수 있다. 대안적으로, 과산화수소 공급원은 과산화수소 생성 수단일 수 있다.

바람직한 실시 형태에서, 과산화수소 공급원은 옥시도리덕타아제 효소, 산소 공급원 및 상기 효소를 위한 기질 공급원을 포함하는 과산화수소 생성 수단이다. 옥시도리덕타아제 효소는 적절한 기질과 산소의 반응을 촉매하여 과산화수소를 생성한다.

본 발명에서 사용하기에 적합한 옥시도리덕타아제 효소 및 상응하는 기질(이는 혈액 및 조직 유체에 존재한다)에는 하기가 포함된다:

효소 기질

글루코오스 옥시다아제 β-D 글루오코스

헥소오스 옥시다아제 헥소오스

콜레스테롤 옥시다아제 콜레스테롤

갈락토오스 옥시다아제 D-갈락토오스

피라노오스 옥시다아제 피라노오스

콜린 옥시다아제 콜린

피루베이트 옥시다아제 피루베이트

글리콜레이트 옥시다아제 글리콜레이트

아미노산 옥시다아제 아미노산

현재 바람직한 옥시도리덕타아제 효소는 글루코오스 옥시다아제이다. 이것은 β-D 글루코오스 기질의 반응을 촉매하여 과산화수소 및 글루콘산을 생성한다.

옥시도리덕타아제 효소의 혼합물이 사용될 수 있다.

옥시도리덕타아제 효소 및 글루코오스는 선택적으로 산소 공급원과 함께 친밀하게 블렌딩될 수 있다. 산소는 임의의 편리한 산소 공여체에 의해 제공될 수 있지만, 편리한 공급원은 대기 중 산소이다.

산소 공급원이 대기 중 산소일 때, 드레싱은 바람직하게 별개의 제 1 층 및 제 2 층을 포함한다. 제 1 층은 옥시도리덕타아제 효소를 포함하고, 사용시 드레싱의 외측부 부근에, 즉 조갑 부위로부터 멀리 위치하며, 여기서 대기 중 산소 수준이 최고이다. 제 2 층은 기질 공급원을 포함하고, 드레싱의 내측부 부근에, 즉 조갑 부위에 인접하여 위치하며, 따라서 생성된 과산화수소가 조갑 부위로 직접 들어갈 수 있게 한다.

층상 실시 형태의 바람직한 형태는 제 1 층 및 제 2 층 둘 모두 가교결합된 수화된 하이드로겔을 포함하는 경우이다. 하이드로겔은 면 거즈 시트 또는 불활성 가요성 메시와 같은 기계적 보강 구조 둘레에 캐스팅되어 구조적으로 보강된 하이드로겔 층 또는 슬래브를 제공할 수 있다.

대안적으로, 제 1 효소-함유 층은 건조된 상태일 수 있지만, 사용 중에 제 2 층과의 유체 연통(fluid communication) 상태로 놓여져 제 1 층 내로 물이 이동하게 되어 효소를 수화시킬 수 있다.

층상 실시 형태에서, 제 1 층은 상대적으로 얇아서, 즉 0.01 내지 2.0mm이고, 제 2 층은 상대적으로 두꺼워서, 즉 0.5 내지 5.0mm인 것이 바람직하다. 제 1 층이 수화된 하이드로겔이라면, 그것은 바람직하게 0.1 내지 2.0mm 두께이다. 제 1 층이 건조 필름이라면, 그것은 바람직하게 0.01 내지 0.1mm 두께이다.

제 1 층의 두께 대 제2 층의 두께의 비는 바람직하게 1:2 내지 1:200, 바람직하게는 1:5 내지 1:50, 더 바람직하게는 1:5 내지 1:20이다.

옥시도리덕타아제 효소는 편리하게 그것이 제2 층을 향해 이동하는 것을 막도록 고정될 수 있다.

