KR101693996B1

KR101693996B1 - 마이크로 RNA miR-3615, miR-5701, miR-5581-3p, miR-4792 및 miR-2467-5p의 만성 폐쇄성 폐질환에 대한 진단 용도

Info

Publication number: KR101693996B1
Application number: KR1020150071758A
Authority: KR
Inventors: 김우진
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2015-05-22
Filing date: 2015-05-22
Publication date: 2017-01-06
Also published as: KR20160137115A

Abstract

본 발명은 마이크로 RNA miR-3615, miR-5701, miR-5581-3p, miR-4792 및 miR-2467-5p의 만성폐쇄성폐질환(COPD) 진단에 관한 새로운 용도를 제공한다. 본 발명의 마이크로 RNA miR-3615, miR-5701, miR-5581-3p, miR-4792 및 miR-2467-5p은 마이크로 RNA-mRNA 통합분석을 통해 관련 mRNA들과 음의 상관관계를 가지는 마이크로 RNA들로서 선별된 것이므로, 실제 COPD 환자에게서 관찰되는 mRNA의 발현 변화에 상응하는 정확한 진단능을 가지고 있다. 본 발명의 마이크로 RNA는 COPD의 진단용 바이오마커로 개발될 수 있다.

Description

마이크로 RNA miR-3615, miR-5701, miR-5581-3p, miR-4792 및 miR-2467-5p의 만성 폐쇄성 폐질환에 대한 진단 용도{Use of Micro RNAs of miR-3615, miR-5701, miR-5581-3p, miR-4792 and miR-2467-5p for Diagnosis of Chronic Obstructive Pulmonary Disease}

본 발명은 마이크로 RNA miR-3615, miR-5701, miR-5581-3p, miR-4792, 및 miR-2467-5p의 만성 폐쇄성 폐질환에 대한 진단 용도에 관한 것이다.

만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)은 복합병(complex disease)으로서 보통 진행성이며 기류 장애(airflow limitation)를 특징으로 한다(1). 여러 유전적 또는 환경적 요인들은 유독한 입자들에 대한 만성 염증을 유발할 수 있다. 그러나 기류 폐쇄(airflow obstruction)의 원인은 완전히 밝혀지지 않았다. 선행 연구에 의하면, COPD를 가진 실험 대상자(subject)의 폐 조직에서 유전자 발현의 변화가 발견되었다. 후생유전학적(epigenetic) 조절이 폐의 유전자 발현에 영향을 주는 것이 밝혀졌다. 마이크로 RNA(microRNA, miRNA, miR)는 작은 비-코딩 RNA(non-coding RNA)로서 번역 후 유전자침묵(post-translational gene silencing) 또는 mRNA의 분해를 매개하는 후생유전학적 요소의 주된 종류 중 하나이다(2). miRNA는 폐의 발달과 항상성 유지에 중요할 뿐만 아니라 폐의 병리학적 과정에도 중요하다(3). miRNA는 흡입한 독소에 대한 세포수준의 반응을 조절하는 역할을 하며 염증 및 항-염증의 조절에도 중요한 역할을 한다. miRNA의 발현조절에 이상이 생기면 만성감염, 자가면역 또는 만성염증이 발생할 수 있기 때문에 miRNA의 변화는 호흡기 질환의 진단용 또는 치료용 바이오마커로서 유망하다(5, 6). COPD 환자의 폐조직, 가래(sputum), 기도상피(airway epithelium) 또는 기관지 폐포 세척액(bronchoalveolar lavage fluid)을 이용하여 COPD의 miRNA의 발현을 연구한 여러 결과들이 보고되고 있다(7-10). 상기 연구결과들은 마이크로 어레이(microarray) 또는 PCR을 통하여 수행되었다. 최근 개발된 대규모 병렬 시퀀싱 기술(massive parallel sequencing technique)은 차별적으로 발현된 miRNA를 연구하는 효과적인 플랫폼(platform)으로 사용된다[11]. 상기 기술은 종래의 마이크로어레이 기반 연구들에서 발견하지 못했던 새로운 miRNA를 포함한 모든 miRNA를 확인할 수 있는 유일한 기술이다.

본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.

