KR101682637B1

KR101682637B1 - 청피경옥고를 유효성분으로 포함하는 신경세포보호 및 기억력개선효과를 갖는 약학 조성물 및 청피경옥고를 함유하는 기능성식품

Info

Publication number: KR101682637B1
Application number: KR1020140047674A
Authority: KR
Inventors: 조정희; 조현우; 최인영; 김지현; 이희운; 허담
Original assignee: 한약진흥재단; 재단법인 전남생물산업진흥원
Priority date: 2014-04-21
Filing date: 2014-04-21
Publication date: 2016-12-06
Also published as: KR20150121788A

Abstract

본 발명은 인삼; 복령; 청피; 지황즙; 및 꿀;을 포함하여 구성된 것을 특징으로 하는 신경세포보호 및 기억력개선효과를 갖는 청피경옥고 조성물 및 이를 함유하는 기능성식품에 관한 것으로서, 잡화꿀을 이용한 청피경옥고는 신경세포의 산화적 손상에 의한 손상을 거제하며, 중추 신경계의 콜린성시스템(cholinergic system)의 이상 및 손상에 의해 나타나는 기억력 감퇴와 인지능력 상실에 효과가 있고, 잡화꿀과 청피경옥고 성분이 세포사멸과 관련이 깊은 caspase-3의 활성을 억제하는 효과가 있다.

Description

청피경옥고를 유효성분으로 포함하는 신경세포보호 및 기억력개선효과를 갖는 약학 조성물 및 청피경옥고를 함유하는 기능성식품{Pharmaceutical composition having the protection of neuronal cells, the improvement of memory and cognition ability comprising CitriPericarpium, and functional foodproduct containing the same}

본 발명은 청피경옥고를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 경옥고에 청피와 잡화꿀을 가미함으로써 청피경옥고를 유효성분으로 포함하는 신경세포보호 및 기억력개선효과를 갖는 약학 조성물 및 청피경옥고를 함유하는 기능성식품에 관한 것이다.

기억력과 관련된 신경계는 cholinergic 신경계, glutamatergic 신경계, GABAergic 신경계, serotonergic 신경계, adrenergic 신경계 등이 알려져 있으나 특히 콜린성(cholinergic) 신경계가 주로 기억력과 관계가 있다고 알려져 있다. 스코폴라민(Scopolamine)은 cholinergic 신경의 아류(subtype)중 하나인 무스카린 수용체 (mAChR)를 차단하는 경쟁적 antagonist의 하나로 아세틸콜린의 양은 변화시키지 않고, 시냅스 간극에서 아세틸콜린이 수용체에 결합하는 것을 방해하는데, 이는 중추 신경계 cholinergic 신경의 손상에 의해 나타나는 현상과 유사한 기억력 감퇴를 나타내며 이 모델에 효과가 있는 약물은 cholinergic 신경계를 경유하여 효능을 나타낼 것이라 생각된다.

지금까지 알쯔하이머(AD:Alzheimer's disease)형 치매의 경우 뇌의 cholinergic 신경세포의 광범위한 변성 및 소실이 인지능, 기억력 감퇴 주요 원인으로 생각되어, 남아 있는 cholinergic 신경계의 활성을 증가시켜 손상된 인지능과 기억력을 부분적으로나마 회복될 수 있는 약물들에 대한 연구가 주로 진행되어 왔으나 아직까지 효과적인 약물은 부족한 상태이다.

이에 본 출원인은 경옥고와 청피 및 잡화꿀을 이용하여 신경세포보호 활성이 높고 기억력 개선효과가 뛰어난 청피경옥고를 개발하게 되었다.

경옥고란 정혈(精血)을 돕고 생명을 연장시키는 익수 보약의 일종으로서, 동의보감에 의하면 인체내 모든 기관의 기능을 유지 및 활성화시키는 데에 대단한 효과가 있다고 전해진다. 또한, 경옥고는 정혈제 및 정력제로서의 약효뿐만 아니라, 구체적으로는 오장이 허약하여 피로를 자주 느끼는 환자, 위장이 약하여 소화불량이 심한 환자, 장염 장경련이 자주 일어나 복통이 심한 환자, 날씨가 조금만 음냉하면 감기에 잘 걸리고 기관지 천식으로 숨이 차고 해수 기침이 심한 환자에게 효과적이며 특히, 심신이 허약한 노약자들이 장복할 경우 흰머리가 검어지고 치아가 새로 돋아나며 생명을 연장시키는 효과가 있는 것으로 기재되어 있다.

