KR101680355B1 - 스캐폴드 제조 방법 및 이에 의해 제조된 스캐폴드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 스캐폴드 제조 방법 및 이에 의해 제조된 스캐폴드에 관한 것으로, 보다 상세하게는 스캐폴드에 콜라겐 및 SDF-1을 물리적, 화학적으로 함유시켜 골 재생을 촉진시키는 스캐폴드 제조 방법 및 이에 의해 제조된 스캐폴드에 관한 것으로, 스캐폴드 표면을 3-APTES로 표면처리하여 콜라겐 및 SDF-1가 물리적 화학적으로 스캐폴드에 부착되도록 하여, 인테그린이 적합한 세포외기질로 판단하도록 하면서 SDF-1의 배출속도가 시간의 경과시에도 급격한 변화가 일어나지 않도록 하여 골 손실이 일어난 부분의 회복시간을 단축하는 스캐폴드 및 그 제조방법에 있다.

Description

스캐폴드 제조 방법 및 이에 의해 제조된 스캐폴드{Method for scaffold and scaffod thereof}
본 발명은 스캐폴드 제조 방법 및 이에 의해 제조된 스캐폴드에 관한 것으로, 보다 상세하게는 스캐폴드에 콜라겐 및 SDF-1을 물리적, 화학적으로 함유시켜 골 재생을 촉진시키는 스캐폴드 제조 방법 및 이에 의해 제조된 스캐폴드에 관한 것이다.
세포외 물질 중에는 단백질과 다당류와 같은 유기 고분자를 주성분으로 하고 있는 세포외 기질(extracellular matrix; ECM) 이라고 불리는 유기고형물질이 존재하고, 상기 ECM은 조직의 구조적 지지체로서 그리고 세포의 접착유도물질 역할을 한다.
이러한 ECM에 세포가 접착하면 세포내 정보전달이 활성화되고, 세포형태, 증식, 세포사(cell death) 등의 기본적인 세포기능이 제어되므로, 인공적으로 상기 세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 역할을 수행하는 물질인 스캐폴드를 제조하여 골수복재로서 뿐만 아니라 환자의 줄기세포를 스캐폴드에 부착하여 골 손상 부위에 이식하는 조직공학 분야에서도 활발히 사용하고 있으며, 상기 스캐폴드에 대한 선행기술로 대한민국 등록특허 10-1230704호에서는 인산칼슘을 이용한 스캐폴드가 제시되어 있고, 대한민국 등록특허 제10-1436740호에는 젤라틴, 콜라겐, 키토산 등 천연 고분자로 이루어진 스캐폴드가 제시되어 있다.
이러한 스캐폴드에는 특정 신호 전달 분자(signaling molecules)를 포함시켜 상기 분자를 적절한 시점에 적절한 량으로 전달하여 줄기 세포의 표현형을 조절하는데, 상기 스캐폴드의 신호 전달 분자의 예로 케모킨(chemokine)으로 불리는 주화성 신호 전달 분자(chemotactic sigmaling molecules)가 있으며, 상기 주화성 신호전달 분자 중 하나인, SDF-1(stromal derived factor-1)은 스캐폴드에 함유되어 줄기세포를 스캐폴드 내부로 유도하는 역할을 하여 골 재생을 촉진시킨다.
이와 같이 스캐폴드에 SDF-1을 적용한 기술로 국내 등록특허 제10-1436740호가 있으며, 이는 젤라틴, 콜라겐, 키토산 등 천연 고분자로 이루어진 스캐폴드가 높은 생분해성으로 인하여 체내에서 구조를 오랫동안 유지하지 못하므로, 이를 보완하기 위하여 상기 젤라틴과 실록산의 혼합을 통하여 체내에서 분해되지 않고 안정하며 기계적 강도가 우수한 젤라틴-실록산 하이브리드 스캐폴드를 제공하고, 상기 하이브리드 스캐폴드 내부에 SDF-1을 포함시켜 체내에서 우수한 화학적 물리적 안정성을 유지함과 동시에 SDF-1을 천천히 방출하므로 조직 재생에 유용하게 사용할 수 있도록 한 기술이 공개되어 있다.
