BR122016023717B1

BR122016023717B1 - kit embalado que compreende uma combinação de um líquido aquoso e um curativo

Info

Publication number: BR122016023717B1
Application number: BR122016023717A
Authority: BR
Inventors: Austin Andrew; Davis Paul
Original assignee: Insense Ltd
Priority date: 2009-05-01
Filing date: 2010-04-30
Publication date: 2018-09-11
Also published as: BRPI1009976B1; DK2424578T3; KR20160110561A; GB0907553D0; JP2012525366A; WO2010125398A2; US8815234B2; KR101723534B1; WO2010125398A3; AU2010243349A1; US20120058101A1; CA2758471C; KR101703555B1; RU2011148938A; CN102405065A; CA2758471A1; ES2586851T3; EP2424578B1; BRPI1009976A2; RU2527341C2

Abstract

a presente invenção refere-se a um método de tratamento de uma infecção de superfície corporal humana ou animal, particularmente, uma infecção fúngica, método este que compreende aplicação de um líquido aquoso à superfície corporal infectada, por exemplo, região ungueal, seguida por aplicação de um curativo compreendendo uma fonte de peróxido de hidrogênio. também é proporcionada uma combinação do líquido de curativo para uso no método.

Description

A presente invenção refere-se ao tratamento de infecções da superfície corporal humana ou animal, particularmente, uma infecção fúngica de uma região da unha humana.

Antecedentes [003] Unhas saudáveis em condição visivelmente boa são aspectos importantes e altamente apreciados de aparência humana. Frequentemente, a aparência, força e saúde das unhas podem ser adversamente afetadas por infecção com células fúngicas patogênicas, tipicamente, do gênero Trychophyton, e há uma forte demanda de terapias que aperfeiçoam a aparência de unhas afetadas por eliminação dos fungos infectantes. Embora existam numerosos remédios no mercado, há insatisfação generalizada com tecnologias e produtos disponíveis. [004] Agentes sistemicamente transferidos podem atingir a região ungueal por meio da corrente sanguínea, porém pobre penetração na região ungueal a partir da circulação e efeitos colaterais graves limita à utilidade da abordagem.

[005] Unhas fungicamente infectadas são, frequentemente, tornadas porosas ou abrem-se pela ação dos fungos invasores. Desse modo, frequentemente, a unha é cocolonizada com bactérias que podem exacerbar os efeitos prejudiciais dos fungos liberando enzimas destrutivas adicionais e toxinas localmente ativas.

[006] Reconhece-se bem que, mesmo que uma infecção fúngica ungueal seja reduzida por meio de uma terapia conhecida, a infecção é rara e completamente eliminada e, é usual de infecções retornarem logo após tratamento ser interrompido.

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Sumário da Invenção [007] Os inventores descobriram que os ingredientes ativos não prontamente penetram na unha e pouco, se qualquer, do material aplicado à superfície superior atinge as estruturas subjacentes onde as células fúngicas podem residir em segurança relativa.

[008] Em um primeiro aspecto, a invenção refere-se a um método de tratamento de uma infecção de superfície corporal humana ou animal, por exemplo, uma infecção fúngica, método este que compreende aplicação de um líquido aquoso à superfície corporal infectada, por exemplo, a região ungueal, seguida por aplicação de um curativo compreendendo uma fonte de peróxido de hidrogênio.

[009] Em um segundo aspecto, a invenção refere-se a uma combinação de um líquido aquoso e um curativo compreendendo uma fonte de peróxido de hidrogênio no tratamento de uma infecção de superfície corporal humana ou animal, por exemplo, uma infecção fúngica, particularmente, mas não exclusivamente, uma região ungueal humana ou animal.

[0010] Em um terceiro aspecto, a invenção refere-se ao uso de uma combinação de um líquido aquoso e um curativo compreendendo uma fonte de peróxido de hidrogênio na manufatura de um medicamento para o tratamento de uma infecção de superfície corporal humana ou animal, por exemplo, uma infecção fúngica, particularmente, mas não exclusivamente, uma região ungueal humana ou animal. [0011] Ao aplicar um líquido aquoso à superfície corporal infectada, a superfície corporal amacia, e torna-se mais porosa. Por exemplo, isso pode permitir que o líquido passe para o interior da região ungueal via a porosidade existente. Desse modo, o líquido proporciona um caminho de fluxo aquoso, para o interior da superfície corporal, por exemplo, região ungueal.

