KR101688924B1

KR101688924B1 - 히알루론산의 항비만 효과

Info

Publication number: KR101688924B1
Application number: KR1020120066493A
Authority: KR
Inventors: 박주웅; 이창원; 신운섭; 박용일
Original assignee: 바이오스트림테크놀러지스(주)
Priority date: 2012-06-21
Filing date: 2012-06-21
Publication date: 2016-12-22
Also published as: KR20130143196A

Abstract

본 발명은 히알루론산 즉 중분자히알루론산 및 저분자히알루론산을 유효성분으로 함유하는 비만 예방, 치료 또는 체지방감소 효과에 관한 것이며, 특히 중분자히알루론산이 비만 예방, 치료 또는 체지방감소 효과에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

히알루론산의 항비만 효과{Antiobesity effect of hyaluronic acid}

본 발명은 히알루론산 즉 중분자히알루론산 및 저분자히알루론산을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 및 치료에 관한 것이다.

비만은 체지방이 증가된 형태로 에너지의 섭취와 소비의 불균형에 의해 발생하며(Speigelman & Filer. Obesity and the regulation of energy balance. Cell 104:531-543(2001)), 체중의 과잉증가가 아니라 체내 지방조직의 과잉증가를 의미한다. 식생활의 서구화와 생활의 편리화로 인한 활동량 감소로 인한 비만 인구의 급격한 증가는 전 세계적인 보건 문제가 되고 있다. 현재 우리나라의 경우에도 급속한 경제 성장과 의학발달, 생활수준의 향상, 생활의 편리화, 식생활 형태의 변화와 활동량 감소에 의하여 비만인구가 증가하고 있다. 2010년 국민 건강 통계에 의하면 우리나라 성인의 비만(체질량지수 25kg/m² ) 유병률은 1998년 25.56%에서 2010년 30.55%로 지속적으로 증가하고 있으며, 이는 미국(NHANES, 2005~2008년, 만 20세 이상, 체질량지수 30.0kg/m² 이상)의 비만 유병률 34.25%에 근접한 수준이다(Ministry of Health, Welfare and Family Affairs(MOHWFA):Korea Center for Disease Control and Prevention(KCDCP) 2010). 비만은 제 2형 당뇨병, 담석증, 고혈압, 고지형증, 관상동맥성 심장병, 대사증후군과 같은 만성질환의 주요 위험인자가 되고(Willett W.W et al., Guidelines for healthy weight. N. Engl. J. Med. 342, 427-433(1999)). 비만인구의 증가는 의료비용의 증가, 경제활동 인구의 감소 등 사회적 손실 증가와 관련되기 때문에 비만의 예방과 치료는 전 세계적인 보건 문제로 규정되어 점차 증가하고 있는 비만의 예방 및 관리를 위한 연구의 필요성이 높다. 이러한 이유로 비만을 치료하거나 예방하는 다양한 항비만 약물을 개발하기 위한 연구에 대한 관심이 집중되어 왔다. 항비만 약물은 식이 섭취 감소, 대사 작용을 변형 또는 에너비 소비 증가를 통해 제중 감소를 유도하지만, 이러한 효과와 함께 안전성의 문제가 지속적으로 지적되고 있다(Mark A.L. et. al., Cariovascular side effects of antiobesity drugs: a yellow flag in the race to safe pharmacotherapy for obesith. Circulation. 120:719-721(2009)). 이로 인하여 지금까지 다양한 항비만 약물들이 생산되어 왔지만 심각한 부작용들로 인해 시판이 중단되기도 하였다. 현재 미국의약국에서 승인되어 장기간 사용이 가능한 항비만제는 시상하부 신경절에서 세로토닌 및 노르에피네프린의 재흡수를 억제함으로써 식욕억제와 포만감을 증가시키는 Sibutramine과 췌장 리파아제의 억제를 통한 장간막 지방흡수를 감소시키는 Orlistat 2종이 있다. 그러나 이 약물들은 협압증가, 구갈, 변비, 두통, 복부통진, 간손상, 불면증 등의 부작용이 보고되었으며, 최근 사용 기준이 강화되는 등의 논란이 야기되고 있다.

