KR101698927B1

KR101698927B1 - 다기능 셀룰라아제의 세포표면 발현방법 및 이의 용도

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Publication number: KR101698927B1
Application number: KR1020150111218A
Authority: KR
Inventors: 송재준; 최종현; 고경철; 이빛나; 정대은
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2015-08-06
Filing date: 2015-08-06
Publication date: 2017-01-23

Abstract

본 발명은 다기능 셀룰라아제(multifunctional cellulase)의 세포표면 발현방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 상세하게는 소의 루멘(rumen) 부유물에서 추출한 메타게놈 라이브러리로부터 로봇 기반의 초고속 탐색 시스템을 이용하여 스크리닝한, 엑소-셀룰라아제, 엔도-셀룰라아제 및 β-글루코시다아제의 기능을 모두 가지고 있는 다기능 셀룰라아제를 세포 외막 단백질 C(Omp C)를 부착 모티프로 하여 대장균의 세포표면에 발현하는 방법에 관한 것이다.

Description

다기능 셀룰라아제의 세포표면 발현방법 및 이의 용도{Method for displaying multifunctional cellulolytic enzyme in bacterial cell surface and use thereof}

본 발명은 다기능 셀룰라아제를 대장균 세포의 표면에 발현하는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

세포표면 발현(Cell surface display)은 박테리아, 효모, 또는 동물세포의 표면에 발현하는 단백질을 세포 부착 모티프(cell anchoring motif)로 이용하여 외래 단백질 또는 펩티드를 세포표면에 안정적으로 발현시키는 기술이다(Cornelis P (2000) Curr Opin Biotechnol 11 (5):450-454). 이 기술은 1980년대 중반에 스미스가 최초로 펩티드 또는 작은 단백질을 필라멘터스 파아지(filamentus phage)의 pⅢ와 융합하여 발현시킴으로써 최초로 알려졌으며, 표면 발현 시스템(surface expression system)이라고 명명하였다. 이후, 미생물의 분비 기작에 대한 연구가 활발히 진행되면서 원하는 단백질을 미생물의 표면에 안정적으로 발현시키는 세포표면 발현(cell surface display)이라는 새로운 분야가 등장하였다. 처음에는 파아지 표면이 박테리아보다 단순하기 때문에 파아지 표면에 외래 단백질을 발현시키는 연구가 진행되었으나, 파아지를 이용하는 경우, 삽입되어 표면에 발현될 수 있는 외래 단백질의 길이가 매우 제한될 뿐만 아니라 응용 범위에도 한계가 있어, 점차 박테리아를 이용한 세포표면 발현에 관심을 가지게 되었다.

이와 같이 미생물의 세포표면 발현 기술은 단백질 라이브러리 스크리닝부터 바이오 연료의 생산에 이르기까지 다양한 생물공학적 응용분야인 백신 및 항체 개발, 펩티드 라이브러리 스크리닝, 전세포 바이오 촉매를 이용하는 바이오융합 및 바이오부착(bioadsorption) 등의 분야에 응용되고 있으며, 작은 단백질 또는 펩티드의 세포표면 발현 시스템으로 가장 널리 활용되는 균주는 대장균(Escherichia coli)이다. 대장균 표면에 발현하는 단백질 시스템은 C-말단 제거-융합 전략으로 적용된 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)의 외막 단백질 C(outer membrane protein C, OmpC)를 '부착 모티프(anchoring motif)'로 사용하여 큰 단백질을 대장균의 표면에 효과적으로 발현시킬 수 있다는 것이 알려져 있다(Choi JH et cl., (2005) J Microbiol Biotechnol 15 (1):141-146).

한편, 셀룰로오스는 글리코시드 가수분해효소인 (1) 셀룰로오스 폴리머의 내부를 무작위 공격하는 엔도-β-1,4 글루카나아제(endo-β-1,4-glucanase); (2) 셀룰로오스 사슬의 비환원 또는 환원 말단으로부터 셀로바이오스를 제거하는 엑소-β-1,4-셀로바이오하이드롤라아제(exo-β-1,4-cellobiohydrolase); 및 (3) 셀로-올리고사카라이드(cello-oligosaccharides) 및 셀로바이오스(cellobiose)를 포도당(glucose)으로 가수분해하는 β-글루코시다아제(β-glucosidase, BGL)에 의해 포도당으로 분해될 수 있다(Beguin P et al., (1994) FEMS Microbiol Rev 13:25-58; Clarke AJ (1997) enzymology and biotechnology. Technomic, Lancaster, pp 23-68; Henrissat B et al., (1985) Biotechnology 3: 722-726).

최근에 형광 기반의 HTS(high-troughput screening) 어세이 시스템(Ko KC et al., (2013) J Microbiol Methods 94:311-316; Ko KC et al., (2011) Appl Microbiol Biotechnol 89:1453-1462)을 이용하여 소의 루멘(rumen) 부유물에서 추출한 메타게놈 라이브러리로부터 셀룰라아제 활성을 가지는 celEx-BR12 유전자를 선별하였으며, 선별된 셀룰라아제가 엑소-셀룰라아제, 엔도-셀룰라아제 및 자일라나아제(xylanase) 활성을 갖는 다기능성 효소(multifunctional enzyme)라는 것을 한국공개특허 제2014-0111848호 메타게놈 유래 신규 셀룰라아제 및 이의 제조방법에 개시하였으나, 하나의 유전자(single gene)로부터 엔도-셀룰라아제 및 엑소-셀룰라아제 기능을 갖는 다기능적 셀룰라아제를 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose, CMC)를 이용하며, 대장균의 세포표면에 이종 간 발현하는 방법에 대해서는 언급된 바 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 다기능 셀룰라아제를 대장균 세포의 표면에 발현하는 방법을 제공하고, 본 발명의 발현방법으로 제조된 대장균 세포의 표면에 부착되어 있는 OmpC에 융합된 셀룰라아제 및 이를 분리정제한 셀룰라아제의 활성을 확인하였고, 대장균 세포의 표면에 부착하여 발현된 셀룰라아제의 경우, 반복 재사용 가능함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 5'에서 3' 방향으로, 세포 외막 단백질 C(Omp C)의 N-말단으로부터 7번째 루프에 포함된 300번째 글루타민까지의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자, 서열번호 8의 아미노산 서열을 암호화하는 셀룰라아제 유전자 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 암호화하는 베타-글루코시다아제 유전자를 포함하는 셀룰라아제의 세포표면 발현 벡터를 제조하는 단계;

