KR20200011110A - 일체형 생체연료전지 전극, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 세포배양장치 - Google Patents

일체형 생체연료전지 전극, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 세포배양장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 효소적 생체연료전지 전극에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 산화전극 및 환원전극이 단일 기판 상에 형성된 일체형 생체연료전지 전극, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 세포배양장치에 관한 것이다. 본 발명에 따른 일체형 세포배양용 생체연료전지 전극은 간편하게 구부려서 세포배양용기에 삽입하여 사용할 수 있으며, 생체연료전지의 작동원리에 의해 세포가 전기적 자극을 느끼며 증식, 이주, 노화 세포의 재생에 효과를 나타냄으로써, 세포배양에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

일체형 생체연료전지 전극, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 세포배양장치{Enzymatic biofuel cell electrode with one body, preparation method thereof, and cell culture apparatus comprising the same}
본 발명은 효소적 생체연료전지 전극에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 산화전극 및 환원전극이 단일 기판 상에 형성된 일체형 생체연료전지 전극, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 세포배양장치에 관한 것이다.
21세기 생명공학은 인간복지를 목표로 식량, 환경, 건강 문제에 새로운 해결책의 가능성을 제시하고 있으며, 특히 최근 줄기세포의 이용기술은 난치병 치료의 새로운 장으로 떠오르고 있다. 이전까지는 난치병 치료를 위해 장기 이식이나 유전자 치료 등이 제시되었으나, 면역 거부와 공급장기 부족, 유전자에 대한 지식 부족으로 실용화가 미진하였다.
이에 줄기세포 연구에 대한 관심이 고조되어, 증식과 분화를 통해 모든 기관을 형성할 능력을 가진 만능 줄기세포가 대부분의 질병 치료는 물론 장기 훼손을 근원적으로 해결할 수 있는 것으로 인식되었다. 또한, 많은 과학자가 대부분의 장기재생 분야나 난치병이었던 파킨슨병, 각종 암, 당뇨병과 척수손상 등의 치료에 이르기까지 다양하게 줄기세포의 적용 가능성을 제시해왔다.
한편, 상처와 같은 외상의 치유는 세포가 상처 부위로 이동하고 증식함으로써 달성된다. 따라서, 세포의 이동 및 증식을 촉진시킴으로써 상처치유를 촉진할 수 있다.
이와 같이 상처치유를 위한 세포의 이동 및 증식, 원하는 조직으로의 줄기세포의 분화를 통틀어 세포 거동이라하며, 이러한 세포의 거동은 물리적 및/또는 화학적 환경에 의해 영향을 받는다. 이는 세포의 거동이 신호전달체계에 의해 조절되며, 이러한 신호전달 체계는 다양한 물리 화학적 인자에 의해 조절될 수 있기 때문이다.
상기 물리적 인자 중의 하나는 전기자극으로, 이는 골격근의 유지 및 근관 형성에 매우 중요한 요소이며, 운동뉴런으로부터의 전기자극의 부재가 탈신경근위축(denervated muscle atrophy) 등을 유발함이 보고되었다. 관절질환에 저주파를 적용한다던지, 간질환자의 뇌에 직접 전기자극을 가하는 방법 또한 이러한 물리적인 전기자극을 이용한 치료방법의 대표적인 예이다.
따라서, 전기자극은 세포의 이동, 증식을 촉진시킬 수 있으므로 세포 배양에도 사용될 수 있다.
한편, 생체연료전지(biofuel cell, 이하 BFC)는 효소, 살아있는 세포와 같은 생체 촉매를 기반으로 한 연료 전지로서 정의되며, 생물학적 에너지를 전기 에너지로 변환하는 초소형 장치로서, 1911년에 대장균에 의한 유기 화합물의 분해의 관찰에서, 첫번째 BFC가 구성된 이후, 상기 BFC는 효소, 세포 기관 또는 미생물을 이용하여 더욱 치밀한 시스템으로 발전되어 왔으며, 현재는 심박조율기, 신경 자극기, 약물전달 펌프를 비롯한 이식용 바이오메디컬 기기의 전원으로서 각광받고 있다(A Heller, Miniature biofuel cells, Physical Chemistry Chemical Physics 6 (2004) 209, I Ivanov, T Vidakovic-Koch, K Sundmacher, Recent Advances in Enzymatic Fuel Cells: Experiments and Modeling, Energies 3 (2010) 803-846).
본 발명자들은 이전 특허인 대한민국 등록특허 제10-1772727호에서 "효소적 생물연료전지 기반 전기자극에 의한 세포 거동 조절 방법"에서 효소적 생체연료전지를 세포 배양에 사용할 수 있음을 개시하였다.
그러나, 종래의 생체연료전지는 산화전극과 환원전극이 분리되어 제작되었으므로, 이를 세포배양에 사용하기 위해 세포배양용기에 붙여서 사용했는데, 이때, 상기 전극들을 세포배양용기에 붙일 때의 세포 오염에 대한 불안정함과, 전극이 작으므로 핀셋 등을 사용해야 하기 때문에 사용이 불편한 문제점이 있었다.
1. 대한민국 등록특허 제10-1772727호 2. 대한민국 공개특허 제10-2017-0060620호
본 발명은 상기 문제를 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 제1 목적은 산화전극 및 환원전극이 단일 기판 상에 형성된 일체형 생체연료전지 전극을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 제2 목적은 상기 일체형 생체연료전지 전극의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 제3 목적은 상기 일체형 생체연료전지 전극을 포함하는 세포배양장치를 제공하는 것이다.
상기 제1 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
효소적 생체연료전지 전극에 있어서,
플렉시블 기판;
상기 플렉시블 기판 상에 형성된 플렉시블한 전극층;
상기 전극층 상에서 일측 말단에 형성된 산화전극;
상기 전극층 상에서 타측 말단에 형성된 환원전극; 및
상기 전극층 상에서 상기 산화전극과 환원전극 사이에 형성되며, 상기 산화전극과 환원전극을 연결하는 연결부를 포함하는 일체형 생체연료전지 전극을 제공한다.