따라서 이러한 비만치료제의 다양한 부작용으로 인해 최근에 인체에 독성 및 부작용이 적은 비만 예방 및 치료에 효과적인 신물질 개발이 절실히 요구되고 있다.

히알루론산(hyaluronic acid)은 동물 등의 피부에 많이 존재하는 생체 합성 천연물질로서 분자량이 수십만에서 수백만dalton(Da)으로 반복단위인 글루쿠론산(glucuronic acid)과 N-아세틸 글루코사민(N-acetyl-glucosamine)이(1

3)과 (1→4)로 번갈아 결합 되어 있는 무색의 고점도 다당류이다. 히알루론산은 수화기가(-OH)가 많기 때문에 친수성이 높고, 매우 높은 점성과 탄성이 있어 세포를 서로 접촉시키며, 관절을 부드럽게 하고, 피부, 장기 또는 세포 사이를 결합하거나 지탱하는 역할을 한다. 따라서 히알루론산은 보습효과를 가지며, 물리적 마찰에 대한 윤활효과가 우수하여 의약품으로는 관절윤활제와 장기유착방지제로 또한 성형외과에서는 필러(filler)로 사용되고 있으며, 화장품으로는 보습제로 많이 사용되고 있다.

따라서 본 발명은 천연 및 인체에 존재하는 고분자물질인 히알루론산이 비만 억제 작용이 우수함을 발견하여 히알루론산을 비만 예방 또는 치료제 및 건강 식품으로 유용하게 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

신규미생물 비브리오 스플린디더스 BST398 및 이을 이용한 저분자 히알루론산의 제조방법(출원번호 10-2011-0031094)

없음

본 발명의 목적은 히알루론산 즉 중분자히알루론산 및 저분자히알루론산을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 치료 또는 비만 개선용 건강식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 수행하기 위하여, 본 발명을 히알루론산 즉 중분자히알루론산 및 저분자히알루론산을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 비만 치료 또는 비만 개선용 건강식품을 제공하는 것이다.

상기에서 히알루론산을 미생물 발효에 의해서 고분자히알루론산을 생산하였으며, 고분자히알루론산을 사용하여 효소공법으로 중분자히알루론산 및 저분자히알루론산을 선행기술(출원번호 : 10-2011-0031094)의 방법으로 제조하였다.

본 발명의 히아루론산 즉 중분자히알루론산 및 저분자히알루론산은 항비만 또는 체지방감소 효과가 우수하다.

도 1은 GPC(Gel permeation chromatography)에 의한 고분자히알루론산(A), 중분자히알루론산(B) 및 저분자히알루론산(C)을 분석한 그래프이다.
도 2는 3T3-L1 지방세포에 대한 히알루론산의 세포독성을 대조군에 대한 백분율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 3은 3T3-L1 지방세포에 대한 히알루론산의 지질축적 억제를 대조군에 대한 백분율(%)을 나타냈으며, 지방세포의 분화 정도를 보여주는 오일 레드 0 염색 결과 사진이다.
도 4는 3T3-L1 지방세포가 히알루론산에 의해 세포사멸 혹은 세포괴사 확인을 나타내는 분석 결과이다.
도 5는 히알루론산이 지방세포로 분화하는 단계에서 PPAR-γ와 aP2의 발현에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 미생물 발효에 의한 고분자히알루론산(High molecular weight hyaluronic acid, HMW-HA)의 제조

본 실험에서는 공지되어 있는 기술을 이용하였으며, 스트렙토코커스이규 서브스페이스 쥬에피테미커스 ATCC 39920(Streptococcus equi subspecies zooepidemicus) 균주를 배양한 배양액으로부터 원심분리로 균체를 제거하고 상등액에 에탄올을 50%(V/V)에서 80%(V/V), 바람직하게는 70%로 처리하여 4℃ 에서 10℃의 저온에서 10시간 이상 방치한 다음에 고분자히알루론산 침전물을 얻었다. 그리고 침전물을 70% 이상의 에탄올로 세척 후에 건조하여 고분자히알루론산(분자량 크기 : 1,500,000~2,000,000Da)을 제조하였다.