기질, 예를 들어 글루코오스는 서서히 용해하는 고형물로서 존재하는 수화된 하이드로겔 구조물 내에 용해된 형태, 또는 느린 방출을 위한 다른 구조물 내에 캡슐화된 형태를 포함하여 다양한 형태로 존재할 수 있다.

과잉의 기질을 갖도록 드레싱을 배열하는 것이 바람직하며, 따라서 드레싱은 사용시 장시간의 기간, 예를 들어 적어도 1시간, 예를 들어 1 내지 10시간 이상에 걸쳐 과산화수소를 생성하도록 기능할 수 있다.

본 발명에 따른 조합물은 전형적으로 상기에 기재된 수성 용액 및 과산화수소 공급원을 포함하는 드레싱의 조합물을 포함하는 패키징된 키트이다.

이들 구성요소는 전형적으로 밀봉된 불투수성 패키지 내에 있다.

이제 본 발명을 하기 도면을 참고하여 예로서 설명할 것이다.

도 1은 과산화수소 생성을 보여주는 측정된 전류 대 시간을 나타낸 도표이다.

도 2a는 진균 T. 루브룸(T. rubrum)의 사멸 곡선을 나타낸 도표이다.

도 2b는 진균 T. 루브룸의 사멸 곡선을 나타낸 다른 도표이다.

[실시예]

실험 요약

시험 디스크를 10⁷개의 진균 세포를 함유하는 50% 혈청에 담가서 고단백 환경을 재생성하였다. 이들 시험 디스크를 50% 혈청을 또한 함유하는 겔 베드 위에 올려놓아서 조갑상과의 접촉을 모방하였다. 디스크에 고추냉이 퍼옥시다아제 또는 락토퍼옥시다아제의 수성 용액을 투여하였으며, 이들 각 세트의 디스크는 상이한 용량 수준의 효소를 갖는다. 대조 디스크를 어떠한 종류의 퍼옥시다아제도 사용하지 않고서 남겨두었다. 이 실험은 과산화수소 발생 중층 패치(하기 참조)를 대부분의 시험 디스크의 표면에 적용함으로써 시작하였으며, 이들을 한정된 시간 기간 동안 그대로 두었다. 일부 디스크는 추가의 실험 대조로서 덮지 않은 상태로 남겨두어, 미처리 상태로 남겨둘 때 얼마나 잘 진균 세포가 생존하는지를 측정하였다. 설정된 시간 간격으로, 샘플링을 위하여 대표적인 디스크를 내보냈으며, 생존한 진균 세포의 수를 표준 방법에 의해 측정하였다. 이들 실험은 수 시간 동안 그대로 둔다면, 중층 겔 패치에 의해 전달된 과산화수소가 진균 세포를 사멸시킬 수 있음을 보여주었다. 그러나, 진균 사멸 속도는 진균과 접촉된 퍼옥시다아제 효소의 추가의 존재에 의해 크게 향상되었다. 효소 고추냉이 퍼옥시다아제가 락토퍼옥시다아제보다 더 강력하였으며, 그 효과는 일반적으로 용량과 함께 증가하였다.

실시예 1: 과산화수소 생성의 관점에서 과산화수소 제공 중층 패치의 구성 및 평가

전기화학(슬로우 크로노(slow chrono) 기술)을 사용하여 과산화수소(H₂O₂) 생성을 측정하였다. 드레싱을 주문제작(bespoke) 센서 위에 올려놓고, 전극을 가로질러 퍼텐셜을 인가하고, H₂O₂의 존재를 측정하였다.

드레싱은 2개의 층으로 구성되었다: (i) 수화된 하이드로겔 층 및 (ii) 글루코오스 옥시다아제를 함유하는 건조 필름 활성화 층.