한편, 경옥고의 현대적 연구 결과에 의하면, 경옥고는 항산화 효과를 가짐으로써, 세포 생리 활성에 기여한다. 뿐만 아니라, 경옥고는 피부 노화 현상을 완화하는 데에도 유효하다고 알려져 있다.

또한, 청피 (Aurantii Immatri Pericarpium)는 운향과인 귤 (Citrus)의 덜익은 과실의 과피로서, 진해, 거담작용이 있고 소화관의 운동능을 강화하며 항균작용과 항알러지 작용이 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 혜암 황도연이 지은 방약합편에 의하면 청피를 포함한 15가지의 한약재로 이루어진 이기거풍산(利氣祛風散)을 중풍과 구안와사의 치료에 이용하였다고 한다. 청피의 구성성분으로는 헤스페리딘, 아피제닌, 나린진, 노빌레튼 등의 플라보노이드와 리모넨 등의 정유가 있다.

본 청피를 이용한 특허로는 청피 추출물을 유효성분으로 함유하는 허혈성질환의 예방 및 치료용 약학조성물로 개발한 특허(대한민국 특허등록번호 제0669980호)가 있으나, 청피와 경옥고 및 잡화꿀의 성분이 복합적으로 작용함에 따른 상승효과에 의한 신경세포보호 및 기억력개선효과에 관해서는 상기 문헌 어디에도 게재된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 신경세포보호 및 기억력 개선에 관하여 연구를 거듭한 결과 청피경옥고의 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신경세포보호 및 기억력개선효과를 갖는 잡화꿀이 가미된 청피경옥고를 유효성분으로 포함하는 신경세포보호 및 기억력개선효과를 갖는 약학 조성물 및 청피경옥고를 함유하는 기능성식품을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명에 따른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

인삼; 복령; 청피; 지황즙; 및 꿀;을 포함하여 구성된 것을 특징으로 하는 청피경옥고를 유효성분으로 포함하는 신경세포보호 및 기억력개선효과를 갖는 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은

상기 꿀이 잡화꿀인 것을 특징으로 하는 청피경옥고를 유효성분으로 포함하는 신경세포보호 및 기억력개선효과를 갖는 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은

상기 청피경옥고가, 인삼 5 중량부 내지 9 중량부, 복령 2 중량부 내지 5 중량부, 청피 9 중량부 내지 13 중량부, 지황즙 20 중량부 내지 30 중량부, 꿀 45 중량부 내지 60 중량부의 혼합물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 청피경옥고를 유효성분으로 포함하는 신경세포보호 및 기억력개선효과를 갖는 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은

상기 청피경옥고의 함량이, 인삼 7.8 중량부, 복령 3.8 중량부, 청피 11.8 중량부, 지황즙 25.6 중량부, 잡화꿀 51.0 중량부의 혼합물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 청피경옥고를 유효성분으로 포함하는 신경세포보호 및 기억력개선효과를 갖는 약학 조성물을 제공한다.

삭제

또한, 본 발명은

청피경옥고를 유효성분으로 포함하는 신경세포보호 및 기억력개선효과를 갖는 기능성식품을 제공한다.

또한, 본 발명은

인삼, 복령, 청피를 곱게 분소하고 골고루 섞어서 혼합물을 제조하는 혼합물 제조단계; 상기 혼합물에 지황즙을 섞어서 반죽하여 반죽물을 제조하는 반죽물 제조단계; 상기 반죽물에 잡화꿀을 혼합하는 꿀첨가단계; 상기 꿀이 함께 혼합된 반죽물을 72시간 동안 약한 불로 중탕하여 끓이는 중탕단계; 중탕 후 흐르는 물에 충분히 식혀 냉각하는 냉각단계; 냉각 후 24시간 동안 약한 불에 다시 끓여 가열하는 가열단계; 및 가열 후 충분히 방냉하는 방냉단계;를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 신경세포보호 및 기억력개선효과를 갖는 청피경옥고의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

상기 혼합물 제조단계에서, 인삼은 7.8 중량부, 복령은 3.8 중량부, 청피는 11.8 중량부이며,

상기 반죽물 제조단계에서, 지황즙은 25.6 중량부이며,

상기 꿀첨가단계에서, 잡화꿀은 51.0 중량부인 것을 특징으로 하는 신경세포보호 및 기억력개선효과를 갖는 청피경옥고의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

제 7항 또는 제 8항의 제조방법에 의해 제조된 신경세포보호 및 기억력개선효과를 갖는 청피경옥고를 제공한다.