국제공개특허 제WO2010/129860호

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본 발명자들은 만성폐쇄성폐질환(COPD)과 특정 유전자와의 연관성 연구를 통하여 COPD를 정확하게 진단할 수 있는 바이오 마커를 발굴하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 대규모 병렬 시퀀싱 기술을 이용하여 새로 발굴한 마이크로 RNA가 COPD 환자와 정상 환자 사이에서 차별적으로 발현되어 COPD의 진단에 매우 유용하게 사용될 수 있음을 실험적으로 증명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 만성 폐쇄성 폐질환의 진단용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 만성 폐쇄성 폐질환의 진단용 키트를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 만성 폐쇄성 폐질환의 진단용 바이오마커를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 만성 폐쇄성 폐질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해, 만성 폐쇄성 폐질환 마커인 마이크로 RNA의 발현 수준을 측정하는 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 마이크로 RNA miR-3615(hsa-miR-3615), miR-5701(hsa-miR-5701), miR-5581-3p(hsa-miR-5581-3p), miR-4792(hsa-miR-4792), 또는 miR-2467-5p(hsa-miR-2467-5p)를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 만성폐쇄성폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)의 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명은 마이크로 RNA miR-3615, miR-5701, miR-5581-3p, miR-4792, 또는 miR-2467-5p의 만성폐쇄성폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)의 진단에 관한 새로운 용도에 관한 것이다.

본 발명의 “마이크로 RNA”는 유전자 발현을 제어하는 역할을 하는 작은 RNA이며, 상기 마이크로 RNA는 세포 내부의 mRNA와 서열 특이적으로 결합하여 mRNA의 분해를 유발하거나 번역 억제를 유도하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 마이크로 RNA miR-3615, miR-5701, miR-5581-3p, miR-4792, 및 miR-2467-5p는 각각 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5에 개시된다.

본 발명에서 상기 “마이크로 RNA miR-3615, miR-5701, miR-5581-3p, miR-4792, 또는 miR-2467-5p를 검출할 수 있는 제제”는 상기 마이크로 RNA와 특이적으로 결합 또는 반응하여 이의 존재 또는 농도를 확인할 수 있는 제제를 의미하며, 구체적으로 상기 마이크로 RNA들에 결합할 수 있는 앱타머(aptamer), 핵산(nucleic acid), 올리고뉴클레오타이드, 항체(antibody) 또는 이의 단편, 펩타이드 및 PNA(Peptide nucleic acid)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 “마이크로 RNA miR-3615, miR-5701, miR-5581-3p, miR-4792, 또는 miR-2467-5p를 검출할 수 있는 제제”는 마이크로 RNA miR-3615, miR-5701, miR-5581-3p, miR-4792, 또는 miR-2467-5p의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프라이머(primer) 또는 프로브(probe)이다.

상기 용어 “상보적”은 어떤 특정한 혼성화 또는 어닐링 조건하에서 본 발명의 마이크로 RNA miR-3615, miR-5701, miR-5581-3p, miR-4792, 또는 miR-2467-5p의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서, 상기 용어 “상보적”은 완전히 상보적(perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브가 miR-3615, miR-5701, miR-5581-3p, miR-4792, 또는 miR-2467-5p의 뉴클레오타이드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.

상기 프로브는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 상기 프로브는 바람직하게는 단일쇄이다. 바람직하게는, 상기 프로브는 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다. 상기 프로브는 자연발생(naturally occurring)의 dNMP (즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

상기 프라이머는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 상기 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 상기 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 상기 프라이머는 주형인 RNA miR-3615, miR-5701, miR-5581-3p, miR-4792, 또는 miR-2467-5p의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 프라이머는 유전자 증폭반응(amplication reaction)에 사용되는 것이다. 상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소연쇄반응(ploymerase chain reaction), 역전사-중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction), 실시간-중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 복구연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재증폭(transcription-mediated amplification), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기 서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소연쇄반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction), 임의적 프라이밍 중합효소연쇄반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction), 핵산염기서열 기반증폭(nucleic acid sequence based amplification), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loopmediated isothermal amplification)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 COPD로 의심되는 환자의 생물학적 시료에 대해 사용한다. 상기 생물학적 시료는 COPD의 발병 여부를 확인하기 위하여 마이크로 RNA를 검출하는데 사용되는 시료를 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 가래, 기관지 폐포 세척액(bronchoalveolar larvage fluid), 요액, 혈액, 혈청, 타액, 눈물, 척수액, 흉강액, 복강액, 조직 또는 세포이다.