또한 바람직하게는, 상기 전극층은 카본 블랙, 금, 은, 탄소나노튜브, 그래핀 및 그래파이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 재질 또는 이의 혼합물로 이루어질 수 있다.
또한 바람직하게는, 상기 산화전극은 글루코스 산화효소(glucose oxidase; GOX 또는 GOD), 글루코스 탈수소화효소(glucose dehydrogenase; GDH), 젖산 산화효소(uricase; UOX), 젖산 탈수소화효소(lactate dehydrogenase; LDH), 갈락토오스 산화효소(galactose oxidase; GAOX), 셀로비오스 탈수소화효소(cellobiose dehydrogenase; CDH), 프락토스 탈수소화효소(fructose dehydrogenase), 알콜 탈수소화효소(alcohol dehydrogenase; ADH), 알데하이드 탈수소화효소(aldehyde dehydrogenase; ALDH), 포름산 탈수소화효소(formate dehydrogenase), 옥살산 탈수소화효소(oxalate oxidase), 파이루베이트 탈수소화효소(pyruvate dehydrogenase; PDH) 및 막결합 수소화효소(membrane-bound hydrogenase; MBH)로 구성된 군으로부터 선택되는 산화전극용 효소와, 상기 산화전극용 효소와 반응하는 전자전달 매개체를 포함할 수 있다.
또한 바람직하게는, 상기 환원전극은 빌리루빈 산화효소(bilirubin oxidase; BOD), 라케이즈(Laccase), 퍼록시다이제(horseradish peroxidase; HRP), 카탈라아제(catalase; CAT), 시토크롬 c(cytochrome c; CYCS), 시토크롬 산화효소(cytochrome oxidase; COX), 및 마이크로과산화효소(microperoxidase; MP-11)로 구성된 군으로부터 선택되는 환원전극용 효소와, 상기 환원전극용 효소와 반응하는 전자전달 매개체를 포함할 수 있다.
또한 바람직하게는, 상기 전자전달 매개체의 농도는 0.1~10.0 mg/mL일 수 있다.
또한 바람직하게는, 상기 연결부에는 상기 전극층 상에 절연층이 형성될 수 있다.
또한, 상기 제2 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
플렉시블 기판 상에 전극층을 형성하는 단계;
상기 전극층 상에 일측 말단에, 산화전극용 효소, 상기 산화전극용 효소와 반응하는 전자전달 매개체 및 가교제를 포함하는 로딩 용액을 캐스팅하여 산화전극을 제조하는 단계;
상기 전극층 상에 타측 말단에, 환원전극용 효소, 상기 환원전극용 효소와 반응하는 전자전달 매개체 및 가교제를 포함하는 로딩 용액을 캐스팅하여 환원전극을 제조하는 단계; 및
상기 전극층 상에 상기 산화전극과 환원전극을 연결하는 연결부에 절연층을 형성하는 단계를 포함하는 일체형 생체연료전지 전극의 제조방법을 제공한다.
또한 바람직하게는, 상기 전극층은 카본 블랙, 금, 은, 탄소나노튜브, 그래핀 및 그래파이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 재질 또는 이의 혼합물로 이루어질 수 있다.
또한 바람직하게는, 상기 전극층은 용액공정 또는 증착공정을 이용하여 형성될 수 있다.
또한 바람직하게는, 상기 산화전극용 효소는 글루코스 산화효소(glucose oxidase; GOX 또는 GOD), 글루코스 탈수소화효소(glucose dehydrogenase; GDH), 젖산 산화효소(uricase; UOX), 젖산 탈수소화효소(lactate dehydrogenase; LDH), 갈락토오스 산화효소(galactose oxidase; GAOX), 셀로비오스 탈수소화효소(cellobiose dehydrogenase; CDH), 프락토스 탈수소화효소(fructose dehydrogenase), 알콜 탈수소화효소(alcohol dehydrogenase; ADH), 알데하이드 탈수소화효소(aldehyde dehydrogenase; ALDH), 포름산 탈수소화효소(formate dehydrogenase), 옥살산 탈수소화효소(oxalate oxidase), 파이루베이트 탈수소화효소(pyruvate dehydrogenase; PDH) 및 막결합 수소화효소(membrane-bound hydrogenase; MBH)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
또한 바람직하게는, 상기 환원전극용 효소는 빌리루빈 산화효소(bilirubin oxidase; BOD), 라케이즈(Laccase), 퍼록시다이제(horseradish peroxidase; HRP), 카탈라아제(catalase; CAT), 시토크롬 c(cytochrome c; CYCS), 시토크롬 산화효소(cytochrome oxidase; COX), 및 마이크로과산화효소(microperoxidase; MP-11)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
또한 바람직하게는, 상기 전자전달 매개체의 농도는 0.1~10.0 mg/mL일 수 있다.
또한 바람직하게는, 상기 가교제는 폴리에틸렌글리콜 디글리시딜 에테르(PEGDGE), 폴리(도파민)(PDA), 폴리(비닐피리딘), 폴리(아크릴아미드)(PAA), 폴리(에틸렌 알콜)(PEG), 폴리(에틸렌이민)(PEI), 폴리비닐피롤리돈(PVP) 및 나피온(nafion)으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 상기 제3 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 일체형 생체연료전지 전극을 포함하는 세포배양장치를 제공한다.
또한 바람직하게는, 상기 세포배양장치는
상면이 개방되며, 배양액을 담을 수 있는 외부용기;
상기 외부용기의 상단에 결합되어 미생물이 침투하는 것을 방지하는 용기 커버;
상기 외부용기 내에 삽입된, 연료물질을 포함하는 배양액; 및
상기 외부용기 내에 삽입되되, 상기 배양액에 산화전극 및 환원전극이 접촉하도록 구부려져서 삽입된, 일체형 생체연료전지 전극을 포함할 수 있다.
