KR101661535B1 - 인삼 추출물의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인삼 추출물의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 초고압(high hydrostatic pressure)과 세포벽 분해효소(HHP-E)를 이용하여 무공해, 저비용의 진세노사이드 함량이 높은 인삼 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 간단한 방법으로 고함량의 다양한 진세노사이드를 추출함과 동시에 오염발생을 줄이고 비용을 절감하는 효과가 있다. 고함량의 메이저 진세노사이드뿐만 아니라 마이너 진세노사이드도 함유되어 Rg1 및 Rb1의 비율과 Re, Rc, Rb2, Rg2, Rf, Rd, Rh1 및 화합물 k(compound K)의 함량이 높은 상품성이 우수한 인삼 추출물 및 상기 인삼 추출물이 함유된 건강기능식품, 피부 외용제 조성물 및 약학 조성물을 제공한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 간단한 방법으로 고함량의 다양한 진세노사이드를 추출함과 동시에 오염발생을 줄이고 비용을 절감하는 효과가 있다. 고함량의 메이저 진세노사이드뿐만 아니라 마이너 진세노사이드도 함유되어 Rg1 및 Rb1의 비율과 Re, Rc, Rb2, Rg2, Rf, Rd, Rh1 및 화합물 k(compound K)의 함량이 높은 상품성이 우수한 인삼 추출물 및 상기 인삼 추출물이 함유된 건강기능식품, 피부 외용제 조성물 및 약학 조성물을 제공한다.
Description
본 발명은 인삼 추출물의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 초고압(high hydrostatic pressure)과 세포벽 분해효소(HHP-E)를 이용하여 무공해, 저비용의 진세노사이드 함량이 높은 인삼 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
인삼은 세계에서 소비되는 약초 중 가장 유명한 것 중의 하나로서 한국 뿐만 아니라 중국과 일본에서도 천년 이상 동안 사용되어 왔으며(Tyler, J. Pharm. Technol. 11, 214-220, 1995), 장수, 생명연장을 위한 강장제(tonic)로 이용되거나 아답토겐 시약(adaptogenic agent)으로 각종 스트레스, 피로, 암, 당뇨병에 대항하여 생체 기능을 향상시키는데 이용되어 왔다.
인삼으로부터 추출된 추출물은 면역, 항암, 항산화, 항당뇨 활성을 포함한 여러 가지 의학적인 효과가 있는 것으로 알려져 있는데, 이러한 효과는 주로 인삼 사포닌인 진세노사이드라 불리우는 트리테르페노이드 글루코사이드(triterpenoid glucoside)에 기인한다. 진세노사이드는 식물에 존재하는 여러 사포닌 중 인삼의 사포닌 성분만을 특별하게 구분하여 명명한 것으로써, 진세노사이드는 다양한 항암, 항알레르기, 항염증, 정신안정, 진통, 기억력 개선, 간기능 강화, 항당뇨, 항스트레스, 호흡기 질환 개선, 소화기관 개선, 혈당 강하, 면역력 증강, 항산화 및 항노화 등의 효과가 있는 것으로 보고되어 있다.
진세노사이드는 1960년대 초반에 분리되어 생리학적, 약리학적 연구에 널리 이용되었으며, 다양한 생물학적 활성을 갖는 40 개 이상의 진세노사이드가 인삼 뿌리에서 분리되었다. 진세노사이드는 아글리콘(aglycon)의 구조에 따라 크게 프로토파낙사디올(glucosides of protopanaxadiol, PPD-type ginsenosides, Ra1, Ra2, Ra3, Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Rg3), 프로토파낙사트리올(glucosides of protopanaxatriol, PPT-type ginsenosides, Re, Rf, Rgl, Rg2) 및 올레아난(Oleanane-type ginsenosides) 세 가지로 나뉜다.
또한, 진세노사이드는 비율상 많은 양을 차지하고 있는 프로토파낙사트리올(PPT) 계열의 Rg1, Re 등과 프로토파낙사디올(PPD) 계열의 Rb1, Rc, Rb2, Rd 등으로 이루어진 메이저 진세노사이드(major ginsenoside)와 Rg3, Rk, Rg5 등 미량의 마이너 진세노사이드(minor ginsenoside)로 나뉜다. 마이너 진세노사이드는 메이저 진세노사이드의 당 가수분해 처리공정에 의해 만들어지기도 하며, 자연계에 존재하는 배당체 화합물과 마찬가지로 메이저 진세노사이드에 비하여 흡수나 약효 등의 면에서 훨씬 뛰어난 효과를 나타낸다.