층 1의 제조: 하이드로겔 시트를 다음과 같이 제조하였다:

20% 나트륨 2-아크릴아미도-2-메틸프로판설폰산(Lubrizol Corporation, 50% 수성 스톡 용액), 10% 글루코오스(Fisher Scientific, 분석용 등급), 0.1% 락트산아연(Aldrich)의 수성 용액을 제조하였다. Peg 700 디아크릴레이트(Aldrich)를 가교결합제로서, 그리고 2-하이드록시-2-메틸 프로피오페논(Aldrich)을 광개시제로서 포함시켰다. 6.5g 및 13g의 용액을 10 x 10cm 페트리 디쉬 내로 분배하고, 20초 동안 100mW/cm² UV 광을 가하였다.

층 2의 제조: 건조 필름을 다음과 같이 제조하였다:

25% w/w PVA(Gohsenol 폴리비닐 알코올, 코드 EG05P, Nippon Gohsei에 의해 공급됨) 용액의 수성 용액을 제조하였다. 추가적으로, 40.3mg의 글루코오스 옥시다아제(Biocatalysts, 150,000 unit/g) + 300mg의 히스티딘(Sigma) + 150mg의 시트르산(Fisher, 분석용 등급) + 75mg의 요오드화칼륨(Sigma)을 2ml의 분석용 등급의 물(Fisher)에 용해시켰다. 30 g의 25% PVA 용액을 글루코오스 옥시다아제/히스티딘/시트르산/요오드화칼륨 용액과 혼합하고 침강하게 두어서 임의의 포집된 공기 기포를 제거하였다. 이어서, 혼합물을 50℃에서 건조시켜 40 내지 45마이크로미터 두께의 건조 필름을 생성하였다.

전기화학적 분석:

주문제작 3 전극 센서(작업, 상대 및 기준)를 분석에 사용하였다. Ezescan 계기 장비 및 소프트웨어를 영국 루턴 소재의 Whistonbrook Technologies로부터 구매하였다. 이들 전극을 Teflon 박스 내에 장착하고 25℃ 인큐베이터 내에 넣었다. 사용시, 20㎕의 0.1M KCl 용액을 센서의 전극 단부에 적용하였다. 층 1 하이드로겔 시트(6.5g 및 13g의 캐스트 중량)의 1.5 x 2cm 섹션을 잘라내고 KCl 용액 위에 올려놓아서 전극과의 균등한 접촉을 확보하고 겔과 센서 사이에 공기 기포가 포집되지 않도록 하였다. 겔을 덮어서 증발을 감소시켰다.

전극을 가로질러 +950mV의 퍼텐셜을 인가하였으며, 발생된 전류를 기록하였다. 정상(steady) 기준선 전류를 얻었을 때, 건조 필름의 1.5 x 2cm의 섹션을 층 1 하이드로겔 시트의 표면에 적용하였다. 발생된 전류를 기록하였다. 도 1을 참조한다.

도 1은 +950mV의 퍼텐셜이 센서에 접한 층 1 하이드로겔 시트에 인가되었을 때, 측정가능한 배경 전류가 거의 없으며, 따라서 이 소정의 퍼텐셜에서 하이드로겔의 제조에 사용된 물질로부터의 방해가 거의 없음을 입증한다. 건조 효소 필름의 적용(그래프 상의 약 4000초에서임) 후, 글루코오스 옥시다아제 화학이 활성화되고 H₂O₂가 생성되며, 이것은 층 1 하이드로겔을 통하여 전극으로 빠르게 확산되고, 여기서 전류의 유의한 상승이 측정된다. 이는 이중층 시스템이 이중층 시스템 내에서 H₂O₂를 생성하고 그것을 접촉 표면으로 전달함을 명백하게 보여준다. 도표의 주요 고원(plateau)(5,000초와 13,000초 사이)과 관련하여 발생된 전류는 일반적으로 약 0.1% H₂O₂ (aq)와 같다. 추가적으로, 층 1 하이드로겔의 상이한 두께는, 더 얇은 겔(6.5g 겔/10 x 10cm 면적)이 인가 시간(활성화 후 약 3000초)에 유의하게 더 높은 피크 전류(따라서 H₂O₂의 농도)를 제공한 것을 제외하고는, 매우 유사한 곡선을 생성하였다. 이어서, H₂O₂ 측정치는 곡선이 활성화 후 약 40,000초(약 11시간)에서 평탄한 반응으로 되돌아올 때까지 점차로 하강한다.