본 발명에 따른 잡화꿀을 이용한 청피경옥고는 신경세포의 산화적 손상에 의한 손상을 거제하며, 중추 신경계의 콜린성시스템(cholinergic system)의 이상 및 손상에 의해 나타나는 기억력 감퇴와 인지능력 상실에 효과가 있다.

또한, 본 발명에 따른 잡화꿀과 청피경옥고 성분은 세포사멸과 관련이 깊은 caspase-3의 활성을 억제하는 효과가 있다.

도 1은 잡화꿀과 아카시아꿀에 의한 HT22세포 보호효과를 비교하는 그래프,
도 2는 아카시아꿀을 이용한 청피경옥고(CKOG-1)와 잡화꿀을 이용한 청피경옥고(CKOG-2)의 HT22세포의 세포보호 활성을 비교하는 그래프,
도 3은 청피경옥고의 세포 사멸 억제가 세포 사멸과정에서 caspase-3 경로를 경유한다는 것을 보여주는 실험결과자료,
도 4는 Morris water maze test를 이용한 청피경옥고의 기억력 개선효과의 측정결과를 보여주는 그래프.
도 5는 Probe test를 이용한 청피경옥고의 기억력 개선효과의 측정결과를 보여주는 그래프.
도 6은 Passive avoidance test를 이용한 청피경옥고의 기억력 개선효과의 측정결과를 보여주는 그래프.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐으로, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에 따른 청피경옥고는 인삼, 복령, 청피, 지황즙, 꿀로 이루어진다. 이때, 인삼은 5 중량부 내지 9 중량부, 복령은 2 중량부 내지 5 중량부, 청피는 9 중량부 내지 13 중량부, 지황즙은 20 중량부 내지 30 중량부, 꿀은 45 중량부 내지 60 중량부, 바람직하게는 인삼은 7.8 중량부, 복령은 3.8 중량부, 청피는 11.8 중량부, 지황즙은 25.6 중량부, 잡화꿀은 51.0 중량부의 혼합물로 이루어진다.

청피가 9 중량부보다 적은 경우에는 청피의 효과가 미비하여 청피의 효능인 뇌세포보호 효과가 적으며, 13 중량부보다 많은 경우에는 첨가되는 양에 비해 그 유의적 차이가 없고 다른 구성성분들과의 함량에 대한 균형이 깨져 경옥고의 효능을 발휘하지 못하게 된다.

또한, 벌꿀은 항균, 항산화, 항염증, 항바이러스 등 다양한 기능성을 지닌 것으로 알려져 있다. 그 중 항균 및 항산화 활성은 대표적인 벌꿀의 기능성으로 손

꼽힌다. 항산화 활성은 활성산소를 소거함으로써 식품이나 인체 내의 산화작용을 줄여주는 역할을 한다. 활성산소는 물질대사에 의한 부산물로, 산소가 전자를 얻어 환원되면 초과산화(superoxide,O₂ ^-), 과산화수소(hydrogen peroxide,H₂O₂), 수산(hydroxylradical, HO), 물(H₂O)이 순차적으로 생성되는데 이때 생성된 물질들을 일반적으로 활성 산소라 한다. 활성 산소(reactive oxygen species, ROS)는 반응성이 매우 높은 물질로 세포를 손상시켜 동맥경화, 당뇨병, 암, 노화 등을 유발하는 것으로 알려져 있다(Wiseman and Halliwell, 1996). 벌꿀에 함유되어 있는 항산화 활성과 관련된 물질로는 플라보노이드(Ferreres et al ., 1991; Sabatier et al ., 1992), 페놀산(Andrade et al ., 1997), 각종 효소(glucose oxidase,catalase 등), 비타민 C, 유기산, 아미노산 등이다.