[0012] Aplicação subsequente de um curativo compreendendo

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3/17 uma fonte de peróxido de hidrogênio desse modo resulta em difusão eficaz do peróxido de hidrogênio juntamente com o caminho de fluxo aquoso gerado nas partes internas, menos acessíveis da superfície corporal, por exemplo, região ungueal, permitindo que o peróxido de hidrogênio penetre profundamente, permitindo redução ou eliminação significativa da infecção, por exemplo, infecção fúngica em todos os componentes de, por exemplo, a região ungueal.

[0013] Unhas apresentam uma anatomia e composição distintivas que devem ser avaliadas quando considerando novas abordagens para terapia visada na placa ungueal e leito ungueal subjacente, bem como todas as estruturas associadas. A parte mais conspícua de uma unha, a placa ungueal, consiste de uma estrutura dura queratinizada, composta de células mortas, cornificadas (corneócitos), pressionada a partir da matriz na base da unha. A maior parte da placa ungueal é semitransparente, permitindo que a cor do suprimento sanguíneo mostre-se na derme, através de, proporcionando uma cor rosada. A própria unha é relativamente desprovida de umidade, mas quando exposta à água, pode tornar-se relativamente hidratada, assumindo um estado amolecido e flexível.

[0014] A parede da unha, uma dobra de pele que sobrepõe os lados da unha, mantém a placa ungueal no lugar e protege suas bordas. A única parte viva, reprodutora da unha é a matriz ungueal, situada diretamente abaixo da cutícula. Novas células formam nesse ponto e continuamente avançam à medida que amadurecem para produzir a placa ungueal. A matriz é também suprida com nervos, bem como vasos sanguíneos abundantes para proporcionar as células com nutrição e oxigênio.

[0015] Os restos da placa ungueal no leito ungueal, a qual é contínua com a matriz. Esta, também, é abundantemente suprida com vasos sanguíneos e nervos. Sua superfície é formada em numerosas

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4/17 elevações (ridges) paralelas que se encaixam exatamente com as elevações na superfície inferior da placa ungueal. A cutícula é a parte da epiderme da pele que se sobrepõe a unha. Ela protege a matriz de bactérias invasoras e danos físicos.

[0016] Células fúngicas podem residir e crescer em quaisquer partes dessas estruturas e isso é importante para qualquer tratamento impregnar todas as áreas a fim de eliminar quaisquer focos residuais de infecção, bem como eliminar infecção nas principais áreas da placa ungueal.

[0017] O termo região ungueal é definido neste relatório compreender a placa ungueal, leito ungueal, matriz ungueal, cavidade ungueal e cutícula.

[0018] A invenção também se refere a um método de tratamento de células infectadas por vírus de papiloma humano, método este que compreende aplicação de um líquido aquoso, conforme definido neste relatório, às células infectadas seguida por aplicação de um curativo compreendendo uma fonte de peróxido de hidrogênio conforme definido neste relatório.

[0019] A invenção também se refere a uma combinação de um líquido aquoso, conforme definido neste relatório, e um curativo compreendendo uma fonte de peróxido de hidrogênio, conforme definido neste relatório, no tratamento de células infectadas por vírus de papiloma humano.

[0020] Em uma modalidade preferida, o líquido aquoso compreende uma enzima peroxidase. A peroxidase difunde-se para o interior da superfície corporal, por exemplo, a região ungueal.

[0021] A enzima peroxidase, uma vez que tenha penetrado na região interna da superfície corporal, por exemplo, unhas; permanece essencialmente inativa até que peróxido de hidrogênio difunde-se via o caminho aquoso do curativo. Na presença de peroxidase, os efeitos

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5/17 oxidativos de peróxido de hidrogênio são acentuados.

[0022] Verificou-se desse modo que a peroxidase, substancialmente, acentua a atividade, particularmente, atividade antifúngica, do peróxido de hidrogênio porque a peroxidase catalisa a oxidação de moléculas fúngicas vulneráveis, mas essenciais em, ou na membrana celular e/ou citoplasma das células fúngicas.

[0023] Qualquer peroxidase adequada poderá ser empregada, incluindo, lactoperoxidase, peroxidase de rábano-silvestre, peroxidase de iodeto, peroxidase de cloreto e mieloperoxidase, Contudo, lactoperoxidase e peroxidase de rábano-silvestre são atualmente preferidas. [0024] A concentração de enzima peroxidase no líquido aquoso situa-se preferencialmente, na faixa de 1 a 1.000 mg/ml, preferencialmente, de 50 a 1.000 mg/ml, mais preferencialmente, de 100 a 500 mg/ml.

