KR101672352B1

KR101672352B1 - Vaccine composition for tuberculosis containing MTBK 20620

Info

Publication number: KR101672352B1
Application number: KR1020150116600A
Authority: KR
Inventors: 신성재; 김우식; 조상래; 한승정
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2015-08-19
Filing date: 2015-08-19
Publication date: 2016-11-03
Also published as: KR20160012097A

Abstract

본 발명은 MTBK 20620 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 MTBK 20620 단백질을 항원으로 이용할 경우, 결핵균에 의한 감염을 유발시킨 동물모델의 비장과 폐에서 높은 IFN-γ 생성능을 나타내며, 빠른 후천적 방어면역의 형성과 T 세포의 기억화를 유지시켜줌으로써 결핵을 효과적으로 예방할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 MTBK 20620 단백질은 결핵의 치료 시에도 사용 가능하여 재발율이 높은 고병원성 결핵의 재발 또는 재감염을 예방하고 치료 효율을 높이는 데 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a vaccine composition for preventing tuberculosis containing MTBK 20620 protein. The use of the MTBK 20620 protein according to the present invention as an antigen shows high IFN-γ production ability in the spleen and lung of an animal model causing infection by Mycobacterium tuberculosis and maintains rapid acquired defense immunity and T cell memory Tuberculosis can be effectively prevented. In addition, the MTBK 20620 protein according to the present invention can be used to treat tuberculosis and thus can be effectively used to prevent recurrence or reinfection of highly pathogenic tuberculosis having a high recurrence rate and to improve treatment efficiency.

Description

Vaccine composition for tuberculosis prevention containing MTBK 20620 protein {Vaccine composition for tuberculosis containing MTBK 20620}

본 발명은 MTBK 20620 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a vaccine composition for preventing tuberculosis comprising MTBK 20620 protein.

결핵은 WHO에서 규정한 3대 감염질환 중 하나로 1882년 미생물학자인 로베르트 코흐에 의해 발견되었으며, 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacerium tuberculosis)에 의하여 유발되는 높은 발병률과 사망률을 보이는 치명적인 질병이다. 전 세계적으로 약 6천만명 환자가 활동성 결핵에 감염되어 있으며, 매년 약 5천만에서 1억여명이 새로 결핵에 감염되는 것으로 추정되고 있고, 적어도 매년 900만명 이상의 새로운 결핵 환자가 발생하며, 연간 150만 명 이상이 결핵으로 사망한다고 알려졌다. 결핵 발병률(incidence rate)은 인구 10만명 당 146명, 결핵 사망률은 인구 10만명 당 49명으로 단일 감염병 중에서 가장 많은 사망 원인을 차지하고 있어, 세계적으로 심각한 보건 문제로 남아 있다.Tuberculosis is one of the three major infectious diseases regulated by the WHO, discovered by microbiologist Robert Koch in 1882, and is a fatal disease with high incidence and mortality caused by Mycobacerium tuberculosis. About 60 million patients worldwide are infected with active tuberculosis, and it is estimated that between 50 and 100 million new cases of tuberculosis are infected each year, at least 9 million new cases of tuberculosis occur annually, and more than 1.5 million annually. It is known that he died of tuberculosis. The incidence rate of tuberculosis is 146 per 100,000 people, and the mortality rate of tuberculosis is 49 per 100,000 people, accounting for the most death among single infectious diseases, which remains a serious health problem worldwide.

결핵균들의 우점적인 유전자형을 가진 베이징과의 결핵균은 전 세계에 널리 퍼져있으며 (Glynn et al., 2002), 주로 동아시아에 빈번하게 퍼져있다 (European Concerted Action on New Generation Genetic Markers and Techniques for the Epidemiology and Control of Tuberculosis, 2006). 결핵균 중에서 베이징과에 속하는 유전자형을 가지는 빈도는 중국이 92%, 한국이 72%, 베트남이 40% 인 것으로 추정된다 (Glynn et al., 2002). 베이징과 결핵균의 유전자형은 단일약물 내성 및 다재내성을 포함한 결핵균의 약제내성과 관련되어 있다 (Buu et al., 2009). 또한 베이징과의 유전자형은 잠복기상태의 결핵균의 재발과도 밀접한 연관성을 가지고 있다 (Burman et al., 2009).Mycobacterium tuberculosis of the Beijing family, which has a dominant genotype of tuberculosis bacteria, is widely spread all over the world (Glynn et al., 2002), and is frequently spread mainly in East Asia (European Concerted Action on New Generation Genetic Markers and Techniques for the Epidemiology and Control. of Tuberculosis, 2006). Among Mycobacterium tuberculosis, the frequency of genotypes belonging to the Peking family is estimated to be 92% in China, 72% in Korea, and 40% in Vietnam (Glynn et al., 2002). The genotypes of Beijing and Mycobacterium tuberculosis are associated with drug resistance of Mycobacterium tuberculosis, including monodrug resistance and multiple resistance (Buu et al., 2009). In addition, the genotype with Beijing is closely related to the recurrence of Mycobacterium tuberculosis in the latent state (Burman et al., 2009).

한국의 전체 결핵 발병률은 감소하고 있는 추세(직접도말양성결핵균의 유병률, 1965년에 10만명에 686명에서 1995년 10만명에 93명)에 있지만 (Hong et al., 1998), 여전히 상대적으로 높은 비율(0.11%)이다 (unpublished survey data by the CDC in Korea). 최근 들어 우리나라에서 발병하는 결핵환자 중에 약제내성을 나타내는 MDR-TB 환자와 XDR TB 환자가 급격하게 증가하는 추세에 있다. 한국 TB 발병 중 약 10%는 다재 내성 결핵(MDR-TB)이지만, 보다 우려되는 것은, 전체 다재내성 결핵균 중 광범위한 다재 내성 결핵(XDR-TB)의 비율이 5~15%로 나타났다는 것이다 (Jain & Dixit, 2008; Kim et al., 2008). 한국 내 결핵균의 유전자 지문은 베이징 결핵균과의 하나가 우점적으로 존재하는 것으로 나타났으며, 이 유전자형은 총 결핵균의 18.4%를 차지하는 것으로 나타났다 (Choi et al., 2010; Kim et al., 2001; Park et al., 2000). 김 등(2001)은 한국에서 고등학교 학생들에게 결핵을 야기시킨 결핵균 중 베이징과에 속하는 전염성이 강한 결핵균을 확인하였으며, 이 균을 K 균이라 명명하였다. The overall incidence of tuberculosis in Korea is on a decreasing trend (the prevalence of direct smear-positive tuberculosis bacteria, from 686 in 100,000 in 1965 to 93 in 100,000 in 1995) (Hong et al., 1998), but still relatively relatively. It is a high percentage (0.11%) (unpublished survey data by the CDC in Korea). Recently, among tuberculosis patients with onset in Korea, the number of MDR-TB patients and XDR TB patients showing drug resistance is on a rapid increase. About 10% of Korean TB outbreaks are multi-resistance tuberculosis (MDR-TB), but what is more worrying is that the proportion of extensive multi-resistance tuberculosis (XDR-TB) among all multi-resistance tuberculosis bacteria was 5-15% (Jain & Dixit, 2008; Kim et al., 2008). As for the genetic fingerprint of Mycobacterium tuberculosis in Korea, one of the Mycobacterium tuberculosis family in Beijing was predominantly present, and this genotype was found to account for 18.4% of the total Mycobacterium tuberculosis (Choi et al., 2010; Kim et al., 2001; Park et al., 2000). Kim et al. (2001) identified the highly contagious Mycobacterium tuberculosis belonging to the Beijing department among the Mycobacterium tuberculosis that caused tuberculosis in high school students in Korea, and named it K.