실시예 2 : 중분자히알루론산(Middle molecular weight hyaluronic acid, MMW-HA)의 제조

본 실험에서는 고분자히알루론산을 사용하여 다음과 같이 제조하였다. 선행기술(출원번호 : 10-2011-0031094)에서 사용한 효소공법으로 효소 생산 균주인 비브리오 스플린디더스 BST398(KCTC11899BP) 균의 배양액을 사용하였으며, 고분자히알루론산을 0.1M 트리스 완충용액(pH7.0)에 0.5% 내지 1.0%(W/V)를 용해한 용액에 효소액 5 내지 10%(V/V)를 첨가하여 30℃에서 2시간 내지 6시간 동안 효소반응을 시킨 후에 반응액으로부터 중분자히알루론산을 분리하였다. 분리방법은 반응액을 한외여과(분자량 크기 : 100KDa)하여 10만 이하의 히알루론산을 회수한 후에 한외여과(분자량 크기 : 10KDa)로 농축하여 중분자히알루론산(분자량 크기 : 50,000~40,000Da)을 제조하였다,

실시예 3 : 저분자히알루론산(Low molecular weight hyaluronic acid, LMW-HA)의 제조

본 실험에서는 고분자히알루론산을 사용하여 다음과 같이 제조하였다. 선행기술(출원번호 : 10-2011-0031094)에서 사용한 효소공법으로 효소 생산 균주인 비브리오 스플린디더스 BST398(KCTC11899BP) 균의 배양액을 사용하였으며, 고분자히알루론산을 0.1M 트리스 완충용액(pH7.0)에 0.5% 내지 1.0%(W/V)를 용해한 용액에 효소액 5 내지 10%(V/V)를 첨가하여 30℃에서 효소 반응을 하였다. 효소 반응 시간은 점도계를 이용하여 점도를 측정해가면서 점도가 완전히 감소될 때까지 진행하였다. 반응이 종료되면 한외여과장치(분자량 크기 : 10KDa)로 여과하여 여액을 얻은 후 나노여과장치를 이용하여 여액을 탈염 및 농축하여 저분자히알루론산(분자량 크기 : 3,000~1,000Da)을 제조하였다,

실시예 4 : 히알루론산의 분자량 측정(Molecular weight, Mw)

히아루론산의 분자량 크기는 젤투과크로마토그라피(Gel Permeation Chromatography, GPC)방법으로 측정하였으며, 이 때 컬럼은 Shodex OHpak column(SB-805HQ, 8.0 x 300mm, Showa Denko Co., Japan)을 사용하였으며, 검출기는 ELSD(Evaporative Light Scattering Detector, Alltech)로 검출하였으며, 컬럼 온도는 30℃에서 용매는 10mM 초산암모니움이며, 유속은 0.7ml/min로 실행하였다. 표준 샘플로는 플루란(Pullulan)1,080 ~ 710,000Da을 사용하여 실시예1, 2, 3의 평균 분자량을 측정한 후에 그 결과를 도 1에 나타내었다.