상기 기관지 폐포 세척액은 폐질환을 진단하는 방법인 기관지폐포세척요법(bronchoalveolar larvage)의 시료로서 기관지의 말초를 생리 식염액으로 세척한 액(fluid)을 의미한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 설명된 조성물을 포함하는 COPD의 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 키트는 본 발명의 마이크로 RNA miR-3615, miR-5701, miR-5581-3p, miR-4792, 또는 miR-2467-5p의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 포함하는 마이크로어레이(microarray) 칩을 포함한다.

상기 마이크로어레이 칩에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 지지체(substrate) 상에 고정화된다. 상기 지지체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커 (예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 마이크로 RNA miR-3615, miR-5701, miR-5581-3p, miR-4792, 또는 miR-2467-5p를 포함하는 COPD의 진단용 바이오 마커를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 분리된 생물학적 시료에서 마이크로 RNA miR-3615, miR-5701, miR-5581-3p, miR-4792, 또는 miR-2467-5p의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, COPD의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해, COPD 마커인 상기 마이크로 RNA의 발현 수준을 측정하는 방법을 제공한다.

본 발명의 특징 및 이점을 정리하면 다음과 같다.

(i) 본 발명은 마이크로 RNA miR-3615, miR-5701, miR-5581-3p, miR-4792 및 miR-2467-5p의 만성 폐쇄성 폐질환 진단에 관한 새로운 용도를 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 마이크로 RNA miR-3615, miR-5701, miR-5581-3p, miR-4792 및 miR-2467-5p은 새롭게 발굴한 COPD의 진단용 바이오 마커이다.

(ⅲ) 본 발명의 마이크로 RNA miR-3615, miR-5701, miR-5581-3p, miR-4792 및 miR-2467-5p은 마이크로 RNA-mRNA 통합분석을 통해 관련 mRNA들과 음의 상관관계를 가지는 마이크로 RNA들로서 선별된 것이므로, 실제 COPD환자에게서 관찰되는 mRNA의 발현 변화에 상응하는 정확한 진단능을 가지고 있다.

본 발명은 마이크로 RNA miR-3615, miR-5701, miR-5581-3p, miR-4792 및 miR-2467-5p의 만성 폐쇄성 폐질환 진단에 관한 새로운 용도를 제공한다. 본 발명의 마이크로 RNA miR-3615, miR-5701, miR-5581-3p, miR-4792 및 miR-2467-5p은 마이크로 RNA-mRNA 통합분석을 통해 관련 mRNA들과 음의 상관관계를 가지는 마이크로 RNA들로서 선별된 것이므로, 실제 COPD 환자에게서 관찰되는 mRNA의 발현 변화에 상응하는 정확한 진단능을 가지고 있다. 본 발명의 마이크로 RNA는 COPD의 진단용 바이오마커로 개발될 수 있다.

도 1은 본 발명의 miRNA 분석의 작업흐름도를 보여준다.
도 2는 COPD 환자와 정상인 사이에 차별적으로 발현되는 miRNA의 MA 플롯(plot)을 보여준다. 붉은 점들은 p값 < 0.01 인 유전자를 보여준다.
도 3은 miRNA와 상기 miRNA의 타겟 mRNA들 사이의 상호관계를 보여준다. 상기 RNA들은 COPD 환자와 정상 폐기능을 가지고 있는 흡연자들 사이에서 차별적으로 발현되는 RNA들을 의미한다.

실시예

실험재료 및 방법

1. COPD 환자 및 대조군

폐조직 검체는 기류 폐쇄(airflow obstruction)를 가진 15명의 실험 대상자들(COPD 환자들)과 2008년 3월에서 2011년 3월까지 서울아산병원의 조직세포자원센터에서 수술받은 환자로서 정상 폐활량을 가지는 11명의 실험 대상자들로부터 습득하였다. 기류 폐쇄는 기관지 확장제 후(post-bronchodilator) FEV1/FVC 비율이 0.7 보다 적은 상태로 정의하였으며, 정상 폐활량은 미국 흉부 학회(the American Thoracic Society) 및 유럽 호흡기 학회(European Respiratory Society)의 기준에 따라 정의하였다[12]. 본 발명의 실험은 서울아산병원의 생명윤리위원회(2011-0711)의 승인하에 수행하였으며 모든 환자의 사전 동의하에 수행하였다.