한국형 고병원성 결핵균인 K 균주는 마우스 감염 시 초기 선천면역을 극복할 수 있는 특이적 병인기전을 나타내며 이는 결핵균 표준 균주인 마이코박테리움 튜버쿨로시스 H37Rv 균주 감염량의 10배에 해당되는 성장속도를 나타낸다. 한국형 고병원성 결핵균인 K 균주 감염에 의한 마우스의 폐사는 결핵균 표준 균주인 마이코박테리움 튜버쿨로시스 H37Rv 균주 감염에 의한 마우스의 폐사보다 2배이상 빠르며, 감염 후 폐사 시기의 균수는 거의 동일한 것으로 보아 감염 후기에는 숙주의 면역반응에 의한 면역병리가 병인기전으로서 매우 중요할 것으로 생각되기에 선천면역보다는 예방백신 등을 통한 후천면역을 특이적으로 올려주는 것이 한국형 고병원성 결핵균인 K 균주를 방어하는 핵심 요소일 것으로 판단되었다. The Korean-type highly pathogenic Mycobacterium tuberculosis K strain exhibits a specific pathogenesis mechanism capable of overcoming the initial innate immunity when infected with a mouse, which represents a growth rate that is 10 times the amount of infection of the Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain, the standard strain of Mycobacterium tuberculosis. . The death of mice caused by infection with the Korean-type highly pathogenic Mycobacterium tuberculosis K strain is more than twice as fast as that of mice infected with Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain, the standard strain of Mycobacterium tuberculosis, and it is considered that the number of bacteria at the time of death after infection is almost the same. In the latter period, the immune pathology caused by the host's immune response is considered to be very important as a pathogenesis mechanism, so specifically raising acquired immunity through preventive vaccines rather than innate immunity is a key factor in defending the K strain, a highly pathogenic tuberculosis bacteria in Korea. Was judged to be.

현재, 결핵은 주로 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)의 비독성 균주인 바실러스 칼메트-구에린(BCG: Bacillus Calmette-Guerin)의 생균을 이용하여 예방하고 있다. 그러나 BCG 백신은 한국형 고병원성 결핵균에는 그 효과가 없는 것으로 알려져 있으며, 안전성 및 효능에 논란이 있어 (Styblo K et al., Tuberc Lung Dis 1976; 7:17-43), 미국과 같은 몇몇 국가는 이의 사용을 금지하고 있다. 또한, BCG는 HIV에 감염된 어린이들에게 사용하기에는 적당하지 못하다고 알려져 있다. 이에 BCG를 대체할 보다 안전하고 효과가 우수한 새로운 결핵 예방 백신의 개발이 요구되고 있다.Currently, tuberculosis is mainly prevented using live bacteria of Bacillus Calmette-Guerin (BCG), a non-toxic strain of Mycobacterium bovis. However, BCG vaccine is known to be ineffective against Korean highly pathogenic Mycobacterium tuberculosis, and its safety and efficacy are controversial (Styblo K et al., Tuberc Lung Dis 1976; 7:17-43), and some countries, such as the United States, use it. Are prohibited. In addition, BCG is known to be inadequate for use in HIV-infected children. Accordingly, there is a need to develop a new vaccine for preventing tuberculosis that is safer and more effective to replace BCG.

따라서, 본 발명자는 새로운 결핵 예방 백신을 개발하기 위한 연구를 계속한 결과, 기존의 결핵 표준 균주에는 존재하지 않고, 한국형 결핵균 K 균주에만 특이적으로 존재하는 병원성 인자를 찾아 규명하였으며, 상기 병원성 인자인 MTBK 20620 단백질이 마우스의 결핵균 감염 시 비장과 폐에서 높은 IFN-γ 생성능을 나타내며, 결핵균의 방어 면역을 오랫동안 유도할 수 있고 빠르게 반응할 수 있는 memory CD4 T 세포를 증가 시키는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. Therefore, as a result of continuing research to develop a new tuberculosis prevention vaccine, the present inventors found and identified a pathogenic factor that does not exist in the existing tuberculosis standard strain, but specifically exists only in the Korean tuberculosis bacteria K strain. The present invention was completed by confirming that the MTBK 20620 protein exhibits high IFN-γ-producing ability in the spleen and lungs when infected with Mycobacterium tuberculosis in mice, and increases the memory CD4 T cells that can induce the protective immunity of Mycobacterium tuberculosis for a long time and respond quickly. I did.

본 발명의 목적은 MTBK 20620 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a vaccine composition for preventing tuberculosis comprising MTBK 20620 protein.

본 발명의 또 다른 목적은 MTBK 20620 단백질을 포함하는 결핵의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating tuberculosis comprising MTBK 20620 protein.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 MTBK 20620 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물을 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention provides a vaccine composition for preventing tuberculosis comprising MTBK 20620 protein.

또한, 본 발명은 MTBK 20620 단백질을 포함하는 결핵의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating tuberculosis containing MTBK 20620 protein.