또한 바람직하게는, 상기 세포배양장치는 생체연료전지의 산화전극에서 연료를 산화시켜 전자를 방출하며, 환원전극에서 전자를 소모하여 전류가 순환하는 과정을 통해 발생된 전기자극으로 세포를 배양시킬 수 있다.
또한 바람직하게는, 상기 전기자극은 절대값이 200 μA/cm2 미만일 수 있다.
또한 바람직하게는, 상기 세포배양장치는 외부 전력공급원을 필요로 하지 않는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 생체연료전지 전극을 세포배양에 최적화하도록 일체형으로 구현하고, 플렉시블한 기판을 사용하므로 세포배양용기 크기에 적합하도록 구부려 삽입이 가능하며, 탈부착이 용이하므로, 미리 세포배양용기에 붙일 필요가 없어, 세포배양용기에 전극을 붙이기 위한 별도의 도구를 사용하지 않아도 되므로 세포 오염의 가능성이 적고, 사용하기 간편하다. 본 발명에 따른 일체형 생체연료전지 전극은 세포배양용기에 간편하게 삽입하여 사용할 수 있으며, 생체연료전지의 작동원리에 의해 세포가 전기적 자극을 느끼며 증식, 이주, 노화 세포의 재생에 효과를 나타냄으로써, 세포배양에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 일체형 생체연료전지 전극의 평면도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 일체형 생체연료전지 전극의 단면도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 일체형 생체연료전지 전극를 세포배양 용기에 삽입하는 모습이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 일체형 생체연료전지 전극을 포함하는 세포배양장치 및 세포배양에 대한 작동 메커니즘을 나타내는 모식도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 일체형 생체연료전지 전극 사용시, 일반 세포 증식에 대한 CCK-8 실험 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 일체형 생체연료전지 전극 사용시, 노화 세포 증식에 대한 CCK-8 실험 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 일체형 생체연료전지 전극 사용시, 세포 독성에 대한 실험 결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 일체형 생체연료전지 전극 사용시, 스크래치 영역에 대한 세포 이주(migration) 영역의 백분율을 나타낸 그래프이다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 각 도면에 제시된 동일한 참조 부호는 동일한 부재를 나타낸다.
아래 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 실시예를 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조 부호를 부여하고, 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서, 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명에서, 용어 '효소적 생체연료전지(enzymatic fuel cell)'는 생체연료의 화학적 에너지를 전기적 에너지로 전환시키는 장치로서, 연료를 산화시키기 위한 촉매로서 효소를 이용하는 특별한 형태의 연료전지이다. 따라서, 종래의 연료전지와는 달리 값비싼 금속촉매를 필요로 하지 않는다.
본 명세서에서 '생체연료전지'는 '효소적 생체연료전지'를 의미하며, 혼용하여 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 일체형 생체연료전지 전극의 평면도이다.
도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 일체형 생체연료전지 전극은 산화전극(1), 환원전극(2), 및 상기 산화전극과 환원전극을 연결하는 연결부(3)로 이루어져 있다.
본 발명의 특징은 생체연료전지 전극에 있어서, 산화전극(1)과 환원전극(2)을 연결하여 일체형으로 제작했다는 점에 있다.
종래의 생체연료전지를 이용한 세포배양은 막대 형태의 산화전극과 환원전극을 분리하여 개별적인 전극 두 개로 사용하였고, 이를 세포배양에 사용하기 위해 세포배양용기에 붙여서 사용했는데, 이때, 상기 전극들을 세포배양용기에 붙일 때의 세포 오염에 대한 불안정함과, 전극이 작으므로 핀셋 등을 사용해야 하기 때문에 사용이 불편한 문제점이 있었다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자는 상기 산화전극(1)과 환원전극(2)을 하나의 플렉시블한 기판의 양 말단에 제작하여, 구부린 형태로 일반 세포배양용기에 삽입하여 사용함으로써, 전극을 별도로 세포배양용기에 붙이지 않아도 되므로 세포 오염의 가능성이 낮으며, 사용이 용이하여 세포배양시에 유용하게 사용될 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 일체형 생체연료전지 전극의 단면도이다.
도 2를 참조하면, 본 발명에 따른 일체형 생체연료전지 전극(10)은
플렉시블 기판(5);
상기 플렉시블 기판 상에 형성된 플렉시블한 전극층(4);
상기 전극층 상에서 일측 말단에 형성된 산화전극(1);
상기 전극층 상에서 타측 말단에 형성된 환원전극(2); 및
상기 전극층 상에서 상기 산화전극과 환원전극 사이에 형성되며, 상기 산화전극과 환원전극을 연결하는 연결부(3)를 포함한다.
본 발명에 따른 일체형 생체연료전지 전극에 있어서, 상기 기판(5)은 용이하게 구부릴 수 있도록 플렉시블 기판을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 플렉시블 기판으로는 OHP 필름 등의 필름류, 실리콘 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 당업계에서 통상적으로 사용되는 플렉시블 기판 재료를 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 일체형 생체연료전지 전극에 있어서, 상기 기판(5) 상에는 전극층(4)이 형성된다.
상기 전극층(4)은 카본 블랙, 금, 은, 탄소나노튜브, 그래핀 및 그래파이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 재질 또는 이의 혼합물로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 플렉시블한 전도성 물질이라면 사용가능하다.
상기 전극층(4)은 용액공정 또는 증착공정을 이용하여 형성될 수 있다.
상기 용액공정으로는 스핀코팅(spin-coating), 드롭캐스팅(drop-casting), 바코팅(bar coating), 슬롯 다이(slot-die coating), 그라비아 프린팅(Gravure-printing), 노즐 프린팅(nozzle printing), 잉크젯 프린팅(ink-jet printing), 스크린 프린팅(screen printing), 전기수력학적 젯 프린팅(electrohydrodynamic jet printing), 전기분무(electrospray) 등을 포함할 수 있다.