다이올계 사포닌에 속하는 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd 등의 인체 내 주요 대사산물로 알려진 20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-prototopanaxadiol(화합물 k, compound k)는 마이너 진세노사이드가 체내 소화액 또는 장내 세균의 도움을 받아 사포닌의 당 부분이 제거되며 생성된 물질로서, Rg1, Rb1 등의 성분의 분해와는 관계가 없고 Rg3 등의 성분이 효과를 발휘하기 위해 최종적으로 분해된 형태이다. 화합물 K는 암세포 증식 억제, 항암제의 항암 활성 증대, 알러지 억제 및 피부 보호 활성을 나타내는 것으로 알려져 있어, 이를 효율적으로 제조하려는 연구가 많이 이루어지고 있다.
종래 알려진 화합물 K를 제조하는 방법으로는 다이올계 사포닌을 효소인 나린지나제로 가수분해시켜 제조하거나, 쥐에 경구투여 후 대장에서 분해산물로 생성되는 화합물 K를 분리하는 방법이 있다. 그러나, 이 방법들은 수율이 극히 낮을 뿐만 아니라 여러 가지 2차 대사산물이 생성되어 화합물 K를 고순도로 정제하기가 어려운 문제점이 있으며(Kohda Hiroshi and Tanaka Osamu, The Pharm. Society of Japan 95:246(1975); Karikura 등, Chem. Pharm. Bull. 38:2859(1990)), 인삼 사포닌을 화합물 k로 전환하는 방법은 주로 미생물에 의해 이루어져 혐기성 조건에서 균을 배양해야 하거나 식용이 어려운 문제점이 있다.
진세노사이드는 크게 당부분(glycone)과 비당부분(aglycone)으로 구성된 배당체로서, 진세노사이드가 체내에서 흡수될 때 개개인의 장내 존재하는 특유 미생물에 의해 분해되어 흡수된다. 즉, 진세노사이드는 섭취 후 사람의 장내 미생물에 의해 대사되어 그 대사산물이 다양한 생리활성을 나타내는 것이다. 이러한 장내 존재하는 특유 미생물은 체질, 식습관 등에 따라 존재의 유무와 그 양이 다르기 때문에 진세노사이드의 전환율과 생체이용율이 달라지고, 인삼을 복용한 후 개인마다 다른 효과가 나타나게 된다. 예를 들어, 어떤 사람은 진세노사이드 중 디올 형태만을 흡수하고 어떤 사람은 트리올 형태만 흡수하며 어떤 사람은 진세노사이드를 전혀 흡수하지 못한다.
더욱 구체적으로, 프로토파낙사디올계 진세노사이드인 Rb1, Rb2, Rc는 사람의 장내 세균에 의해 20-O-β-D-글루코피라노실(glucopyranosyl)-20(S)-프로토파낙사디올(prototopanaxadiol)로 대사되고(Hasegawa H, et al., Planta Medica 63:463-40, 1997; Tawab MA, et al., Drug Metab. Dispos. 31:1065-71, 2003), 프로토파낙사트리올계 진세노사이드인 Re, Rg1은 장내세균에 의해 진세노사이드 Rh1이나 진세노사이드 F1으로 대사되며(Hasegawa H, et al., Planta Medica 62:453-7, 1996; Tawab MA, et al., Drug Metab. Dispos. 31:1065-71, 2003), 이렇게 전환된 화합물 K, Rh1 및 F1은 다양한 생리활성을 나타낸다.
또한, 인삼의 종류, 가공방법 또는 생육방법에 따라 함유된 진세노사이드의 종류와 양은 달라지게 된다. 고려인삼(Panax ginseng)은 22 개의 PPD 타입 진세노사이드와 14 개의 PPT 타입 진세노사이드를 포함하는 반면, 미국인삼(Panax quinquefolium)은 13 개의 PPD 타입 진세노사이드와 5 개의 PPT 타입 진세노사이드를 포함한다. 특정한 종의 인삼속 식물에서도 진세노사이드의 조성은 뿌리, 줄기, 잎 및 열매와 같은 부위에 따라 다양하게 나타난다.
상기와 같은 생리학적, 약리학적 유효성분인 진세노사이드가 함유된 인삼 추출물을 제조하기 위해 다양한 방법이 개발되었고, 이는 진세노사이드의 추출 효율을 최대화하고 분해를 최소화하며 유기용매 사용으로 인한 환경오염과 생산비용을 줄이는 방안으로 개발되어 왔다.
인삼 추출물에 대한 관심과 니즈(needs)가 높고, 인삼 추출물의 효능 강화를 위해서는 흡수가 용이한 진세노사이드를 고함량으로 추출해야 한다. 따라서, 우수한 인삼 제품을 제조하기 위해서는 메이저 진세노사이드뿐만 아니라 수삼과 같은 인삼에는 함유되어 있지 않거나 미량으로 함유되어 다양한 약리 작용을 하는 것으로 알려져 있는 마이너 진세노사이드도 별도의 전환과정 없이 함께 추출 및 제조할 수 있는 저비용, 고효율의 방법을 개발할 필요가 있다.