본 발명에 따른 MTBK 20620 단백질을 항원으로 이용할 경우, 결핵균에 의한 감염을 유발시킨 동물모델의 비장과 폐에서 높은 IFN-γ 생성능을 나타내며, 빠른 후천적 방어면역의 형성과 T 세포의 기억화를 유지시켜줌으로써 결핵을 효과적으로 예방할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 MTBK 20620 단백질은 결핵의 치료 시에도 사용 가능하여 재발율이 높은 고병원성 결핵의 재발 또는 재감염을 예방하고 치료 효율을 높이는 데 유용하게 사용될 수 있다. When the MTBK 20620 protein according to the present invention is used as an antigen, it exhibits high IFN-γ-producing ability in the spleen and lungs of an animal model that induces infection by Mycobacterium tuberculosis, and maintains rapid formation of acquired protective immunity and memory of T cells. You can effectively prevent tuberculosis by giving it. In addition, the MTBK 20620 protein according to the present invention can be used in the treatment of tuberculosis, and thus can be usefully used to prevent recurrence or reinfection of highly pathogenic tuberculosis with a high recurrence rate, and to increase treatment efficiency.

도 1은 한국형 결핵균 K 균주(Mycobacterium tuberculosis K strain)의 MTBK 20620 유전자 및 주변 유전자들과 결핵 표준 균주인 마이코박테리움 튜버쿨로시스 H37Rv의 동일한 지역을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 클로닝을 통해 분리한 재조합 MTBK 20620 단백질을 SDS-PAGE를 통해 확인한 도이다.
도 3은 동물 실험 디자인을 나타낸 도이다.
도 4는 결핵균 감염 4주 후, 마우스의 비장 세포에 재조합 MTBK 20620 단백질을 처리 한 후, IFN-γ의 생성능을 나타낸 도이다.
도 5는 결핵균 감염 4주 후, 마우스의 폐 세포에 재조합 MTBK 20620 단백질을 처리 한 후, IFN-γ의 생성능을 나타낸 도이다.
도 6은 결핵균 감염 8주 후, 마우스의 비장 세포에 재조합 MTBK 20620 단백질을 처리 한 후, IFN-γ의 생성능을 나타낸 도이다.
도 7은 결핵균 감염 8주 후, 마우스의 폐 세포에 재조합 MTBK 20620 단백질을 처리 한 후, IFN-γ의 생성능을 나타낸 도이다.
도 8은 결핵균 감염 후 유세포 분석기를 이용한 마우스의 memory T 세포 분석방법을 나타낸 도이다.
도 9는 결핵균 감염 4주 후, 마우스의 비장 세포에 재조합 MTBK 20620 단백질을 처리 한 후, memory CD4 T 세포의 증가를 나타낸 도이다.
도 10은 결핵균 감염 4주 후, 마우스의 폐 세포에 재조합 MTBK 20620 단백질을 처리 한 후, memory CD4 T 세포의 증가를 나타낸 도이다.
도 11은 결핵균 감염 8주 후, 마우스의 비장 세포에 재조합 MTBK 20620 단백질을 처리 한 후, memory CD4 T 세포의 증가를 나타낸 도이다.
도 12는 결핵균 감염 8주 후, 마우스의 폐 세포에 재조합 MTBK 20620 단백질을 처리 한 후, memory CD4 T 세포의 증가를 나타낸 도이다. 1 is a diagram showing the result of comparing the MTBK 20620 gene and surrounding genes of the Korean-type Mycobacterium tuberculosis K strain with the same region of the standard tuberculosis strain Mycobacterium tuberculosis H37Rv.
Figure 2 is a diagram confirming the recombinant MTBK 20620 protein isolated through cloning through SDS-PAGE.
3 is a diagram showing an animal experiment design.
4 is a diagram showing the ability to produce IFN-γ after 4 weeks of infection with Mycobacterium tuberculosis, after treatment with the recombinant MTBK 20620 protein in the spleen cells of mice.
5 is a diagram showing the ability to produce IFN-γ after 4 weeks of infection with Mycobacterium tuberculosis, after treatment with the recombinant MTBK 20620 protein in the lung cells of the mouse.
6 is a diagram showing the ability to produce IFN-γ after 8 weeks of infection with Mycobacterium tuberculosis, after treatment with recombinant MTBK 20620 protein in the spleen cells of mice.
7 is a diagram showing the ability to produce IFN-γ after 8 weeks of infection with Mycobacterium tuberculosis, after treatment with the recombinant MTBK 20620 protein in the lung cells of the mouse.
8 is a diagram showing a method for analyzing memory T cells of a mouse using a flow cytometer after infection with Mycobacterium tuberculosis.
9 is a diagram showing an increase in memory CD4 T cells after 4 weeks of infection with Mycobacterium tuberculosis, after treatment with the recombinant MTBK 20620 protein in the spleen cells of mice.
10 is a diagram showing an increase in memory CD4 T cells after 4 weeks of infection with Mycobacterium tuberculosis, after treatment with the recombinant MTBK 20620 protein in the lung cells of the mouse.
11 is a diagram showing an increase in memory CD4 T cells after 8 weeks of infection with Mycobacterium tuberculosis, after treatment with the recombinant MTBK 20620 protein in the spleen cells of mice.
12 is a diagram showing an increase in memory CD4 T cells after 8 weeks of infection with Mycobacterium tuberculosis, after treatment with the recombinant MTBK 20620 protein in lung cells of mice.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 MTBK 20620 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물을 제공한다. The present invention provides a vaccine composition for preventing tuberculosis comprising MTBK 20620 protein.

MTBK 20620(AIB48607.1)은 279bp의 유전자 및 92개의 아미노산 서열로 구성되어 있으며, 단백질의 크기는 8.6KDa이고 PI값은 8.36이다. MTBK 20620의 기능은 hypothetical protein으로 아직 알려져 있지 않으며 특정한 도메인이나 모티프도 가지고 있지 않지만, 결핵 표준 균주에 존재하지 않는 유전자로써 M. tuberculosis 210, M. tuberculosis X122, M. tuberculosis HN878, M. tuberculosis CTRI-4, M. tuberculosis CCDC5180, M. tuberculosis CCDC5079, M. tuberculosis R1207, M. tuberculosis W-148 등의 베이징과의 결핵균에서 동일하게 존재하는 것으로 밝혀졌다. 한국형 결핵균 K 균주(Mycobacterium tuberculosis K strain)의 MTBK 20620 유전자 및 주변 유전자들과 결핵 표준 균주인 마이코박테리움 튜버쿨로시스 H37Rv의 동일한 지역을 비교한 결과를 도 1에 나타내었다. MTBK 20620 (AIB48607.1) is composed of a gene of 279 bp and a sequence of 92 amino acids, the size of the protein is 8.6 KDa and the PI value is 8.36. The function of MTBK 20620 is not yet known as a hypothetical protein and does not have a specific domain or motif, but it is a gene that does not exist in the tuberculosis standard strain. M. tuberculosis 210, M. tuberculosis X122, M. tuberculosis HN878, M. tuberculosis CTRI- 4, M. tuberculosis CCDC5180, M. tuberculosis CCDC5079, M. tuberculosis R1207, M. tuberculosis W-148 were found to be the same in the tuberculosis bacteria of the Beijing family. Figure 1 shows the results of comparing the MTBK 20620 gene and surrounding genes of the Korean-type Mycobacterium tuberculosis K strain with the same region of the standard TB strain Mycobacterium tuberculosis H37Rv.