(2) 상기 발현 벡터를 대장균에 도입하여 형질전환된 대장균을 획득하는 단계; 및

(3) 상기 형질전환된 대장균을 배양하는 단계;를 포함하는 다기능 셀룰라아제의 세포표면 발현방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 5'에서 3' 방향으로, 세포 외막 단백질 C(Omp C)의 N-말단으로부터 7번째 루프에 포함된 300번째 글루타민까지의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자, 서열번호 8의 아미노산 서열을 암호화하는 셀룰라아제 유전자 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 암호화하는 베타-글루코시다아제 유전자를 포함하는 발현 벡터를 도입하여 형질전환된, 다기능 셀룰라아제를 세포표면에 발현하는 대장균을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 대장균을 배양하여 대장균의 표면에 다기능 셀룰라아제를 발현시키는 단계를 포함하는 세포표면에서 발현되는 다기능 셀룰라아제의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 세포표면에서 발현되는 다기능 셀룰라아제의 제조방법으로 제조된 대장균 세포표면에서 발현되는 다기능 셀룰라아제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 대장균 세포표면에서 발현되는 다기능 셀룰라아제를 기질에 처리하여 기질을 분해하는 방법을 제공한다.

본 발명은 다기능 셀룰라아제를 대장균 세포의 표면에 발현하는 방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 상세하게는 외래 단백질을 세포표면에 부착하여 발현시킬 수 있는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 유래의 세포 외막 단백질 C(Outer membrane protein; OmpC)의 변형된 유전자를 세포표면 발현 모티프로 이용하여 다기능 셀룰라아제를 세포표면에 발현하는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 발현방법에 따라, 대장균 세포의 표면에 발현된 다기능 셀룰라아제는 재사용이 가능할 뿐만 아니라 분리정제가 용이하므로 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 E. coli MC4100 pTrc99A 및 pTOCBR12로부터 획득한 외막단백질의 SDS-PAGE 분석결과이다. M, 분자량의 크기(kDa); (-), E. coli MC4100(pTrc99A); (+), E. coli MC4100(pTOCBR12); OmpC-CBR12, E. coli K12 OmpC-융합된 CelEx-BR12 셀룰라아제; OmpC, E. coli MC4100 OmpC; OmpA, E. coli MC4100 OmpA.
도 2는 재조합 CelEx-BR12를 갖는 E. coli MC4100의 FACS 분석결과이다. (-), E. coli MC4100 (pTrc99A); (+), E. coli MC4100 (pTOCBR12).
도 3은 OmpC-셀룰라아제 융합 단백질이 내재된 E. coli MC4100에 대한 세포 전체(A) 및 외막 단백질 분획(B)의 엑소-셀룰라아제의 활성을 확인한 결과이다.
도 4는 세포표면-발현된 CelEx-BR12 셀룰라아제가 내재된 E. coli MC4100의 재사용 가능성에 대한 시간-프로파일을 나타낸 것이다.
도 5는 세포표면에 발현된 셀룰라아제를 포함하는 대장균이 탄소원으로 CMC를 사용하여 성장하는 것을 확인한 결과이다.
도 6은 발현벡터 pTOCBR12-Bgl의 유전자 지도이다.

본 발명은 (1) 5'에서 3' 방향으로, 세포 외막 단백질 C(Omp C)의 N-말단으로부터 7번째 루프에 포함된 300번째 글루타민까지의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자, 서열번호 8의 아미노산 서열을 암호화하는 셀룰라아제 유전자 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 암호화하는 베타-글루코시다아제 유전자를 포함하는 셀룰라아제의 세포표면 발현 벡터를 제조하는 단계;

(3) 상기 형질전환된 대장균을 배양하는 단계;를 포함하는 다기능 셀룰라아제의 세포표면 발현방법에 관한 것이다.

상기 단계 (3) 이후에, 대장균의 표면에 발현된 셀룰라아제를 분리정제하는 단계;를 더 포함할 수 있으며, 상기 단계 (3)에서 대장균의 배양은 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose)를 탄소원으로 이용하는 것이 바람직하지만, 이에 한정하지 않으며, 글루코오스를 포함하여 일반적으로 사용하는 에너지원은 어느 것이든 무방하게 사용할 수 있다.

본 발명의 세포표면에 다기능 셀룰라아제를 발현시키기 위해서는 표면 발현 모체가 매우 효율적인 분비신호 서열 및 세포 외막 표면에 안정되게 부착될 수 있는 목표신호(targeting signal)를 가지고 있고, 크기가 큰 외래 단백질의 전달도 가능하게 하며, 많은 양을 안정적으로 발현시킬 수 있어야 하므로, 세포표면 발현 모체의 대상으로서 살모넬라에서 유래한 세포 외막 단백질 C(OmpC)(서열번호 12)를 선택하였다.