선행기술로 대한민국 등록특허 10-0228510(진세노사이드 Rg3 및/또는 Rg5의 제조방법), 대한민국 공개특허 10-2013-0059773(피부 주름 개선효과를 가지는 가공 인삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 건강기능성식품), 대한민국 공개특허 10-2011-0108820(이산화탄소 초임계 추출된 인삼 추출물을 포함하는 비만 억제용 조성물) 등이 있으나, 종래 용매를 이용한 가열 추출방법은 시간이 오래 소요되고 효율이 떨어질 뿐만 아니라 유효성분이 열에 의해 파괴되는 문제점이 있다. 또한, 초음파를 활용한 추출방법은 음파 진동의 기계적 충격에 의해 세포막이 파괴되어 내용물의 용출은 용이하게 하나 산업적으로 적용하기에는 어려운 문제가 있고, 이산화탄소를 이용한 초임계 추출방법은 지용성 물질 추출에는 적정하나 수용성 물질 추출에는 한계가 있다.
이와 같이, 종래 인삼 추출물의 제조방법은 추출 효율이 낮고 장시간이 소요되거나 비용이 많이 들고 에너지의 소비가 높아 산업적으로 적용하기에는 여러 가지 문제점을 안고 있다.
본 발명의 목적은 진세노사이드 수율이 높은 당 분해효소의 종류 및 첨가율과 초고압의 적용을 통해 종래 추출방법에 비하여 간단하고 비용이 절감된 인삼 추출물을 제조하는 방법을 제공함에 있다.
또한, 본 발명의 목적은 고함량의 메이저 진세노사이드뿐만 아니라 마이너 진세노사이드도 함유되어 Rg1 및 Rb1의 비율과 Re, Rc, Rb2, Rg2, Rf, Rd, Rh1 및 화합물 k(compound K)의 함량이 높은 상품성이 우수한 인삼 추출물 및 상기 인삼 추출물이 함유된 건강기능식품, 피부 외용제 조성물 및 약학 조성물을 제공함에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 인삼속(Panax species) 식물의 뿌리, 줄기, 잎 및 열매를 포함하는 군에서 선택되는 1 이상의 원료;와 물 및 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올을 포함하는 군에서 선택되는 1 이상의 용매;가 혼합되어 있는 현탁액을 제조하는 단계; (2) 상기 (1)단계에서 제조한 현탁액을 셀룰라아제(cellulase), 아밀라아제(amylase), 펙티나아제(pectinase), 셀로비아제(cellobiase) 및 비스코자임(viscozyme)을 포함하는 군에서 선택되는 1 이상의 당 분해효소와 혼합하여 혼합액을 제조하는 단계; 및 (3) 상기 (2)단계에서 제조한 혼합액을 32 내지 60 ℃에서 0.1 내지 200 MPa로 처리하여 진세노사이드가 함유된 추출물을 제조하는 단계;를 포함하는 인삼 추출물의 제조방법을 제공한다.
상기 (1)단계에서 인삼속 식물은 고려인삼(Panax ginseng), 화기삼(Panax quinquefolium), 전칠삼(Panax notoginseng), 죽절삼(Panax japonicum), 삼엽삼(Panax trifolium), 히말라야삼(Panax pseudoginseng) 또는 베트남삼(Panax vietnamensis)인 것을 특징으로 한다.
상기 (1)단계에서 현탁액은 용매 100 중량부에 대하여 인삼속 식물의 뿌리, 줄기, 잎 및 열매를 포함하는 군에서 선택되는 1 이상의 원료가 10 내지 25 중량부로 혼합된 것을 특징으로 한다.
상기 (2)단계에서 현탁액은 생리학적으로 허용되는 산을 첨가하여 pH를 4.5 내지 5로 조절하는 것을 특징으로 한다.
이때, 생리학적으로 허용되는 산은 염산, 황산 및 인산을 포함하는 무기산과 옥살산, 아세트산, 숙신산, 타르타르산, 아스코르브산, 시트르산, 글루탐산, 메타설폰산 및 에탄설폰산을 포함하는 유기산으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 한다.
상기 (2)단계에서 당 분해효소는 현탁액 100 부피부에 대하여 1 내지 5 부피비로 혼합하는 것을 특징으로 한다.