실시예 2: 수성 용액으로서 퍼옥시다아제 함유 프라이머 샘플의 제조

퍼옥시다아제를 위한 적합한 염기성 담체를 다음과 같이 제조하였다: 50mM 인산나트륨 완충액(pH 6 내지 6.5)을 0.2% w/w Tween 20(Sigma) 계면활성제와 혼합하였다. 여기에 퍼옥시다아제 효소를 용해시켜 100㎍/ml의 최종 농도를 생성하였다.

담체 제형을 변경하여 필요에 따라 상이한 특성을 제공할 수 있다. 예를 들어, 완충염의 농도 및 유형을 변경하여, 일정 범위의 완충 한계를 제공할 수 있고 사용되는 효소(예를 들어, 퍼옥시다아제)의 최적 pH 및 적용에 따라 용액의 pH를 변경할 수 있으며; 계면활성제의 농도 및 유형을 변경하여 상이한 습윤 특성을 제공할 수 있고; 추가의 중합체성 증점제를 포함시켜 (예를 들어, 일단 적용되면 조갑에서 용액이 흘러나가는 것을 막는 것을 돕기 위하여) 유체의 유동 특성을 감소시킬 수 있으며; 사용되는 효소의 수준을 또한 변경하여 처리된 구조물 상이나 내에서의 더 강하거나 감소된 퍼옥시다아제 매개 작용을 가능하게 한다. 드레싱의 효능을 개선하기 위하여 추가의 첨가제, 예를 들어 항미생물제가 또한 혼입될 수 있다.

실시예 3: 모델 시스템에서 트리코피톤 루브룸(Trichophyton rubrum)에 대한 본 발명의 항진균 처리 시스템의 시험

문헌["In vitro diffusion bed, 3-day repeat challenge 'capacity' test for antimicrobial wound dressings", J. Greenman, R. M. S. Thorn, S. Saad, A. Austin International Wound Journal (2006), 3, 322-329]에 설명된 기술에 기초하여 시험관내(in vitro) 평대 정적 확산 모델(flat bed static diffusion model)을 이용하였다.

사부로(Saboraud) 액체 매질 내의 감자 덱스트로오스 한천 상에서 트리코피톤 루브룸의 성숙 표면 성장 바이오매스를 유화시키고, 현탁액을 제거하며, 보텍스(vortex) 혼합하고, 이어서 큰 입자를 용액으로부터 침강시킴으로써 시험 접종물을 제조하였다. 생성된 현탁액을 분광광도법으로 조정하여 10⁷cfu ml^-1의 표준화된 접종물을 생성하였는데, 이는 임의의 살진균 효과가 검출될 수 있게 하기에 충분히 고밀도이다(10³cfu 초과의 감소가 살균 효과의 지표로서 간주된다).

규정된 접종물 100㎕ 부피를 폴리-AMPS 시험대(이의 제형은 25g 겔 시트/10 x 10cm 디쉬를 제외하고는, 실시예 1에 기재된 층 1 하이드로겔과 동일하다)의 표면 상의 복제 셀룰로오스 디스크에 재현탁시키고, 이어서 시험 생성물을 적용하였다(도 1). 2층 드레싱을 시험하였다. 이들 층은 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 사용 전에 필요한 농도로 분석용 물에 용해시킴으로써 락토퍼옥시다아제 또는 고추냉이 퍼옥시다아제 효소를 제조하였다. 락토퍼옥시다아제는 신규한 국소 처리의 임의의 항진균 효과를 증강시킬 수 있는 것으로 생각되며, 일부의 실험 시스템에 있어서, 셀룰로오스 디스크를 락토퍼옥시다아제 또는 고추냉이 퍼옥시다아제 용액으로 사전처리하여 차별적 효과를 확인하였다. 제안된 실험적인 시험 및 대조 조건의 범위가 표 1에 나타나 있다.