히알루론산의 평균 분자량

히알루론산의 종류	분자량크기(Da)
고분자히알루론산(A)	1,500,000 ~ 2,000,000
중분자히알루론산(B)	50,000~40,000
저분자히아루론산(C)	3,000~1,000

실시예 5 : 3T3-L1 지방전구세포를 이용한 항비만 효과의 평가

(1). 3T3-L1 지방전구세포의 배양 및 분화 유도

3T3-L1 지방전구세포는 미국세포주은행(ATTC)으로부터 구입하였다. 세포는 10% FBS가 포함된 DMEM을 사용하여 100mm dish에서 CO₂배양기(CO2-5%, 37℃)에서 배양하였다. 3~4일 후 세포가 80~90%정도 confluency하게 되면 0.1% trypsin ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)를 처리하여 세포를 분리하고 원심분리(1,300rpm, 2min)에서 세포를 모은 후 4x10⁴ cells/ml로 희석하여 24 well plate에 0.5 ml씩 plating 하여 배양하였다. 2일에 한번씩 10 % FBS가 포함된 새로운 DMEM 배양액으로 바꿔 주었다. 3-4일 후 세포가 100 % confluency하게 되면 2일 후에 DMEM 배양액에 10 /ml insulin, 0.5 mM IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine), 1㎛ dexamethasone이 첨가된 differentiation medium을 처리하여 분화를 유도하였다. 2일 후에는 10 ㎍/ml insulin만 포함된 배양액으로 교환하고 2일에 한 번씩 4일 동안 10 % FBS가 포함된 새로운 DMEM 배양액으로 갈아주면서 분화를 유도하였다.

(2). 3T3-L1 지방세포의 세포독성 확인

세포 생존율의 측정을 위한 methylthiazolyldiphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay는 Sladowski 등의 방법을 따라 행하였다. 즉, 살아있는 세포에 처리된 MTT는 미토콘드리아에 있는 reductase에 의해 환원되어 formazan이라 불리는 적자색 crystal이 형성되는 원리를 이용한 것으로, 처리된 물질이 세포 독성을 나타낼 경우 세포를 사멸하게 하고, 사멸한 세포의 미토콘드리아는 제 기능을 못하게 되므로, 형성되는 formazan의 양이 줄어들게 된다. 배양시킨 3T3-L1 지방세포를 96 well plate에 5x10³ cells/ml로 분주하여 plate에 약 80 % 정도 차면 배양액을 제거 후 2시간 동안 SF medium으로 바꾸어 주었다. 그 후에 SF medium과 히알루론산을 농도별로 (0, 62.5 125, 250, 500, 1000 ㎍/ml)희석하여 24시간 동안 처리하였다. 5 mg/ml로 용해한 MTT용액을 각 well 마다 120 ㎕씩 처리하여 호일로 어둡게 한 후 4시간 동안 CO₂배양기(CO2-5%, 37℃)에서 배양하였다. 배양이 끝난 다음 배양액을 제거한 뒤 DMSO 200 ㎕/well로 넣으면서 피펫을 이용해 잘 교반하였다. 그 후 ELISA reader로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과 히알루론산의 세포독성 범위를 분화된 3T3-L1 지방세포를 이용하여 증식률에 미치는 영향을 MTT assay로 분석하였다. 3T3-L1 지방세포에 히알루론산을 62.5, 125, 250, 500, 1000 ㎍/ml 의 농도로 처리 하였하여 대조군과 비교하여 보았을 때 고분자히알루론산의 경우 94.65±2.67, 94.24±0.74, 96.34±2.54, 101.00±3.08, 105.69±3.23%이었으며(도 2. A, p<0.001), 중분자히알루론산의 경우 96.90±2.24, 95.32±2.19, 94.29±3.94, 96.80±1.70, 96.51±2.70%으로 유의적인 차이가 없었고(도 2. B), 저분자히알루론산의 경우 97.55±1.98, 95.41±1.96, 95.10±3.46, 96.43±2.61, 98.55±2.00%으로 유의적인 차이가 나타나지 않았다(도 2. C). 따라서 히알루론산은 3T3-L1 지방세포에 세포독성이 없음을 확인하였다.