상기 인삼 추출물은 상기 (2)단계에서 당 분해효소로 펙티나아제와 셀룰라아제의 혼합효소 또는 펙티나아제, 셀룰라아제 및 셀로비아제의 혼합효소를 첨가하고, 상기 (3)단계에서 95 내지 105 MPa의 초고압으로 처리하여 전체 진세노사이드의 함량을 증가시킨 것을 특징으로 한다.
상기 인삼 추출물은 상기 (2)단계에서 당 분해효소로 아밀라아제, 셀룰라아제 및 펙티나아제를 첨가하여 진세노사이드 Rg1 및 Rb1의 함량을 증가시킨 것을 특징으로 한다.
이때, 아밀라아제, 셀룰라아제 및 펙티나아제는 5 내지 20 : 0.5 내지 2 : 2 내지 8의 혼합비(unit/ml)로 첨가되는 것을 특징으로 하며, 상기 인삼 추출물은 기능성 음료 조성물로 이용되는 것을 특징으로 한다.
상기 인삼 추출물은 상기 (2)단계에서 당 분해효소로 셀룰라아제, 펙티나아제 및 셀로비아제를 첨가하여 진세노사이드 Rd의 함량을 증가시킨 것을 특징으로 한다.
이때, 셀룰라아제, 펙티나아제 및 셀로비아제는 0.5 내지 3 : 0.5 내지 3 : 0.5 내지 3의 혼합비(unit/ml)로 첨가되는 것을 특징으로 하며, 상기 인삼 추출물은 피부 외용제 조성물로 이용되는 것을 특징으로 한다.
상기 인삼 추출물은 상기 (2)단계에서 당 분해효소로 셀룰라아제, 아밀라아제 및 셀로비아제를 첨가하여 진세노사이드 Rh1 및 화합물 k(compound k)를 함유하는 것을 특징으로 한다.
이때, 셀룰라아제, 아밀라아제 및 셀로비아제는 0.5 내지 3 : 0.5 내지 3 : 0.5 내지 3의 혼합비(unit/ml)로 첨가되는 것을 특징으로 하며, 상기 인삼 추출물은 항암용 약학 조성물로 이용되는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 상기 제조방법에 의해 추출된 인삼 추출물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인삼 추출물에 함유된 진세노사이드의 약학적 유효량 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항산화용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인삼 추출물에 함유된 진세노사이드의 약학적 유효량 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 면역력 증진용 약학 조성물을 제공한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 최적의 당 분해효소의 종류 및 첨가율과 초고압을 적용하고 농축함으로써, 간단한 방법으로 고함량의 다양한 진세노사이드를 추출함과 동시에 오염발생을 줄이고 비용을 절감하는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 고함량의 메이저 진세노사이드뿐만 아니라 마이너 진세노사이드도 함유되어 Rg1 및 Rb1의 비율과 Re, Rc, Rb2, Rg2, Rf, Rd, Rh1 및 화합물 k(compound K)의 함량이 높은 상품성이 우수한 인삼 추출물 및 상기 인삼 추출물이 함유된 건강기능식품, 피부 외용제 조성물 및 약학 조성물을 제공하는 효과가 있다.
도 1은 인삼 추출물의 제조공정.
도 2는 다양한 압력에 따라 추출된 진세노사이드의 함량.
도 3은 상압(0.1 MPa) 및 초고압(100 MPa)에서 처리한 4년근 금산 인삼, 6년근 금산 인삼 및 4년근 풍기 인삼의 전체 진세노사이드 함량 비교.
도 4는 용매에 혼합된 인삼 함유량(인삼 농도)에 따른 전체 진세노사이드 함량.
도 5는 다양한 효소의 조합에 따른 상압(0.1 MPa) 및 초고압(100 MPa)에서 추출된 전체 진세노사이드 함량. A는 아밀라아제, P는 펙티나아제, C는 셀룰라아제, Cb는 셀로비아제, V는 비스코자임.
도 6은 초고압(100 MPa)에서 추출된 인삼과 용매가 혼합된 현탁액의 pH와 세포벽 분해효소 종류에 따른 메이저 진세노사이드 Re+Rg1+Rb1+Rc+Rb2(㎍/g)의 수율 비교.
도 7은 초고압(100 MPa)에서 추출된 초고압 처리 온도와 세포벽 분해효소 종류에 따른 메이저 진세노사이드 Re+Rg1+Rb1+Rc+Rb2(㎍/g)의 수율 비교.
도 8은 (a)는 표준 진세노사이드 혼합물, (b)는 상압에서 24 시간 처리, (c)는 초고압에서 24 시간 처리, (d)는 상압에서 12 시간 처리, (e)는 초고압에서 12 시간 처리한 추출물에 함유된 진세노사이의 HPLC 그래프.