[0025] O líquido aquoso também preferencialmente compreende tensoativos e/ou solventes, os quais têm sido verificados acentuar penetração do líquido na superfície corporal, por exemplo, unhas.

[0026] O curativo é preferencialmente em uma condição hidratada, para que o peróxido de hidrogênio possa difundir-se na região ungueal eficazmente, uma vez que o curativo seja aplicado. Água suficiente é exigida no curativo para formar uma junção de contato líquido entre a região ungueal e o curativo.

[0027] Preferencialmente, a resistência osmótica do líquido aquoso é a mesma ou similar àquela do líquido no curativo para acentuar fluxos de fluido e soluto desejados.

[0028] O curativo preferencialmente doa água à região ungueal em uso, obtida selecionando propriedades osmóticas apropriadas de maneira conhecida.

[0029] O material do curativo poderá ser na forma de hidrogel, uma esponja, uma espuma ou alguma outra forma de matriz hidrófila

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6/17 que pode manter água suficiente para permitir um caminho de difusão controlado entre o curativo e a região ungueal. Preferencialmente, o curativo conterá solutos que servem para regular a passagem de peróxido de hidrogênio, por exemplo, mediante ligação de hidrogênio, a qual poderá ser obtida por meio de concentrações de polímeros apropriados, por exemplo, polissacarídeos, incluindo glicosaminoglicanos. [0030] O curativo poderá compreender um curativo de algodão úmido ou poderá incluir um material de mecha estrutural com ingredientes úmidos. Preferencialmente, contudo, o curativo inclui um ou mais géis à base de água ou aquoso, também referido como hidrogéis hidratados. Tais géis poderão ser formados de uma variedade de materiais e poderão conter uma variedade de reagentes, como serão discutidos abaixo.

[0031] Tipicamente, o curativo será na forma de uma lâmina, camada ou película. O curativo poderá, alternativamente, ser na forma de um gel ou loção amorfa, preferencialmente, um hidrogel, não apresentando uma forma ou formato fixo, que pode ser deformado e perfilado em três dimensões, incluindo, sendo espremido através de um bico. Géis amorfos são, tipicamente, não reticulados ou apresentam baixos níveis de reticulação. Um gel amorfo de adelgaçamento sob cisalhamento (shear-thinning) poderá ser usado. Tal gel é líquido quando submetido à tensão de cisalhamento (por exemplo, quando sendo derramado ou espremido através de um bico), mas é fixo quando estático.

[0032] Hidrogéis hidratados adequados são descritos em WO 03/090800. O hidrogel hidratado convenientemente compreende material polimérico hidrófilo. Materiais poliméricos hidrófilos adequados incluem poliacrilatos e metacrilatos, por exemplo, conforme fornecido por First Water Ltd. na forma de hidrogéis em placas, incluindo ácido poli-2-acrilamido-2-metilpropanossulfônico (poliAMPS) ou sais deste

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7/17 (por exemplo, conforme descritos in WO 01/96422), polissacarídeos, por exemplo, gomas de polissacarídeo, particularmente, goma xantana (por exemplo, disponível sob a Marca Registrada Keltrol), vários açúcares, ácidos policarboxílicos (por exemplo, disponíveis sob a Marca Registrada Gantrez AN-169 BF de ISP Europe), poli(éter metilvinílico coanidrido maleico) (por exemplo, disponível sob a Marca Registrada Gantrez AN 139, apresentando um peso molecular na faixa de 20.000 a 40.000), polivinilpirrolidona (por exemplo, na forma de graus comercialmente disponíveis conhecidos como PVP K-30 e PVP K-90), óxido de polietileno (por exemplo, disponível sob a Marca Registrada Polyox WSR-301), álcool polivinílico (por exemplo, disponível sob a Marca Registrada Elvanol), polímero poliacrílico reticulado (por exemplo, disponível sob a Marca Registrada Carbopol EZ-1), celuloses e celuloses modificadas, incluindo hidroxipropilcelulose (por exemplo, disponível sob a Marca Registrada Klucel EEF), carboximetilcelulose de sódio (por exemplo, disponível sob a Marca Registrada Cellulose Gum 7LF) e hidroxietilcelulose (por exemplo, disponível sob a Marca Registrada Natrosol 250 LR).