상기 MTBK 20620 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 인코딩 되는 단백질, 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. The MTBK 20620 protein includes a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a protein encoded by a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, and a functional equivalent of the protein.

상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. The "functional equivalent" refers to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 as a result of addition, substitution or deletion of amino acids, at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, even more preferably In other words, it has 95% or more sequence homology, and refers to a protein that exhibits substantially the same physiological activity as a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.

또한, 본 발명의 MTBK 20620 단백질에는 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 변이체란 MTBK 20620 단백질의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 단편에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). MTBK 20620 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성 (Merrifleld, J. Amer. chem. Soc. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다 (Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989). In addition, the MTBK 20620 protein of the present invention includes not only a protein having its native amino acid sequence, but also a variant thereof. The variant refers to a protein having an amino acid sequence of MTBK 20620 protein and a sequence different from one or more amino acid residues by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof. Amino acid exchanges in proteins and fragments that do not totally alter the activity of the molecule are known in the art (H. Neuroth, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). The MTBK 20620 protein or variant thereof can be extracted naturally or synthesized (Merrifleld, J. Amer. chem. Soc. 85:2149-2156, 1963) or prepared by genetic recombination methods based on DNA sequences (Sambrook et al. al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 2nd ed., 1989).

상기 MTBK 20620 단백질은 서열번호 2의 염기서열로 암호화될 수 있으며, 상기 뉴클레오티드와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. The MTBK 20620 protein may be encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and variants capable of functioning functionally identical to those of the nucleotide are included within the scope of the present invention.

본 발명의 MTBK 20620 단백질은 한국형 결핵균 K 균주로부터 유래한 것으로서, DNA 서열을 기초로 하여 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우 단백질을 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체에서 목적으로 하는 단백질이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 후 형질전환체로부터 목적으로 하는 단백질을 회수함으로써 수득될 수 있다.The MTBK 20620 protein of the present invention is derived from the Korean Mycobacterium tuberculosis K strain, and can be produced by a recombinant method based on a DNA sequence. In the case of using genetic recombination technology, a nucleic acid encoding a protein is inserted into an appropriate expression vector, and the host cell is cultured so that the desired protein is expressed in a transformant transformed with the recombinant expression vector. It can be obtained by recovering the protein.

본 발명의 결핵은 안결핵, 피부 결핵, 부신 결핵, 신장결핵, 부고환 결핵, 림프선 결핵, 후두 결핵, 중이 결핵, 장결핵, 다제내성 결핵, 폐결핵, 담결핵, 골결핵, 인후결핵, 임파선 결핵, 폐허증, 유방 결핵 또는 척추 결핵을 포함하며, 이에 제한되지 않는다. Tuberculosis of the present invention is ocular tuberculosis, skin tuberculosis, adrenal tuberculosis, kidney tuberculosis, epididymal tuberculosis, lymphatic tuberculosis, laryngeal tuberculosis, middle ear tuberculosis, intestinal tuberculosis, multidrug resistant tuberculosis, pulmonary tuberculosis, cholangiocarcinoma, bone tuberculosis, throat tuberculosis, lymph node tuberculosis, ruins Including, but not limited to, breast tuberculosis or spinal tuberculosis.

본 발명의 결핵은 한국형 고병원성 결핵균인 K 균주에 의해 발병되는 것을 포함한다. The tuberculosis of the present invention includes those caused by the K strain, which is a Korean type highly pathogenic tuberculosis bacterium.

본 발명에 따른 백신 조성물은 병원성 유기체의 약독화된 균주를 개체에 접종하여 병원체에 대한 면역 반응을 유도한 것이 아니라, 백신 효과를 가지는 단백질 항원을 투여함으로써 이후의 병원균 감염을 예방한 것을 특징으로 하기 때문에, 기존에 알려진 BCG 면역법에 비하여 보다 안전한 면역법임을 특징으로 한다. The vaccine composition according to the present invention is characterized in that an attenuated strain of a pathogenic organism is not inoculated into an individual to induce an immune response against the pathogen, but a protein antigen having a vaccine effect is administered to prevent subsequent pathogen infection. Therefore, it is characterized in that it is a safer immunization method compared to the previously known BCG immunization method.

또한, 본 발명에 따른 MTBK 20620 단백질은 BCG 백신 투여 후, 부스터(booster) 백신으로 이용될 수 있다. In addition, the MTBK 20620 protein according to the present invention can be used as a booster vaccine after BCG vaccine administration.

본 발명에 따른 MTBK 20620 단백질을 항원으로 이용할 경우, 결핵균에 의한 감염을 유발시킨 동물모델의 비장과 폐에서 높은 IFN-γ 생성능을 나타내며, 빠른 후천적 방어면역의 형성과 T 세포의 기억화를 유지시켜줌으로써 결핵을 효과적으로 예방할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 MTBK 20620 단백질은 결핵의 치료 시에도 사용 가능하여 재발율이 높은 고병원성 결핵의 재발 또는 재감염을 예방하고 치료 효율을 높이는 데 유용하게 사용될 수 있다.
When the MTBK 20620 protein according to the present invention is used as an antigen, it exhibits high IFN-γ-producing ability in the spleen and lungs of an animal model that induces infection by Mycobacterium tuberculosis. You can effectively prevent tuberculosis by giving it. In addition, the MTBK 20620 protein according to the present invention can be used in the treatment of tuberculosis, and thus can be usefully used to prevent recurrence or reinfection of highly pathogenic tuberculosis with a high recurrence rate, and to increase treatment efficiency.