이와 같은 벌꿀은 그 밀원벌로 아래표와 같이 페놀화합물 및 플라보노이드 함량차이가 나며 그로 인하여 벌꿀의 항균 및 항산화 활성도면에서 차이가 난다. 벌꿀의 총 페놀화합물(TPC) 및 벌꿀의 총 플라보노이드 함량(TFC)은 Folin-Chiocalteau 방법에 따라 측정하였다.

본 발명에서는 메밀(Fagopyrum esculentum)꿀, 유채(Brassica Campestris)꿀, 감귤(Citrus unshiu)꿀, 헛개나무(Hovenia dulcis)꿀, 사과(Malus pumila)꿀, 벚(Prunus serrulata)꿀에서 선택된 적어도 1개 이상의 벌꿀로 이루어진 잡화꿀을 사용하며, 벌꿀효능면에서 일반적으로 많이 소비되는 아카시아꿀과 비교한다.

본 발명에 따른 청피경옥고의 제조방법은 혼합물 제조단계, 반죽물 제조단계, 꿀첨가단계, 중탕단계, 냉각단계와, 가열단계와, 방냉단계를 포함한다.

구체적으로는, 인삼 7.8 중량부, 복령 3.8 중량부, 청피 11.8 중량부를 곱게 분소하고 골고루 섞어서 혼합물을 제조한다. 그런 다음, 혼합물에 지황즙 25.6 중량부를 섞어서 반죽하여 반죽물을 제조한다. 다음, 반죽물에 잡화꿀 51.0 중량부를 혼합한다. 꿀이 함께 혼합된 반죽물을 72시간 동안 약한 불로 중탕하여 끓인다. 중탕 후 흐르는 물에 충분히 식혀 냉각한다. 냉각 후 24시간 동안 약한 불에 다시 끓여 가열한다. 가열후 충분히 방냉하여 위생 포장한다.

상기의 공정단계에 의하여 청피경옥고가 제조되며, 제조된 청피경옥고를 사용하여 효과실험을 하였다. 효과실험 결과는 아래와 같다

<실험예1> MTT assay

세포독성은 MTS(CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega, USA) 용액을 이용하여 세포생존율을 확인하였다. HT22 세포를 96well plate에 1×103 cells/100uL되게 분주하고 24시간 배양하였다. 여기에 각 샘플을 각각의 well에 처리하고 1시간 후 H2O2 250uM을 처리하여 24시간 배양하였다. 이후 MTS 용액을 10㎕씩 첨가하고 4시간 후 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

<실험예2> 웨스턴 면역블로팅(Western immunoblotting)

샘플을 PBS로 2번씩 세척한 후, 각기 100㎕의 lysis buffer (10×PBS, 1% NP-40, 20% SDS, 0.5 M EDTA, 0.01 M PMSF, 10 mg/㎖ Leupeptin, 1 mg/㎖ pepstatin A)를 처리하여 균질화를 시켰다. 균질화된 샘플을 튜브에 옮긴 후, 15,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 상층액을 새로운 튜브에 저장하였다. 브래드포드(Bradford) 단백질 정량법(1976)을 이용하여 각각 60㎍의 샘플들을 12% SDS-PAGE 전기영동을 시킨 후, 폴리불화비닐리덴 멤브레인(Polyvinylidine Difluoride membrane)에 이전(transfer)한다. Membrane은 5% skim milk에 1시간 동안 차단을 시켰고, caspase-3, GAPDH 항체를 1% skim milk에 1,000배 희석하여 4에서 18시간 이상 배양한다. 그 후, membrane을 0.1% Tween-20/1×TBS에 10분 간격으로 3번 세척 하였고, membrane을 1% skim milk에 5,000배 희석된 호세라디쉬 퍼옥시다아제 라벨드(horseradish-peroxidase labeled) 2차 항체에 1시간 동안 배양한 후, 3번 세척을 거쳐서 증폭화학발광(Enhanced Chemiluminoscent (ECL)) 시약을 1분간 처리한 다음 화학발광디텍터(chemiluninoscece detector)로 측정하였다.