2개의 층을 접촉시킴으로써 2층 드레싱을 활성화하였다. 하이드로겔 시트를 셀룰로오스 디스크와 접촉된 상태로 놓고, 이어서 건조 필름을 하이드로겔 시트의 최상 표면에 적용하였다. 시험대를 28℃에서, 그리고 설정된 시간 간격(0, 1, 2, 4 및 24시간)으로 인큐베이션하였으며; 셀룰로오스 디스크를 꺼내고, PBS에 재현탁시키며, 연속적으로(serially) 희석하고, 이어서 사보로 덱스트로오스 한천 상에 나선 플레이팅(spiral plating)하였다. 인큐베이션(5일) 후, 처리 노출 후 상이한 시점에서의 피부사상균 생존수를 콜로니 계수(cfu disc^-1)로 측정하였다. 그 결과를 GraphPad Prism(v.4)을 사용하여 그래프로 나타내고 분석하였다.

결과

실험 결과가 도 2에 나타나 있으며, 모든 시험 조건이 유의한 항미생물 효과를 이끌어냈고, 처리 노출 후 3시간까지 임의의 국소 처리 아래에서 생존 세포가 검출될 수 없었음이 명확하다. 디스크 내의 락토퍼옥시다아제는 농도 의존적으로 국소 처리의 효과를 증강시키는 것으로 나타나지만, 1㎍ ml^- ¹는 시험 처리 단독과 비교하여 유의한 효과가 없었다(도 2a). 디스크 내의 고추냉이 퍼옥시다아제 또한 농도 의존적으로 국소 처리의 효과를 증강시키는데, 여기서는 심지어 최저 농도(1㎍ ml^-1)조차도 유의한 효과를 갖는다(도 2b). 대조 샘플 내에서는 T. 루브룸 세포수에 있어서 약간의 하강이 있었으며, 이 유기체가 특히 24시간 인큐베이션 후 진균 시험대 검정 플레이트 상에 그다지 잘 지지되지 못함을 보여주지만; 모든 시험 처리는 대조와 비교하여 유의한 효과를 보여주었다. 흥미롭게도, 24시간째에 불활성 처리 대조가 덮지 않은 대조와 비교하여 유기체에 약간의 보호를 제공하고 있는 것으로 나타난다.

결론

이들 결과로부터 국소 처리 단독은 T. 루브룸에 대하여 유의한 항미생물 효과를 가지며, 3시간 이내에 이 시스템에 대한 최소 검출점(2 x 10² 세포수) 아래로까지 생존 세포수를 감소시키는데, 이는 살진균 효과(3배 초과의 log 감소)의 지표이다. 락토퍼옥시다아제 및 고추냉이 퍼옥시다아제 둘 모두 국소 처리의 효과를 증강시키지만, 고추냉이 퍼옥시다아제가 더 효과적임이 명백하다.

다양한 신규한 처리의 항진균 잠재성을 측정하기 위한 실험적인 시험 및 대조 조건

대조 1	덮지 않은 디스크
대조 2	불활성 국소 처리
시험 1	활성 국소 처리
시험 2	활성 국소 처리 + 디스크 내의 1㎍/ml의 락토퍼옥시다아제
시험 3	활성 국소 처리 + 디스크 내의 100㎍/ml의 락토퍼옥시다아제
시험 4	활성 국소 처리 + 디스크 내의 500㎍/ml의 락토퍼옥시다아제
시험 5	활성 국소 처리 + 디스크 내의 1㎍/ml의 고추냉이 퍼옥시다아제
시험 6	활성 국소 처리 + 디스크 내의 100㎍/ml의 고추냉이 퍼옥시다아제
시험 7	활성 국소 처리 + 디스크 내의 500㎍/ml의 고추냉이 퍼옥시다아제