대장균의 주 포린 단백질(major porin protein)인 세포외막 단백질 C은 21개의 분비신호 서열을 포함하여 367개 아미노산으로 구성되어 있으며, 세포외막 단백질 F(OmpF)와 더불어 배지 내의 삼투압(osmolarity)에 반응하여 발현되는 단백질로서, 단위 세포당 약 105개의 분자가 발현될 만큼 다량으로 발현되는 세포외막 단백질이다(Mizuno, T., et al., J. Biol. Chem., 258:6932-6940, 1983).

세포 외막 단백질 C의 세포막 위상(membrane topology)을 살펴보면, 단백질의 N-말단과 C-말단이 주변 세포질에 존재하고, 8개의 루프(loop)는 세포외막 바깥쪽으로, 7개의 루프는 주변 세포질 쪽으로 돌출되어 있고(Puente, J., et al., Gene, 156:1-9, 1995), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)에서 유래한 세포외막 단백질 C의 경우, 세포 외막 바깥쪽으로 돌출되어 있는 8개의 루프 중 4번째와 6번째 루프에 각각 로타바이러스(rotavirus) VP4 캡시드 단백질 에피토프(epitope) RV160(22개의 아미노산)와 RV252(28개의 아미노산)을 성공적으로 발현시켰다(Puente, J., et al., Gene, 156:1-9, 1995)는 것이 알려져 있어, 본 발명에서는 살모넬라에서 유래한 세포외막 단백질 C(OmpC)의 N-말단으로부터 세포외막 바깥쪽으로 돌출된 8번째 루프까지의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자, 바람직하게는 N-말단으로부터 세포외막 바깥쪽으로 돌출된 7번째 루프까지의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자, 가장 바람직하게는 최소한 N-말단으로부터 세포 외막 바깥쪽으로 돌출된 5번째 루프까지의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 포함하는 OmpC의 변형된 재조합 유전자를 부착모티프로 발현시키고, 이의 C-말단 부위에 셀룰라아제를 암호화하는 유전자를 융합시킴으로써, 세포 표면에 셀룰라아제를 발현시키는 것이다.

광의의 셀룰라아제는 그 작용특성에 따라 엔도-β-1,4-글루카나아제(endo-β-1,4-glucanase), 엑소-β-1,4-글루카나아제(exo-β-1,4-glucan cellobiohydrolase; exocellobiohydrolase), 베타-글루코시다아제(β-glucosidase ; cellobiase)로 분류된다. 엔도-β-1,4-글루카나아제는 β-1,4-글루칸에 엔도형으로 작용하여 셀로올리고당을 생성하며, 결정성의 셀룰로오스에 작용하기 어렵다. 엑소-β-1,4-글루카나아제는 아비셀(Avicel) 등의 결정성의 셀룰로오스에도 작용하여 아비셀라아제(avicelase)라고 부르고 엑소 형으로 작용하여 셀로비오스(cellobiose)를 생성하고, 베타-글루코시다아제는 셀로올리고당의 비환원 말단에서 글루코오스를 유리하는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 기존의 셀룰라아제들은 셀룰로오스를 분해하는 과정에서 속한 유형에 따라 부분적인 역할만 할 수 있을 뿐 하나의 효소가 셀룰로오스를 포도당으로 직접 분해할 수는 없기 때문에 다수의 효소제를 혼합해서 사용해야 한다는 불편함을 가지고 있다. 하지만 본원 발명의 셀룰라아제는 다기능성으로, 엑소-셀룰라아제, 엔도-셀룰라아제 및 베타-글루코시다아제의 활성을 모두 갖는 것이 특징이다.

이와 같은 다기능성 셀룰라아제를 선별하기 위하여, 분자생물학적 방법(Sambrook et al., Molecular cloning, 1989)으로 메타게놈 DNA 라이브러리(metagenomic library)를 제작하였으며, 소의 루멘 부유물에서 메타게놈 라이브러리 제작을 위한 DNA를 추출하여 포스미드 라이브러리(fosmid library)를 구축하기 위해, 포스미드 pCC1FOS 벡터에 연결한 후 λDNA 패키징 키트에 포장하여 대장균(E. coli) EPI300-T1에 형질전환하였다. 메타게놈은 특정 자연환경에 존재하는 모든 미생물의 유전체 집합으로 정의되고 있으며, 환경 시료로부터 추출한 유전체 또는 유전자를 포함하는 클론을 총칭하여 메타게놈이라고 부르고 있다 (Handelsman, J. et al., Chem Biol., 5:R245, 1998). 상기 메타게놈 라이브러리로부터 다기능 셀룰라아제를 선별하기 위하여 로봇기반의 초고속 탐색 시스템을 이용하여 20,000여 개의 클론을 분석하여 다기능 셀룰라아제를 선별한 것이다.

본 발명에서, "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열이 작동가능하도록 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능을 수행할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명에서 플라스미드 (plasmid) 및 벡터(vector)는 때로 상호 교환적으로 사용된다.

상기 기질은 셀룰라아제가 분해할 수 있는 물질로서, 셀룰로오스 등을 예로 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 대장균의 표면에 발현된 다기능 셀룰라아제는 반복하여 재사용 가능한 것으로, 1 내지 5회 반복 사용할 수 있으며, 이에 제한하지 않는다.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

[재료 및 방법]

카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose, CMC) 및 4-methylumbelliferyl-β-D-cellobioside (MeUmbG₂)는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터 구입하여 사용하였고, 다른 시약들은 상업적으로 판매되는 최고 순도의 것을 사용하였다.

[균주 및 플라스미드]

본 발명에서 모든 플라미드의 숙주로 사용된 균주는 E. coli MC4100 균주 [F2 araD139 D(argF-lac)U169 rpsL150 (Strr) relA1 flbB5301 deoC1 ptsF25 rbsR] (ATCC 35695)이다. pTBgl(BGL 유전자가 삽입된 pTrc99A) 플라스미드는 전남대학교로부터 분양받아 사용하였다.