(3). 3T3-L1 지방세포에서의 지질축적 확인

히아루론산을 농도별로 처리하면서 분화시킨 세포의 배양액을 버리고 PBS로 씻어주었다. 세포를 고정시키기 위해 10 % formaldehyde를 500 ㎕씩 각 well에 넣고 4 에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후에 formaldehyde를 제거하고 PBS로 3번 씻어낸 후 CO₂ incubator에서 말려준다. plate가 다 마르면 Oil Red O 염색약 (Oil Red O 500 mg을 2-propanol 100 ml에 녹인 용액을 증류수와 6:4의 비율로 섞은 후 0.45 ㎛ filter로 여과한 용액)을 500 ㎕씩 넣고 상온에서 어두운 상태로 30분간 염색한 후 PBS로 3번 씻어내었다. 염색이 된 세포는 현미경으로 관찰하였으며, 관찰 후 well당 300 ㎕의 2-propanol로 지방세포 내 염색된 염색약을 추출하여 ELISA reader로 500 nm에서 OD값을 측정하였다.

그 결과 지방세포 분화 억제효과를 확인하기 위하여 중성지방만을 붉은색으로 염색하는 Oil Red O 염색법을 통하여 3T3-L1 지방세포 내 생성된 중성지방의 양을 측정하였다. 분화된 3T3-L1 지방세포에 히알루론산을 0, 25, 50, 100, 200 ㎍/ml로 처리한 후 생성된 중성지방을 Oil Red O 시약으로 염색한 결과 대조군을 100 %로 잡고 비교하였을 때 고분자히알루론산의 경우에는 98.27±1.88, 98.58±3.05, 97.85±5.94, 96.48±13.58로 통계적인 유의차가 없는 것으로 나타났고(도 3. A), 중분자히알루론산의 경우 75.51±4.50, 65.41±7.15, 58.08±10.44, 53.35±8.68로 농도 의존적으로 유의적인 감소를 보였다(도 3. B, p<0.001). 저분자히알루론산의 경우 96.89±10.55, 96.27±7.52, 95.95±12.74, 93.06±9.62로 나타나 통계적으로 유의적인 차이가 없었다(도 3. C). 이 결과는 현미경적 관찰에서도 동일한 결과로 확인되었다(도 3. A, B, C). 도 3 에서와 같이 본 발명에 따른 히알루론산 중에서 중분자히알루론산은 3T3-L1 지방세포의 분화를 농도의존적으로 억제하였으며, 결과적으로 지방의 양도 감소시켰다. 따라서 본 발명에 따른 중분자히알루론산은 항비만 효과 및 체지방감소 효과가 있을 것으로 생각된다.

실시예 6 : 3T3-L1 지방세포에서의 세포 사멸 및 괴사 확인

3T3-L1 세포를 분화시킨 후 히알루론산을 농도별로 처리하고 3일간 배양하였다. 배양이 끝나면 배양액을 제거한 후 PBS 500 ㎕로 씻어낸 후 Trypsin EDTA를 200 ㎕씩 넣어서 세포를 때어내었다. 때어낸 세포를 배양액과 함께 원심분리 (2,000 rpm, 3 min, 4)하여 세포를 침전시켰다. 침전된 세포에 Anexin V Binding Buffer을 500 ㎕씩 넣어서 피펫으로 섞어주었다. kit 안의 시약을 각각 5 ㎕씩 넣고 5분간 손으로 잘 섞어주었다. 다시 한번 원심분리하여 세포를 모으고 Anexin V Binding Buffer 500 ㎕씩 넣으면서 피펫팅 하여 잘 섞어주었다. 다시 원심분리하여 Buffer를 버리고 2 % formaldehyde를 500 ㎕씩 넣어서 피펫팅 한 후 FACs tube에 옮겨서 측정하였다.

