KR101673377B1

KR101673377B1 - 독활 추출물을 포함하는 고추 역병 방제용 조성물

Info

Publication number: KR101673377B1
Application number: KR1020140034475A
Authority: KR
Inventors: 오태석; 김창호; 구한모; 김성민; 임현구
Original assignee: 오태석
Priority date: 2014-03-25
Filing date: 2014-03-25
Publication date: 2016-11-09
Also published as: KR20150111477A

Abstract

본 발명은 독활 추출물을 포함하는 고추 역병 방제용 조성물 및 독활 추출물을 이용하여 고추 역병을 방제하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 독활 추출물을 유효성분으로 포함하는 고추 역병 방제용 조성물은 고추 역병에 대한 방제 효과가 있어서 원예작물의 식물병에 대한 천연 방제제로서 활용이 기대된다.

Description

독활 추출물을 포함하는 고추 역병 방제용 조성물{A composition for preventing Phytophthora blight containing Aralia cordata Thunb extracts}

본 발명은 독활 추출물을 포함하는 고추 역병 방제용 조성물 및 이를 이용하여 고추 역병을 방제하는 방법에 관한 것이다.

현대의 작물생산체계는 생산성 향상에 저해요인이 되는 유해생물의 끊임없는 위협으로부터 작물을 보호하기 위한 발전을 계속해 왔다. 현대사회는 건강 지향적 욕구의 증대와 안정성에 대한 인식이 높아져 합성농약의 사용에 대한 인식이 변화되고 있다. 이러한 현실적인 문제로 인하여 천연물에서 각종 병원성미생물과 식물병 유발균에 대해 항균력을 보이는 물질을 이용하는 친환경농자재의 생산과 소비가 지속적으로 증가하고 있는데 일반적으로 식물체 및 한약재 중에는 미생물로부터 자신을 보호하기 위하여 향균성분을 함유하고 있으며 주로 유기산, 지방산, 플라보노이드 등의 페놀성 물질 및 배당체 등에 기인한다고 한다. 이러한 이유로 식품, 의약 및 생물공학산업 등의 분야에서도 항균성 소재의 연구를 위한 천연물의 추출성분에 관한 연구가 진행되고 있으며 항균력이 뛰어나고 안정성이 확인된 항균물질을 분리하여 응용하는 연구가 활발하게 진행되고 있다(Han, 2004 : Park et al.., 2001).

현대 농업에서 살균제를 제외하고는 식물병의 효율적인 방제는 생각할 수 없다. 특히 농업선진국에서의 살균제에 대한 의존도는 더욱 높아서, 전세계의 살균제 생산량 중 서구 유럽이 39%, 극동아시아지역이 28%, 미국이 12%를 사용하고 있고 나머지 21%만이 전세계의 나머지 지역에서 사용되고 있다.

살균제에 의한 식물병의 방제는 1850년대 Alexis Millardet에 의해 개발된 Bordeaux Mixture가 Plasmopara viticola 에 의한 포도나무 노균병을 방제하는데 사용되면서 부터이다. 1900년대 중반에 많은 수의 유기살균제가 개발되어 다양한 식물병의 방제를 위해 사용되기 시작된 이후로, 현재 113종의 유효성분을 지닌 200여가지 살균제가 사용되고 있다.

일반적으로, 고추역병은 우리나라에서 경제적으로 매우 중요한 것으로 고추생산에 있어 큰 감수요인이 되고 있다. 이를 방제하기 위하여 저항성품종의 재배, 윤작, 길항균을 이용한 생물적 방제 등이 다양하게 행해지고 있으나, 현재까지 가장 효율적인 방제법은 살균제 살포를 통한 화학적 방제인 것으로 알려져 있다.

메타락실 (metalaxyl), 포세틸알루미늄 (fosetyl-Al), 옥사디실 (oxadixyl), 프로파모캅 (propamocarb), 카퍼옥시클로라이드 (copperoxychloride), 클로로탈로 닐 (chlorothalonil), 디티아논 (dithianon) 등이 현재 우리나라에서 고추역병 방제용 살균제로서 사용되고 있으며, 메타락실-카퍼옥시클로라이드, 메타락실-디티아논, 옥사디실-클로로탈로닐 등이 혼합제로 또한 사용되고 있다. 그러나 이들 약제의 우수한 약효에도 불구하고, 약제저항성 균주의 출현으로 인하여 새로운 구조를 가진 화합물, 또는 새롭게 약효가 확인된 기존의 화합물이 최근 관심을 받고 있다.