도 9는 효소 아밀라아제, 셀룰라아제 및 펙티나아제를 첨가하여 상압(0.1 MPa) 및 초고압(100 MPa)에서 추출할 경우 Rg1+Rb1의 함량이 크게 증가됨을 나타내는 그래프.
도 10은 효소로 셀룰라아제, 펙티나아제 및 셀로비아제를 첨가하여 12, 18 및 24 시간 동안 각각 상압(0.1 MPa) 및 초고압(100 MPa)에서 추출한 경우 Rd의 수율 비교.
도 2는 다양한 압력에 따라 추출된 진세노사이드의 함량.
도 3은 상압(0.1 MPa) 및 초고압(100 MPa)에서 처리한 4년근 금산 인삼, 6년근 금산 인삼 및 4년근 풍기 인삼의 전체 진세노사이드 함량 비교.
도 4는 용매에 혼합된 인삼 함유량(인삼 농도)에 따른 전체 진세노사이드 함량.
도 5는 다양한 효소의 조합에 따른 상압(0.1 MPa) 및 초고압(100 MPa)에서 추출된 전체 진세노사이드 함량. A는 아밀라아제, P는 펙티나아제, C는 셀룰라아제, Cb는 셀로비아제, V는 비스코자임.
도 6은 초고압(100 MPa)에서 추출된 인삼과 용매가 혼합된 현탁액의 pH와 세포벽 분해효소 종류에 따른 메이저 진세노사이드 Re+Rg1+Rb1+Rc+Rb2(㎍/g)의 수율 비교.
도 7은 초고압(100 MPa)에서 추출된 초고압 처리 온도와 세포벽 분해효소 종류에 따른 메이저 진세노사이드 Re+Rg1+Rb1+Rc+Rb2(㎍/g)의 수율 비교.
도 8은 (a)는 표준 진세노사이드 혼합물, (b)는 상압에서 24 시간 처리, (c)는 초고압에서 24 시간 처리, (d)는 상압에서 12 시간 처리, (e)는 초고압에서 12 시간 처리한 추출물에 함유된 진세노사이의 HPLC 그래프.
도 9는 효소 아밀라아제, 셀룰라아제 및 펙티나아제를 첨가하여 상압(0.1 MPa) 및 초고압(100 MPa)에서 추출할 경우 Rg1+Rb1의 함량이 크게 증가됨을 나타내는 그래프.
도 10은 효소로 셀룰라아제, 펙티나아제 및 셀로비아제를 첨가하여 12, 18 및 24 시간 동안 각각 상압(0.1 MPa) 및 초고압(100 MPa)에서 추출한 경우 Rd의 수율 비교.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
인삼은 약 60 cm 내외의 다년생 초본으로, 보통 4~6년 후 가을에 수확하며 가공하지 않은 그대로의 인삼을 수삼이라 한다. 수삼은 저장에 문제가 있기 때문에 가공이 필요하며 가공방식에 따라 백삼, 홍삼 등으로 분류되고, 생육환경에 따라 재배삼, 장뇌삼, 산삼 등으로 구분된다.
인삼은 오래 전부터 천연 에르고제닉 에이드(natural ergogenic aid)로 알려져 있으며, 면역력 증강, 항스트레스, 항암, 항노화, 항산화, 숙취, 강장효과 등에 이르기까지 다양한 효능들이 밝혀지고 있다(Kim SH, et al., J Sports Med. Phys. Fitness., 45(2):178-82, 2005)(Gillis CN, Biochem Pharmacol., 54(1):1-8, 1997; Attele AS, et al., Biochem Pharmacol., 58(11):1685-93, 1999; Shin HR, et al., Cancer Causes Control., 11(6):565-76, 2000). 미토콘드리아 에너지 대사를 개선시키고, 유산소 운동능력(aereobic exercise performance)의 증진에 진세노사이드 Rg1과 Rb1이 작용한다고 보고된 바 있고(Wang LC, et al., Planta Med., 64(2):130-133, 1998), 진세노사이드 Rg3와 Re의 항산화 효능에 의해 산화적 스트레스(oxidative stress)가 감소된다고 보고되어 있다(Tian J, et al., Neurosci. Lett., 374(2):92-97, 2005; Cho WC, et al., 2006, Eur. J. Pharmacol., 550(1-3):173-179, 2006).