2. 마이크로 RNA의 준비, 염기서열의 확인 및 발현양의 측정방법

절제한 1μg의 폐 검체로부터 cDNA 라이브러리를 구축하기 위하여 TruSeq RNA 라이브러리 키트(Illumina Inc.)를 사용하였으며, RNA에 대한 차세대 염기서열 분석(next generation sequencing, NGS)을 위해 Illumina HiSeq 2000을 사용하였다. 라이브러리들은 Agilent technologies 2100 Bioanalyzer에서 제시한 qPCR(quantitative PCR) 정량 프로토콜에 따라 qPCR을 수행하여 RNA를 정량하였다.

3. 마이크로 RNA 데이터 분석 방법

miRNA의 발현수준을 측정하기 위하여, miRExprerss's 파이프라인(pipeline)에 따라 측정을 수행하였다. 간단히 설명하면, miRExpress는 miRNA-시퀀스 판독결과들(miRNA-seq reads)을 miRBase 20.0의 전구 miRNA 레퍼런스(precursor miRNA reference)와 정렬시켰다. 상기 정렬된 판독결과들을 각 시료의 전체 판독결과들에 대하여 정규화(normalize)하였으며, RPM(reads per million)에 따라 표준화(standardized)하였다. 필터된 데이터는 대수적으로 변환하였으며 upper-quantile method에 따라 정규화하였다. miRNA 발현 차이의 통계적 유의성(statistical significance)은 폴드 변화(fold change)와 Student’s t-test를 통하여 결정하였으며 상기 두 가지 평가 기준들 사이에서 아무런 차이가 없으면 의미 없는 가설로 평가하였다. 도 1은 분석 작업 흐름도(workflow)을 보여준다.

4. 마이크로 RNA-mRNA 통합분석 방법

각 데이타 세트(data set)에서 유의한 발현 차이(p 값 < 0.01)를 보이는 데이터들을 통합하였다. miRTarBase를 이용하여 추정되는 mRNA-miRNA 타겟 쌍(target pair)을 추출하고 피어슨의 상관 계수(Pearson’s correlation coefficients)를 이용하여 추정되는 mRNA-miRNA 쌍 사이의 음의 상관관계(negative correlation)을 확인하였다[14]. 대표적인 쌍(pair)들은 cytoscape를 이용하여 시각화하였다. 차별적 발현 유전자(differentially expressed genes, DEG)의 생물학적 유전자 기능 주석(biological gene function annotation) 분석은 DAVID tool(http://david/abcc/ncifcrf.gov/)을 이용하여 수행하였다.

실험결과

1. COPD 환자 및 대조군들의 인구통계학적 특성(demographic characteristics)

기류 폐쇄가 있는 15명의 실험대상자와 정상 폐활량을 가지는 11명의 실험대상자에 대하여 연구를 수행하였다(표 1). 모든 실험대상자들은 남자였으며 증상이 있는 실험대상자들 및 증상이 없는 실험대상자들의 평균나이는 각각 66.8세 및 66.2세였다. COPD를 가진 실험대상자들의 폐기능은 COPD를 가지고 있지 않은 실험대상자들에 비하여 심각하게 낮은 수준이었다.

	COPD (n=15)	Control (n=11)	p value
Male (%)	15(100.0)	11(100.0)	-
Age	66.8 7.2	60.2 7.8	0.03
Smoking (Pack-year)	50.0 32.7	29.8 16.3	0.05
FEV₁(%ofpredicted)	63.8 7.2	102.0 9.9	<0.001
FEV₁/FVC	54.2 6.8	76.2 4.7	<0.001
DLCO (%)	74.2 12.0	96.5 21.0	0.002