고추는 우리나라 농가의 가장 보편적인 소득작물로서 생산 및 소비의 비중이 높은 작물이나 각종 병해충에 대한 저항성이 낮아 노지에서의 친환경재배가 어려운 실정이다. 특히 역병(Phytophthora capsici), 탄저병(Colletotrichum acutatum), 일부 바이러스병(CMV,TMV, PepMoV 및 TSWV 등)은 우리나라와 같은 몬순지역에서 심각한 피해를 주는 것으로 알려져 있다((Kim et al ., 2008a,2010a,2010b). 이 중에서 역병의 경우 매년 편차가 존재하지만 가장 심각한 병해로 알려져 있다(Kim et al.,2010a).

고추 역병의 발생은 고추의 유묘기부터 전생육기간에 걸쳐서 발병하며 강우일수와 밀접하게 관련되어 있는데, 발생 정도는 강수량이나 강수일수에 의해서 크게 차이가 나고 있지만, 매년 5% 이상되는 발생주율을 보이고 있다(박 등, 2012).

상기 고추역병의 병방제를 위해서 8만3천여 정보의 고추 재배지에 약 1,000 M/T (1993년)의 유기합성 살균제가 살포되고 있어서 농약으로 인한 환경에 대한 심각한 부작용 및 약제저항성 균주 출현 가능성을 초래하고 있다. 따라서 이러한 관점에서 상기 고추역병의 방제를 위한 저독성일 뿐만 아니라 환경을 파괴하지 않는 친환경적 살균제 개발이 절실히 요청되고 있는 상황이라고 할 수 있다.

한편, 독활(Araliae Cordatae Radix ; Angelica pubescens for. Biserrata Shan Etyuan)은 두릅나무과(Araliaceae)에 속하는 다년생초본으로 땃두릅 또는 땅두릅이라고 불리며, 산에서 주로 자생하고, 높이는 1.5 m이고 꽃을 제외한 전체에 털이 약간 있다. 잎은 3~ 5장의 잔잎으로 된 겹잎으로 어긋나며, 잔잎 가장자리에는 톱니가 있다. 또한, 잎은 어긋나고 길이 50~100 ㎝, 나비 3~20 ㎝이며 어릴때에는 연한 갈색 털이 있다. 작은 잎은 달걀 모양 또는 타원형이고 가장자리에 톱니가 있다. 잎 표면은 녹색이고 뒷면은 흰빛이 돌며 잎자루 밑부분 양쪽에 작은 떡잎이 있다. 꽃은 연한 초록색으로, 암꽃과 수꽃이 따로 한 그루에 피는데, 7~ 8월에 가지 끝에 산형(傘形) 꽃 차례로 핀다. 열매는 장과(漿果)로 10월에 검은색으로 익는다. 흔히 약으로 쓰기 위해 심기도 하는데, 한방에서 쓰는 독활은 봄과 가을에 뿌리줄기 및 뿌리를 캐서 겉껍질을 벗겨 햇볕에 말린 것으로 편두통 치료에 쓰인다. 뿌리를 캐자마자 바로 햇볕에 말리면 향기가 없어지므로 바람이 잘 통하는 그늘에서 어느 정도 말린 다음 햇볕에 말리는 것이 좋다. 이른 봄 어린 순은 식용하며, 가을에 잎이 죽은 다음 흑을 덮어서 어린 순이 길게 자랄 수 있도록 한다. 지금까지 알려진 독활의 성분으로는 비타민 B12, 엽산(folic acid), 리모넨(limonen), 사비넨(sabinene), α-피넨(α-pinene), γ-테르피넨(γ-terpinene), 미르센(myrcene), 후물렌(humulene, α-caryophyllene) 등이 가장 널리 알려져 있다.

독활은 동아시아 지역의 산지에 분포하는데, 스테로이드 호르몬의 복합물질을 함유하고 있어, 신경 중추를 마비시키는 진통 작용을 한다. 또한, 약리 실험에서 강장작용, 혈당량 감소 작용, 중추신경 흥분작용, 성선 자극작용, 강심작용, 이뇨작용, 피로회복 촉진작용 등이 밝혀져 있다. 한방에서는 또한 다리나 무릎에 무력감이 올 때에도 응용되었고, 반신불수, 하지마비, 손발이 차거나 저린데, 허리와 어깨 통증 등에 널리 이용되어 왔다.