본 발명의 백신 조성물은 단독으로 투여 가능하지만 바람직하게는, 애쥬번트와 함께 투여한다. 애쥬번트는 면역세포의 초기 활성화 과정에서 비특이적으로 항원에 대한 면역 반응을 촉진하는 물질로, 숙주에게 면역원은 아니지만 면역계의 세포의 활성을 증대시킴으로써 면역을 강화하는 제제, 분자등을 의미한다(Warren et al., 1986, Annu.Rev.Immunol,. 4:369). 본 발명의 백신 조성물과 함께 투여되어 면역 반응을 증강시킬 수 있는 애쥬번트는 임의의 다양한 애쥬번트를 포함하며, 전형적인 애쥬번트로는 프로인트 애쥬번트(Freund adjuvant), 알룸 화합물(aluminum compound), 무라밀 디펩타이드(muramyl dipeptide), 리포폴리싸카라이드(LPS), 모노포스포릴 리피드 A, 또는 쿠일 A 등이 알려져 있다. 상기 애쥬번트는 백신 조성물과 동시에 투여되거나 시간 간격을 두고 순차적으로 투여될 수 있다.The vaccine composition of the present invention can be administered alone, but is preferably administered with an adjuvant. Adjuvant is a substance that non-specifically promotes an immune response to an antigen in the initial activation process of immune cells.It is not an immunogen to a host, but refers to an agent or molecule that enhances immunity by increasing the activity of cells in the immune system (Warren et al. al., 1986, Annu. Rev. Immunol,. 4:369). Adjuvants that can be administered together with the vaccine composition of the present invention to enhance the immune response include any of a variety of adjuvants, and typical adjuvants include Freund adjuvant, aluminum compound, and Mura. Wheat dipeptide (muramyl dipeptide), lipopolysaccharide (LPS), monophosphoryl lipid A, or kuyl A and the like are known. The adjuvant may be administered simultaneously with the vaccine composition or may be sequentially administered at intervals of time.

또한, 본 발명의 백신 조성물은 추가적으로 용매, 부형제 등을 더 포함할 수 있다. 상기 용매에는 생리식염수, 증류수 등이 포함되며, 상기 부형제에는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포타슘 설페이트 등이 포함되나, 이에 제한되지 않으며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상적으로 백신 제조에 사용하는 물질을 더 포함할 수 있다. In addition, the vaccine composition of the present invention may further include a solvent, an excipient, and the like. The solvent includes physiological saline, distilled water, and the like, and the excipients include, but are not limited to, aluminum phosphate, aluminum hydroxide, aluminum potassium sulfate, and the like, and substances commonly used for vaccine production in the field to which the present invention belongs. It may further include.

본 발명의 백신 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 이용되는 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 경구형 또는 비경구형 제제로 제조할 수 있고, 바람직하게는 비경구형 제제인 주사액제로 제조하며, 진피 내, 근육 내, 복막 내, 정맥 내, 피하 내, 비강 또는 경막 외(eidural) 경로로 투여할 수 있다. The vaccine composition of the present invention can be prepared by a method commonly used in the technical field to which the present invention belongs. The vaccine composition of the present invention can be prepared in an oral or parenteral formulation, and is preferably prepared as an injection solution as a parenteral formulation, and is intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, nasal or epidural ( eidural) route.

본 발명의 백신 조성물은 면역학적 유효량으로 개체에 투여할 수 있다. 상기 “면역학적 유효량"이란 결핵 예방효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 특정 면역원에 따라 달라지며, 예방 접종 대상자의 연령, 체중, 건강, 성별, 개체의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 1회 내지 수회 투여가능 하다.
The vaccine composition of the present invention can be administered to a subject in an immunologically effective amount. The term "immunologically effective amount" refers to an amount sufficient to exhibit a tuberculosis prophylactic effect and an amount that does not cause side effects or serious or excessive immune reactions, and the exact dosage concentration varies depending on the specific immunogen to be administered, and vaccination It can be easily determined by a person skilled in the art according to factors well known in the medical field, such as age, weight, health, sex, sensitivity of the individual to the drug, route of administration, and method of administration of the subject, and can be administered once to several times.

본 발명의 약학적 조성물은 MTBK 20620 단백질과 함께 결핵의 예방 및 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 포함할 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention may include one or more known active ingredients having a preventive and therapeutic effect of tuberculosis together with MTBK 20620 protein.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.The pharmaceutical composition of the present invention may further include suitable carriers, excipients, and diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions. Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical composition of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil. In the case of formulation, it is prepared using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants that are usually used.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.The pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated and used in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions according to a conventional method. I can. Suitable formulations known in the art are preferably those disclosed in Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA. Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and these solid preparations are prepared by mixing at least one or more excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin, and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used. Liquid preparations for oral administration include suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups, etc.In addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included. have. Preparations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, and suppositories. As a base for suppositories, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin paper, glycerogelatin, and the like may be used.

본 발명의 조성물은 결핵의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
The composition of the present invention may be used alone for the prevention and treatment of tuberculosis, or in combination with surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy, and methods of using a biological response modifier.

이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 상세히 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail through the following examples. These examples are for explaining the present invention in detail, and the scope of the present invention is not limited by these examples.

실시예Example 1. 재조합 1. Recombination MTBKMTBK 20620 단백질의 준비 Preparation of 20620 protein

한국형 결핵균 K 균주(Mycobacterium tuberculosis K strain)로부터 게놈 DNA를 추출하여, 이로부터 MTBK 20620 유전자를 클로닝하였다. 정방향 프라이머(5'-CATATGGTGACCGACCCCGACAT-3') 및 역방향 프라이머(5'-AAGCTTCCACCAT CTGCGCTTTC-3')를 이용하여 PCR을 수행하였으며, MTBK 20620 부위를 증폭하였다. 상기 PCR 산물을 NdeI 및 HindIII 제한 효소로 절단하고, 이를 발현 벡터인 pET-22b(+) 벡터(Novagen, Madison, WI)에 삽입하였다. MTBK 20620 유전자가 삽입된 pET-22b(+) 벡터를 이용하여 E. coli BL21을 형질전환 시킨 후, 이를 600nm에서의 흡광도 (OD)가 0.4 내지 0.5가 될 때까지 30℃에서 배양한 후에 1 mM의 이소프로필-D-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)를 첨가하고, 30℃에서 8시간 동안 다시 배양하였다. 상기 형질전환 대장균을 초음파 세포파쇄기를 이용하여 파쇄한 후, 4℃에서 30분간 15000rpm으로 원심분리하여 조추출액을 분리한 뒤, 상층액을 회수하고 ALON Metal Affinity Resin (Clontech)을 이용하여 제조사의 방법에 준하여 정제하였다. 최종적으로 정제한 재조합 단백질을 SDS-PAGE를 통해 확인하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
Genomic DNA was extracted from the Korean Mycobacterium tuberculosis K strain, and the MTBK 20620 gene was cloned therefrom. PCR was performed using the forward primer (5'-CATATGGTGACCGACCCCGACAT-3') and the reverse primer (5'-AAGCTTCCACCAT CTGCGCTTTC-3'), and the MTBK 20620 site was amplified. The PCR product was digested with NdeI and HindIII restriction enzymes and inserted into the expression vector pET-22b(+) vector (Novagen, Madison, WI). After transforming E. coli BL21 using the pET-22b(+) vector into which the MTBK 20620 gene was inserted, it was incubated at 30° C. until the absorbance (OD) at 600 nm became 0.4 to 0.5, and then 1 mM Isopropyl-D-thiogalactopyranoside (IPTG) was added, and incubated again at 30° C. for 8 hours. After crushing the transformed E. coli using an ultrasonic cell disruptor, centrifugation at 4°C for 30 minutes at 15000 rpm to separate the crude extract, recover the supernatant, and use the manufacturer's method using ALON Metal Affinity Resin (Clontech). Purified according to. Finally, the purified recombinant protein was confirmed through SDS-PAGE. The results are shown in FIG. 2.