그 결과 히알루론산을 농도별로 3T3-L1 비만세포에 처리하여 세포를 회수한 후 Anneexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC) 와 propidium iodide (PI) 의 double staining 방법을 이용해 세포사멸 및 괴사를 측정하였다. Annexin-PI 이중형광염색에서 살아있는 정상세포는 annexin FITC와 PI가 모두 음성이고 세포사멸이 시작된 세포는 annexin-FITC만이 단독 양성이며 세포사멸이 진행되어 2차 괴사세포로 되면 annexin FITC와 PI가 모두 양성이다. 3T3-L1 비만세포를 분화시킨 후 히알루론산을 농도별로 처리하여 3일간 배양하였다. 고분자히알루론산의 경우 annexin FITC와 PI 의 양성반응은 히알루론산을 처리하지 않은 대조군을 100%로 잡았을 때 25, 50, 100, 200 ㎍/ml에서 각각 79, 62, 65, 67%로 진행되었으며(도. 4. A), 중분자히알루론산의 경우 대조군에 비해 81, 66, 41, 47%였다(도 4. B). 저분자히알루론산의 경우 대조군에 비해 81, 66, 41, 47% 나타나(도 4. C) 고분자히알루론산. 중분자히알루론산, 저분자히알루론산 모든 군에서 세포사멸 또는 괴사가 일어나지 않은 것을 알 수 있었다.

실시예 7 : Peroxisome proliferator-activated receptor(PPAR-γ)와 adipocyte protein 2(aP2)의 발현 조사

지방세포의 분화과정 중 히알루론산에 의해 발현되는 유전자의 변화를 알아보기 위해 3T3-L1 지방세포에 히알루론산을 농도별로 처리한 군과 대조군을 비교하였다. 배양한 세포의 mRNA를 추출한 후 지방세포의 분화 과정 중 발현 marker로 알려져 있는 peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR-), adipocyte protein 2 (aP2) 유전자의 발현변화를 RT-PCR을 통해 확인하였다. 지방세포로 분화시키고 히알루론산을 처리하지 않은 대조군의 발현을 100%로 잡았을 때 고분자히알루론산의 경우 PPAR-γ는 농도(25, 50, 100, 200 ㎍/ml)별로 93, 96, 95, 95%로 나타났으며, aP2 에서도 대조군에 비교하여 93, 94, 93, 95% 로 나타나 유의적인 감소를 보였다(도 5. A, p<0.001). 중분자히알루론산의 경우 PPAR-γ는 대조군에 비해 81, 69, 58, 56%로 감소하였으며, aP2의 경우 81, 67, 56, 55%로 유의적인 감소효과를 보였다(도 5. B, p<0.001). 저분자히알루론산의 경우 PPAR-γ는 대조군에 비해 76, 70, 64, 56%로 감소하였으며(p<0.01), aP2 에서도 대조군에 비교하여 93, 84, 83, 66%로 유의적인 감소효과를 보였다(도 5. C, p<0.001).

본 발명에서 얻어진 모든 결과는 SAS program (ver. 9.1)을 이용하여 평균과 표준편차를 구하고, 1원 배치 분산분석을 하였으며, 유의한 영향이 나타났을 때 각 군별 차이는 Duncan's multiple range test로 a = 0.05 수준에서 유의성을 검정하였다. 지방세포의 분화군과 각각의 실험군 간의 비교는 student t-test로 유의성 검정을 실시하였다.

미생물 발효에 의해 산업화, 상용화된 고분자 히알루론산으로부터 효소공법에 의한 중분자히알루론산 및 저분자히알루론산을 친환경공법으로 용이하게 대량생산이 가능하므로 비만 예방 또는 항비만 치료제 또는 건강 식품으로 유용하게 사용할 수 있을 것이다. 또한 본 발명의 기술은 고분자 다당류의 저분자화하는 기술에 응용될 것이다.

없음

Claims

분자량이 40,000 내지 50,000 Da인 중분자히알루론산 또는 1,000 내지 3,000 Da인 저분자히알루론산을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
삭제
분자량이 40,000 내지 50,000 Da인 중분자히알루론산 또는 1,000 내지 3,000 Da인 저분자히알루론산을 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 개선용 기능성 식품.