진세노사이드 Rg1은 면역증강효과(Okamura N et al. Biol. Pharm. Bull. 17(2), 270(1994)), 항피로작용(Saito H et al. Japan J. Pharmacology, 24, 119(1974)) 및 유해자극 방어작용(Yoshimatsu H et al. Physiology and Behavior, 53(1), 1(1993))을 갖고, 진세노사이드 Rd는 부신피질호르몬 분비 촉진작용(Hiai S et al. Chem Pharm. Bull. 31, 168(1983)), 진세노사이드 Rb1은 단백질 합성 촉진작용(Zhang J T et al. Acta Pharmaceutica Sinica 23(1), 12,(1988)), 진세노사이드 Rc는 진통작용, 단백질 및 지질 합성 촉진작용, 진세노사이드 Rb2는 항당뇨작용, 면역조절작용, 콜레스테롤 대사작용 등 다양한 약리효과를 갖는다.
인삼 추출물의 피부와 관련된 효능으로는 소염작용(Korean J. Dermatol. 18(1):39-42(1980), Korean J. Dermatol. 14(4):335-339(1976)), 과각화방지(Korean J. Dermatol. 28(4):434-440(1990)), 여드름 예방 및 치료(Korean J. Dermatol. 30(1):27-33(1992), Korean J. Dermatol. 28(4):434-440(1990)), 항산화(Proceedings of the 2 nd international ginseng symposium 13-17(1978)), 탄력성 및 수화성 증가(Fitoterapia 57(1):15-28(1986), Fitoterapia 57(4) 217-222(1986)), 상처치유(Brit. J. Pharmacol. 125:255-262(1998), Arch. pharm. res. 25(1):71-76(2002)), 콜라겐 분해억제(Mol. Cells 9(5):476-483(1999)), 미백(Journal of the society of cosmetic scientists of korea 27(2):45-56(2001)) 등이 있다.
PPD계 진세노사이드와 PPT계 진세노사이드는 체내에서 각기 다른 작용을 하는데, 진세노사이드 Rb1으로 대표되는 PPD계 사포닌은 중추신경에 대한 억제작용을 나타내어 정신안정, 신경이완, 진통, 항경련, 혈압강하, 파파베린양 작용 등을 나타내는 것으로 알려져 있고, 진세노사이드 Rg1으로 대표되는 PPT계 사포닌은 중추신경에 대해 흥분적으로 작용하여 항피로작용이 있는 것으로 알려져 있다.
화합물 K는 종양의 침입을 막거나 염색체 변형과 종양 형성을 예방함으로써 전이 또는 항암 효과를 유도하고(Wakabayashi C, et al., Oncol. Res. 9:411-7, 1998; Lee SJ, et al., Cancer Lett. 144:39-43, 1999), Rh1은 각종 암세포 성장에 대한 세포독성 효과(Odashima S, et al., Cancer Res. 45:2781-4, 1985; Ota T, et al., Cancer Res. 47:3863-7, 1987; Lee HY, et al., Differentiation mechanism of ginsenosides in cultured murine F9 teratocarcinoma stem cells. Proc. 6th Int. Ginseng symp. Seoul 127-31, 1993) 및 항알레르기, 항염증(Park EK, et al., Int. Arch. Allergy Immunol. 133:113-120, 2004) 활성을 가진다.
본 발명은 (1) 인삼속(Panax species) 식물의 뿌리, 줄기, 잎 및 열매를 포함하는 군에서 선택되는 1 이상의 원료;와 물 및 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올을 포함하는 군에서 선택되는 1 이상의 용매;가 혼합되어 있는 현탁액을 제조하는 단계; (2) 상기 (1)단계에서 제조한 현탁액을 셀룰라아제(cellulase), 아밀라아제(amylase), 펙티나아제(pectinase), 셀로비아제(cellobiase) 및 비스코자임(viscozyme)을 포함하는 군에서 선택되는 1 이상의 당 분해효소와 혼합하여 혼합액을 제조하는 단계; 및 (3) 상기 (2)단계에서 제조한 혼합액을 32 내지 60 ℃에서 0.1 내지 200 MPa로 처리하여 진세노사이드가 함유된 추출물을 제조하는 단계;를 포함하는 인삼 추출물의 제조방법을 제공한다.
상기 인삼 추출물의 제조방법은 (4) 상기 (3)단계에서 제조한 추출물에 함유된 당 분해효소를 불활성화하는 단계; 및 (5) 상기 (4)단계에서 당 분해효소를 불활성화시킨 추출물을 농축하는 단계;를 더 포함한다.
상기 (1)단계에서 인삼속 식물은 고려인삼(Panax ginseng), 화기삼(Panax quinquefolium), 전칠삼(Panax notoginseng), 죽절삼(Panax japonicum), 삼엽삼(Panax trifolium), 히말라야삼(Panax pseudoginseng) 또는 베트남삼(Panax vietnamensis) 등이 있고, 가공여부와 생육환경에 따른 홍삼, 수삼, 백삼, 재배삼, 장뇌삼 또는 산삼 등도 이용 가능하다.