그러나, 상기한 선등록 특허는 천연 고분자인 젤라틴을 실록산과 혼합하여 제조되는 스캐폴드로서, 세포의 인테그린(integrin)이 상기 실록산을 적합한 세포외기질로 판단하지 않아 세포의 증식 및 분화 속도가 다소 지연되고, 젤라틴-실록산 하이브리드 스캐폴드의 표면에 아미노기가 생성되지 않아 자체적으로는 성장인자인 SDF-1과 화학결합 하지 않고, 물리적인 모세관 힘에 의해서만 SDF-1을 함유하므로, 생체 내 이식시 세포가 부착되기 전에 SDF-1이 빨리 방출된 후 시일이 지날수록 그 방출량이 급격히 감소하여 지속적인 세포 재생 효과를 얻을 수 없다는 문제점이 있었다.
한편, 본 발명인의 선등록특허 10-1230704호의 인산칼슘 스캐폴드에도 상기 SDF-1을 적용시킬 수 있으나, 상기 인산칼슘 스캐폴드에는 표면에 아미노기가 없어서 SDF-1의 적용시 모세관현상에 의한 물리적인 SDF-1의 결합만 가능할 뿐 화학적 결합이 이루어지지 않아, 인체에 적용시 스캐폴드의 SDF-1이 급속히 방출되어 세포 재생 효과를 얻을 수 없는 문제점이 있었다.
본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 스캐폴드 표면을 3-APTES로 표면처리하여 아미노기를 생성함으로서, 콜라겐 및 SDF-1이 물리적 화학적으로 스캐폴드에 부착되도록 하여, 인테그린이 적합한 세포외기질로 판단하도록 하면서 SDF-1의 배출속도가 시간의 경과시에도 급격한 변화가 일어나지 않도록 하여 골 손실이 일어난 부분의 회복시간을 단축하는 데 본 발명의 목적이 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징은 스캐폴드에 3-APTES를 표면처리하는 단계(S1), 콜라겐 및 SDF-1 혼합 용액 제조 단계(S2), 상기 (S2)의 용액에 상기 (S1)에서 3-APTES로 표면처리된 인산칼슘 스캐폴드를 침지하는 단계(S3)를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 스캐폴드 제조 방법에 있다.
상기에서 스캐폴드는 인산칼슘 스캐폴드를 사용한다.
상기 (S2)의 콜라겐 및 SDF-1 혼합용액은 콜라겐을 증류수에 투입한 후, 아세트산을 넣고 녹인 제 1 용액과 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)와 엔-하이드록시-석신이미드(NHS)를 증류수와 혼합한 제 2 용액을 각각 1:1의 비율로 혼합하여 6시간 이상 유지한 혼합액의 pH가 5.5-4.7가 되면, SDF-1를 첨가하여 완전히 용해시켜 제조한다.
상기한 바와 같은 구성을 갖는 본 발명에 따르면, 스캐폴드에 3-APTES를 표면처리하여 생성된 아미노기에 SDF-1과 콜라겐의 카르복실기를 동시에 함유시킴으로써, 인체 식립 시, 물리적으로 함유된 SDF-1이 초반에 방출되어 줄기 세포의 스캐폴드 주위로 이동을 증가시키며, 화학적으로 결합된 SDF-1은 계속적인 세포의 유도에 관여하는 ECM역할을 수행할 수 있고, 콜라겐에 의하여 세포의 인테그린이 적합한 ECM으로 판단하여 세포의 부착 및 생장율을 증가시킬 수 있는 효과가 있다.
이를 통해 세포의 증식 및 분화 속도가 증가하고, 이는 골 재생 속도의 증가로 이어져 회복 시간의 단축에 크게 기여하게 된다.