독활은 특이한 냄새가 나며, 맛은 약간 쓰고 맵다. 효과로는 풍한습으로 인한 근육통, 관절염, 요통, 무릎과 하지 동통에 사용하고 조습작용이 있어 피부가려움증, 외감성 발열, 두통 등에 효과가 있다. 약리작용으로는 진정, 최면, 진통, 항염증, 혈압강하, 항경련, 항궤양, 햇빛 알러지 등에 대한 효과가 보고되었다.

독활은 관절 등에서 발생되는 염증에 대하여 항염의 효과가 있다고 알려졌으며 벼 도열병에 대하여 항균력이 존재하는 것으로 확인되었다. 이처럼 독활은 염증 및 일부 식물성곰팡이 병원균에 대하여 활성이 최근에 보고되었으나 고추와 같은 원예작물에서의 항균력에 대해서는 현재까지 보고된 바가 없다.

이에 본 발명에서는 친환경 고추재배를 위하여 천연물을 이용한 고추 역병 방제제를 개발하기 위한 기초물질 탐색을 진행하였다.

따라서, 본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 고추 역병 방제용 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명에서 해결하고자 하는 다른 기술적 과제는 고추 역병을 방제하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 독활 추출물을 유효성분으로 포함하는 고추 역병 방제용 조성물을 제공한다.

상기한 다른 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 독활 추출물을 포함하는 조성물을 이용하여 고추 역병을 방제하는 방법을 제공한다.

이상과 같이 독활 추출물은 고추 역병에 대한 방제 효과가 있어서 원예작물의 식물병에 대한 천연 방제제로서 활용이 기대된다.

본 명세서에 첨부되는 다음의 도면들은 본 발명의 바람직한 실시예를 예시하는 것이며, 전술한 발명의 내용과 함께 본 발명의 기술사상을 더욱 이해시키는 역할을 하는 것이므로, 본 발명은 그러한 도면에 기재된 사항에만 한정되어 해석되어서는 아니 된다.
도 1은 독활 추출물의 농도에 따른 고추 역병에 대한 방제 활성을 나타낸 사진이다.
도 2는 독활로부터 추출된 화합물 1 (ent-Pimara-8(14),15-diene-19-oic acid) 및 화합물 2 (ent-Kaur-16-en-19-oic acid)의 고추 역병에 대한 방제 활성을 나타낸 사진이다.

본 발명에서는 독활 추출물을 포함하는 고추 역병 방제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 독활 추출물은 독활의 어느 부위에서도 가능하며, 본 발명에서는 독활을 동결건조상태에서 보관된 것을 사용하는 것이 바람직하다. 그리고 추출용액은 물 또는 유기용매로 추출하여 얻을 수 있는데, 유기용매로는 저급 알콜, 아세톤, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에테르, 에틸아세테이트, 헥산 등을 예시할 수 있다. 저급알콜로는 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올을 예시할 수 있으며, 에탄올이 가장 바람직하다.

본 발명에서 용어, "추출물(extract)"은 천연물로부터 분리된 활성성분을 의미한다. 추출물은 물, 유기용매, 또는 이의 혼합용매를 이용하는 추출과정으로 획득할 수 있으며, 추출액, 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함한다.

본 발명에서 독활 추출물은 물, 유기 용매, 또는 이의 혼합 용매를 사용하여 추출하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 유기 용매, 특히 에탄올을 사용하여 추출한다. 추출한 액은 바로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 유기용매를 사용하여 추출하는 경우, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매인 유기용매를 사용하며 생약의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 약제의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등이 있다. 여과는 추출액으로부터 부유하는 고체 입자를 제거하는 과정으로, 면, 나일론 등을 이용하여 입자를 걸러내거나 한외여과, 냉동여과법, 원심분리법 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

추출액의 농축에는 감압농축, 역삼투압 농축 등의 방법이 사용될 수 있다. 농축 후 건조 단계는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조, 적외선건조 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 경우에 따라, 최종 건조된 추출물을 분쇄하는 공정을 추가할 수 있다.