1. 대장균에서 OmpC-융합된 CelEx-BR12 유전자에 대한 발현벡터의 설계

CelEx-BR12(GenBank Accession No. KC963960)을 코딩하는 최적화된 유전자(celEx-BR12opti)는 pTrc99A(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) 플라스미드에 클로닝하였다.

대장균 K-12 OmpC에서 세포 외막 바깥쪽으로 돌출되어 있는 8개의 루프 중 C-말단으로부터 2번째 루프의 글루타민(glutamine, Gln₃₀₀)을 융합포인트로 선정하였고, OmpC-융합된 CelEx-BR12(OCBR12)은 대장균 K-12 균주와 CelEx-BR12로부터 잘려진 OmpC의 올리고뉴클레오티드 프라이머(서열번호 1 내지 4)를 이용하는 오버래핑 PCR 기법으로 합성하였다.

OmpC -F: 5'-AGG AAA CAG ACC ATG AAA GTT AAA GTA CTG TCC-3'(서열번호 1)

OmpC_CBR12-R: 5'-TTC CCG CTT GCT GCA GGT AAG CCA GGG-3'(서열번호 2)

(상기 밑줄은 벡터와 상동성을 갖는 부분이고, 볼드체는 개시코돈이다)

CBR12_OmpC-F: 5'-TTA CCT GCA GCA AGC GGG AAA GGT CAA TAA-3'(서열번호 3)

CBR12-R: 5'-CGA CTC TAG AGG ATC TTA TTA ATG GTG ATG ATG GTG ATG TTT CTC TAG GGG CTT TCC T-3' (서열번호 4)

(상기 밑줄은 벡터와 상동성을 갖는 부분이고, 볼드체는 종결코돈이다)

상기 오버래핑 프라이머들(서열번호 1 내지 4)을 이용한 중합효소연쇄반응(PCR)은 대략 2kb 단편 수율을 나타냈으며, 상기 PCR에 의해 증폭된 DNA 단편은 In-Fusion Cloning Kit(Clontech Laboratories, Mountain View, CA)를 이용하여 제한효소 NcoI 및 BamHI로 절단하고 삽입하여 pTOCBR12 플라스미드를 제작하였다.

또한, OmpC(서열번호 12)에 융합된 CelEx-BR12(서열번호 8) 및 베타-글루코시다아제(BGL) 효소(서열번호 10)를 코딩하는 유전자(서열번호 7, 9 및 11로 이루어진 CelEx-BR12, 베타-글루코시다아제(BGL) 및 OmpC 유전자)를 포함하는 플라스미드 pTOCBR12-Bgl를 제작하기 위하여, 우선 pTBgl(BGL 유전자가 pTrc99A에 클로닝된 플라스미드) 플라스미드를 주형으로 하고, 하기의 올리고뉴클레오티드 프라이머(서열번호 5 및 6)를 이용하여 PCR 증폭함으로써 DNA 단편을 획득하였다.

Bgl-F: 5'-GCA GGC ATG CAA GCT T AT GAT GAT CGA AGC CAA GA-3'(서열번호 5)

Bgl-R: 5'-CAA AAC AGC CAA GCT TTT ATC ATC CCG GCT TGT GGT T-3'(서열번호 6)

(상기 밑줄은 벡터와 상동성을 갖는 부분이고, 볼드체는 종결코돈이다).

상기 PCR 증폭은 TProfessional Thermocycler (Biometra, Goettingen, Germany)를 이용하였으며, 이후, 플라스미드 pTOCBR12를 제한효소 HindIII으로 절단한 후, 상기 서열번호 5 및 6의 프라이머를 이용하여 증폭된 DNA 단편을 삽입하여 재조합 플라스미드 pTOCBR12-Bgl를 수득하였다.

또한, 대장균(E. coli) XL1-Blue는 플라스미드의 클로닝 및 유지에 대한 숙주세포로 사용하였고, 상기 제조한 재조합 플라스미드를 대장균 MC4100에 형질전환시킨 재조합 대장균 단백질을 생산하였다.

2. 세포표면에서 재조합 OmpC-융합된 CelEx-BR12 효소의 발현 및 분리

E. coli MC4100(pTrc99A) 및 E. coli MC4100(pTOCBR12) 균주는 30℃의 온도로, 50㎍/㎖의 앰피실린을 포함하는 3㎖의 LB(Luria-Bertani) 배지에서 성장시켰다. 상기 배양한 재조합 세포는 1mM의 IPTG(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여, 600nm(OD₆₀₀)에서의 광학활성이 0.4 내지 0.6이 되도록 유도하였다. 외막 단백질(OMP) 분획은 Triton X-100으로 배양 유도된 비용해성 분획으로부터 준비하였고, SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 분석하였다(도 1).

한편, 상기 배양한 세포들은 7,000g 이상으로, 10분 동안 원심분리하였고, 차가운 10mM의 Na₂HPO₄(pH 7.2) 완충용액으로 세척하였다. 이후, 상기 세포들은 1㎖의 차가운 10mM의 Na₂HPO₄(pH 7.2) 완충용액으로 다시 녹이고, VCX750 sonicator(Sonics Materials Inc., Newtown, CT)를 이용하여 세포를 파괴하였다. 세포 파편과 파괴되지 않은 원형 그대로의 세포들은 상온에서 12,000rpm으로 2분 동안 원심분리하여 제거하였고, 상등액을 다시 상온에서 12,000rpm으로 30분 동안 원심분리하여 막 단백질 분획을 회수하였다. 회수된 막 단백질 분획은 2%(w/v) Triton X-100을 포함하는 500㎕의 10mM Na₂HPO₄ (pH 7.2)에 녹여, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션 하였다. 이후, 비용해성 분획은 4℃에서 12,000rpm으로 30분 동안 원심분리하여 회수하였다. 회수한 비용해성 분획은 10mM의 Na₂HPO₄(pH 7.2) 완충용액으로 세척한 후, 50㎕의 PBS(pH 7.4) 완충용액에 재현탁하여 준비하였다.