아울러, 공지의 스캐폴드를 이용하여 골 재생 속도가 높은 우수한 스캐폴드를 제조할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 BCP 스캐폴드의 SEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 스캐폴드에 표면 처리 및 콜라겐과 SDF-1이 함유되는 과정을 나타내는 도식도이다.
도 3은 본 발명에 따른 스캐폴드 표면의 XPS 분석 결과를 나타낸 것이다.
이하 본 발명의 실시예를 첨부한 도면을 참조하여 살펴본다.
최근 줄기세포에 대한 연구는 성체줄기세포, 그 중에서도 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell) 및 조혈모 줄기세포(hematopoietic stem cell)에 대하여 주로 이루어지고 있는데, 중간엽 줄기세포는 윤리적인 문제가 없고, 면역 거부반응이 없어 향후 세포치료의 유용한 도구로 각광 받고 있다.
줄기세포에 있어 가동화(mobilization)라는 개념은 골수 틈새(bone marrow niche)에 있는 중간엽 줄기세포가 멀리 떨어진 손상된 조직으로부터 유래한 특정 신호를 받아 골수에서 순환계(systemic circulation)로 이동하는 것을 말한다.
또한, 회귀(homing)이라는 개념이 있는데, 이것은 가동화되었던 줄기세포들이 대상 조직의 혈관계에 포착되어 내피세포(endothelium) 안으로 이동(transmigration)되는 것을 뜻한다. 회귀작용과 관련된 세포 표면 단백질에는 SDF-1α(Stromal cell-derive factor-1α)및 이것의 수용체(receptor)인 CXCR-4(CXC chemokine receptor-4)가 알려져 있으며, 조직이 손상을 입거나, 재생이 필요한 조직에서 SDF-1α의 농도 경사(concentration gradient)를 형성하게 되어, 줄기세포는 그 표면에 발현된 CXCR4를 통해 표적 조직으로 이동하게 되며, 구르기(rolling) 및 부착(adhesion)이 일어나게 된다.
결론적으로 SDF-1은 세포의 회귀현상을 통해 세포가 원하는 곳으로의 이동을 가능하게 할 수가 있으며, 이를 통한 상처로의 줄기세포 이동을 통해 빠른 회복을 기대할 수 있다.
한편, 콜라겐은 인체에 가장 많이 포함되어 있는 단백질의 한 종류로서, 자연골에도 type I 콜라겐이 존재하는 것으로 알려져 있다. 상기 콜라겐을 이용했을 시, 인테그린이 콜라겐을 세포외기질로 적합판단하게 되고 이는 세포가 잘 부착되는데 도움이 된다.
이와 같이 세포의 부착시간이 단축 될수록 빠른 증식 및 분화가 가능해 지며, 이는 빠른 골 재생에 있어서 중요한 요인이 되고 있다.
본 발명에서는 상기한 바와 같이 골 재생에 효과적인 SDF-1과 콜라겐을 함유한 스캐폴드를 골손실이 일어난 부분에 식립함으로써 골 재생 속도를 증가시켜 회복시간의 단축에 크게 기여하도록 하는 데 특징이 있다.
이에 따라 본 발명의 실시예를 하기에서 첨부된 도면을 참조하여 보다 상세하게 살펴본다. 단, 하기 실시예는 발명을 예시하는 것으로, 이에 국한되는 것은 아니다.
(1) 스캐폴드 준비
인산칼슘 스캐폴드는 인체 자연골의 구성성분으로 세포외기질(ECM) 역할로서 세포의 부착과 골전도성이 우수하며, 생체친화성이 높고, 생체활성 및 세포의 전도가 뛰어난 물질로 알려졌으며, 종래의 젤라틴-실록산 하이브리드 스캐폴드보다 생체활성과 기계적 강도가 높다.