또한, 상기 추출물은 추가의 분획 공정을 수행할 수 있다. 바람직하게는 상기 추출물을 증류수에 현탁시켜 비극성 유기 용매, 예를 들어, 헥산, 에테로, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸아세테이드 또는 이들의 혼합 용매로 비극성용매 가용층을 추출, 분리하여 수득하도록 하고, 이를 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다.

구체적으로, 독활 분말에 에탄올, 바람직하게는 90 내지 95% 에탄올을 1:4 내지 1:6 (w/v)의 비율, 바람직하게는 1:5 (w/v)의 비율로 첨가하고 상온, 예를 들어 15 내지 30℃의 온도에서 15 내지 35시간, 바람직하게는 20 내지 30시간, 더욱 바람직하게는 24시간 동안 추출한 후 여과하여 독활의 에탄올 추출물을 제조할 수 있다. 바람직하게는 상기 추출액을 여과하여 얻어진 여액을 감압농축하여 제조할 수 있다. 상기 추출방법들에서 추출 공정은 필요에 따라 2회 이상 반복하여 실시할 수 있으며, 여과 후 얻어진 추출물을 동결 건조 또는 감압 건조시켜 분말 형태로 만들 수도 있다.

독활 추출물은 하기 단계를 다음과 같다:

(S1) 독활을 분쇄기로 분쇄하는 단계;

(S2) 상기 분쇄된 독활을 에탄올을 1:4 내지 1:6 (w/v)의 비율로 혼합하여 상온에서 20 내지 25시간 동안 교반 추출하고 여과하여 감압 농축하는 단계;

(S3) 상기 감압 농축된 독활 추출물에 증류수를 가하여 현탁하고 클로로포름, 에틸 아세테이트, n-부탄올 및 물의 순서로 분획하여 농축하는 하는 단계; 및

(S4) 상기 수득된 에틸 아세테이트 층을 감압 농축하여 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피를 CHCl₃과 MeOH를 100:1에서 1:2 (v/v)의 용매조건으로 하여 사용하여 수행하고 헥산과 아세톤을 20:1에서 10:1 (v/v)의 용매조건으로 하여 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 독활 추출물을 수득하는 단계.

바람직하게, 상기 여과공정은 예를 들어 Whatman, No.2 여과지를 사용하여 수행하며, 감압농축은 회전 진공증발기(Rotary evaporator N-1000, Eyela, Japan)로 43 내지 47℃ 수욕 상에서 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명의 고추 역병 방제용 조성물에는 독활 추출물을 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 1 내지 90 중량%, 바람직하게는 10 내지 80 중량%의 양으로 포함할 수 있다.

본 발명의 독활 추출물을 포함하는 고추 역병 방제용 조성물은 본 발명에 의한 균주를 유효량 함유하고 농화학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명에 의한 조성물은 당업계에 공지된 방식의 농약 제제화 방식에 따라, 예컨대 유효성분을 분말화, 펠렛화 또는 과립화하여 제형화하여 그대로 사용할 수 있다. 상기 조성물은 표면 활성화제, 비활성 담체, 보존제, 습윤제, 공급 촉진제, 유인제, 캡슐화제, 결합제, 유화제, 염료, UV 보호제, 완충제 등 목적 병원균 및 작물에 따라 적용하기 용이한 다른 성분을 부가함으로 수득할 수 있다. 본 발명의 조성물은 적용하기 전에 적당한 양의 물 또는 다른 희석제로 희석을 하여 직접 적용하기에 적합한 형태 또는 농축액 또는 1차 조성물일 수 있다. 또한, 항균성 물질인 독활 추출물의 농도는 특정 제제의 성질, 적용 식물의 종류, 재배지역의 토양 및 기후 등에 따라 적절히 조설할 수 있음이 당업계에 명백히 이해될 것이다.

본 발명에서는 상기 독활 추출물을 포함하는 조성물을 이용하여 고추 역병을 방제하는 방법을 제공한다. 이 때 고추의 총 100 중량부에 대하여 독활 추출물은 0.01 내지 10 중량부의 양으로 사용할 수 있다.

본 발명의 독활 추출물은 기존의 역병 방제제인 트리사이클라졸(Tricyclazole)의 방제효과와 필적할 정도의 방제효과가 있어 고추 역병에 대한 방제 효과가 있어서 원예작물의 식물병에 대한 천연 방제제로서 활용이 기대된다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> 고추 역병 방제 물질 선별

고추 역병의 공시균주는 KACC(Korea Agricultural Culture Collection)에서 분양받은 Phytophthroa capsici Leonian (KACC No. 40158)를 이용하였다.

