CN114732799B - 一种自供电的无载药抗菌贴片 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物能源转换及医疗抗菌技术领域，特别涉及一种自供电的无载药抗菌贴片，本发明以金属有机框架材料包封的葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶或两种酶的类酶催化剂为阳极催化剂，以过氧化物酶或类过氧化物酶为阴极催化剂，构成完整的由燃料电池组成的无任何药物负载的贴片；阳极以生物体系中的葡萄糖分子为燃料，产生电子和活性氧自由基，阴极接收阳极传递的电子，催化双氧水分解，产生活性氧自由基；贴片可以产生外电场，促进电极捕获细菌；电极产生的活性氧自由基可以杀死细菌，起到抗菌效果；从调控高血糖环境、精确捕获‑杀菌、调控活性氧不可控富集三个方面出发，发挥高效抑菌效果。

Description

一种自供电的无载药抗菌贴片
技术领域
本发明属于生物能源转换及医疗抗菌技术领域，特别涉及一种自供电的无载药抗菌贴片。具体涉及用具有级联催化作用的葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶或类酶催化剂，设计双催化剂修饰的生物阳极，以过氧化物酶或类酶催化剂为阴极催化剂；使用柔性导电材料作为基底电极，所构建的贴片可以改善伤口高糖环境，在产电的同时产生自由基，发挥高效的抗菌作用，有望用于糖尿病人的伤口护理。
背景技术
糖尿病伤口的快速愈合是世界性难题。与正常伤口相比，糖尿病伤口的高血糖环境不但延缓了凝血和新血管形成的过程，同时作为细菌生长的营养物质，导致细菌滋生严重，最终导致伤口愈合周期延长。同时，生物体会对高血糖产生应激反应，产生过多的活性氧，使得自身免疫系统显著降低，这也是导致糖尿病患者伤口愈合缓慢、细菌感染严重的关键因素。因此，长时间的伤口暴露以及高血糖环境导致糖尿病伤口发生严重的细菌感染和扩散，最终致使伤口溃疡甚至截肢。因此，迫切需要开发针对糖尿病人伤口护理的新型抗菌技术。
传统的抗菌策略使用抗生素作为抑菌试剂。然而，抗生素的长时间使用会导致抗生素依赖性和超级耐药菌的产生。更重要的是，糖尿病伤口表面通常会形成致密的细菌生物膜，严重阻碍了抗生素向深层组织的渗透，导致抑菌效果显著下降。针对这个问题，生物酶或具有类酶活性的纳米材料被应用于抑菌治疗。主要利用生物酶或纳米材料催化H2O2分解产生具有强氧化能力的活性氧(ROS)，ROS可以破坏细菌的细胞膜，实现全谱性灭菌。然而，基于催化剂的抗菌贴剂在加速糖尿病伤口愈合方面仍面临三个巨大挑战：(i)伤口处H2O2含量较低，严重限制了抗菌效果；(ii)ROS的扩散距离极短；(iii)高血糖是细菌感染和扩散的根本原因之一，不具备降糖功能的抗菌贴片很难从根本上消除细菌感染的风险。综上，一种先进的糖尿病伤口治疗贴片应同时具有广谱、精准的抗菌作用，以及调节高血糖的功能。
酶生物燃料电池，是以生物分子为燃料，以生物酶或类酶纳米材料为催化剂，在生物体环境直接产生电能的装置。葡萄糖燃料电池(GBFC)则是一类特殊的生物燃料电池。以葡萄糖氧化酶或类葡萄糖氧化酶为阳极催化剂的GBFC可以直接以体液中的葡萄糖和氧气为燃料，催化葡萄糖分解，同时产生大量的H2O2。因此GBFC在产生电能的同时可以降低葡萄糖浓度并产生H2O2，克服伤口处H2O2含量低对基于ROS抑菌策略的限制。但是GBFC在无载药抑菌贴片领域的应用还尚未报导，主要难点在于：如何设计新型生物阳极，使阳极在降血糖的同时可以催化产生的H2O2分解产生抗菌试剂-ROS；如何将GBFC设计为柔性贴片；如何调控H2O2在伤口处的不可控富集，防止其对正常组织和免疫系统的侵害。