실시예Example 2. 2. MTBKMTBK 20620 단백질의 결핵 예방 백신으로서의 효능 검증 실험 Experiment to verify the efficacy of 20620 protein as a vaccine for preventing tuberculosis

2-1. 실험 디자인2-1. Experiment design

상기 실시예 1에서 분리한 MTBK 20620 단백질이 결핵 예방 백신으로 이용될 수 있는지 그 효능을 검증하기 위하여, 동물 실험을 수행하였다. In order to verify the efficacy of the MTBK 20620 protein isolated in Example 1 can be used as a vaccine for preventing tuberculosis, animal experiments were performed.

실험 동물로는 생후 5 내지 6주된 특이적 병원체가 없는 암컷 C57BL/6 마우스(Japan SLC, Inc. Shijuoka, Japan)를 이용하였으며, 상기 마우스를 연세대학교 의학 연구 센터 내의 BL-3 바이오해저드 애닐멀 룸의 제한 공간에서 사육하였다. 마우스에게는 멸균된 판매용 마우스 먹이와 물을 임의적으로 제공하였다.As experimental animals, female C57BL/6 mice (Japan SLC, Inc. Shijuoka, Japan) without specific pathogens 5 to 6 weeks old were used, and the mice were BL-3 Biohazard Animal Room in Yonsei University Medical Research Center. It was bred in a confined space of. Mice were optionally provided with sterile, commercial mouse food and water.

한편, 결핵균 표준 균주인 마이코박테리움 튜버쿨로시스 H37Rv(Mycobacterium tuberculosis H37Rv)와 한국형 결핵균 K 균주(Mycobacterium tuberculosis K strain)를 7H9-OADC broth에서 15일간 배양하였다. 배양된 균주를 수집한 후, 6 mm 글래스 비드로 부드럽게 볼텍싱하면서 파쇄하였다. 세포 응집물이 가라앉은 다음, 상청액을 수거하고 각각 나누어 -70℃에 보관하였다. 이를 해동한 후, 살아있는 박테리아를 Middlebrook 7H11 아가(Difco, Detroit, MI, USA)에서 단계적 희석 평판 배양하고 카운팅하였다. On the other hand, Mycobacterium tuberculosis H37Rv (Mycobacterium tuberculosis H37Rv) and Korean Mycobacterium tuberculosis K strain were cultured in 7H9-OADC broth for 15 days. After collecting the cultured strain, it was crushed while gently vortexing with 6 mm glass beads. After the cell aggregates settled, the supernatant was collected, divided, and stored at -70°C. After thawing, the living bacteria were cultured on a gradual dilution plate in Middlebrook 7H11 agar (Difco, Detroit, MI, USA) and counted.

각 마우스에게 결핵균을 접종하기 위해, 상기 박테리아 현탁액을 음파조(sonic bath)에서 가볍게 음파처리하고, pH7.2의 PBS(phosphate buffered saline)로 희석시켜 원하는 수의 박테리아를 수득하였으며, Glas-Col inhalation device (Terre Haute, IN)를 이용하여 마우스당 200-250개의 마이코박테리움 튜버쿨로시스 H37Rv 또는 한국형 결핵균 K 균주가 들어가도록 흡입시켜 감염시켰다. 감염 4주 및 8주 후 마우스의 비장 세포와 폐 세포를 분리하여 항원 자극에 의한 IFN-γ 생성능과 memory T 세포의 증가를 확인하였다. 상기 실험 디자인을 도 3에 나타내었다.
In order to inoculate each mouse with Mycobacterium tuberculosis, the bacterial suspension was lightly sonicated in a sonic bath, and diluted with phosphate buffered saline (PBS) of pH 7.2 to obtain a desired number of bacteria, Glas-Col inhalation Using a device (Terre Haute, IN), 200-250 Mycobacterium tuberculosis H37Rv or Korean Mycobacterium tuberculosis K strain per mouse was inhaled and infected. After 4 and 8 weeks of infection, splenocytes and lung cells of mice were isolated to confirm the increase of IFN-γ-producing ability and memory T cells by antigen stimulation. The experimental design is shown in FIG. 3.

2-2. 2-2. IFNIFN -γ -γ 생성능Generating ability 분석 analysis

IFN-γ의 생성능을 확인하는 것은 결핵균 예방 백신 후보물질을 발굴하는데 효과적인 방법 중 하나로 알려져있다. 따라서 MTBK 20620 단백질이 IFN-γ의 생성능에 미치는 영향을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. Confirming the ability to produce IFN-γ is known as one of the effective methods for discovering vaccine candidates for the prevention of tuberculosis bacteria. Therefore, the following experiment was performed to confirm the effect of the MTBK 20620 protein on the ability to produce IFN-γ.

상기 실시예 2-1과 같이, 마이코박테리움 튜버쿨로시스 H37Rv 또는 한국형 결핵균 K 균주 감염 4 주 및 8주 후의 마우스의 비장 및 폐 세포를 분리한 후, 생체 외(X-vivo)에서 MTBK 20620 단백질 자극을 통하여 항원 특이적 IFN-γ의 생성능을 ELISA를 통하여 확인하였다. 대조군으로는 초기 결핵 감염 시 유도되는 항원으로 알려져 있으며, 마이코박테리움 튜버쿨로시스 H37Rv 및 한국형 결핵균 K 균주가 모두 가지고 있는 ESAT-6 항원을 대조군으로 사용하였다. 그 결과를 도 4 내지 도 7에 나타내었다. As in Example 2-1, after isolation of the spleen and lung cells of mice 4 and 8 weeks after infection with Mycobacterium tuberculosis H37Rv or Korean Mycobacterium tuberculosis K strain infection, MTBK 20620 in vitro (X-vivo) The ability to generate antigen-specific IFN-γ through protein stimulation was confirmed through ELISA. As a control, it is known as an antigen induced during initial tuberculosis infection, and ESAT-6 antigens possessed by both Mycobacterium tuberculosis H37Rv and Korean Mycobacterium tuberculosis K strains were used as controls. The results are shown in FIGS. 4 to 7.