상기 증착공정으로는 진공 증착(evaporation), 열 증착(thermal deposition), 플래쉬 증착(flash deposition), 레이저 증착(laser deposition), 화학적 증기 증착 (chemical vapor deposition), 원자층 증착(atomic layer deposition), 물리 기상 증착(physical vapor deposition), 물리화학적 공-진공증착 (physical-chemical co-evaporation deposition), 순차적인 증착 (sequential vapor deposition), 용액 공정 조합 증착(solution process-assisted thermal deposition) 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 일체형 생체연료전지 전극에 있어서, 상기 전극층(4) 상에는 산화전극(1), 환원전극(2), 및 연결부(3)가 형성된다.
이때, 도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 상기 산화전극(1)은 일측 말단에 형성되고, 환원전극(2)은 타측 말단에 형성되며, 상기 산화전극(1)과 환원전극(2) 사이에는 연결부(3)가 형성된다.
상기 산화전극은 글루코스 산화효소(glucose oxidase; GOX 또는 GOD), 글루코스 탈수소화효소(glucose dehydrogenase; GDH), 젖산 산화효소(uricase; UOX), 젖산 탈수소화효소(lactate dehydrogenase; LDH), 갈락토오스 산화효소(galactose oxidase; GAOX), 셀로비오스 탈수소화효소(cellobiose dehydrogenase; CDH), 프락토스 탈수소화효소(fructose dehydrogenase), 알콜 탈수소화효소(alcohol dehydrogenase; ADH), 알데하이드 탈수소화효소(aldehyde dehydrogenase; ALDH), 포름산 탈수소화효소(formate dehydrogenase), 옥살산 탈수소화효소(oxalate oxidase), 파이루베이트 탈수소화효소(pyruvate dehydrogenase; PDH) 및 막결합 수소화효소(membrane-bound hydrogenase; MBH)로 구성된 군으로부터 선택되는 산화전극용 효소와, 상기 산화전극용 효소와 반응하는 전자전달 매개체를 포함할 수 있다.
상기 환원전극은 산소와 수소를 물로 치환시키는 효소들을 사용할 수 있으며, 예를 들면, 빌리루빈 산화효소(bilirubin oxidase; BOD), 라케이즈(Laccase), 퍼록시다이제(horseradish peroxidase; HRP), 카탈라아제(catalase; CAT), 시토크롬 c(cytochrome c; CYCS), 시토크롬 산화효소(cytochrome oxidase; COX), 및 마이크로과산화효소(microperoxidase; MP-11)로 구성된 군으로부터 선택되는 환원전극용 효소와, 상기 환원전극용 효소와 반응하는 전자전달 매개체를 포함할 수 있다.
상기 산화전극용 효소 또는 환원전극용 효소와 반응하는 전자전달 매개체는 당업계에서 통상적으로 사용되는 루테늄 착물, 오스뮴 착물 등의 화합물을 사용할 수 있다. 일례로, PAA-PVI-[Os(디메톡시-비피리딘)2Cl], PAA-PVI-[Os(디클로로-비피리딘)2Cl], PAA-PVP-[Os(디메톡시-비피리딘)2Cl], PAA-PVP-[Os(디클로로-비피리딘)2Cl], PAA-PVI-[Os(디메틸-비피리딘)2Cl], PAA-PVP-[Os(디메틸-비피리딘)2Cl], PAA-PVI-[Os(디카르복실-비피리딘)2Cl], PAA-PVP-[Os(디카르복실-비피리딘)2Cl] 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 전자전달 매개체는 농도를 조절함으로써 발생하는 전류의 세기를 조절할 수 있다. 이때, 상기 전자전달 매개체의 농도는 0.1~1.0 mg/mL인 것이 바람직하다. 만일, 상기 전자전달 매개체의 농도가 0.1 mg/mL 미만이면 전류량이 극히 적어 세포에 미치는 영향이 극히 적을수 있고, 10 mg/mL을 초과하면 용액의 침전으로 재현성 있는 전극을 제작하지 못하는 문제가 있다.
또한, 효소와 전자전달 매개체를 전극에 고정화하기 위하여, 상기 산화전극(1) 및 환원전극(2)은 가교제를 더 포함할 수 있으며, 상기 가교제로는 폴리에틸렌글리콜 디글리시딜 에테르(PEGDGE), 폴리(도파민)(PDA), 폴리(비닐피리딘), 폴리(아크릴아미드)(PAA), 폴리(에틸렌 알콜)(PEG), 폴리(에틸렌이민)(PEI), 폴리비닐피롤리돈(PVP) 및 나피온(nafion)으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 산화전극(1)과 환원전극(2) 사이에는 연결부(3)가 형성된다.
상기 연결부(3)는 상기 산화전극(1)과 환원전극(2) 사이에 형성되며, 상기 산화전극(1)에서 형성된 전자가 환원전극(2)으로 이동하는 통로가 된다. 상기 연결부(3)는 단전을 방지하기 위하여, 상기 전극층 상에 절연층이 형성되며, 상기 절연층의 재료는 당업계에서 통상적으로 사용되는 절연 재료를 사용할 수 있다.
상기 전극층 상에 절연층을 형성하는 방법은 테이핑, 코팅, 도포 등 당업계에서 통상적으로 사용하는 방법을 이용할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 상기 연결부에 절연 테이프를 붙여 절연층을 형성하였다.
또한, 본 발명은 상기 일체형 생체연료전지 전극의 제조방법을 제공한다.
상기 일체형 생체연료전지 전극의 제조방법은
플렉시블 기판 상에 전극층을 형성하는 단계;
상기 전극층 상에 일측 말단에, 산화전극용 효소, 상기 산화전극용 효소와 반응하는 전자전달 매개체 및 가교제를 포함하는 로딩 용액을 캐스팅하여 산화전극을 제조하는 단계;
상기 전극층 상에 타측 말단에, 환원전극용 효소, 상기 환원전극용 효소와 반응하는 전자전달 매개체 및 가교제를 포함하는 로딩 용액을 캐스팅하여 산화전극을 제조하는 단계; 및
상기 전극층 상에 상기 산화전극과 환원전극을 연결하는 연결부에 절연층을 형성하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 일체형 생체연료전지 전극의 제조방법에 있어서, 각 단계의 구체적인 설명은 상술한 바와 같으므로 생략한다.