2. 마이크로 RNA의 발현 결과

miRBase로 판독정렬(read alignment)한 후, miRNA 발현 프로파일(profile)을 구축하였다. 두 그룹의 MA plot들은 도 2에 개시되어있다. Student's t-test(p values <0.01)를 통해 분석한 결과, 45개의 miRNA들이 이들의 발현에 있어서 유의한 차이가 있었다. 그 중에서 37개의 miRNA들은 하향 조절(down-regulated)되었으며, 8개의 miRNA들은 상향 조절(up-regulated)되었다(표 3). 특히, has-miR-5701(miR-5701, 서열번호 2) 및 has-miR-4792(miR-4792, 서열번호 4)는 하향조절된 것으로 확인되었으며, has-miR-3615(miR-3615, 서열번호 1), has-miR-5581-3p(miR-5581-3p, 서열번호 3) 및 has-miR-2467-5p(miR-2467-5p, 서열번호 5)는 상향조절된 것으로 확인되었다. 상기 miRNA의 표기에 있어서 hsa-는 인간 miRNA를 의미한다.

이름	뉴클레오타이드 서열	서열번호
has-miR-3615	UCUCUCGGCUCCUCGCGGCUC	1
has-miR-5701	UUAUUGUCACGUUCUGAUU	2
has-miR-5581-3p	UUCCAUGCCUCCUAGAAGUUCC	3
has-miR-4792	CGGUGAGCGCUCGCUGGC	4
has-miR-2467-5p	UGAGGCUCUGUUAGCCUUGGCUC	5

가장 의미 있게 하향 조절된 miRNA는 has-miR-374a-3p이며 가장 의미 있게 상향 조절된 has-miRNA는 miR501-3p이다.

miRNA	Fold change Log₂(COPD/control)	P value	Relative Expression Level
hsa-miR-374a-3p	-0.98	2.88E-06	1106.12
hsa-miR-28-3p	-1.27	3.92E-06	9374.92
hsa-miR-151a-3p	-0.94	3.38E-05	15103.77
hsa-miR-181d-5p	-1.22	5.19E-05	611.79
hsa-miR-30a-5p	-0.94	5.58E-05	105396.74
hsa-miR-143-3p	-0.92	9.06E-05	491023.47
hsa-miR-181b-5p	-0.86	0.00013	5460.44
hsa-miR-378i	-2.86	0.00015	1.14
hsa-miR-378f	-1.48	0.00037	7.41
hsa-miR-501-3p	0.58	0.00041	407.71
hsa-miR-3912	-0.82	0.00061	25.46
hsa-miR-181a-2-3p	-0.83	0.00067	1060.20
hsa-miR-769-5p	-0.64	0.00082	1291.66
hsa-miR-361-5p	-0.62	0.00089	795.60
hsa-miR-660-5p	-0.58	0.00091	2516.08
hsa-miR-379-5p	0.99	0.0010	23.70
hsa-miR-30e-3p	-0.55	0.0012	1125.77
hsa-miR-101-3p	-0.86	0.0016	36486.23
hsa-miR-3615	0.60	0.0021	75.89
hsa-miR-30c-2-3p	-0.92	0.0023	223.88
hsa-miR-5701	-5.75	0.0023	1.71
hsa-miR-26a-5p	-1.16	0.0024	659712.75
hsa-miR-181c-5p	-1.02	0.0027	6709.97
hsa-miR-148a-3p	-0.82	0.0027	73365.14
hsa-miR-5581-3p	2.26	0.0028	0.57
hsa-miR-561-5p	-0.76	0.0029	81.55
hsa-miR-23b-3p	-0.66	0.0030	16244.60
hsa-miR-125b-1-3p	0.43	0.0030	179.91
hsa-miR-199b-5p	0.31	0.0030	2565.56
hsa-miR-339-3p	-0.65	0.0033	83.49
hsa-miR-30a-3p	-0.68	0.0033	2448.65
hsa-miR-140-3p	-0.49	0.0037	3636.24
hsa-miR-522-3p	-1.69	0.0044	2.21
hsa-miR-1307-5p	0.46	0.0045	2398.55
hsa-miR-532-5p	-0.72	0.0050	2674.38
hsa-miR-191-5p	-0.58	0.0052	47807.07
hsa-miR-181a-5p	-0.93	0.0055	92828.63
hsa-miR-4792	-3.49	0.0061	0.74
hsa-miR-27b-5p	-0.59	0.0068	220.54
hsa-let-7f-5p	-0.80	0.0073	48844.75
hsa-miR-3913-3p	-0.95	0.0076	18.56
hsa-miR-331-3p	-0.62	0.0081	895.74
hsa-miR-2467-5p	0.78	0.0089	2.52
hsa-miR-340-5p	-0.59	0.0091	2724.00
hsa-miR-195-3p	-0.66	0.0093	95.67