[0033] Misturas de materiais poliméricos hidrófilos poderão ser utilizadas em um gel.

[0034] Em um hidrogel hidratado de material polimérico hidrófilo, o material polimérico hidrófilo está desejavelmente presente sob uma concentração de pelo menos 0,1%, preferencialmente, de pelo menos 0,5%, preferencialmente, de pelo menos 1%, preferencialmente, de pelo menos 2%, mais preferencialmente, de pelo menos 5%, ainda mais preferencialmente, de pelo menos 10%, ou de pelo menos 20%, desejavelmente, de pelo menos 25% e, ainda mais desejavelmente, de pelo menos 30% em peso, com base no peso total do gel. Mesmo quantidades maiores, até aproximadamente, 40% em peso com base no peso total do gel, poderão ser utilizadas.

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8/17 [0035] Um hidrogel hidratado preferido compreende ácido poli-2acrilamido-2-metilpropanossulfônico (poli AMPS) ou sais do mesmo, preferencialmente, em uma quantidade de, aproximadamente 20% em peso do peso total do gel.

[0036] A fonte de peróxido de hidrogênio poderá compreender peróxido de hidrogênio per se ou peróxido de hidrogênio em combinação com ou em complexo com outra entidade.

[0037] Alternativamente, a fonte de peróxido de hidrogênio poderá ser um dispositivo de geração de peróxido de hidrogênio.

[0038] Em uma modalidade preferida, a fonte de peróxido de hidrogênio é um dispositivo de geração de peróxido de hidrogênio compreendendo enzima oxidorreductase, uma fonte de oxigênio e uma fonte de substrato para a enzima. A enzima oxidorreductase catalisa uma reação de um substrato apropriado com oxigênio para produzir peróxido de hidrogênio.

[0039] Enzimas oxidorreductases adequadas para uso na invenção e os substratos correspondentes (os quais estão presentes no sangue e fluidos tissulares) incluem os seguintes:

Enzima Substrato

Glicose oxidase Hexose oxidase Colesterol oxidase Galactose oxidase Piranose oxidase Colina oxidase Piruvato oxidase Glicolato oxidase Aminoácido oxidase β-D-glicose

Hexose

Colesterol

D-galactose

Piranose

Colina

Piruvato

Glicolato

Aminoácido [0040] A enzima oxidorreductase atualmente preferida é glicose oxidase. Esta catalisa reação de substrato β-D-glicose para fornecer

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9/17 peróxido de hidrogênio e ácido glicônico.

[0041] Uma mistura de enzimas oxidorreductases poderá ser usada.

[0042] A enzima oxidorreductase e glicose poderão ser intimamente misturadas, opcional e juntamente com uma fonte de oxigênio. O oxigênio poderá ser proporcionado por qualquer doador de oxigênio conveniente, mas uma fonte conveniente é oxigênio atmosférico.

[0043] Quando a fonte de oxigênio é oxigênio atmosférico, o curativo, preferencialmente, compreende primeira camada e segunda camada distintas. A primeira camada compreende a enzima oxidorreductase e é localizada na proximidade das partes externas do curativo, isto é, distante da região ungueal em uso, onde os níveis de oxigênio atmosférico são mais altos. A segunda camada compreende a fonte de substrato e é localizada na proximidade das partes internas do curativo, isto é, adjacente à região ungueal, de modo que peróxido de hidrogel produzido pode entrar na região ungueal, diretamente.

[0044] Uma forma preferida da modalidade de camadas é onde tanto a primeira camada quanto a segunda camada incluem hidrogéis hidratados reticulados. Os hidrogéis poderão ser vazados em torno de uma estrutura mecânica de reforço, tal como uma compressa de gaze de algodão ou uma malha flexível inerte, por exemplo, para proporcionar uma camada ou placa (slab) de hidrogel estruturalmente reforçada. [0045] Alternativamente, a primeira camada contendo enzima poderá ser em condição seca, mas colocada em comunicação de fluido com a segunda camada durante uso, resultando em migração de água com a primeira camada para hidratar a enzima.