본 발명에 따라 제조된 일체형 생체연료전지 전극은 재질이 유연성을 갖기 때문에 구부려서 브릿지 형태로 도 3과 같이 세포배양용기에 삽입할 수 있으므로, 세포를 배양시키는 데에 용이하게 사용할 수 있다.
상기 일체형 생체연료전지 전극의 길이는 삽입하는 세포배양용기의 크기에 따라 조절하여 제작할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 일체형 생체연료전지 전극을 포함하는 세포배양장치를 제공한다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 일체형 생체연료전지 전극을 포함하는 세포배양장치 및 세포배양에 대한 작동 메커니즘을 나타내는 모식도이다.
도 4를 참조하면, 상기 세포배양장치는
상면이 개방되며, 배양액을 담을 수 있는 외부 용기(20);
상기 외부 용기의 상단에 결합되어 미생물이 침투하는 것을 방지하는 용기 커버(30);
상기 외부용기 내에 삽입된, 연료물질을 포함하는 배양액(40); 및
상기 외부용기 내에 삽입되되, 상기 배양액에 산화전극 및 환원전극이 접촉하도록 구부려져서 삽입된, 일체형 생체연료전지 전극(10)을 포함한다.
상기 세포배양장치는 생체연료전지의 작동원리를 이용하며, 구체적으로 생체연료전지의 산화전극에서 연료물질을 산화시켜 전자를 방출하며, 방출된 전자는 상기 생체연료전지의 연결부를 따라 환원전극으로 이동하고, 환원전극에서 전자를 소모하여 전류가 순환하는 과정을 통해 전기자극을 발생시킨다.
본 발명에 따른 구체적인 실시예에서는 도 4에 나타낸 바와 같이, 산화전극은 글루코스 탈수소화효소를 포함하여 글루코스를 글루코노락톤으로 산화시키고, 환원전극 빌리루빈 산화효소를 포함하여 산소분자를 물로 환원시키면서 전기자극을 발생시킨다. 이렇게 발생된 전기자극을 통해 세포가 전기적 자극을 느끼며 증식, 이주, 노화 세포의 재생에 효과를 나타냄으로써, 세포배양에 유용하게 사용될 수 있다.(도 5 내지 8 참조).
이때, 배양 가능한 세포는 성체줄기세포(adult stem cells), 배아줄기세포(embryonic stem cells) 및 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cells; iPSCs)를 포함하는 줄기세포 또는 심근세포, 근육전구세포 및 신경전구세포를 포함하는 체세포로 세포의 종류에 구애되지 않는다.
이때, 발생되는 전기자극은 절대값이 200 μA/cm2 미만인 것이 바람직하다. 만일 절대값이 200 μA/cm2 을 초과하면, 오히려 세포가 사멸되는 문제가 있다.
나아가, 본 발명에 따른 세포배양장치에 있어서, 사용되는 효소적 생체연료전지는 효소작용에 의해 기질을 산화 또는 환원시키면서 전자를 발생하거나 소모하는 시스템이므로 효소작용을 위한 기질이 공급되는 한, 외부로부터의 전력공급이 없이도 지속적으로 전기자극을 생성할 수 있다. 상기 기질은 연료물질 또는 산화제를 세포배양액에 첨가하는 등의 형식으로 공급될 수 있다. 따라서, 상기 세포배양장치는 외부 전력공급원을 필요로 하지 않는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 세포배양장치에 있어서, 상기 배양액(40)은 당업계에서 통상적으로 사용하는 배양액을 사용할 수 있으며, 예컨대 둘베코스 변형 이글즈 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium: DMEM) 배양액 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 나아가, 본 발명에 따른 세포배양장치에 있어서, 사용되는 효소적 생체연료전지는 효소작용에 의해 기질을 산화 또는 환원시키면서 전자를 발생하거나 소모하는 시스템이므로 효소작용을 위한 기질이 공급되는 한, 외부로부터의 전력공급이 없이도 지속적으로 전기자극을 생성할 수 있다. 상기 기질은 연료물질 또는 산화제를 세포배양액에 첨가하는 등의 형식으로 공급될 수 있다. 따라서, 상기 세포배양장치는 외부 전력공급원을 필요로 하지 않는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 세포배양장치에 있어서, 상기 배양액(40)은 당업계에서 통상적으로 사용하는 배양액을 사용할 수 있으며, 예컨대 둘베코스 변형 이글즈 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium: DMEM) 배양액 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 생체연료전지의 연료물질로는 다양한 당류(sugars) 및 저분자량의 지방족 알콜(low aliphatic alcohols)를 제한없이 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 글루코스, 프락토스, 셀로비오스, 락토즈, 메탄올, 에탄올, 글리세롤, 파이루베이트, 수소 등을 포함한다. 상기 산화제로는 산소 분자 이외에도 과산화수소 또는 큐멘 과산화물(cumene peroxide)을 포함할 수 있다.
상기 효소적 생체연료전지의 산화전극과 환원전극은 단전을 방지하기 위하여 서로 격리되도록 위치시키는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 일체형 생체연료전지 전극은 유연하여 잘 구부러지므로, 상기 생체연료전지 전극의 연결부를 구부려서 외부 용기(20)의 바닥에서 산화전극과 환원전극이 각각 가장 멀리 이격되어 배양액(40)과 접촉하도록 배치할 수 있다.
본 발명에 따른 세포배양장치에 있어서, 배양 용기의 상단에는 세포배양시 미생물이 침투하는 것을 방지하기 위한 용기 커버(30)가 구비된다.