고추 역병에 대한 항균력이 있을 것으로 판단되는 천연물은 독활, 강활, 은행잎, 오미자, 쑥, 잔디, 억새, 바랭이 8종을 선발하였다. 독활, 강활은 충남 당진시에 위치한 한약재상에 특등품으로 구입하였고, 은행잎은 충남 예산군에 위치한 공주대학교 산업과학대학 조경수에서 2012년 10월에 수거하였으며, 쑥, 잔디, 억새, 바랭이는 충남 예산군에 위치한 공주대학교 부설농장에서 수거하여 동결건조 후에 -70℃로 보관하여 추출용 시료로 사용하였다.

동결건조 상태로 보관된 항균물질을 분쇄기 (HMF-34 0,Hanil,Korea)로 분쇄하여 추출용 시료로 사용하였다. 추출용매는 90% 에탄올(HPLC grade, Burdick & Jackson, USA)을 사용하였고 독활 분말과 에탄올을 1:5 (w/v)의 비율로 혼합하여 상온에서 24동안 교반추출 후에 여과지(Whatman, No.2)로 여과한 후 회전 진공증발기(Rotary evaporator N-1000, Eyela, Japan)로 45℃ 수욕 상에서 감압 농축하여 고추역병에 대한 항균력을 검증하였다.

<실시예 2> 고추 역병에 대한 실내 검정

Disk Paper Method

전배양된 P. grisea를 균주의 농도를 1⁴개/mL 농도로 조절하여 Spread stick 을 이용하여 PDA배지에 도말하여 준비하였고 독활 추출물 및 항균활성물질을 500, 250, 125, 62.5mgL ^- ¹로 제조한 다음에 8 disk paper에 흡수시켜 완전히 건조시킨 후에 건조된 disk를 P. grisea가 도말된 평판 배지 위에 완전히 밀착시킨 상태로 25 incubator에서 배양 후 disk 주변에 생성된 clear zone을 측정하여 농도별 항균활성을 비교하였다. 비교군으로는 트리사이클라졸(Tricyclazole) 수화제(빔, 동부한농)를 사용하였고, 각 시험은 3반복으로 수행하였다.

상기 실시예 1에서 선별된 천연 항균물질의 고추역병에 대한 항균 시험 결과는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

	clean zone()
	500mgL^-1	250mgL^-1	125mgL^-1	62.5mgL^-1
비교군	21	19	17	19
독활	17	19	18	19
오미자	9	10	-	-
은행잎	9	-	-	-
강활	12	13	-	-
바랭이	-	-	-	-
잔디	9	-	10	-
억새	10	-	-	9
쑥	11	-	-	-

상기 표 1에서 보듯이, 고추역병에 대한 가장 높은 항균력을 보인 것은 비교군인 트리사이클라졸로서 500mgL-1과 250mgL-1수준에서 21와 19의 높은 항균력을 나타냈고 125mgL-1수준에서도 17의 clean zone이 형성되었으며 62.5mgL-1의 저농도에서도 19의 항균력을 보여 농도에 상관없이 고추역병에 대한 높은 항균력이 확인되었다.

8종의 천연 항균물질의 고추역병에 대한 항균력에 대한 검정을 한 결과 오미자, 억새, 은행잎, 잔디, 바랭이는 모든 농도에서 항균력이 없거나 10㎜이하로 나타났고 쑥은 11㎜의 clean zone을 형성하였다. 강활의 경우에는 13㎜의 clean zone이 형성되어 항균력이 존재하나 이들 천연물의 경우에는 비교군에 비하여 50%이하의 낮은 수준의 항균력을 보여 고추역병의 방제제로서의 활용도는 높지 않은 것으로 판단되었다.

이중 고추 역병에 대하여 가장 높은 항균력을 보인 천연물은 독활로서 도 1에서 보듯이 독활의 경우에는 500mgL-1과 250mgL-1 수준에서는 각각 17 및 19의 clean zone이 확인되었으며 125mgL-1에서도 18의 높은 항균력이 존재하였고 62.5mgL-1에서도 19의 clean zone이 확인되어 농도에 상관없이 고추 역병에 대하여 높은 항균력을 지니고 있는 것으로 판단되었다.