상기 (1)단계에서 현탁액은 용매 100 중량부에 대하여 인삼속 식물의 뿌리, 줄기, 잎 및 열매를 포함하는 군에서 선택되는 1 이상의 원료가 10 내지 25 중량부, 바람직하게는 20 내지 25 중량부로 혼합된 것이 최적의 효과를 나타낸다. 용매에 대해 인삼 원료의 농도가 10 내지 25 중량부를 벗어날 경우 목적으로 하는 진세노사이드의 수율이 낮아져 효율성이 떨어지는 문제가 발생하므로, 상기 농도의 범위에서 인삼 슬러리를 용매와 혼합하는 것이 매우 중요하다.
또한, 상기 현탁액은 인삼속 식물의 뿌리, 줄기, 잎, 열매 또는 이들의 혼합원료를 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매와 함께 습식분쇄하여 제조된 것이 바람직하다.
상기 (2)단계에서 현탁액은 생리학적으로 허용되는 산을 첨가하여 pH를 4.5 내지 5, 바람직하게는 4.5 내지 4.8로 조절하는 것이 최적의 효과를 나타낸다. pH는 효소 활성에 직접적인 영향을 미치는 중요인자로서 pH의 작은 변화에 따라 추출되는 진세노사이드의 종류와 수율이 현저하게 달라지게 된다. 본 발명에서 셀룰라아제, 아밀라아제, 펙티나아제, 비스코자임 및 셀로비아제를 포함하는 군에서 선택되는 1 이상의 당 분해효소가 인삼 추출과정에서 소량의 첨가에도 최적의 활성을 나타내는 pH의 범위는 4.5 내지 5로, 상기 범위를 벗어날 경우 진세노사이드 수율이 떨어지며 진세노사이드 수율을 높이기 위해 효소의 첨가량을 증가시킬 경우 경제성 및 효율성이 떨어지는 문제가 있다.
이때, 생리학적으로 허용되는 산은 염산, 황산 및 인산을 포함하는 무기산과 옥살산, 아세트산, 숙신산, 타르타르산, 아스코르브산, 시트르산, 글루탐산, 메타설폰산 및 에탄설폰산을 포함하는 유기산으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상인 것이 바람직하다.
상기 (2)단계에서 당 분해효소는 현탁액 100 부피부에 대하여 1 내지 5 부피비, 바람직하게는 2 내지 4 부피비, 더 바람직하게는 3 내지 4 부피부로 혼합하는 것이 최적의 효과를 나타낸다.
본 발명에 따른 인삼 추출물의 제조방법은 여러 가지 당 분해효소가 함께 작용하여 우수한 활성을 나타내는 최적의 pH와 온도에서 압력을 가함으로써, 종래 효소를 첨가하여 진세노사이드를 추출하는 방법에 비하여 적은 양의 효소로도 우수한 진세노사이드 수율을 나타내어 경제성이 높은 효과가 있다.
상기 (3)단계에서 혼합액의 처리 온도는 37 내지 55 ℃, 바람직하게는 40 내지 50 ℃, 더 바람직하게는 40 내지 45 ℃에서 처리하는 것이 최적의 효과를 나타낸다. 본 발명에 따른 여러 가지 당 분해효소가 초고압 과정에서 최적의 활성으로 진세노사이드 수율의 상승 효과를 나타내는 처리 온도는 37 내지 55 ℃로, 상기 범위를 벗어날 경우 효소 활성이 둔화되고 에너지 소비가 높아져 경제성이 떨어지며 목적으로 하는 진세노사이드의 추출이 원활하지 않은 문제점이 있다.
또한, 상기 (3)단계에서 혼합액의 처리 압력은 0.1 내지 150 MPa, 바람직하게는 50 내지 150 MPa, 더 바람직하게는 50 내지 100 MPa로 처리하는 것이 최적의 효과를 나타낸다. 혼합액의 처리 압력이 증가할수록 진세노사이드 수율은 높아지나 높은 에너지를 소비하고 처리 압력이 너무 낮으면 진세노사이드 추출이 원활하지 않으므로, 효소를 첨가한 후 상기 범위 내에서 혼합액을 처리하여 진세노사이드를 추출하는 것이 중요하다.
이때, 상기 온도와 압력에서 혼합액은 밀봉하여 8 내지 30 시간, 바람직하게는 12 내지 24 시간, 더욱 바람직하게는 18 내지 24 시간 동안 처리하는 것이 최적의 효과를 나타낸다.
상기 (4)단계에서 당 분해효소를 불활성화하는 방법은 추출물을 70 내지 100 ℃에서 10 내지 50 분간, 바람직하게는 70 내지 90 ℃에서 10 내지 40 분간 열처리하는 것이 최적의 효과를 나타낸다.