도 4 내지 도 7에 나타낸 바와 같이, 감염 4 주 후 마우스의 비장 및 폐 세포에서 MTBK 20620 단백질 자극을 통해 IFN-γ의 생성능이 증가되는 것을 확인하였으며, 두 단백질 모두 마이코박테리움 튜버쿨로시스 H37Rv 보다 한국형 결핵균 K 균주에서 더 높은 IFN-γ의 생성능을 보임을 확인하였다. 또한, 감염 8 주 후 MTBK 20620 단백질은 비장세포에서 균주 특이적 IFN-γ 생성을 보이지 않았으나, 한국형 결핵균 K 균주 감염 마우스의 폐 세포에서는 그 특이성이 보이는 것을 확인하였다.
As shown in FIGS. 4 to 7, it was confirmed that the ability to produce IFN-γ was increased through stimulation of the MTBK 20620 protein in the spleen and lung cells of mice 4 weeks after infection, and both proteins Mycobacterium tuberculosis H37Rv It was confirmed that the Korean-type Mycobacterium tuberculosis K strain showed higher IFN-γ-producing ability. In addition, it was confirmed that the MTBK 20620 protein did not show strain-specific IFN-γ production in splenocytes 8 weeks after infection, but its specificity was observed in lung cells of mice infected with Korean Mycobacterium tuberculosis K strain.

2-3. memory T 세포 분석2-3. memory T cell analysis

결핵균 감염 시 결핵균 항원에 대한 특이적 T 림프구(lymphocytes)가 복제, 분화하여 effector T 세포가 된다. effector T 세포는 면역반응이 사라지게 되면 대부분 사멸하게 되고 일부는 살아남아 오랫동안 지속되는 memory T 세포를 형성하게 된다. 이렇게 유도된 memory T 세포는 빠른 후천적 방어면역의 형성과 T 세포의 기억화를 유지시켜주는 역할을 한다고 알려져 있다. 따라서 MTBK 20620 단백질이 memory T 세포에 미치는 영향을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.During Mycobacterium tuberculosis infection, specific T lymphocytes for Mycobacterium tuberculosis antigens replicate and differentiate to become effector T cells. When the immune response disappears, effector T cells mostly die and some survive to form long-lasting memory T cells. The memory T cells induced in this way are known to play a role in the formation of rapid acquired defense immunity and maintaining the memory of T cells. Therefore, the following experiment was performed to confirm the effect of the MTBK 20620 protein on memory T cells.

상기 실시예 2-1과 같이, 마이코박테리움 튜버쿨로시스 H37Rv 또는 한국형 결핵균 K 균주 감염 4 주 및 8주 후의 마우스의 비장 및 폐 세포를 분리한 후, MTBK 20620 단백질 자극을 통한 native T cell (CD3+CD4+CD62L+CD44-CD127+), central memory T cell (CD3+CD4+CD62L+CD44+CD127+), effector memory T cell (CD3+CD4+CD62L-CD44+CD127+), effector T cell (CD3+CD4+CD62L-CD44+CD127-)의 유도를 유세포 분석기(FACSverse, BD)를 통하여 분석하였다(도 8). 보다 구체적으로, 비장과 폐 세포에 MTBK 20620 단백질 자극 후, 24시간 뒤 세포를 PBS로 2회 세척하고 원심 분리하였다. 그 다음, 항-CD3-V450, 항-CD4-PerCP-Cy5.5, 항-CD44-PE, 항-CD62L-FITC 및 항-CD127-APC 등의 항체를 처리한 후 30분간 상온에 방치하였다. isotype control은 Rat IgG2b-FITC, Rat IgG2b-PE, Rat IgG2a-APC를 사용하였다. 이를 PBS로 수회 세척한 후 유세포 분석기를 이용하여 분석하였다. 그 결과를 도 9 내지 도 12에 나타내었다. As in Example 2-1, after isolation of the spleen and lung cells of mice 4 and 8 weeks after infection with Mycobacterium tuberculosis H37Rv or Korean Mycobacterium tuberculosis K strain infection, native T cells ( CD3+CD4+CD62L+CD44-CD127+), central memory T cell (CD3+CD4+CD62L+CD44+CD127+), effector memory T cell (CD3+CD4+CD62L-CD44+CD127+), effector T cell (CD3+CD4) +CD62L-CD44+CD127-) was analyzed by flow cytometry (FACSverse, BD) (FIG. 8). More specifically, after stimulation of the MTBK 20620 protein in the spleen and lung cells, after 24 hours, the cells were washed twice with PBS and centrifuged. Then, antibodies such as anti-CD3-V450, anti-CD4-PerCP-Cy5.5, anti-CD44-PE, anti-CD62L-FITC and anti-CD127-APC were treated and left at room temperature for 30 minutes. Rat IgG2b-FITC, Rat IgG2b-PE, and Rat IgG2a-APC were used for isotype control. After washing this several times with PBS, it was analyzed using a flow cytometer. The results are shown in Figs. 9 to 12.

도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같이, 한국형 결핵균 K 균주 감염 4 주 후 마우스의 비장 세포에서 MTBK 20620 단백질 자극을 통해 effector/memory T 세포의 수와 비율이 마이코박테리움 튜버쿨로시스 H37Rv 감염군 보다 증가함을 확인하였다. 9 and 10, the number and ratio of effector/memory T cells through MTBK 20620 protein stimulation in the spleen cells of mice 4 weeks after infection with the Korean Mycobacterium tuberculosis K strain was more than that of the Mycobacterium tuberculosis H37Rv-infected group. It was confirmed that it increased.

또한, 도 11 및 도 12에 나타낸 바와 같이, 감염 8주 후 마우스의 비장 및 폐 세포에서 MTBK 20620 단백질 자극을 통해 effector/memory T 세포의 수와 비율이 증가함을 확인하였으며, 특히 MTBK 20620 단백질은 한국형 결핵균 K 균주 감염군에서 마이코박테리움 튜버쿨로시스 H37Rv 감염군 보다 높은 값을 보임을 확인하였다.
In addition, as shown in FIGS. 11 and 12, it was confirmed that the number and ratio of effector/memory T cells increased through the stimulation of the MTBK 20620 protein in the spleen and lung cells of the mouse 8 weeks after infection, and in particular, the MTBK 20620 protein It was confirmed that the Korean-type Mycobacterium tuberculosis K strain-infected group showed higher values than the Mycobacterium tuberculosis H37Rv-infected group.