<실험예3> 기억력 개선 효과 탐색을 위한 실험동물 제작

3-1. 실험동물

6주령의 SD-rat (male)을 구입한 후 6일 동안 동물사육실의 환경 하에서 검역 및 순화시키면서 일반 건강상태를 관찰한 후, 건강한 개체를 선별하여 시험에 사용하였다. 개체식별은 유성매직을 이용하여 각 개체번호 꼬리에 표시하며, 사육상자는 시험번호, 시험물질명, 시험항목, 입수일, 순화기간, 군분리일, 시험기간, 성/동물번호 및 시험책임자를 기재한 개체식별카드를 부착하여 식별하였다. 순화기간 중 이상이 발생한 개체와 정상적으로 체중이 증가하지 않은 개체를 제외한 후, 각 군간 평균체중 및 표준편차가 균일하도록 군 분리를 실시하였다.

3-2. 사육환경

본 시험의 환경은 온도 (22±3), 상대습도 (50±20) %, 환기횟수 (10 ~ 15) 회/시간, 조명주기 12시간 (8:00 ~ 20:00), 조도 (150 ~ 300) Lux의 사육환경으로 설정된 동물사육실에서 사료와 음용수를 급여하여 사육하며, 순화 및 시험기간 동안 격리 사육을 실시하였다.

3-3. 유발물질(scopolamine) 투여

유발물질로서 식염수(saline)에 녹인 스코폴라민(scopolamine) (1 mg/kg b.w.)을 복강투여 하였다.

스코폴라민(scopolamine)은 콜린성(cholinergic) 신경의 아류(subtype)중 하나인 무스카린 수용체를 차단하여 경쟁적 길항제의 하나로서 아세틸콜린의 양은 변화시키지 않고, 시냅스 간극에서 아세틸콜린이 수용체에 결합하는 것을 방해한다. 이는 중추 신경계의 콜린성(cholinergic) 신경의 손상에 의해 나타나는 현상과 유사한 기억력 감퇴를 나타낸다.

또한, 양성대조를 위해 사용한 치매 치료제인 도네페질(donepezil)은 아세틸콜린에스테라제(acetylcholinesterase)의 억제제(inhibitor)로서, 아세틸콜린(acetylcholine)을 가수분해하는 acetylcholinesterase의 활성을 억제하는 역할을 한다. 그러므로 donepezil을 투여하면 시냅스 사이의 신호전달물질인 아세틸콜린(acetylcholine)의 함량을 증가시키게 되고, 인지능력 및 기억력을 일시적으로 회복시키는 효과를 보이게 된다.

3-4. 시험군의 구성

시험군의 구성은 무처리군(control), 스코폴라민만 투여한 음성대조군(Scopolamine), 스코폴라민과 도네페질을 함께 투여한 양성대조군(Donepezil), 스코폴라민과 청피경옥고를 함께 투여하되 청피경옥고의 함량을 달리한 시료군(CKOG)으로 아래 [표 2]과 같다.

3-5. 실험 design

실험스케줄은 아래 표3과 같이, 15일간 24시간 간격으로 비파 5% 에탄올추출물 투여군(Low, High)에 시료를 전처리(경구투여) 하였다. 16일째 되는 날, 시료를 투여하고 2시간 후, scopolamine을 투여(1 mg/kg b.w.,복강투여) 하였다. scopolamine을 투여한지 30분 후에 인지기능 평가(water maze test)를 실시하였으며, 이와 같은 방식으로 총 5일간 행동평가를 수행하였다.

<실험예4> 인지능력 개선효과 테스트

4-1. 모리스 인지능력 평가(Morris Water maze test)

Water maze test는 Morris(1984) 실험법을 수정 보완한 것으로, 원형풀 (diameter: 180 cm, height: 75 cm)에 물을 25±1 cm로 채우고, 탈출 platform (24 cm)을 수면 1 cm 아래에 숨겼다. 위치를 확인할 수 있게 벽의 네면에 공간단서를 설치하고, 탈지분유를 물에 풀어 도피대를 육안으로 확인 할 수 없게 하였다. 실험 2일전과 하루전에 모든 실험군을 도피대가 없는 swimming pool에서 1분간 자유롭게 수영하게 해, 수영하는 상황에 적응시켰다. 본 실험에 들어가 도피대가 놓인 사분면을 제외한 3곳 중 2곳에서 임의의 순서로 동물을 출발시켜 60초간 도피대를 찾도록 하였다. 도피대를 찾으면 그로부터 20초간 그 위에 머무르게 하고, 45초 안에 도피대를 찾지 못하면 실험자가 손으로 동물을 도피대까지 유도하여 20초간 머물도록 하였다. 20초간의 위치 학습이 끝나면 바로 임의의 분면에서 동물을 출발시켜 도피대 까지 찾아가는 시간과 이동거리를 측정하였다. 도피대를 찾아 올라가면, 20초의 시간을 주고 연속적으로 하루에 총 4번을 시행하고, 모든 데이터는 pool위에 설치된 카메라로 촬영되어, video tracking system(Panlab, USA) 으로 분석 하였다.