<실시예 2> 독활 추출물의 화합물 동정

상기 고추 역병에 대한 높은 항균력을 가지는 것으로 확인된 독활의 유효성분을 다음과 같이 분석 및 동정하였다.

독활을 충남 당진시에 위치한 한약재상에 특등품으로 구입하여 동결건조 상태로 보관된 독활을 분쇄기 (HMF-34 0, Hanil, Korea)로 분쇄하여 추출용 시료로 사용하였다. 추출용매는 90% 에탄올(HPLC grade, Burdick & Jackson, USA)을 사용하였고 독활 분말과 에탄올을 1:5 (w/v)의 비율로 혼합하여 상온에서 24동안 교반추출 후에 여과지(Whatman, No.2)로 여과한 후 회전 진공증발기(Rotary evaporator N-1000, Eyela, Japan)로 45℃ 수욕 상에서 감압 농축하여 고추역병에 대한 항균력을 검증하였다.

이중에서 고추 역병에 대한 항균력이 가장 높은 독활 추출물에 다시 증류수 1L를 가하여 현탁한 후에 클로로포름 - 에틸 아세테이트 - n-부탄올 - 물 순서로 분획하여 농축하여 클로로포름 5.51g, 에틸 아세테이트 4.24g, n-부탄올 7.85g, 물 10.92g을 얻었다.

이어서, 강한 저해활성을 나타내는 에틸 아세테이트 층을 감압농축한 후 저해 물질을 분리하기 위하여 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피를 CHCl₃과 MeOH를 100:1에서 1:2의 용매조건으로 하여 실시하여 5개의 분획으로 나누었다. 이 중 항균활성을 강하게 나타내는 6번째 분획물에서 활성물질을 분리하기위해 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피를 헥산과 아세톤을 20:1에서 10:1의 용매조건으로 실시하여 화합물 1 (130mg)과 화합물 2 (20 mg)를 수득하였다. 이들 화합물은 MS와 NMR data 분석을 통해 확인하였다. 분석결과는 다음과 같다:

화합물 1

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃)δ:5.71(1H,dd,J = 10.6, 17.2 Hz, H-15), 5.14 (1H, br d, J = 1.2 Hz, H-14), 4.94 (1H, dd, J = 2.2, 11.2 Hz, H-16b), 4.91 (1H, dd, J = 2.1, 17.1, H-16a), 2.34 (1H, ddd, J = 2.4, 4.2, 13.8 Hz, H-12b), 2.17 (1H, br d, J = 13.5 Hz, H-3b), 1.98 (1H, td, J = 5.1, 13.8, H-12a), 1.84-1.92 (2H, m, H-6), 1.78-1.82 (1H, m, H-2b,11b), 1.74 (1H, m, H-1b) 1.70 (1H, m, H-9), 1.5-1.6 (1H, m, H-7a), 1.46-1.51 (1H, m, H-11a), 1.22-1.32 (1H, m, H-2a), 1.28 (1H, dd, J = 3.0, 14.4, H-5), 1.26 (3H, s, H-18), 1.17-1.24 (1H, m, H-7b), 1.05 (1H, dt, J = 3.9, 13.5, H-1a, 3a), 1.00 (3H, s, H-17), 0.65 (3H, s, H-20); ¹³C-NMR(100 MHz, CDCl3) δ: 184.6 (COOH), 147.1 (C-15), 137.9 (C-8), 128.0 (C-14), 112.9 (C-16), 56.1 (C-5), 50.5 (C-9), 44.0 (C-4), 39.2 (C-1), 39.2 (C-10), 38.5 (C-13), 37.9 (C-3), 36.4 (C-12), 35.8 (C-7), 29.3 (C-17), 29.2 (C-18), 24.1 (C-6), 19.6 (C-11), 19.2 (C-2), 13.8 (C-20)

¹H-NMR spectrum에서 δ 0.65, 1.00 및 δ 1.26에서 3개의 메틸 기들이 관찰되었으며, δ 4.91, 4.94와 δ 5.71, 5.14에서 4개의 olefinic proton들을 확인할 수 있었다. ¹³C-NMR에서는 δ 184.6에서 하나의 carbonyl signal을, δ 112.9, 128.0와 δ 137.9, 147.1에서 4개의 olefinic signal을 확인 할 수 있었고, 세개의 methyl signal들이 각각 δ13.8, 29.3, 29.2에서 관찰 되었다. 이와 같은 데이터를 기존의 Han(2005) 등이 보고한 문헌 데이터와 비교 검토한 결과 독활의 주성분인 화합물 ent-Pimara-8(14),15-diene-19-oic acid로 동정하였다.