发明内容
本发明解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种自供电无载药抗菌贴片。
本发明的技术方案如下：
一种自供电无载药抗菌贴片，包括支撑材料、阳极、阴极和电阻器件；
所述阴极和阳极用电阻器件连接，所述支撑材料负载阳极、阴极和电阻器件；
所述阴极包括负载有功能化碳纳米管薄膜的柔性电极，所述功能化碳纳米管薄膜负载有阴极酶；所述阴极酶为过氧化物酶或过类过氧化物酶催化剂；
所述阳极包括负载有阳极催化剂的柔性电极，所述阳极催化剂是MOF包封两种具有级联作用的生物酶和碳纳米管；所述两种具有级联作用的生物酶为葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶或两种酶的类酶催化剂。
优选地，所述支撑材料为医用胶带，所述电阻器件为1～100kΩ的微型电阻，所述柔性电极为碳布。
优选地，所述阴极的制备方法为：将单壁碳纳米管/金纳米颗粒(SWCNT/AuNPs)复合物粉末与聚四氟乙烯乳液混合，制成SWCNT/AuNPs薄膜，按压在柔性电极上，形成基底电极，将所述过氧化物酶或类过氧化物酶催化剂负载在基底电极上，制得阴极。进一步地，所述聚四氟乙烯乳液质量分数为30％；所述SWCNT/AuNPs复合物粉末与聚四氟乙烯乳液按质量比80:20混合；所述柔性电极上薄膜的质量为10～20mg cm-2；所述过氧化酶或类过氧化物酶催化剂溶液的加入量为50μL，浓度为10～20mg mL-1；所述过氧化物酶或类过氧化物酶催化剂负载在基底电极上的具体步骤为：将基底电极与1mg mL-1EDC/NHS溶液孵育30min，然后将40μL 5～10mg mL-1过氧化物酶或类过氧化物酶催化剂溶液滴加到基底电极表面，4℃条件下孵育过夜。
优选地，所述阳极催化剂的制备方法为：将SWCNT加入聚乙烯吡咯烷酮水溶液中，超声分散后，加入含有3-甲基-1，2，4-三唑、葡萄糖氧化酶或类葡萄糖氧化酶催化剂和辣根过氧化物酶或类辣根过氧化物酶催化剂的混合溶液，搅拌后加入Zn(NO3)2，混合均匀后静置，制得阳极催化剂溶液。进一步地，所述阳极催化剂的具体制备方法为：0.01～0.06g聚乙烯吡咯烷酮溶解在0.5mL二次水中，加入2.00～8.00mg SWCNT，超声分散30min，搅拌2h；后加入0.5mL含有100～200mM 3-甲基-1，2，4-三唑、4～12mg葡萄糖氧化酶或类葡萄糖氧化酶催化剂和1～6mg辣根过氧化物酶或类辣根过氧化物酶催化剂的混合溶液，搅拌30min；然后加入40μL 50～100mM Zn(NO3)2·6H2O，搅拌5min，最后室温静置24h，制得阳极催化剂溶液。
优选地，所述阳极的制备方法为：将阳极催化剂溶液滴加到经过等离子体技术处理的碳布上，干燥后制得阳极。
优选地，所述自供电无载药抗菌贴片表面负载有离子透过性隔膜；与伤口接触部分通过离子透过性隔膜隔开，防止贴片黏附在伤口上。
相对于现有技术，本发明的优点如下，
本发明提出了以GBFC为供电能源设备和杀菌元素的无载药抗菌贴片，在无药物负载和无任何助剂添加的条件下，实现了精准、高效抑菌，同时可高效调控高血糖的病理环境。
本发明以金属有机框架材料(MOF)包封的葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶或两种酶的类酶催化剂为阳极催化剂，以过氧化物酶或类酶为阴极催化剂，分别将阴阳极催化剂修饰在柔性碳布上，构成生物阳极和阴极。用微型电阻连接阴阳极，并将完整的GBFC负载在医疗胶带上，赋予其可穿戴性。