4일간의 실험이 끝나면 24시간 후인 5일째 되는 날, probe trial을 시행한다. 도피대 없이 90초 동안 자유 수영을 하게 하여 이전 도피대의 위치에 대한 기억을 보유하고 있는지에 대한 검사를 실시하였다.

4-2. 수동적 회피반응실험 (passive avoidance test)

본 실험 8시간 전, 밝은 불빛이 드는 chamber와 암소의 chamber가 작은 통로로 붙어있는 상황에서, 밝은 불빛이 드는 chamber에 실험동물을 놓아둔다. 실험동물은 본능적으로 어두운 chamber로 들어가게 되지만 전기쇼크(electric shock)를 이용하여 혐오자극을 주어 공포학습을 시킨다. 8시간 후, 밝은 빛의 chamber에 실험동물을 두었을 때, 어두운 암소의 chamber에 들어갈 때까지의 시간을 측정하여 이를 수치화하였다.

실험결과

<실험결과1> 잡화꿀과 아카시아꿀에 의한 HT22세포 보호효과

경옥고의 구성 물질 중 가장 많은 부분을 차지하는 것은 꿀로 51.1%를 차지한다. 현재 많이 유통 사용되는 잡화꿀(Honey1), 아카시아꿀(Honey2)에 의한 HT22세포보호 효과를 확인한 결과, 도 1에 도시된 바와 같이, 시료 각각을 0.02 mg/ml, 0.2 mg/ml, 2 mg/ml 농도로 처리하고 H₂O₂로 HT22 세포사멸을 유도할 경우 잡화꿀이 아카시아꿀에 비해 세포보호 효과가 높은 것으로 관찰되었다.

이는 잡화꿀이 아카시아꿀에 비해 페놀함량 및 플라보노이드 함량이 많아 그에 따른 효과인 항균, 항산화 활성을 갖는다는 것을 입증한다 할 것이다.

<실험결과2> 청피경옥고 구성물질 조성변화에 의한 뇌세포 보호효과

본 실험 과정에서 청피의 뇌세포 보호효과를 확인했으며, 꿀의 종류에 따라 항균, 항산화 활성 효과가 다른 것을 확인하여, 아카시아꿀을 이용한 청피경옥고(CKOG-1), 잡화꿀을 이용한 청피경옥고(CKOG-2)를 제조하여 HT22세포의 세포보호 활성을 확인하였다.

그 결과 도 2에 도시된 바와 같이, 잡화꿀을 이용한 CKOG-2의 H₂O₂ 유도 HT22세포 사멸과 관련하여 아카시아꿀을 이용한 CKOG-1에 비하여 뇌세포 보호 효과가 높은 것을 확인했으며, 도 3에 도시된 바와 같이 청피경옥고의 세포 사멸 억제는 세포 사멸과정에서 caspase-3 경로를 경유하는 것으로 관찰되었다.

<실험결과3> 청피경옥고의 인지능력, 기억력 개선효과

잡화꿀을 이용하여 제조한 청피경옥고(CKOG)의 인지능력, 기억력 개선효과를 모리스 인지능력 평가(Morris Water maze test) 및 Probe test를 통해 검증하였고 그 결과를 도 4 내지 도 6에 나타내었다.