Claims

사람 또는 동물 체표면 진균 감염을 치료하기 위한 조합물로서,
사람 또는 동물 체표면 진균 감염을 부드럽게 하기 위한 수성 액체 및 상기 체표면에 후속적으로 적용하기 위한 과산화수소 공급원을 포함하는 드레싱의 조합물.
삭제
제1항에 있어서, 체표면은 조갑 부위인, 조합물.
제1항에 있어서, 수성 액체는 퍼옥시다아제 효소를 포함하는, 조합물.
제4항에 있어서, 퍼옥시다아제는 락토퍼옥시다아제, 고추냉이 퍼옥시다아제 또는 이의 혼합물을 포함하는, 조합물.
제4항 또는 제5항에 있어서, 수성 액체 중의 퍼옥시다아제 효소의 농도는 1 내지 1000㎍/ml의 범위인, 조합물.
제1항에 있어서, 수성 액체는 계면활성제 및/또는 용매를 포함하는, 조합물.
제1항에 있어서, 드레싱이 물을 추가로 포함하는, 조합물.
제1항에 있어서, 드레싱은 수화된 하이드로겔 물질을 포함하는, 조합물.
제1항에 있어서, 과산화수소 공급원은 옥시도리덕타아제 효소, 산소 공급원 및 상기 효소에 대한 기질 공급원을 포함하는 과산화수소 생성 수단인, 조합물.
제10항에 있어서, 옥시도리덕타아제 효소는 글루코오스 옥시다아제를 포함하는, 조합물.
제10항 또는 제11항에 있어서, 드레싱은 별개의 제 1 층 및 제 2 층을 포함하며, 상기 제 1 층은 옥시도리덕타아제 효소를 포함하고 드레싱의 외측부에 위치하며, 상기 제 2 층은 기질 공급원을 포함하고 드레싱의 내측부에 위치한, 조합물.
수성 액체를 감염된 체표면에 적용한 후 과산화수소 공급원을 포함하는 드레싱을 적용하는 것을 포함하는 사람이 아닌 동물 체표면 진균 감염의 치료방법.
삭제
제13항에 있어서, 체표면은 조갑 부위인, 치료방법.
제13항에 있어서, 수성 액체는 퍼옥시다아제 효소를 포함하는, 치료방법.
제16항에 있어서, 퍼옥시다아제는 락토퍼옥시다아제, 고추냉이 퍼옥시다아제 또는 이의 혼합물을 포함하는, 치료방법.
제16항 또는 제17항에 있어서, 수성 액체 중의 퍼옥시다아제 효소의 농도는 1 내지 1000㎍/ml의 범위인, 치료방법.
제13항에 있어서, 수성 액체는 계면활성제 및/또는 용매를 포함하는, 치료방법.
제13항에 있어서, 드레싱은 사용시 조갑(nail) 부위에 물을 제공하는, 치료방법.
제13항에 있어서, 드레싱은 수화된 하이드로겔 물질을 포함하는, 치료방법.
제13항에 있어서, 과산화수소 공급원은 옥시도리덕타아제 효소, 산소 공급원 및 상기 효소에 대한 기질 공급원을 포함하는 과산화수소 생성 수단인, 치료방법.
제22항에 있어서, 옥시도리덕타아제 효소는 글루코오스 옥시다아제를 포함하는, 치료방법.
제22항 또는 제23항에 있어서, 드레싱은 별개의 제 1 층 및 제 2 층을 포함하며, 상기 제 1 층은 옥시도레덕타아제 효소를 포함하고 드레싱의 외측부에 위치하고, 상기 제 2 층은 기질 공급원을 포함하고 드레싱의 내측부에 위치한, 치료방법.