특히, 본 발명에서는 BCP가 함유된 인산칼슘 스캐폴드(이하 '인산칼슘 스캐폴드'라고 한다.)를 제조하여 사용한다. 이는 BCP(biphasic tricalcium phosphate)가 천연뼈와 가장 유사한 화학적 성분으로 이루어진 hydroxyapatite(HAp, Ca10(PO4)6(OH)2)와 β-tricalciumphosphate(β-TCP,Ca3(PO4)2)이 공존하는 것으로, HAp의 인체 뼈와의 뛰어난 화학적 결합력과 비교적 우수한 강도, β-TCP의 우수한 생분해성이 균형을 이루고 있어, 스캐폴드의 기계적 강도와 생분해성을 더욱 높힐 수 있기 때문이다.
이러한 스캐폴드의 구조는 도 1에 나타내는 바와 같이 200μm-400μm의 매크로 기공과 0.5μm-5μm 크기의 마이크로 개기공으로 구성된다.
(2) 3-aminopropyltriethoxysilane(3-APTES) 표면처리
상기 (1)에서 준비된 200μm-400μm의 매크로 기공과 0.5μm-5μm 크기의 마이크로 개기공으로 구성된 다공성 인산칼슘 스캐폴드에 SDF-1 및 콜라겐를 코팅하기 위한 전처리 과정으로, 3-APTES를 표면처리한다.
(1)에서 설명한 다공성 인산칼슘 스캐폴드는 표면에 아미노기가 없어, 표면처리를 하지 않으면 콜라겐 및 SDF-1과 화학 결합을 할 수 없으므로, 표면처리를 통하여 아미노기를 생성하여 SDF-1 및 콜라겐이 화학적으로 부착되도록 함으로서, 스캐폴드에 대한 고정성이 확보되고, 이에 세포가 안정적으로 부착될 수 있도록 하는 과정이다.
이러한 표면처리 방법을 구체적으로 살펴보면, 먼저 3-APTES를 3차 증류수 부피 기준 5 ~ 15vol%로 3차 증류수에 첨가하여 완전히 혼합한 혼합액에 상기 인산칼슘 스캐폴드를 침지시켜 90~100ㅀC에서 1~3시간동안 침지시킨 후, 증류수와 초음파를 이용하여 반응한 3-APTES만 남기기 위해 완전히 세척함으로써, 반응하지 않고 잔여하는 3-APTES를 제거한다.
이 과정에서 인산칼슘 스캐폴드 표면의 하이드록실기(-OH)가 3-APTES의 라디칼과 반응하여 인산칼슘 스캐폴드와 3-APTES가 결합하게 되고, 결과적으로 침지된 인산칼슘 스캐폴드의 표면에는 도 2와 같이, 하이드록실기가 아미노기(-NH2)로 치환된 형상이 나타난다.
(3) 콜라겐(Collagen) 및 SDF-1 용액(solution) 제조
제 1 용액 : 콜라겐을 증류수 중량 기준 0.1~1.0wt%로 증류수에 첨가한 후, 아세트산(acetic acid) 0.1~0.5ml를 넣고 완전히 녹여준다.
제 2 용액 : 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)carbodiimide, EDC)와 엔-하이드록시-석신이미드(N-Hydroxy-succinimide, NHS)를 3차 증류수 중량 기준 0.1~0.5wt%로 3차 증류수와 혼합한다.
상기에서 제조한 제 1 용액과 제 2 용액을 각각 1~2:2~1(바람직하게는 1:1)의 비율로 혼합하고 3-10시간(바람직하게는 6시간) 유지시켜서 카르복실기(carboxyl group)를 활성화시킨 혼합액의 pH가 5.5-4.7정도의 약산으로 확인되면 상기 제1/2용액의 혼합 용액에 혼합용액 총중량 기준 0.1~1wt%의 SDF-1를 첨가하고 완전히 용해시켜 콜라겐 및 SDF-1 용액을 제조한다.
(4) 콜라겐 및 SDF-1을 인산칼슘 스캐폴드에 코팅(coating)하는 단계
상기 3-APTES로 표면처리된 인산칼슘 스캐폴드에 콜라겐 및 SDF-1을 화학적 결합과 물리적 작용을 통해 일괄적으로 함유시킬 수 있어, 제조 공정을 단순화 할 수 있다.