3. 형광 활성을 갖는 세포의 분류

정제된 CelEx-BR12 효소를 토끼에 예방 접종하여 생산된 CelEx-BR12 항혈청은 고객 맞춤형 영진 프론티어(주)의 항체생산 서비스에 의해 제조되었다. 영진 프론티어(주)에 의해 실시된 동물의 관리 및 실험은 영진 프론티어(주)의 기관동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인을 받아 실시하였고, 동물 처리 프로토콜은 기관 및 국제 지침에 따라 수행하였다.

재조합 OMPC-CELEX-BR12 융합 단백질의 표면 위치 파악은 유세포 분석기로 분석하였다. pTrc99A(MC4100)는 음성 대조군으로 사용하였고, 수확한 재조합 세포를 PBS 완충용액으로 3번 세척한 후, 1% 소 혈청 알부민(BSA)과 토끼 폴리클로날 항-CELEX-BR12 항체를 함유(1:25, v/v)하는 PBS 완충용액으로 재용해시켜 90분간 상온에서 인큐베이션 하였다. 상기 반응 세포를 PBS 완충용액으로 3회 세척한 다음, FITC(fluorescein isothiocyanate)가 융합된 항-토끼 이차 항체와 함께 배양하였다. FITC 표지된 세포는 형광활성화 세포분류기(FACS)를 이용하여 조사하였다. 각 샘플의 경우, 10만 개의 클론을 무작위로 분석하였다.

4. 엑소-셀룰라아제의 활성 측정

유도된 재조합 대장균 MC4100(pTOCBR12) 및 MC4100(pTrc99A) 세포로부터 분리한 OMPs 효소의 활성은 MeUmb 그룹의 방출을 측정하여 분석하였다.

0.1mM의 MeUmbG₂를 포함하는 100mM의 아세트산나트륨(sodium acetate) 완충용액 (pH 5.0)에 상기 세포 또는 단백질을 분주하고, 37℃에서 10분(전(whole) 세포) 또는 30분(총 OMPs)동안 MeUmb 그룹의 방출량을 측정하여 분석하였다. 0.05~1nM의 4-메틸움벨리페론(4-methylumbelliferone)을 표준으로 하였다.

방출된 MeUmb 그룹의 형광강도는 1420 VICTOR multilabel counter (PerkinElmer Life Sciences)로 측정하였으며, 여기파장(λ_excitation)은 365nm이고, 방출파장(λ_emission)은 460nm 이상의 파장으로 하였다.

본 어세이는 0.1mM의 MeUmb 글리코시드(glycoside)를 포함하는 100mM의 아세트산나트륨(sodium acetate) 완충용액(pH 5.0)에서 총 반응부피가 100㎕가 되도록 수행하였고, 500mM의 글리신 완충용액(pH 10.4) 100㎕을 첨가함으로써, 반응을 종료하였다.

5. 세포표면에 발현된 효소의 재사용 가능성 분석

유도된 재조합 대장균 MC4100(pTOCBR12) 세포들은 4℃에서 10분 동안 10,000ㅧg로 원심분리하였다. 원심분리한 세포들은 100mM의 아세트산나트륨(sodium acetate) 완충용액(pH 5.0)으로 세 번 세척하였고, OD₆₀₀약 1.0이 되도록 하였다.

세척된 상기 세포들은 100㎕씩 분주하고, 4℃에서 5분 동안 10,000ㅧg 로 원심분리하였고, 이후 어세이에 사용할 수 있도록 재용해하였다.

효소활성 어세이에 대한 세포의 재사용 가능성은 0.1mM의 MeUmbG₂를 포함하는 100mM의 아세트산나트륨(sodium acetate) 완충용액(pH 5.0) 100㎕에 용해하여 전세포를 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하여 평가하였고, 반응은 500mM의 글리신 완충용액(pH 10.4) 100㎕를 첨가하여 4℃에서 5분 동안 10,000ㅧg로 원심분리하여 종료하였다. 상기 원심분리에 의해 수확된 세포들은 다시 100㎕의 반응 혼합물에 재용해시키고, 반응을 5 사이클까지 반복하였다.

6. 탄소원으로 CMC를 이용한 배지 및 성장 분석

세포들은 30℃에서 교반 배양기(shaking incubator)에서 250rpm으로 초기배양을 실시하였다. 30℃에서 6시간 동안 세포를 성장시킨 후, 1mM IPTG를 첨가하여 OD₆₀₀에서 0.4~0.6의 흡광도를 유지하도록 하였다. 이후, 상기 배양된 세포를 50mg/ℓ의 앰피실린과 0.1%(w/v)의 글루코오스가 보충된 R/2 배지[2g/ℓ의 (NH₄)₂HPO₄; 6.75g/ℓ의 KH₂PO₄; 0.85g/ℓ의 시트르산(citric acid); 0.7g/ℓ의 MgSO₄·7H₂O; 10g/ℓ의 5M HCl; FeSO₄·7H₂O을 포함하는 5㎖/ℓ의 추적용 금속용액; 2.25g/ℓ의 ZnSO₄·7H₂O; 1g/ℓ의 CuSO₄·5H₂O; 0.35g/ℓ의 MnSO₄·H₂O; 0.23g/ℓ의 Na₂B₄O₇·10H₂O; 2g/ℓ의 CaCl₂·2H₂O; 및 0.106g/ℓ의 (NH₄)₆MO₇·O₂₄·4H₂O (pH 6.8)]에 접종하였다.