이하 본 발명의 조성물의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
Hereinafter, examples of the formulation of the composition of the present invention will be described, but this is not intended to limit the present invention, but is intended to be described in detail.

제제예Formulation example 1. One. 산제의Powdery 제조 Produce

MTBK 20620 단백질 2 gMTBK 20620 protein 2 g

유당 1 g1 g lactose

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
The above ingredients were mixed and filled in an airtight cloth to prepare a powder.

제제예Formulation example 2. 정제의 제조 2. Preparation of tablets

MTBK 20620 단백질 100 mgMTBK 20620 protein 100 mg

옥수수전분 100 mg100 mg corn starch

유당 100 mg100 mg lactose

스테아린산 마그네슘 2 mg2 mg of magnesium stearate

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
After mixing the above ingredients, tablets were prepared by tableting according to a conventional tablet preparation method.

제제예Formulation example 3. 캡슐제의 제조 3. Manufacture of capsules

MTBK 20620 단백질 100 mgMTBK 20620 protein 100 mg

옥수수전분 100 mg100 mg corn starch

유당 100 mg100 mg lactose

스테아린산 마그네슘 2 mg2 mg of magnesium stearate

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
After mixing the above ingredients, a gelatin capsule was filled according to a conventional capsule preparation method to prepare a capsule formulation.

제제예Formulation example 4. 주사제의 제조 4. Preparation of injection

MTBK 20620 단백질 10 mgMTBK 20620 protein 10 mg

만니톨 180 mgMannitol 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg2974 mg of sterile distilled water for injection

Na₂HPO₄2H₂O 26 mgNa ₂ HPO ₄ 2H ₂ O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
It is prepared with the above ingredients per ampoule (2 ml) according to a conventional injection preparation method.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Vaccine composition for tuberculosis containing MTBK 20620 <130> 1.10-1 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 92 <212> PRT <213> MTBK 20620 <400> 1 Met Thr Asp Pro Asp Ile Ala Thr Val Leu Arg Gln Met Lys Ile Pro 1 5 10 15 Glu Arg Met Thr Ser Ser Gln Ala Leu Arg Asp Phe Leu Leu Ala Asn 20 25 30 Thr Glu Asp Gly Arg Asn Val Pro Thr Gly Pro Glu Gln Val Leu Gln 35 40 45 Leu Asn Gly Leu Leu Leu Leu Ser His Leu Glu Val Ile Asn Ala Leu 50 55 60 Gly Ala Leu Glu Glu Arg Phe Ala Leu Glu His Tyr Gln Lys Phe Gln 65 70 75 80 Gln Glu Leu Lys Lys His Arg Lys Arg Arg Trp Trp 85 90 <210> 2 <211> 279 <212> DNA <213> MTBK 20620 <400> 2 gtgaccgacc ccgacatcgc caccgtcttg cggcagatga agatccccga gcgtatgacc 60 agcagccagg cgctccgcga cttcttgctg gccaacaccg aggacggacg gaacgtgcca 120 actggtcccg aacaagtcct tcagttgaat gggctgctcc tcctttcgca cctggaggtc 180 attaacgccc ttggggcttt ggaagagcga ttcgcgctgg agcattacca gaagttccag 240 caagagctga agaagcaccg aaagcgcaga tggtggtag 279 <110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Vaccine composition for tuberculosis containing MTBK 20620 <130> 1.10-1 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 92 <212> PRT <213> MTBK 20620 <400> 1 Met Thr Asp Pro Asp Ile Ala Thr Val Leu Arg Gln Met Lys Ile Pro 1 5 10 15 Glu Arg Met Thr Ser Ser Gln Ala Leu Arg Asp Phe Leu Leu Ala Asn 20 25 30 Thr Glu Asp Gly Arg Asn Val Pro Thr Gly Pro Glu Gln Val Leu Gln 35 40 45 Leu Asn Gly Leu Leu Leu Leu Ser His Leu Glu Val Ile Asn Ala Leu 50 55 60 Gly Ala Leu Glu Glu Arg Phe Ala Leu Glu His Tyr Gln Lys Phe Gln 65 70 75 80 Gln Glu Leu Lys Lys His Arg Lys Arg Arg Trp Trp 85 90 <210> 2 <211> 279 <212> DNA <213> MTBK 20620 <400> 2 gtgaccgacc ccgacatcgc caccgtcttg cggcagatga agatccccga gcgtatgacc 60 agcagccagg cgctccgcga cttcttgctg gccaacaccg aggacggacg gaacgtgcca 120 actggtcccg aacaagtcct tcagttgaat gggctgctcc tcctttcgca cctggaggtc 180 attaacgccc ttggggcttt ggaagagcga ttcgcgctgg agcattacca gaagttccag 240 caagagctga agaagcaccg aaagcgcaga tggtggtag 279

Claims

A vaccine composition for preventing tuberculosis comprising MTBK 20620 protein as an active ingredient.

The vaccine composition for preventing tuberculosis according to claim 1, wherein the MTBK 20620 protein is represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

3. The vaccine composition for the prevention of tuberculosis according to claim 2, wherein the MTBK 20620 protein is encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.

The method of claim 1, wherein the tuberculosis is selected from the group consisting of tuberculosis, skin tuberculosis, adrenal tuberculosis, renal tuberculosis, epidemic tuberculosis, lymphatic tuberculosis, laryngeal tuberculosis, middle ear tuberculosis, intestinal tuberculosis, multidrug-resistant tuberculosis, pulmonary tuberculosis, Wherein the vaccine composition is at least one selected from the group consisting of tuberculosis, lymphadenitis, pulmonary tuberculosis, breast tuberculosis, and spinal tuberculosis.

The vaccine composition for preventing tuberculosis according to claim 1, wherein the tuberculosis is caused by K strain which is a Korean highly pathogenic tuberculosis.

2. The vaccine composition according to claim 1, wherein the vaccine composition comprises an adjuvant.

2. The vaccine composition according to claim 1, wherein the vaccine composition is a booster vaccine.

A pharmaceutical composition for preventing or treating tuberculosis comprising MTBK 20620 protein as an active ingredient.