즉, 상기 (3)에서 제조한 콜라겐 및 SDF-1 용액에 상기 (2)에서 3-APTES로 표면처리 된 인산칼슘 스캐폴드를 4~6시간 정도 침지 후, 콜라겐 및 SDF-1이 함유된 인산칼슘 스캐폴드를 꺼내어 3차 증류수를 이용하여 세척하고, 상온에서 완전히 건조한다.
이에 의해 도 2에 나타내는 바와 같이 상기 3-APTES로 표면처리 된 인산칼슘 스캐폴드의 표면에 있는 아미노기(-NH2)와 콜라겐, SDF-1 각각의 카르복시기(-COOH)가 탈수축합반응 하여 물(H2O)을 탈리(脫離)하고, 펩타이드 결합(-CONH)하게 되어 상기 3-APTES로 표면처리 된 인산칼슘 스캐폴드에 콜라겐, SDF-1이 화학적 결합을 하게 된다.
도 3은 본 발명에 따른 스캐폴드 표면의 XPS(X-ray Photoelectron Spectroscopy) 분석 결과를 나타낸 것으로, 300eV 부근에서 검출되는 C1s, 400eV 부근에서 검출되는 N1s, 500eV 이상에서 검출되는 O1s는 각각 펩타이드 결합에서 비롯된 C, N, O이다. 이를 통해 상기 인산칼슘 스캐폴드 표면에 콜라겐과 SDF-1이 3-APTES로 표면처리 된 인산칼슘 스캐폴드 표면에 성공적인 화학적 결합을 하여 코팅이 이루어짐을 확인하였다.
이 때, 화학적 결합을 하지 못한 SDF-1은 콜라겐 섬유(fiber)와 함께 상기 3-APTES로 표면처리 된 인산칼슘 스캐폴드의 표면에 물리적으로 함유될 수 있다.
이러한 본 발명의 스캐폴드에 의하면, 1차적으로 모세관 힘에 의해 세포 및 혈액을 흡수하고 매크로 기공으로 혈관과 세포가 유입된 후, 세포의 인테그린이 스캐폴드 표면에 코팅된 콜라겐을 세포외 기질로 판단하여 세포의 증식 및 분화 속도가 증가한다.
또, 물리적으로 함유되어 있는 SDF-1이 세포의 스캐폴드 주위로 이동을 증가 시켜 초반 세포의 부착 및 증식에 영향을 주면서, 화학적으로 결합된 SDF-1은 계속적인 줄기 세포의 유도 및 유입에 관여할 뿐만 아니라, 매크로 기공을 통해 자가골 형성 점유율을 높일 수 있다.
이를 통해 골 재생 속도가 향상되면서 회복 시간의 단축에 크게 기여할 수 있으므로, 본 발명에 따라, 다공성 스캐폴드 구조에 SDF-1과 콜라겐을 코팅하는 것이 골 재생에 유리하다.

Claims (4)

  1. 200㎛~400㎛의 매크로 기공과 0.5㎛~5㎛의 마이크로 개기공으로 구성된 인산칼슘 스캐폴드 준비 단계(S1);
    S1에서 준비된 스캐폴드에 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-APTES)을 표면 처리하는 단계(S2);
    S2에서 표면 처리된 스캐폴드를 스트로멀 셀 디라이브드 팩터-1(SDF-1)이 0.1wt%~1wt% 첨가된 콜라겐 및 스트로멀 셀 디라이브드 팩터-1(SDF-1) 용액에 4~6시간 침지 하여 코팅하는 단계(S3);
    S3에서 코팅된 스캐폴드를 세척하고, 상온에서 건조하는 단계(S4)로 이루어지는 것을 특징으로 하는 SDF-1이 결합된 스캐폴드 제조 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항의 제조방법으로 제조되어 콜라겐 및 스트로멀 셀 디라이브드 팩터-1(SDF-1)이 스캐폴드 표면에 물리적, 화학적으로 결합 된 것을 특징으로 하는 SDF-1이 결합된 스캐폴드.
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