3-1. Morris water maze test를 이용한 청피경옥고의 인지능력, 기억력 개선효과 측정

스코폴라민(Scopolamine)으로 기억상실(amnesia)을 유발한 후 청피경옥고를 투여한 실험동물을 대상으로 Morris water maze test를 실시한 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 도시된 바와 같이, 무처리군(Control)의 경우 첫째날, 첫 번째 시도에서 146.40초 (±88.53 sec) 수준에서 도피대를 찾았으며, 시도 횟수와 실험일이 지나갈수록 학습이 진행되어 각 실험일 첫 번째 시도는 각각 146.40초 (±88.53 sec), 79.39초 (±50.77 sec), 25.69초 (±14.81 sec), 그리고 마지막 네 번째 날에는 13.71초 (±5.06 sec)만에 도피대를 찾아 탈출하였다. 하지만 Scopolamine만을 투여한 음성대조군 (Scopolamine)은 기억력감퇴와 amnesia가 유발되어 학습이 정상적으로 진행되지 않아 도피대를 찾는 시간이 최장 210.61초 (±36.43 sec)에서, 최단 151.35초 (±26.77 sec)로 무처리군과 유의적 차이를 보였다.

Scopolamine과 양성 대조를 위해 치매 치료제인 도네페질(donepezil)을 같이 처리한 양성대조군(Donepezil)은 최장 164.77초 (±79.43 sec)에서, 최단 66.86초 (±14.63 sec)로 도피대를 찾아 탈출하였다. 그리고, scopolamine과 실험군인 청피경옥고를 같이 투여한 시료군은 저농도(100 mg/kg b.w.)와 고농도(300 mg/kg b.w.)군 각각, 최장 194.90초 (±68.74 sec), 183.30초 (±64.90 sec)로 도피대를 찾아 탈출하였으며, 최단 111.46초 (±26.59 sec), 95.24초 (±28.79 sec)로 도피대를 찾았다.

각 실험일에서 첫 번째 시도만을 비교하였을 때, day 1에는 Control군, 또는 scopolamine군의 모든 군에서 유의적 차이는 관찰할 수 없었다. 하지만 day 2에, 고농도 시료군에서 scopolamine군과 비교하여 유의적으로 도피 시간이 감소하였으며, day 3과 day 4 모두 고농도 시료군에서 도피시간이 유의적으로 감소한 것을 확인하였다. 하지만 control군과 유의적으로 동일한 효과는 어느 군에서도 확인 할 수 없었다. 또한, 각 실험일에서 네 번째 시도만을 비교하였을 때, day 1에서는 첫 번째 시도와 동일하게 시료군에서 scopolamine군과 비교하여 유의적 차이를 관찰 할 수 없었지만, day 2에서 day 4 까지, 고농도 시료군에서 도피 시간이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였으며, day 4에서는 저농도 시료군에서 또한 scopolamine군과 비교하여 유의적으로 도피 시간이 감소함을 확인하였다. 그리고, control군과 동일한 효과는 모든 군에서 확인 할 수 없었다.

3-2. Probe test를 이용한 청피경옥고의 인지능력, 기억력 개선효과 측정

Scopolamine 으로 amnesia를 유발하여 청피경옥고를 투여한 실험동물을 대상으로 Morris water maze test의 연장 실험인 probe test를 실시하였고 그 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에 도시된 바와 같이, Control군의 경우 도피대를 제거하고 90초 동안 도피대가 있었던 분면에서 유영한 시간이 47.77초 (±7.56 sec) 였으며, scopolamine군 (17.15 ±5.57 sec)에서는 control군과 비교하여 도피대가 있었던 분면에서 유영한 시간이 유의적으로 감소하였다. 하지만 청피경옥고 (100 mg/kg b.w.: 23.74 ±3.60 sec, 300 mg/kg b.w.: 27.16 ±8.05 sec)과 도네페질(donezezil)군 (33.83 ±8.56 sec) 모두 도피대 분면 유영시간이 scopolamine군과 비교하였을 때, 유의적으로 증가 하였음을 확인하였다.

3-3. Passive avoidance test를 이용한 청피경옥고의 인지능력, 기억력 개선효과 측정

Scopolamine 으로 amnesia를 유발하여 청피경옥고를 투여한 실험동물을 대상으로 혐오자극을 이용한 passive avoidance test를 실시하였고 그 결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에 도시된 바와 같이, Control군의 경우 밝은 빛의 chamber에서 암소의 chamber로 들어가는 시간이 281.82초 (±29.03 sec)로 측정되었으며, scopolamine군 (97.39±49.58 sec)의 경우, control군과 비교하여 밝은 빛의 chamber에서 머무는 시간이 유의적으로 감소하였다. 하지만 시료군 (100 mg/kg b.w.: 137.80±33.39 sec, 300 mg/kg b.w.: 168.56±32.48 sec)과 donezezil군 (203.85±43.80 sec) 모두 scopolamine군과 비교하였을 때, 밝은 빛의 chamber에서 머문 시간이 유의적으로 증가하였음을 확인하였다.