3. 마이크로 RNA-mRNA 통합분석 결과

mRNA 데이타는 선행결과(GEO accession number: GSE57148)로부터 추출하였다. 1373개의 mRNA들에 대하여 동일한 기준(p 값 < 0.01)을 적용하여 확인하였다. 다르게 발현된 miRNA들과 mRNA들에서, Pearson’s 상관 계수에 의해 16개의 miRNA들과 100개의 mRNA들이 쌍을 이룰 수 있었다. 상기 쌍들 중에서, 27개의 쌍들은 양의 상관관계를 가졌으며 91개의 쌍들은 음의 상관관계를 가졌다. 상기 음의 상관관계를 가지는 쌍들에 대하여 Cytoscape를 이용하여 시각화하였으며(도 3) DAVID tool을 이용한 분석을 수행하여 두 개의 mRNA들의 그룹들이 그것들로 대표되는 염색체 변형(chromatin modification)에 관여하는 유전자들의 수적 관점에서 의미 있게 차이가 있음을 확인하였다.

결론

본 연구를 통하여 miRNA들의 발현이 기류 폐쇄가 있는 폐조직과 그렇지 않은 폐조직에서 서로 다르다는 것을 확인하였다. 또한, 발현양상이 서로 반대인 miRNA-mRNA 타겟 쌍들을 확인하였다. 기류 폐쇄가 있는 폐조직과 그렇지 않은 폐조직에서 서로 다르게 발현되는 대부분의 miRNA들은 기류 폐쇄가 있는 폐조직에서 하향 조절(down-regulated)되었다. 상기 45개의 miRNA 중 37개의 miRNA는 의미 있게 하향 조절되었으며 단지 8개의 miRNA만이 상향 조절되었다. miRNA들의 타겟으로 예측되는 타겟 mRNA들에 대응하는 유전자들은 히스톤 변형에 관여하는 유전자들이 많다. 그러므로 상기 miRNA들은 기류 폐쇄의 원인에 중요한 기여를 할 수 있을 것으로 기대된다.

본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.

<110> Kangwon National University University Industry Cooperation Foundation <120> Use of Micro RNAs of miR-3615, miR-5701, miR-5581-3p, miR-4792 and miR-2467-5p for Diagnosis of Chronic Obstructive Pulmonary Disease <130> MP15-0016 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 1 ucucucggcu ccucgcggcu c 21 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 2 uuauugucac guucugauu 19 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 3 uuccaugccu ccuagaaguu cc 22 <210> 4 <211> 18 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 4 cggugagcgc ucgcuggc 18 <210> 5 <211> 23 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 5 ugaggcucug uuagccuugg cuc 23

Claims

마이크로 RNA miR-3615, miR-5701, miR-5581-3p, miR-4792, 또는 miR-2467-5p를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 만성폐쇄성폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)의 진단용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 제제는 마이크로 RNA miR-3615, miR-5701, miR-5581-3p, miR-4792, 또는 miR-2467-5p의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프라이머(primer) 또는 프로브(probe)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 프라이머는 유전자 증폭반응(amplication reaction)에 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 COPD로 의심되는 환자의 생물학적 시료에 대해 사용하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 가래, 기관지 폐포 세척액(bronchoalveolar larvage fluid), 요액, 혈액, 혈청, 타액, 눈물, 척수액, 흉강액, 복강액, 조직 또는 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항의 조성물을 포함하는 COPD의 진단용 키트.
제 6 항에 있어서, 상기 키트는 마이크로 어레이(micro array)칩인 것을 특징으로 하는 키트.
삭제
분리된 생물학적 시료에서 마이크로 RNA miR-3615, miR-5701, miR-5581-3p, miR-4792, 또는 miR-2467-5p의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, COPD의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해, COPD 진단용 바이오 마커인 상기 마이크로 RNA의 발현 수준을 측정하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 가래, 기관지 폐포 세척액, 요액, 혈액, 혈청, 타액, 눈물, 척수액, 흉강액, 복강액, 조직 또는 세포인 것을 특징으로 하는 방법.