该GBFC贴片阳极在葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶或类酶催化剂的催化作用下，遵循葡萄糖+O2→葡萄糖酸盐+H2O2→ROS的级联反应。阴极在辣根过氧化物酶或类酶催化剂的催化作用下催化H2O2分解产生ROS。因此，该GBFC贴片不仅可以调节高血糖环境，更重要的是，可以利用空气中丰富的O2协同产生足够的H2O2，并进一步催化H2O2分解，原位产生丰富的ROS。阴极则可以协同调控H2O2在伤口处的不可控富集，降低其对正常组织细胞的损伤。
此外，GBFC产生的电场理论上可促进电极捕获带负电的细菌，实现精准杀菌。
本发明提出的自供电的无载药抗菌贴片，从调控高血糖环境、精确捕获-杀菌、调控活性氧不可控富集三个方面出发，发挥高效抑菌效果。
附图说明
图1为本发明设计的基于GBFC的自供电无载药抗菌贴片的结构示意图(a)和工作原理图(b)。
图2为本发明设计得到的SWCNT-MAF-7-GOD-HRP阳极催化剂的扫描电镜图。
图3为本发明设计得到的SWCNT-MAF-7-GOD-HRP阳极和HRP阴极对于葡萄糖氧化(a)和H2O2分解(c)的催化性能的电化学表征图和阳极(b)和阴极(d)在产电的同时产生自由基的荧光光谱分析图。
图4为本发明设计得到的GBFC抗菌贴片在血液环境输出电压的稳定性(a)和荧光方法监测贴片产生自由基的能力(b)。
图5为贴片降低血糖浓度的性能图。
图6为本发明设计得到的抗菌贴片对于E.coli(a)和S.au(b)的抑菌效果。
图7为经抗菌贴片处理的E.coli(a)和S.au(b)的扫描电镜图。
具体实施方式
实施例1：
如图1a所示，本发明设计的自供电无载药抗菌贴片，包括支撑材料(医用胶带)、阳极、阴极和电阻器件；
所述阴极和阳极用电阻器件连接，所述支撑材料负载阳极、阴极和电阻器件；
所述阴极包括负载有功能化碳纳米管薄膜的柔性电极(碳布)，所述功能化碳纳米管薄膜负载有阴极酶；所述阴极酶为过氧化物酶或过类过氧化物酶催化剂；
所述阳极包括负载有阳极催化剂的柔性电极，所述阳极催化剂是MOF包封两种具有级联作用生物酶和碳纳米管；所述两种具有级联作用的生物酶为葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶或两种酶的类酶催化剂。
在柔性碳布材料上负载功能化碳纳米管薄膜作为生物酶的连接剂，阴阳极通过电阻器件连接，贴片与伤口接触部分通过离子透过性隔膜隔开，防止贴片黏附在伤口上。电阻器件为1～100kΩ的微型电阻，典型实施例中，采用2kΩ的微型电阻。
实施例2：
本发明设计的自供电的无载药抗菌贴片体系的构造方法，包括以下步骤：
自供电的无载药抗菌贴片阳极制作：首先我们将葡萄糖氧化酶(GOD)和辣根过氧化物酶(HRP)以及单壁碳纳米管(SWCNT)封装到MAF-7中。0.01～0.06g聚乙烯吡咯烷酮溶解在0.5mL二次水中，加入2.00～8.00mg SWCNT，超声分散30min，搅拌2h。然后加入0.5mL含有100～200mM 3-甲基-1，2，4-三唑、4～12mg葡萄糖氧化酶和1～6mg过氧化物酶的混合溶液，搅拌30min。然后加入40μL 50～100mM Zn(NO3)2·6H2O，搅拌5min，最后室温静置24h。将得到的酶溶液滴加到经过等离子体技术处理的5mm*15mm碳布上，后放置于4℃冰箱干燥，得到SWCNT-MAF-7-GOx/HRP生物阳极。