기본 배지에 고-점도의 CMC를 탄소원으로 보충하였다. 상기 CMC는 별도로 멸균하여 R/2 배지에 최종농도가 1% (w/v)가 되도록 첨가하였다.

실시예 1. E. coli MC4100(pTOCBR12)에서 OmpC-셀룰라아제 융합 단백질의 발현

OmpC에 융합된 CelEx-BR12 유전자를 상기 방법으로, pTrc99A 벡터에 클로닝한 후, 증폭하여 제조한 플라스미드 pTOCBR12를 대장균(E. coli) MC4100에 도입하여 형질전환된 대장균 MC4100(pTOCBR12)을 획득하였다.

외막 단백질 분획 시료는 12%(w/v) 젤(gel) 상에서 SDS-PAGE 분석을 실시 하였고, OmpC-fused CelEx-BR12의 분자량인 약 72kDa 위치에서의 밴드를 확인하였다(도 1).

또한, 상기 72kDa의 밴드에 대하여, 웨스턴 블랏 분석으로, 토끼 폴리클로날 항-CelEx-BR12 항체로 분석하여 재확인하였다. 357개의 아미노산(~39.3kDa)까지의 CelEx-BR12 펩티드가 대장균의 외막에서 부착 모티프(anchoring motif)인 잘려진 OmpC 단백질(300개 아미노산, ~33kDa)에 효율적으로 융합하여 발현될 수 있다는 것을 확인하였다.

실시예 2. FACS 분석을 이용한 다기능 셀룰라아제의 세포표면 발현의 확인

다기능 셀룰라아제의 세포표면 발현 여부를 확인하기 위하여, 본 발명에 따른 재조합 세포를 이용한 FACS 분석을 실시하였다.

상세하게는, 대장균(E. coli) MC4100 (pTOCBR12)의 표면에 CelEx-BR12 셀룰라아제의 발현이 성공적으로 이루어졌는지 여부를 확인하기 위하여, 항-CelEx-BR12 1차 항체에 결합된 FITC-융합된 2차 항체와 결합에 따르는 형광으로 OmpC-셀룰라아제 융합 단백질의 발현을 확인하였다. 도 2B에 개시한 바와 같이, 성공적으로 대장균의 표면에 CelEx-BR12 셀룰라아제가 발현하였음을 확인하였고, 상기 결과와는 대조적으로, E. coli MC4100 (pTrc99A) 세포에서는 CelEx-BR12가 발현되지 않아서, 형광이 검출되지 않았다(도 2A).

실시예 3. 대장균( E. coli MC4100)에 부착된 OmpC-셀룰라아제 융합 단백질의 활성 측정 및 재사용 가능성 확인

수확한 E. coli MC4100(pTrc99A) 및 E. coli MC4100(pTOCBR12) 세포들은 상기한 방법으로, 세 번 세척한 후, 100mM의 아세트산나트륨(sodium acetate) 완충용액(pH 5.0)으로 조절하여 OD₆₀₀값을 1.0으로 맞춰, 분주하였다. 이후, 4℃에서 5분간 11,000g 이상으로 원심분리하고, 반응혼합물의 OD₆₀₀값을 5까지 다르게 조절하였다. 전세포의 효소활성은 플루오르제닉 글리코사이드 기질로 반응하여 생성되는 MeUmb의 방출량으로 측정하였다.

본 발명에 따른 대장균MC4100 (pTOCBR12)에 부착된 OmpC-셀룰라아제 융합 단백질의 활성 측정 결과, 도 3A에 개시한 바와 같이 전(whole) 세포의 엑소-셀룰라아제 활성은 강하게 나타난 반면에 음성대조군인 대장균MC4100 (pTrc99A)에서는 활성이 전혀 없었으며, 상기 세포를 키운 배지를 이용하여 측정한 엑소-셀룰라아제 활성도 나타나지 않았다. 이와 같은 결과로부터 재조합 대장균 표면에서 발현한 셀룰라아제가 배지로 분비되지 않고 세포표면에 잘 부착되어 있다는 것을 알 수 있었다.

또한, 음성대조군인 대장균MC4100(pTrc99A)과 본 발명에 따른 대장균 MC4100(pTOCBR12)으로부터 분리한 총 OMP 분획에서의 엑소-셀룰라아제 활성을 측정하였다.

도 3B에 개시한 바와 같이, 본 발명의 대장균(E. coli MC4100 (pTOCBR12))으로부터 분리한 총 외막 단백질(OMP) 분획은 플루오르제닉 글리코사이드 기질과 반응하여 농도 의존적으로 형광강도가 강하게 증가하였으며, 원형 그대로의 세포와 유사한 경향의 패턴을 보였다. 하지만, 음성대조군인 대장균(E. coli MC4100 (pTrc99A))으로부터 분리한 총 외막 단백질(OMP) 분획의 경우, 세포와 마찬가지로엑소-셀룰라아제 활성이 전혀 나타나지 않았다.

상기 결과들로부터 재조합 OmpC-CelEx-BR12 융합 단백질이 세포표면에 발현된 대장균(E. coli MC4100 (pTOCBR12))에서의 활성을 확인하였고, 이후, 셀룰라아제가 세포표면에 발현된 대장균의 재사용 가능성을 확인하기 위하여, 기질 MeUmbG₂를 이용하여 세포를 반복 사용하면서, 효소(셀룰라아제)의 활성을 확인하였다.

도 4에 개시한 바와 같이, 세포표면에 발현된 엑소-셀룰라아제의 촉매활성이 적어도 5번의 반복 사용에도 효과적으로 활성이 나타남을 확인하였다.