화합물 2

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃):δ 4.66, 4.60(each1H, s, H-17), 2 .50 (1H, brs, H-13), 1.84-2.02(4H, m, H-3a, H-6a, H-13, H-14a), 1.69-1.77(4H, m, H-1a, H-2a, H-6b, H-7a), 1.40-1.48(4H, H-2b, H-11a, H-12a, H-12b), 1.12(2H, brd, J = 6.3 Hz, H-15), 1.11 (3H, s, H-18), 1.00 (1H, dd, J = 4.6, 7.2 Hz , H-14b), 0.92 (1H, t, J = 7.0 Hz, H-5), 0.89 (1H, m, H-3b), 0.85 (1H, m, H-9), 0.82 (3H, s, H-20), 0.68 (1H, m, H-1b); ¹³C-NMR(100 MHz, CDCl₃):δ185.0(C-19), 155.8(C-16), 103.0(C-17), 57.0(C-5), 55.1(C-9), 48.9(C-15), 44.2(C-8), 43.8(C-4), 43.7(C-13), 41.2(C-7), 40.6(C-1), 39.7(C-10), 39.6(C-14), 37.7(C-3), 33.1(C-12), 28.9(C-18), 21.8(C-6), 19.1(C-2), 18.4(C-11), 15.6(C-20)

¹H-NMR spectrum에서 δ 0.82, 1.11 에서 2개의 메틸 기들이 확인되었다. ¹³C-NMR에서는 δ 185.0에서 하나의 carbonyl signal을, δ 103.4에서 1개의 olefinic signal을 확인할 수 있었고, 두개의 methyl signal들이 각각 δ15.6, 28.9에서 관찰 되었다. 따라서 상기의 데이터를 기존의 Han(2005) 등이 보고한 문헌 데이터와 비교 검토한 결과 ent-Kaur-16-en-19-oic acid 로 동정하였다.

<실시예 4> 독활로부터 추출된 화합물 1 및 2의 고추 역병에 대한 실내 검정

상기 실시예 2와 동일한 방법으로 독활로부터 추출된 화합물 1 및 2의 고추 역병에 대한 실내 검정을 실시하였다.

독활로부터 추출된 화합물 1과 2는 그람양성균과 같은 세균에 대해서는 항균활성이 존재하는 것으로 알려져 있으나 아직까지 고추 역병과 같은 곰팡이계열에 대해서는 연구가 전무한 실정이었으나 본 발명에서는 이들 화합물이 고추 역병에 대하여 항균력을 가지고 있는 것으로 하기 표 2 및 도 2에서와 같이 확인되었다.

	clean zone()
	500mgL-1	250mgL-1	125mgL-1	62.5mgL-1
화합물 1	13	13	14	13
화합물 2	13	11	13	13

상기 표 1에서 보듯이, 화합물 1의 경우에는 모든 농도에서 13-14의 clean zone이 확인되어 통계적인 유의차가 확인되지 않았다. 화합물 2의 경우에도 모든 농도에서 항균력이 확인되었는데 500mgL-1과 250mgL-1수준에서 12와 11의 clean zone이 확인되었고 125mgL-1과 62.5mgL-1에서는 13의 clean zone이 확인되었다.

이상의 결과로부터 독활에서 항균력이 있는 물질들을 분리하여 고추 역병에 대한 항균력을 실험한 결과 독활 추출물에 비하여 낮은 항균력을 보이고 있는데 이러한 결과는 ent-Pimara-8(14),15-diene-19-oic acid와 ent-Kaur-16-en-19-oic acid가 단독적으로 항균력을 나타내는 것이 아니라 독활이 포함하고 있는 물질들이 상호간에 상승효과로 강한 항균력을 나타내는 것으로 판단된다.