图2证明本发明所制备的阳极催化剂为微米级球体。采用循环伏安法(CV)测试表征该阳极的电催化性能。图3a证明，添加10mM葡萄糖后，阳极氧化峰电流从0.6mA cm-2增加到1.0mA cm-2，证明阳极对葡萄糖氧化具有较高的催化活性。图3c中，通过荧光光谱分析，检测在对苯二甲酸(TA)存在下，阴极或阳极产生邻羟基对苯二甲酸(HTA)的能力，探究电极产生ROS的能力。HTA在420nm的特征峰随葡萄糖浓度的增加而增强，而在没有葡萄糖的情况下没有检测到420nm处的荧光，证明阳极可以催化葡萄糖分解并产生OH·。
实施例3：
自供电的无载药抗菌贴片阴极制作：首先，将单壁碳纳米管/金纳米颗粒(SWCNT/AuNPs)复合物粉末[合成方法参见Panpan Gai,Rongbin Song,Cheng Zhu,Yusheng Ji,Wengjing Wang,Jian-Rong Zhang and Jun-Jie Zhu,Chemical Communications.,2015,51,16763]与30％聚四氟乙烯乳液按质量比80：20混合，研磨成可以裁剪的薄膜。将其裁剪成所需形状和大小，然后压涂在柔性电极-碳布上，保证电极上SWCNT/AuNPs薄膜的质量为10～20mg cm-2。使用SWCNT/AuNPs复合材料作为基底材料，加速电子转移并为HRP提供固定位点。将负载有SWCNT/AuNPs薄膜的碳布与1mg mL-1EDC/NHS溶液孵育30min，活化AuNPs上的羧基，最后将40μL 5～10mg mL-1HRP溶液滴加到电极表面，置于4℃冰箱孵育过夜，干燥后得到HRP阴极。如图3b所示，H2O2存在时，-0.5V电压下，阴极催化电流从1.3mA cm-2增加到2.8mA cm-2，证明HRP阴极对H2O2的分解具有较高的电催化活性。如图3d所示，在20μA cm-2的电流密度下放电30min，在420nm处观察到了较强的荧光发射峰，证实HRP阴极能够催化H2O2分解，避免其不可控的积累，同时产生抗菌试剂OH·。
实施例4：
GBFC贴片的组装：将5mm*15mm的碳布用高压灭菌锅灭菌后，按照上述阴阳极的制备过程，制备无菌生物阳极和阴极，用2kΩ的微型电阻连接阴极和阳极，用医用透气胶带作为支撑材料，负载阳极、阴极和电阻，组成完整的自供电抗菌贴片。
如图4a所示，在血液中，GBFC贴片可以持续产电，开路电压在36小时内稳定在～0.2V。
本发明的GBFC贴片产生自由基的性能：如图4b所示，在TA存在时，GBFC以20μAcm-2的电流密度放电，我们观察到420nm处的HTA的特征荧光峰随放电时间的增加而增强。证实了GBFC贴片可在产电的同时能产生OH·。
GBFC抗菌贴片的降糖性能：如图5所示，将GBFC的贴片置于细菌培养基中，监测葡萄糖浓度变化。经本发明的GBFC贴片处理的细菌培养基，葡萄糖浓度在25分钟内从10mM急剧下降至～1.1mM，证实了该贴片具有高效降糖作用。
自供电无载药抗菌贴片的杀菌效果：以大肠杆菌(E.coli，革兰氏阴性)和金黄色葡萄糖球菌(S.au，革兰氏阳性)为模型菌，将该贴片与E.coli或S.au孵育，研究该贴剂的杀菌效果。如图6所示，在没有任何处理的情况下，培养基中E.coli或S.au的密度在3小时后略有增加。经GBFC贴片处理后，E.coli和S.au在培养基中的密度分别降低至20％和25％，表明大量细菌被电极捕获。通过用活/死细菌试剂盒染色证明，培养基中残留的细菌活性显著降低，E.coli和S.au的活菌比例分别下降到10％和5％。SEM表征证明，残留E.coli(图7a)和S.au(图7b)细菌的细胞膜都受到严重损伤。由于没有添任何加外源性药物，我们可以得出结论，GBFC的抑菌效果主要由于自供电抗菌贴片可以原位产生抗菌试剂OH·。本发明的自供电的无载药抗菌贴片，从调控高血糖环境、精确捕获-杀菌、调控活性氧不可控富集三个方面出发，发挥了高效的抑菌作用，有望用于治疗糖尿病创伤。