실시예 4. 탄소원으로 CMC를 이용한 세포 성장 분석

탄소원으로 CMC를 이용하는 경우, 셀룰라아제가 표면에 발현된 재조합 세포의 활성을 확인하기 위해, 세포의 발현 과정에서 1%(w/v)의 CMC, 50mg/ℓ의 앰피실린 및 0.1%(w/v)의 글루코오스를 포함하는 R/2 배지에 IPTG(0.1 mM)를 접종하여 세포의 성장을 조절하였다.

기본 배지에 고-점도의 CMC를 탄소원으로서 보충하였다. 상기 CMC는 별도로 멸균하여 R/2 배지에 최종농도가 1% (w/v)가 되도록 첨가하였다.

글루코오스-프리 조건에서 1% (w/v) CMC를 탄소원으로 포함하는 R/2 배지에서 대장균 MC4100 (pTrc99A), 대장균 MC4100 (pTOCBR12) 및 MC4100 (pTOCBR1-Bgl)의 성장을 관찰한 결과는 도 5에 개시한 바와 같이, 대장균 MC4100 (pTrc99A)에 비해 대장균 MC4100 (pTOCBR12) 및 MC4100 (pTOCBR1-Bgl)이 성장이 증진된 것을 OD값의 증가로부터 확인하였다. CelEx-BR12 및 Bgl 효소의 다기능 셀룰라아제 활성은 CMC의 내부 β-1,4-글루코시드 결합(β-1,4-glucosidic bond)를 절단하고 셀로-올리고사카라이드(cello-oligosacharide)(예를 들면, 셀로비스(cellobiose))를 글루코오스로 가수분해하는 것에 기초한 것이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Method for displaying multifunctional cellulolytic enzyme in bacterial cell surface and use thereof <130> PN15179 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpC-F <400> 1 aggaaacaga ccatgaaagt taaagtactg tcc 33 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OmpC_CBR12-R <400> 2 ttcccgcttg ctgcaggtaa gccaggg 27 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBR12_OmpC-F <400> 3 ttacctgcag caagcgggaa aggtcaataa 30 <210> 4 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBR12-R <400> 4 cgactctaga ggatcttatt aatggtgatg atggtgatgt ttctctaggg gctttcct 58 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bgl-F <400> 5 gcaggcatgc aagcttatga tgatcgaagc caaga 35 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bgl-R <400> 6 caaaacagcc aagcttttat catcccggct tgtggtt 37 <210> 7 <211> 1071 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> CelEx-BR12 <400> 7 caagcgggaa aggtcaataa tttccgcata aagagaggga cgaatatttc ccattggtta 60 agtcaatcgg aacaacgcgg ggaagcccga cgactacata tacaagagga tgactttgcc 120 cggctagagg agcttggctt tgacttcgta agaataccta ttgatgaggt ccaattctgg 180 gatgaacaag ggaataagtt acctgaggca tgggagcttt taaagaatgc tcttgactgg 240 tcacggaagc ataatctcag ggctatagtg gacttgcaca taattagatc tcattacttt 300 aacgcagtga atgaggatgg acagaacgct aatactcttt ttacatccga gaaggctcaa 360 caagatttaa ttaatttgtg gtaccaacta agcgattttc taaaggatcg atcatgtgat 420 tgggttgcct acgaattcat gaacgagcct gtagcagatg agcacgagca atggaatcaa 480 ctcgtagcta aggtacataa ggcacttagg agtagggagg ctcaacgcac gcttgtgata 540 gggagtaata ggtggcaagg gcatgagaca atgaagtatc ttaaggtacc cgagggagat 600 aagaatatag tcttatcgtt tcattattat aatccaatga tactcacaca ctatggggca 660 tggtgggccc caataggacg gtattacaag ggaaaggtac attatccagg cgtcctagtc 720 acaaaggagg attatgacgc agcgccagac gagataaagc ctgagctcaa gcaatatact 780 gagcaagttt gggatattaa taaaatacgc gagcagttta 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Arg Ser Cys Asp Trp Val Ala Tyr 130 135 140 Glu Phe Met Asn Glu Pro Val Ala Asp Glu His Glu Gln Trp Asn Gln 145 150 155 160 Leu Val Ala Lys Val His Lys Ala Leu Arg Ser Arg Glu Ala Gln Arg 165 170 175 Thr Leu Val Ile Gly Ser Asn Arg Trp Gln Gly His Glu Thr Met Lys 180 185 190 Tyr Leu Lys Val Pro Glu Gly Asp Lys Asn Ile Val Leu Ser Phe His 195 200 205 Tyr Tyr Asn Pro Met Ile Leu Thr His Tyr Gly Ala Trp Trp Ala Pro 210 215 220 Ile Gly Arg Tyr Tyr Lys Gly Lys Val His Tyr Pro Gly Val Leu Val 225 230 235 240 Thr Lys Glu Asp Tyr Asp Ala Ala Pro Asp Glu Ile Lys Pro Glu Leu 245 250 255 Lys Gln Tyr Thr Glu Gln Val Trp Asp Ile Asn Lys Ile Arg Glu Gln 260 265 270 Phe Lys Asp Ala Ile Glu Ala Ala Lys Lys Tyr Gly Leu Gln Leu Phe 275 280 285 Cys Gly Glu Trp Gly Val Tyr Glu Pro Val Asp Arg Glu Leu Ala Tyr 290 295 300 Asn Trp Thr Arg Asp Met Leu Thr Val Phe Asp Glu Phe Asn Ile Ala 305 310 315 320 Trp Thr Thr Trp Cys Tyr Asp Ala Asp Phe Gly Phe Trp Asp Gln Gln 325 330 335 Arg His Thr Tyr Lys Asp Arg Pro Leu Val Glu Leu Leu Met Ser Gly 340 345 350 Lys Pro Leu Glu Lys 355 <210> 9 <211> 1377 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> BGL <400> 9 atgatgatcg aagccaagaa actcgcagcg cgctttcccg gcgactttgt cttcggcgtt 60 gcaaccgcat ccttccagat cgagggagcc agcaaggcgg atggtcgcaa agcctccatc 120 tgggacgcct tctccaatat gccggggcgc gtttacgggc gccacaacgg cgacgtcgcc 180 tgcgaccatt acaaccggct ggagcaggac ctggacctca tcaagagcct cggcgtcgag 240 gcctaccgct tctcgatcgc ctggccgcgg atcgtgccgg agggcacggg gccgatcaac 300 gagaaggggc tcgactttta cgaccgcctt gtcgacggac tgaaggcgcg cggcatcaag 360 gcctttgcga ccctctatca ctgggacctg ccgctggcgc tgatgggcga cggcggctgg 420 acggcacgca cgaccgccta tgcataccag cgttacgcca agaccgtgat cgcgcgtctg 480 ggggatcgtc tcgacgcggt cgcgaccttc aacgaaccgt ggtgttccgt ctggctcggc 540 catctctacg gtgtccatgc accgggcgag cgcaacatgg atgcagcact tgccgcactg 600 cacttcacca atctcgccca cgggttgggg gtcgcggcga tccgctcgga acggccggaa 660 ctgccggtcg gcatcgtcat caatgcccat tcggtctatc ccggcagcaa cagcgccgag 720 gacaaggccg cggcggagcg 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Ser Gly Glu Gly Phe Thr Ser Gly Val Thr Asn Asn Gly Arg Asp 180 185 190 Ala Leu Arg Gln Asn Gly Asp Gly Val Gly Gly Ser Ile Thr Tyr Asp 195 200 205 Tyr Glu Gly Phe Gly Ile Gly Gly Ala Ile Ser Ser Ser Lys Arg Thr 210 215 220 Asp Ala Gln Asn Thr Ala Ala Tyr Ile Gly Asn Gly Asp Arg Ala Glu 225 230 235 240 Thr Tyr Thr Gly Gly Leu Lys Tyr Asp Ala Asn Asn Ile Tyr Leu Ala 245 250 255 Ala Gln Tyr Thr Gln Thr Tyr Asn Ala Thr Arg Val Gly Ser Leu Gly 260 265 270 Trp Ala Asn Lys Ala Gln Asn Phe Glu Ala Val Ala Gln Tyr Gln Phe 275 280 285 Asp Phe Gly Leu Arg Pro Ser Leu Ala Tyr Leu Gln 290 295 300