[0046] Na modalidade de camadas é preferível que a primeira camada seja relativamente fina, isto é, de 0,01 a 2,0 mm e a segunda camada seja relativamente espessa, isto é, de 0,5 a 5,0 mm. Se a primeira camada é um hidrogel hidratado, então esta é preferencialmen15/33

10/17 te, de 0,1 a 2,0 mm de espessura. Se a primeira camada é uma película seca, então esta é preferencialmente, de 0,01 a 0,1 mm de espessura.

[0047] A razão de espessura de primeira camada para aquela da segunda camada é preferencialmente de, 1:2 a 1:200, preferencialmente, de 1:5 a 1:50, mais preferencialmente, de 1:5 a 1:20.

[0048] A enzima oxidorreductase poderá, convenientemente, ser imobilizada de modo que seja impedida de migrar-se no sentido da segunda camada.

[0049] O substrato, por exemplo, glicose, poderá estar presente em várias formas, incluindo, dissolvido em uma estrutura de hidrogel hidratado, presente como um sólido lentamente dissolvente, ou encapsulado dentro de outra estrutura para liberação lenta.

[0050] É preferível dispor o curativo para apresentar um excesso de substrato, assim o curativo é capaz de funcionar em uso para gerar peróxido de hidrogênio por um período de tempo prolongado, por exemplo, pelo menos uma hora, por exemplo, de 1 a 10 horas ou mais.

[0051] A combinação, de acordo com a invenção é tipicamente um kit de embalagem compreendendo uma combinação de uma solução aquosa e um curativo compreendendo uma fonte de peróxido de hidrogênio, conforme descrita acima.

[0052] Os componentes são, tipicamente, em embalagens seladas, impermeáveis à água.

[0053] A invenção será agora ilustrada, por meio de exemplo, e com referência às figuras seguintes, em que:

[0054] Figura 1 é um gráfico mostrando corrente medida versus tempo que mostra geração de peróxido de hidrogênio.

[0055] Figura 2a é um gráfico mostrando curvas de eliminação do fungo T. rubrum.

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11/17 [0056] Figura 2b é outro gráfico mostrando curvas de eliminação do fungo T. rubrum.

Exemplos

Sumário Experimental [0057] Discos de teste foram impregnados em soro a 50% contendo 10⁷ células fúngicas para recriar um alto ambiente proteico. Os discos foram colocados em um leito de gel, também contendo soro a 50% para imitar contato com o leito ungueal. Os discos foram dosados com soluções aquosas de peroxidase ou lactoperoxidase de rábanosilvestre, cada conjunto de discos apresentando diferentes níveis de dose das enzimas. Discos de controle foram deixados sem peroxidase de qualquer tipo. O experimento foi iniciado aplicando peróxido de hidrogênio gerando bandagens estratificadas (vide abaixo) às superfícies de maior parte dos discos de teste, e essas foram deixados no local por períodos de tempo definidos. Alguns discos foram deixados descobertos como controles experimentais adicionais para determinar como bem as células fúngicas sobreviveram quando deixadas não tratadas. Sob intervalos de tempo ajustados, discos representativos foram removidos para amostragem, e os números de células fúngicas sobreviventes foram determinados por meio de métodos padrões. Esses experimentos mostraram que peróxido de hidrogênio transferido pelas bandagens em gel estratificadas pôde eliminar as células fúngicas, se deixadas no local por diversas horas. Contudo, a taxa de eliminação fúngica foi fortemente acentuada pela presença adicional de enzima peroxidase em contato com o fungo. A enzima peroxidase de rábano-silvestre foi mais potente do que lactoperoxidase, e o efeito geralmente aumentou com dose.

Exemplo 1: Construção e avaliação de um peróxido de hidrogênio doando bandagem estratificada em camadas em termos de geração de peróxido de hidrogênio.

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12/17 [0058] Geração de peróxido de hidrogênio (H₂O₂) foi medida usando eletroquímica (cronotécnica lenta). Um curativo foi colocado em sensor feito sob medida, um potencial aplicado através dos eletrodos e a presença de H₂O₂ medida.

[0059] O curativo foi compreendido de duas camadas: (i) a camada hidrogel hidratada e (ii) a camada de ativação de película seca contendo glicose oxidase.