需要说明的是上述实施例仅仅是本发明的较佳实施例，并没有用来限定本发明的保护范围，在上述基础上做出的等同替换或者替代均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种自供电无载药抗菌贴片，其特征在于，包括支撑材料、阳极、阴极和电阻器件；
所述阴极和阳极用电阻器件连接，所述支撑材料负载阳极、阴极和电阻器件；
所述阴极包括负载有功能化碳纳米管薄膜的柔性电极，所述功能化碳纳米管薄膜负载有阴极酶；所述阴极酶为过氧化物酶；
所述阳极包括负载有阳极催化剂的柔性电极，所述阳极催化剂是金属有机框架材料MOF包封两种具有级联作用生物酶和碳纳米管；所述两种具有级联作用的生物酶为葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶。
2.如权利要求1所述的自供电无载药抗菌贴片，其特征在于，所述支撑材料为医用胶带，所述电阻器件为1~100 kΩ的微型电阻，所述柔性电极为碳布。
3.如权利要求1或2所述的自供电无载药抗菌贴片，其特征在于，所述阴极的制备方法为：将单壁碳纳米管/金纳米颗粒SWCNT/AuNPs复合物粉末与聚四氟乙烯乳液混合，制成SWCNT/AuNPs功能化碳纳米管薄膜，按压在柔性电极上，形成基底电极，将所述过氧化物酶负载在基底电极上，制得阴极。
4.如权利要求3所述的自供电无载药抗菌贴片，其特征在于，所述聚四氟乙烯乳液的质量分数为30%；所述SWCNT/AuNPs复合物粉末与聚四氟乙烯乳液按质量比80:20混合。
5.如权利要求3所述的自供电无载药抗菌贴片，其特征在于，所述柔性电极上SWCNT/AuNPs功能化碳纳米管薄膜的质量为10~20 mg cm-2。
6.如权利要求3所述的自供电无载药抗菌贴片，其特征在于，所述过氧化物酶负载在基底电极上的具体步骤为：将基底电极与1 mg mL-1 EDC/NHS溶液孵育30 min，然后将40 μL 5~10 mg mL-1 过氧化物酶溶液滴加到基底电极表面，4℃条件下孵育过夜。
7.如权利要求1或2所述的自供电无载药抗菌贴片，其特征在于，所述阳极催化剂的制备方法为：将SWCNT加入聚乙烯吡咯烷酮水溶液中，超声分散后，加入含有3-甲基-1，2，4-三唑、葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶的混合溶液，搅拌后加入Zn(NO3)2，混合均匀后静置，制得阳极催化剂溶液。
8.如权利要求6所述的自供电无载药抗菌贴片，其特征在于，所述阳极催化剂的具体制备方法为：0.01~0.06 g 聚乙烯吡咯烷酮溶解在0.5 mL二次水中，加入2.00~8.00 mgSWCNT，超声分散30 min，搅拌2 h；后加入0.5 mL含有100~200 mM 3-甲基-1，2，4-三唑、4~12 mg葡萄糖氧化酶和1~6 mg辣根过氧化物酶的混合溶液，搅拌30 min；然后加入40 μL 50~100 mM Zn(NO3)2·6H2O，搅拌5 min，最后室温静置24 h，制得阳极催化剂溶液。
9.如权利要求6所述的自供电无载药抗菌贴片，其特征在于，所述阳极的制备方法为：将阳极催化剂溶液滴加到经过等离子体技术处理的碳布上，干燥后制得阳极。
10.如权利要求1或2所述的自供电无载药抗菌贴片，其特征在于，所述自供电无载药抗菌贴片表面负载有离子透过性隔膜。
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