본 발명에 따른 세포배양장치는 상기 일체형 생체연료전지 전극(10)의 길이를 용기 커버 크기에 맞도록 조절하여, 상기 용기 커버(30)가 외부 용기(20)와 결합된 상태로 세포배양을 할 수 있으므로, 미생물의 침투 없이 효과적으로 세포배양을 할 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기술된 것으로서, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
< 제조예 1 : 일체형 생체연료전지 전극의 제조>
반자동식의 스크린 프린팅 기기(semi-automatic screen printing machine)를 사용하여 OHP 필름 상에 카본 블랙 잉크(Electrodag®　 423SS (Acheson, Port Hurton, USA))로 아령 형태의 전극층을 프린팅하였다. 구체적으로, 상기 전극층은 도 1에 나타낸 바와 같이, 가로 44 mm, 세로 2.5 mm의 막대 모양과 상기 막대 모양의 양쪽 말단에 직경 4 mm의 원형 모양이 형성된 아령 형태로 이루어졌다.
상기 전극층의 일측의 원형 말단은 산화전극(anode)으로, 타측의 원형 말단은 환원전극(cathode)으로 제조하였고, 상기 산화전극과 환원전극을 연결하는 연결부에는 절연테이프를 붙여서 절연층을 형성시켰다.
상기 산화전극 및 환원전극을 위한 로딩 용액은 효소, 전자전달 매개체 및 가교제를 포함하도록 구성하였다.
이때, 산화전극을 위한 로딩 용액으로는 효소로서 글루코스 탈수소화효소(GDH)(0.385 mg/mL), 전자전달 매개체로서 1.0 mg/mL 농도의 PAA-PVI-[Os(디메톡시-비피리딘)2Cl]+/2+, 및 가교제로서 폴리에틸렌글리콜 디글리시딜 에테르(PEGDGE)를 4:4:1의 부피비로 혼합하여 가교결합된 부가물로 구성하였다.
환원전극을 위한 로딩 용액으로는 효소로서 빌리루빈 산화효소(BOD)(PBS 내 10 U/mL), PAA-PVI-[Os(디클로로-비피리딘)2Cl]+/2+ (증류수 내 0.5 mg/mL), 및 가교제로서 PEGDGE(증류수 내 5.0 mg/mL)를 4:4:1의 부피비로 혼합하여 가교결합된 부가물로 구성하였다.
상기 산화전극에 해당하는 탄소전극상에 산화전극 로딩 용액을 캐스팅하고, 상기 환원전극에 해당하는 탄소전극상에 환원전극 로딩 용액을 캐스팅한 후, 데시케이터 내에서 24시간 동안 실온에서 건조하였다.
제조된 일체형 생체연료전지 전극을 GDH-a로 명명하였고, 상기 일체형 생체연료전지 전극은 재질이 유연성을 갖기 때문에 구부려서 브릿지 형태로 도 3과 같이 세포 배양 용기에 삽입할 수 있으므로, 세포를 배양시키는 데에 용이하게 사용할 수 있다.
< 제조예 2 : 일체형 생체연료전지 전극의 제조>
전자전달 매개체(PAA-PVI-[Os(디메톡시-비피리딘)2Cl])의 농도를 0.5 mg/mL로 변화시킨 것을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 일체형 생체연료전지 전극을 제조하였다.
제조된 일체형 생체연료전지 전극을 GDH-b로 명명하였다.
< 제조예 3 : 일체형 생체연료전지 전극의 제조>
전자전달 매개체(PAA-PVI-[Os(디메톡시-비피리딘)2Cl])의 농도를 0.1 mg/mL로 변화시킨 것을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 일체형 생체연료전지 전극을 제조하였다.
제조된 일체형 생체연료전지 전극을 GDH-c로 명명하였다.
< 제조예 4~6 : 일체형 생체연료전지 전극을 포함하는 세포배양장치의 제조>
12웰 플레이트 배양접시에 배양액으로서 글루코스 함량이 높고(high glucose: 4500 mg/L), 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum) 및 1% 페니실린 스트렙토마이신을 포함하는 둘베코스 변형 이글즈 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium: DMEM) 배양액을 넣었다.
상기 배양접시에 제조예 1 내지 3에서 제조된 일체형 생체연료전지 전극을 넣되, 상기 생체연료전지 전극의 연결부를 구부려서 배양접시의 바닥에서 산화전극과 환원전극이 각각 가장 멀리 이격되어 배양액과 접촉하도록 배치하고, 배양접시 상단에는 미생물의 침투를 방지하지 위해 커버로 닫아 세포배양장치를 제조하였다.
< 실험예 1 : 일체형 생체연료전지 전극의 전기화학특성>
기준전극으로서 Ag/AgCl을 사용하고, 상대전극으로서 Pt 와이어를 사용하여, 순환 전압-전류법(cyclic voltammetry; CV)에 의해 본 발명의 일체형 생체연료전지 전극들의 전기화학적 특성을 측정하였다. 그 결과, 0.4V에서 본 발명에 따른 일체형 생체연료전지 전극의 전류밀도는 -12.5 ~ -62.5 μA/cm2를 나타내었다.
구체적으로, 제조예 1에서 제조된 전극(GDH-a)의 경우에는 -62.5 μA/cm2, 제조예 2에서 제조된 전극(GDH-b)의 경우에는 -43.0 μA/cm2, 및 제조예 3에서 제조된 전극(GDH-c)의 경우에는 -12.5 μA/cm2의 전류밀도를 나타내었다.
이는 인간 신체 내에 이식시, 어떠한 고통이나 얼얼한 느낌 없이 안전한 범위(전류밀도의 절대값이 200 μA/cm2 미만) 내에 있음을 알 수 있다.
< 실험예 2 : 일체형 생체연료전지 전극을 이용한 세포 증식 실험>
본 발명에 따른 일체형 생체연료전지 전극이 세포 증식에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해, 다음과 같은 실험을 수행하였다.
12웰 플레이트 배양 접시에 배양액으로서 글루코스 함량이 높고(high glucose: 4500 mg/L), 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum) 및 1% 페니실린 스트렙토마이신을 포함하는 둘베코스 변형 이글즈 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium: DMEM) 배양액을 넣었다.