Preparação de Camada 1: uma placa de hidrogel foi preparada como segue:

[0060] Preparou-se uma solução aquosa de ácido 2-acrilamido-2metilpropanossulfônico de sódio a 20% (Lubrizol Corporation, solução aquosa de estoque a 50%), glicose a 10% (Fisher Scientific, grau analítico), lactato de zinco a 0,1% (Aldrich). Diacrilato Peg 700 (Aldrich) foi incluído como reticulador e 2-hidróxi-2-metil propiofenona (Aldrich) como o fotoiniciador. 6,5 g e 13 g da solução foram dispensados em uma placa de Petri 10 x 10 cm e submetidas à luz UV 100 mW/cm² por 20 segundos.

Preparação de Camada 2: uma película seca foi preparada como segue:

[0061] Preparou-se uma solução aquosa de solução de PVA a 25% p/p (álcool polivinílico Gohsenol, código EG05P fornecido por Nippon Gohsei). Além disso, 40,3 mg de glicose oxidase (Biocatalysts, 150.000 unidades/grama) + 300 mg de histidina (Sigma) + 150 mg de ácido cítrico (Fisher, grau analítico) + 75 mg de iodeto de potássio (Sigma) foram dissolvidos em 2 ml de água de grau analítico (Fisher). 30 g de solução de PVA a 25% foram misturados com a solução de glicose oxidase/histidina/ácido cítrico/iodeto de potássio e deixados sedimentar-se para remover quaisquer bolhas de ar capturadas. A mistura foi em seguida secada abaixo de 50^oC para fornecer uma película seca de 40 - 45 mícrons de espessura.

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Análise Eletroquímica:

[0062] Um sensor feito sob medida de 3 eletrodos (funcionamento, contador e referência) foi usado para a análise. Instrumentação Ezescan e software foram adquiridos de Whistonbrook Technologies, Luton, RU. Os eletrodos foram montados em uma caixa de Teflon e colocados em uma incubadora a 25^oC. Em uso, 20 ml de solução KCl 0,1 M foram aplicados ao eletrodo final do sensor. Seções de 1,5 x 2 cm da lâmina de hidrogel de Camada 1 (6,5 g e 13 g em peso de vazão) foram cortadas e colocadas na solução de KCl, assegurando ainda contato com os eletrodos e que nenhuma bolha de ar fosse capturada entre o gel e o sensor. Os géis foram cobertos para reduzir evaporação. Um potencial de + 950 mV foi aplicado sobre os eletrodos e a corrente gerada foi registrada. Quando uma corrente constante de linha de referência foi obtida, seções de 1,5 x 2 cm da película seca foram aplicadas às superfícies das placas de hidrogel de Camada 1. A corrente gerada foi registrada. Vide Figura 1:

[0063] Figura 1 demonstra que, quando um potencial de + 950 mV foi aplicado à placa de hidrogel de Camada 1 sobre o sensor, há muito pouca corrente de fundo mensurável, desse modo há pouca interferência dos materiais usados na preparação do hidrogel nesse dado potencial. Após aplicação da película de enzima seca (em torno de 4.000 segundos no gráfico), a química de glicose oxidase é ativada e H₂O₂ é produzido, o qual rapidamente difundiu um pouco o hidrogel de Camada 1 para o eletrodo, em que um aumento significativo na corrente é medido. Isso claramente mostra que o sistema de camada dupla gera H₂O₂ no sistema de camada dupla e transfere-o para a superfície de contato. A corrente gerada em relação ao platô principal do gráfico (entre 5.000 e 13.000 segundos) geralmente iguala-se em torno de H₂O₂ a 0,1% (aq.). Além disso, as diferentes espessuras do hidrogel de Camada 1 produziram curvas muito similares, com a exce19/33

14/17 ção que o gel mais fino (6,5 g de gel por área de 10 x 10 cm) forneceu uma corrente de pico significativamente maior (portanto, concentração de H₂O₂) na hora de aplicação (em torno de 3.000 segundos após ativação). A medição de H2O2 em seguida, gradualmente, declina até as curvas retornarem a uma resposta plana em torno de 40.000 segundos (aproximadamente, 11 horas) após ativação.

Exemplo 2: Preparação de amostras iniciadoras contendo peroxidase como soluções aquosas.

[0064] Um veículo básico adequado para a peroxidase foi preparado como segue: tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 6-6,5 foi misturado com tensoativo Tween 20 a 0,2% p/p (Sigma). A este, enzima peroxidase foi dissolvida para fornecer uma concentração final de 100 mg/ml.