Claims

(1) 5'에서 3' 방향으로, 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 세포 외막 단백질 C(Omp C)을 암호화하는 유전자; 서열번호 8의 아미노산 서열을 암호화하는 셀룰라아제 유전자; 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 암호화하는 베타-글루코시다아제 유전자;를 포함하는 셀룰라아제의 세포표면 발현 벡터를 제조하는 단계;
(2) 상기 발현 벡터를 대장균에 도입하여 형질전환된 대장균을 획득하는 단계; 및
(3) 상기 형질전환된 대장균을 배양하는 단계;를 포함하는 엑소-셀룰라아제, 엔도-셀룰라아제 및 베타-글루코시다아제의 활성을 모두 갖는 것을 특징으로 하는 셀룰라아제의 세포표면 발현방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (3) 이후에, 대장균의 표면에 발현된 셀룰라아제를 분리정제하는 단계;를 더 포함하는 셀룰라아제, 엔도-셀룰라아제 및 베타-글루코시다아제의 활성을 모두 갖는 것을 특징으로 하는 셀룰라아제의 세포표면 발현방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (3)에서 대장균의 배양은 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose)를 탄소원으로 이용하는 것을 특징으로 하는 엑소-셀룰라아제, 엔도-셀룰라아제 및 베타-글루코시다아제의 활성을 모두 갖는 것을 특징으로 하는 셀룰라아제의 세포표면 발현방법.
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5'에서 3' 방향으로, 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 세포 외막 단백질 C(Omp C)을 암호화하는 유전자; 서열번호 8의 아미노산 서열을 암호화하는 셀룰라아제 유전자; 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 암호화하는 베타-글루코시다아제 유전자;를 포함하는 발현 벡터를 도입하여 형질전환된, 엑소-셀룰라아제, 엔도-셀룰라아제 및 베타-글루코시다아제의 활성을 모두 갖는 것을 특징으로 하는 셀룰라아제를 세포표면에 발현하는 대장균.
제5항의 대장균을 배양하여 대장균의 표면에 엑소-셀룰라아제, 엔도-셀룰라아제 및 베타-글루코시다아제의 활성을 모두 갖는 것을 특징으로 하는 셀룰라아제를 발현시키는 단계를 포함하는 세포표면에서 발현되는 엑소-셀룰라아제, 엔도-셀룰라아제 및 베타-글루코시다아제의 활성을 모두 갖는 것을 특징으로 하는 셀룰라아제의 제조 방법.
제6항의 방법에 의해 제조된 대장균 세포표면에서 발현되는 엑소-셀룰라아제, 엔도-셀룰라아제 및 베타-글루코시다아제의 활성을 모두 갖는 것을 특징으로 하는 셀룰라아제.
제7항의 대장균 세포표면에서 발현되는 엑소-셀룰라아제, 엔도-셀룰라아제 및 베타-글루코시다아제의 활성을 모두 갖는 것을 특징으로 하는 셀룰라아제를 기질에 처리하여 기질을 분해하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 대장균 세포표면에 발현된 엑소-셀룰라아제, 엔도-셀룰라아제 및 베타-글루코시다아제의 활성을 모두 갖는 것을 특징으로 하는 셀룰라아제는 1 내지 5회 반복하여 재사용할 수 있는 것을 특징으로 하는 기질을 분해하는 방법.