상기 배양 접시에 인간 피부 섬유아 세포를 2.0 × 104 개를 뿌리고 37℃ 및 5% CO2가 유지되는 인큐베이터에서 일체형 생체연료전지 전극 없이(대조군), 또는 제조예 1~3에서 제조된 일체형 생체연료전지 전극을 삽입하여 세포를 배양하였다. 1일 또는 2일 배양 후, 배양된 세포를 CCK-8 키트에 넣어 세포 생존율을 측정하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 일체형 생체연료전지 전극을 포함하지 않은 대조군에서의 세포 생존율을 100%로 할 때, 본 발명에 따른 일체형 생체연료전지 전극을 포함한 배양 접시에서 배양된 세포는 140% 이상 증식되어 있음을 확인하였다.
다음으로, 노화된 세포에 대하여 전술한 바와 같이 세포증식 실험을 수행하여 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 노화된 세포에 있어서, 전자전달 매개체(PAA-PVI-[Os(디메톡시-비피리딘)2Cl])의 농도를 1.0 mg/mL로 포함하는 일체형 생체연료전지 전극을 사용한 경우(GDH-a), 대조군에 비해 318%의 세포 증식률을 나타냄으로써, 본 발명에 따른 일체형 생체연료전지 전극은 단순 세포 증식뿐 아니라 노화 세포에 대한 세포 재생에도 효과가 뛰어난 것을 알 수 있다.
< 실험예 3 : 일체형 생체연료전지 전극에 대한 세포 독성 실험>
본 발명에 따른 일체형 생체연료전지 전극이 세포 독성에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해, 다음과 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 실험예 2의 세포 증식 실험 후, 상기 세포들을 PBS로 세척후 calsin AM 과 ethidium homodimer-1 시약을 사용하여 30분 동안 염색한 다음, IX-71(olympus, Tokyo, Japan) 형광 현미경으로 관찰함으로써, 살아있는 세포와 죽은 세포비를 통해 재료의 독성이 어느정도 있는지 육안으로 관찰하여 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7은 세포 독성에 대한 실험 결과로서, 살아있는 세포는 초록색으로 염색되고, 죽은 세포는 붉은색으로 염색된다. 즉, 초록색이 많은 경우, 살아있는 세포가 많으므로 세포 독성이 거의 없고, 붉은 색이 많을수록 죽은 세포가 많으므로 세포 독성이 높다는 의미이다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 GDH-a, GDH-b, GDH-c의 일체형 생체연료전지 전극은 모두 대부분의 많은 세포들이 녹색으로 나타남으로써. 세포독성이 없음을 알 수 있다.
< 실험예 3 : 일체형 생체연료전지 전극을 이용한 세포 이주 실험>
세포의 이주는 상처부위를 빠르게 메우는 역할을 하기 때문에 재생 치료에 중요하다. 이에, 본 발명에 따른 일체형 생체연료전지 전극이 세포 이주에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해, 다음과 같은 실험을 수행하였다.
12웰 플레이트 세포 배양 접시에 2.0×104 개의 인간 피부 섬유아세포를 이틀 동안 배양하였다. 다음으로. 미토마이신 C(mitomycin C)를 2시간 동안 처리하여 세포가 자연히 이주하는 것을 방지하였다. 이후, 배양 접시의 가운데에 피펫 팁(pipette tip)을 이용하여 스크래치를 낸 후, 생체연료전지 전극을 포함하지 않거나(대조군), 제조예 1 내지 3에서 제조된 일체형 생체연료전지 전극(GDH-a, GDH-b, GDH-c)을 삽입하여 0시간, 6시간, 12시간 후에 세포의 이주 정도를 현미경으로 관찰하고, 시간별로 스크래치 영역에 대한 세포 이주 영역의 비율을 백분율로 환산하여 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 대조군은 12시간 후에도 세포의 이주가 거의 없었으나, 본 발명에 따른 일체형 생체연료전지 전극 중 GDH-a의 경우, 12시간 만에 80% 이상의 세포들이 스크레치 영역으로 이주하는 것으로 나타났다. GDH-b 및 GDH-c의 경우에도 세포의 이주가 관찰되었다.
세포 이주 정도는 전류밀도의 절대값이 상대적으로 큰 GDH-a (-62.5 μA/cm2)에서 가장 많은 세포들이 이주하였으며, 다음으로 GDH-b (-43.0 μA/cm2), 다음으로 GDH-c (-12.5 μA/cm2) 순으로 나타났다.
따라서, 본 발명에 따른 일체형 생체연료전지 전극은 더 많은 세포들이 상처부위로 이주함으로써 상처를 빠르게 아물도록 촉진시키므로, 상처치료에 효과적임을 알 수 있다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다. 그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 특허청구범위의 범위에 속한다.