[0065] A formulação veículo poderá ser alterada para proporcionar diferentes propriedades conforme exigidas. Por exemplo, a concentração e tipo do sal tampão poderão ser alterados para proporcionar uma faixa de limites de tamponamento e alterar o pH da solução, dependendo da aplicação e do pH ótimo da enzima (por exemplo, peroxidase) usada: a concentração e tipo de tensoativo poderão ser alterados para proporcionar diferentes características de umectação; espessantes poliméricos adicionais poderão ser incluídos para reduzir as características de fluxo do fluido (por exemplo, para ajudar a impedir que a solução escorrana unha uma vez aplicada); o nível de enzima usado poderá também ser alterado para permitir uma ação mediada por peroxidase mais forte ou reduzida em, ou dentro da estrutura tratada. Aditivos adicionais poderão ser também incorporados para aperfeiçoar a eficácia do curativo, por exemplo, agentes antimicrobianos.

Exemplo 3: Teste do sistema de tratamento antifúngico da invenção contra Trichophyton rubrum em um sistema modelo.

[0066] Um modelo de difusão estática de leito plano in vitro foi uti20/33

15/17 lizado, com base nas técnicas descritas, in In vitro diffusion bed, 3-day repeat challenge ‘capacity’ test for antimicrobial wound dressings, J. Greenman, R. M. S. Thorn, S. Saad, A. Austin International Wound Journal (2006), 3, 322-329.

[0067] O inóculo de teste foi preparado emulsificando biomassa de crescimento de superfície madura de Trichophyton rubrum em Ágar batata-dextrose em meio líquido Saboraud, removendo a suspensão, misturando em vórtice, e em seguida permitindo que partículas grandes sedimentem-se fora de solução. A suspensão resultante foi ajustada via espectrofotometria para fornecer um inóculo padronizado em torno de 10⁷ ufc ml^-1, o qual é suficientemente denso para permitir que quaisquer efeitos fungicidas sejam detectados (redução > 10³ ufc é observada conforme indicativa de um efeito cidal).

[0068] Um volume de 100 ml dos inóculos definidos foi ressuspenso em discos de celulose replicativos na superfície de um leito de teste poli-AMPS (cuja formulação é idêntica ao hidrogel de Camada 1 conforme descrito no Exemplo 1, mas vazado como uma placa de gel de 25 g por placa de 10 x 10 cm), por meio do que produtos de teste podem em seguida ser aplicados (Figura 1). Um curativo de duas camadas foi testado. As camadas foram preparadas conforme descritas no Exemplo 1. Enzimas lactoperoxidase ou peroxidase de rábanosilvestre foram preparadas por meio de dissolução em água analítica sob a concentração exigida antes de uso. Pensa-se que lactoperoxidase poderá potencializar quaisquer efeitos antifúngicos do novo tratamento tópico, e para alguns dos discos de celulose dos sistemas experimentais foram pré-tratados com uma solução de lactoperoxidase ou peroxidase de rábano-silvestre para verificar efeitos diferenciais. A faixa de teste experimental proposto e condições de controle são mostradas na tabela 1.

[0069] Os curativos de duas camadas foram ativados unindo as

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16/17 duas camadas juntamente. A placa de hidrogel foi colocada em contato com o disco de celulose e a película seca em seguida aplicada à superfície mais elevada da placa de hidrogel. Leitos de teste foram incubados a 28^oC, e sob intervalos de tempo definidos (0, 1, 2, 4 e 24 horas); os discos de celulose foram removidos, ressuspensos em PBSa, consecutivamente, diluídos e em seguida colocadas em placas espirais sobre ágar dextrose Saboraud. Após incubação (5 dias) o número de sobreviventes dermatófitos sob diferentes pontos de tempo após exposição a tratamento foi determinado por meio de contagem de colônias (disco^-1 ufc). Os resultados foram representados por meio de gráfico e analisados usando GraphPad Prism (v.4).