<실시예 5> 고추 유묘를 이용한 포트 검정

온실에서 32공 트레이육묘판에 4-6엽기까지 재배한 고추(품종: 왕대박) 유묘를 실험에 사용하였다. 고추역병의 병원균은 PDB배지에서 20℃에서 3일간 배양한 후에 PDA배지로 접종후에 6일간 배양한 후에 증류수에 현탁한 후에 형성된 포자냥을 수확하였고 헤모사이토피터를 이용하여 1*10⁴개/mL로 조절한 후에 32공 트레이육묘판에 1공당 10ml씩 부어서 접종하고, 고추 유묘는 온실에 넣어 저면관수하면서, 병이 발생하도록 관리하였다.

실내검정에서 항균활성을 보인 독활 추출물 500mgL^-1, 250mgL^-1, 125mgL^-1, 62.5mgL^-1농도로 병원균을 접종하기 1일 전(예방효과)과 1일 후(치료효과)에 고추 유묘를 재배한 폿트에 10 ml씩 부어서 처리하였다. 병원균을 접종하고 3일과 7일 후에 역병 발생 고추의 수를 조사하였으며 대조구도 동일한 농도의 처리구를 두고 같은 방법으로 조사하였다.

모든 통계분석은 Duncan검정을 실시하였으며, Duncan 검정은 SAS 8.0(Statistical Analysis System)를 이용하여 실시하였다.

이러한 고추 역병을 방제하기 위하여 독활 추출물을 이용하여 32공 트레이육묘판에서 4-6엽기까지 재배된 고추유묘에 500mgL^-1, 250mgL^-1, 125mgL^-1, 62.5mgL^-1수준에서 독활의 고추 역병에 대한 방제실험을 한 결과는 하기 표 3과 같다.

상기 표 3에서 보듯이, 가장 높은 방제효율을 보인 것은 비교군으로서 500mgL-1과 250mgL-1에서는 85%이상의 방제가를 보였고 125mgL-1과 62.5mgL-1에서는 방제효율이 80%로 방제효율은 모든 농도에서 80%이상을 보이고 있다. 독활의 경우에는 250mgL-1에서는 고추 역병 방제가는 60%수준이었으며 125mgL-1과 62.5mgL-1에서는 40%수준으로 독활 추출물을 고추 역병의 예방을 위하여 사용하기 위해서는 250mgL-1이상으로 살포하는 것이 효과적일 것으로 판단되었다.

독활 추출물은 비교군에 비하여는 고추 역병의 예방효과가 낮은 것으로 확인되었으나 박 등(2012)의 연구에서도 시중에서 유통되고 있는 친환경제제들 역시 고추 역병의 방제효율은 40-80%수준의 예방효과를 가지고 있으며 치료효과에서는 4엽기 고추 유묘에서는 오히려 독활 추출물에 비하여 낮은 효과를 보이는 제품도 많은 것으로 확인되었다.

이상과 같은 결과로 볼 때 독활 추출물의 경우에는 계면활성제와 같은 부자재를 혼합하여 침투력을 높이거나 혼합농도 및 추출 용매 등을 달리하여 항균력을 높힐 경우에는 고추 역병에 대한 친환경제제로써 활용가능성이 높을 것으로 판단되며 향후에 심도있는 연구가 진행되어야 할 것으로 판단된다.

Claims

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동결건조된 독활의 추출물을 총 중량을 기준으로 하여 1 내지 90 중량%의 양으로 포함하되 상기 추출물이 하기 단계를 포함하는 방법에 따라 수득된 것임을 특징으로 하는 고추 역병 방제용 조성물:
(S1) 동결건조된 독활을 분쇄기로 분쇄하는 단계;
(S2) 상기 분쇄된 독활과 에탄올을 1:4 내지 1:6 (w/v)의 비율로 혼합하여 상온에서 20 내지 25시간 동안 교반 추출하고 여과하여 감압 농축하는 단계;
(S3) 상기 감압 농축된 독활 추출물에 증류수를 가하여 현탁하고 클로로포름, 에틸 아세테이트, n-부탄올 및 물의 순서로 분획하여 농축하는 하는 단계; 및
(S4) 상기 수득된 에틸 아세테이트 층을 감압 농축하여 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피를 CHCl₃과 MeOH를 100:1에서 1:2 (v/v)의 용매조건으로 하여 사용하여 수행하고 헥산과 아세톤을 20:1에서 10:1 (v/v)의 용매조건으로 하여 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 독활 추출물을 수득하는 단계.
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