1: 산화전극
2: 환원전극
3: 연결부
4: 전극층
5: 플렉시블 기판
10: 일체형 생체연료전지 전극
20: 외부 용기
30: 용기 커버
40: 배양액

Claims (18)

  1. 효소적 생체연료전지 전극에 있어서,
    플렉시블 기판;
    상기 플렉시블 기판 상에 형성된 플렉시블한 전극층;
    상기 전극층 상에서 일측 말단에 형성된 산화전극;
    상기 전극층 상에서 타측 말단에 형성된 환원전극; 및
    상기 전극층 상에서 상기 산화전극과 환원전극 사이에 형성되며, 상기 산화전극과 환원전극을 연결하는 연결부;를 포함하는
    일체형 생체연료전지 전극.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 전극층은 카본 블랙, 금, 은, 탄소나노튜브, 그래핀 및 그래파이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 재질 또는 이의 혼합물로 이루어진 것을 특징으로 하는 일체형 생체연료전지 전극.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 산화전극은 글루코스 산화효소(glucose oxidase; GOX 또는 GOD), 글루코스 탈수소화효소(glucose dehydrogenase; GDH), 젖산 산화효소(uricase; UOX), 젖산 탈수소화효소(lactate dehydrogenase; LDH), 갈락토오스 산화효소(galactose oxidase; GAOX), 셀로비오스 탈수소화효소(cellobiose dehydrogenase; CDH), 프락토스 탈수소화효소(fructose dehydrogenase), 알콜 탈수소화효소(alcohol dehydrogenase; ADH), 알데하이드 탈수소화효소(aldehyde dehydrogenase; ALDH), 포름산 탈수소화효소(formate dehydrogenase), 옥살산 탈수소화효소(oxalate oxidase), 파이루베이트 탈수소화효소(pyruvate dehydrogenase; PDH) 및 막결합 수소화효소(membrane-bound hydrogenase; MBH)로 구성된 군으로부터 선택되는 산화전극용 효소와,
    상기 산화전극용 효소와 반응하는 전자전달 매개체를 포함하는 것을 특징으로 하는 일체형 생체연료전지 전극.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 환원전극은 빌리루빈 산화효소(bilirubin oxidase; BOD), 라케이즈(Laccase), 퍼록시다이제(horseradish peroxidase; HRP), 카탈라아제(catalase; CAT), 시토크롬 c(cytochrome c; CYCS), 시토크롬 산화효소(cytochrome oxidase; COX), 및 마이크로과산화효소(microperoxidase; MP-11)로 구성된 군으로부터 선택되는 환원전극용 효소와,
    상기 환원전극용 효소와 반응하는 전자전달 매개체를 포함하는 것을 특징으로 하는 일체형 생체연료전지 전극.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 전자전달 매개체의 농도는 0.1~10.0 mg/mL인 것을 특징으로 하는 일체형 생체연료전지 전극.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 연결부에는 상기 전극층 상에 절연층이 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 일체형 생체연료전지 전극.
  7. 플렉시블 기판 상에 전극층을 형성하는 단계;
    상기 전극층 상에 일측 말단에, 산화전극용 효소, 상기 산화전극용 효소와 반응하는 전자전달 매개체 및 가교제를 포함하는 로딩 용액을 캐스팅하여 산화전극을 제조하는 단계;
    상기 전극층 상에 타측 말단에, 환원전극용 효소, 상기 환원전극용 효소와 반응하는 전자전달 매개체 및 가교제를 포함하는 로딩 용액을 캐스팅하여 환원전극을 제조하는 단계; 및
    상기 전극층 상에 상기 산화전극과 환원전극을 연결하는 연결부에 절연층을 형성하는 단계를 포함하는 일체형 생체연료전지 전극의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 전극층은 카본 블랙, 금, 은, 탄소나노튜브, 그래핀 및 그래파이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 재질 또는 이의 혼합물로 이루어진 것을 특징으로 하는 일체형 생체연료전지 전극의 제조방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 전극층은 용액공정 또는 증착공정을 이용하여 형성되는 것을 특징으로 하는 일체형 생체연료전지 전극의 제조방법.
  10. 제7항에 있어서,
    산화전극용 효소는 글루코스 산화효소(glucose oxidase; GOX 또는 GOD), 글루코스 탈수소화효소(glucose dehydrogenase; GDH), 젖산 산화효소(uricase; UOX), 젖산 탈수소화효소(lactate dehydrogenase; LDH), 갈락토오스 산화효소(galactose oxidase; GAOX), 셀로비오스 탈수소화효소(cellobiose dehydrogenase; CDH), 프락토스 탈수소화효소(fructose dehydrogenase), 알콜 탈수소화효소(alcohol dehydrogenase; ADH), 알데하이드 탈수소화효소(aldehyde dehydrogenase; ALDH), 포름산 탈수소화효소(formate dehydrogenase), 옥살산 탈수소화효소(oxalate oxidase), 파이루베이트 탈수소화효소(pyruvate dehydrogenase; PDH) 및 막결합 수소화효소(membrane-bound hydrogenase; MBH)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 일체형 생체연료전지 전극의 제조방법.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 환원전극용 효소는 빌리루빈 산화효소(bilirubin oxidase; BOD), 라케이즈(Laccase), 퍼록시다이제(horseradish peroxidase; HRP), 카탈라아제(catalase; CAT), 시토크롬 c(cytochrome c; CYCS), 시토크롬 산화효소(cytochrome oxidase; COX), 및 마이크로과산화효소(microperoxidase; MP-11)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 일체형 생체연료전지 전극의 제조방법.
  12. 제7항에 있어서,
    상기 전자전달 매개체의 농도는 0.1~10.0 mg/mL인 것을 특징으로 하는 일체형 생체연료전지 전극의 제조방법.
  13. 제7항에 있어서,
    상기 가교제는 폴리에틸렌글리콜 디글리시딜 에테르(PEGDGE), 폴리(도파민)(PDA), 폴리(비닐피리딘), 폴리(아크릴아미드)(PAA), 폴리(에틸렌 알콜)(PEG), 폴리(에틸렌이민)(PEI), 폴리비닐피롤리돈(PVP) 및 나피온(nafion)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 일체형 생체연료전지 전극의 제조방법.
  14. 제1항의 일체형 생체연료전지 전극을 포함하는 세포배양장치.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 세포배양장치는
    상면이 개방되며, 배양액을 담을 수 있는 외부용기;
    상기 외부용기의 상단에 결합되어 미생물이 침투하는 것을 방지하는 용기 커버;
    상기 외부용기 내에 삽입된, 연료물질을 포함하는 배양액; 및
    상기 외부용기 내에 삽입되되, 상기 배양액에 산화전극 및 환원전극이 접촉하도록 구부려져서 삽입된, 일체형 생체연료전지 전극을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포배양장치.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 세포배양장치는 생체연료전지의 산화전극에서 연료를 산화시켜 전자를 방출하며, 환원전극에서 전자를 소모하여 전류가 순환하는 과정을 통해 발생된 전기자극으로 세포를 배양시키는 것을 특징으로 하는 세포배양장치.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 전기자극은 절대값이 200 μA/cm2 미만인 것을 특징으로 하는 세포배양장치.
  18. 제14항에 있어서,
    상기 세포배양장치는 외부 전력공급원을 필요로 하지 않는 것을 특징으로 하는 세포배양장치.
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