Claims

Resultados [0070] Os resultados experimentais são mostrados na figura 2 e é evidente que todas as condições de teste obtiveram efeitos antimicrobianos significativos, e mediante 3 horas de exposição pós-tratamento nenhuma célula viável pode ser detectada sob qualquer dos tratamentos tópicos. Lactoperoxidase no disco parece potencializar os efeitos do tratamento tópico de uma maneira dependente de concentração, embora 1 mg ml^-1 não apresentasse nenhum efeito significativo comparado com o tratamento de teste separado (Figura 2a). Peroxidase de rábano-silvestre no disco também potencializa os efeitos do tratamento tópico de uma maneira dependente de concentração, em que mesmo a concentração mais baixa (1 mg ml^-1) apresenta um efeito significativo (Figura 2b). Dentre amostras de controle, há um ligeiro declínio in números de células de T. rubrum, mostrando que esse organismo não é muito bem suportado nas placas de ensaio do leito de teste fúngico, particularmente, após 24 horas de incubação; embora todos os tratamentos de teste mostrassem efeitos significativos comparados com controles. De modo interessante, parece que o controle de tratamento inativo é oferecer alguma proteção ao organismo comparado com o

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17/17 controle descoberto em 24 horas.

Conclusões [0071] É evidente a partir dos resultados que o tratamento tópico isolado apresenta um efeito antimicrobiano significativo em T. rubrum, reduzindo números de células viáveis para baixar o ponto mínimo de detecção para esse sistema (células 2 x 10²) dentro de 3 horas, indicativo de um efeito fungicida (redução > 3 vezes log). Tanto peroxidase quanto peroxidase de rábano-silvestre potencializam os efeitos do tratamento tópico, embora seja evidente que a peroxidase de rábanosilvestre é mais eficaz.

Tabela 1: Teste experimental e condições de controle para determinar o potencial antifúngico de vários novos tratamentos.

Controle 1 Disco descoberto Controle 2 Tratamento tópico inativo Teste 1 Tratamento tópico ativo Teste 2 Tratamento tópico ativo + 1 mg/ml de lactoperoxidase em disco Teste 3 Tratamento tópico ativo + 100 mg/ml de lactoperoxidase em disco Teste 4 Tratamento tópico ativo + 500 mg/ml de lactoperoxidase em disco Teste 5 Tratamento tópico ativo + 1 mg/ml de peroxidase de rábano-silvestre em disco Teste 6 Tratamento tópico ativo + 100 mg/ml de peroxidase de rábano-silvestre em disco Teste 7 Tratamento tópico ativo + 500 mg/ml de peroxidase de rábano-silvestre em disco

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1/2 reivindicações

1. Kit embalado, caracterizado pelo fato de que compreende uma combinação de um líquido aquoso e um curativo compreendendo uma fonte de peróxido de hidrogênio para uso no tratamento de uma infecção de superfície corporal humana ou animal, em que a dita superfície corporal é uma região ungueal; o dito curativo está em uma condição hidratada, contendo água suficiente para formar uma junção de contato líquido entre a região ungueal e o curativo;

o dito curativo está na forma de um gel aquoso; a dita fonte de peróxido de hidrogênio é peróxido de hidrogênio per se; e a resistência osmótica do dito líquido aquoso é a mesma ou similar àquela do líquido no curativo para acentuar fluxos de fluido e soluto desejados.

2. Kit embalado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os componentes são, em embalagens seladas, impermeáveis à água.

3. Kit embalado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a infecção de superfície corporal é uma infecção fúngica.

4. Kit embalado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a superfície corporal é uma região ungueal humana.

5. Kit embalado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o líquido aquoso compreende uma enzima peroxidase.

6. Kit embalado de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a peroxidase compreende lactoperoxidase, peroxidase de rábano-silvestre ou uma mistura das mesmas.

Petição 870180061470, de 17/07/2018, pág. 6/11

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7. Kit embalado de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que a concentração de enzima peroxidase no líquido aquoso situa-se na faixa de 1 a 1.000 pg/ml.

8. Kit embalado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o líquido aquoso compreende tensoativos e/ou solventes.

9. Kit embalado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o curativo doa água à região ungueal em uso.

10. Kit embalado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o curativo compreende um material hidrogel hidratado.

11. Kit embalado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a fonte de peróxido de hidrogênio é um dispositivo de geração de peróxido de hidrogênio compreendendo enzima oxirredutase, uma fonte de oxigênio e uma fonte de substrato para a enzima.

12. Kit embalado de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a enzima oxirredutase compreende glicose oxidase.

13. Kit embalado de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que o curativo compreende primeira camada e segunda camada distintas, a primeira camada compreendendo enzima oxirredutase e estando localizada na proximidade das partes externas do curativo, a segunda camada compreendendo a fonte de substrato e estando localizada na proximidade das partes internas do curativo.

Petição 870180061470, de 17/07/2018, pág. 7/11

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Fig 1

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Fig 2

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