상술한 바와 같이, 기억력 손상 및 치매 같은 질환에 관련이 있는 해마의 신경세포 감소와 관련하여, 본 발명에 따른 잡화꿀을 이용한 청피경옥고로 실험한 결과 잡화꿀에 의해 해마 유래 세포주 HT22의 산화적 손상에 의한 세포손상이 억제되었으며 또한 잡화꿀을 함유한 경옥고에서 아카시아꿀을 이용한 경우보다 세포보호효과가 더 높았다. 이는 잡화꿀과 청피경옥고 성분이 세포사멸과 관련이 깊은 caspase-3의 활성을 억제하기 때문인 것으로 판단된다.

또한, 스코폴라민(scopolamine)을 투여하여 기억력감퇴와 amnesia가 유발된 개체에 잡화꿀을 이용한 청피경옥고를 투여한 결과 기억력 및 인지능력이 회복되어 도피대 탈출 시간이 감소하고, 암소 chamber에 들어가지 않고 밝은 빛의 chamber에 머무는 시간이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 이것은 청피경옥고의 투여가 증가한 acetylcholinesterase의 활성을 감소시킴으로서 상대적으로 acetylcholine의 함량을 증가시켜, 경쟁적 antagonist인 scopolamine과의 경쟁에 있어 acetylcholine이 우위에 설 수 있게 하는 역할을 하는 것으로 추측된다.

본 실험을 통해 잡화꿀을 이용한 청피경옥고는 신경세포의 산화적 손상에 의한 손상을 거제하며, 중추 신경계의 콜린성시스템(cholinergic system)의 이상 및 손상에 의해 나타나는 기억력 감퇴와 인지능력 상실에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

비록 본 발명이 상기에서 언급한 바람직한 실시예와 관련하여 설명되었지만, 본 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다른 다양한 수정이나 변형이 가능할 것이다. 따라서, 첨부된 청구범위는 본 발명의 진정한 범위 내에 속하는 그러한 수정 및 변형을 포함함은 물론이다.

Claims

인삼 5 중량부 내지 9 중량부; 복령 2 중량부 내지 5 중량부; 청피 9 중량부 내지 13 중량부; 지황즙 20 중량부 내지 30 중량부; 및 꿀 45 중량부 내지 60 중량부;를 포함하여 구성되며,
상기 꿀은 잡화꿀인 것을 특징으로 하는 청피경옥고를 유효성분으로 포함하는 신경세포보호 및 기억력개선효과를 갖는 약학 조성물.
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제 1항에 있어서,
상기 청피경옥고의 함량은, 인삼 7.8 중량부, 복령 3.8 중량부, 청피 11.8 중량부, 지황즙 25.6 중량부, 잡화꿀 51.0 중량부의 혼합물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 청피경옥고를 유효성분으로 포함하는 신경세포보호 및 기억력개선효과를 갖는 약학 조성물.
삭제
제 1항 또는 제 4항의 청피경옥고를 유효성분으로 포함하는 신경세포보호 및 기억력개선효과를 갖는 기능성식품.
인삼 7.8 중량부, 복령 3.8 중량부, 청피 11.8 중량부를 곱게 분소하고 골고루 섞어서 혼합물을 제조하는 혼합물 제조단계;
상기 혼합물에 지황즙 25.6 중량부를 섞어서 반죽하여 반죽물을 제조하는 반죽물 제조단계;
상기 반죽물에 잡화꿀 51.0 중량부를 혼합하는 꿀첨가단계;
상기 꿀이 함께 혼합된 반죽물을 72시간 동안 약한 불로 중탕하여 끓이는 중탕단계;
중탕 후 흐르는 물에 식혀 냉각하는 냉각단계;
냉각 후 24시간 동안 약한 불에 다시 끓여 가열하는 가열단계; 및
가열 후 방냉하는 방냉단계;를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 신경세포보호 및 기억력개선효과를 갖는 청피경옥고의 제조방법.
삭제
제 7항의 제조방법에 의해 제조된 신경세포보호 및 기억력개선효과를 갖는 청피경옥고.