상기 (5)단계에서 농축은 48 내지 72 시간 동안 동결건조하는 것이 바람직하다.
상기 인삼 추출물은 상기 (2)단계에서 당 분해효소로 펙티나아제와 셀룰라아제의 혼합효소 또는 펙티나아제, 셀룰라아제 및 셀로비아제의 혼합효소를 첨가하고, 상기 (3)단계에서 95 내지 105 MPa의 초고압으로 처리할 경우 25 mg/g 이상의 높은 진세노사이드 함량을 나타낸다.
본 발명에 따른 인삼 추출물의 제조방법에서 셀로비아제는 단독으로 첨가하였을 때보다 다른 당 분해효소와 함께 첨가하였을 때 높은 진세노사이드 함량과 더불어 마이너 진세노사이드의 수득도 가능하게 한다.
상기 인삼 추출물은 상기 (2)단계에서 당 분해효소로 아밀라아제, 셀룰라아제 및 펙티나아제를 첨가할 경우 진세노사이드 Rg1 및 Rb1의 함량이 크게 증가하여 기능성 음료 조성물로 이용될 수 있다. 더욱 구체적으로, 항피로, 항산화, 면역력 증진 등을 위한 기능성 음료 조성물로 이용될 수 있으며, 이는 식약처가 제시한 진세노사이드 Rg1, Rb1 및 Rg3의 함량이 2.5 내지 34 mg/g일 경우 면역력 증진, 피로 개선, 항산화 등 기능성 건강기능식품으로 인정되는 것에 부합한다.
이때, 아밀라아제, 셀룰라아제 및 펙티나아제는 5 내지 20 : 0.5 내지 2 : 2 내지 8, 바람직하게는, 8 내지 15 : 1 : 2 내지 5, 더 바람직하게는 10 : 1 : 4의 혼합비(unit/ml)로 첨가되는 것이 최적의 효과를 나타낸다. 효소의 최적 조건 하에서 30 ℃, 1 분당 1 μmol의 기질을 생성물로 변환시키기 위해 필요한 효소의 양을 1 단위(unit)라 하며, 1 ml 중의 효소를 단위수로 효소의 농도를 표시한 것이다.
상기 인삼 추출물은 상기 (2)단계에서 당 분해효소로 셀룰라아제, 펙티나아제 및 셀로비아제를 첨가할 경우 진세노사이드 Rd의 함량이 크게 증가되어 미백, 보습, 여드름 개선, 항산화, 노화방지, 항균, 항염, 아토피 등을 위한 피부 외용제 조성물로 이용될 수 있다(Kim et al., J Ginseng Res. (2013) 37:54-63).
이때, 셀룰라아제, 펙티나아제 및 셀로비아제는 0.5 내지 3 : 0.5 내지 3 : 0.5 내지 3, 바람직하게는 0.5 내지 1.5 : 0.5 내지 2 : 0.5 내지 1.5, 더 바람직하게는 1 : 1 : 1의 혼합비(unit/ml)로 첨가되는 것이 최적의 효과를 나타내며, 높은 함량의 진세노사이드 Rd를 추출하기 위해서는 압력 처리 시간을 18 내지 24 시간으로 조절하는 것이 바람직하다.
상기 인삼 추출물은 상기 (2)단계에서 당 분해효소로 셀룰라아제, 아밀라아제 및 셀로비아제를 첨가할 경우 진세노사이드 Re, Rg1, Rc, Rb2와 함께 진세노사이드 Rh1 및 화합물 k(compound k)를 함유하며, 이는 항암용 약학 조성물로 이용될 수 있다. 메이저 진세노사이드의 추출과 함께 메이저 진세노사이드를 마이너 진세노사이드로 전환시켜 보다 간단한 방법으로 Rh1 및 화합물 k의 제조가 가능하다.
이때, 셀룰라아제, 아밀라아제 및 셀로비아제는 0.5 내지 3 : 0.5 내지 3 : 0.5 내지 3, 바람직하게는 0.5 내지 1.5 : 0.5 내지 2 : 0.5 내지 1.5, 더 바람직하게는 1 : 1 : 1의 혼합비(unit/ml)로 첨가되는 것이 최적의 효과를 나타낸다.
본 발명은 상기 제조방법에 의해 추출된 인삼 추출물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 항피로, 항산화, 면역력 증진 등을 위한 건강기능식품을 제공한다.
상기 건강기능식품은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 유제, 시럽제, 액제, 에어로졸, 엑스제, 차, 젤리 또는 음료 형태로 제조될 수 있다. 더욱 구체적으로, 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 비스켓, 떡, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강 식품을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 인삼 추출물을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강 식품 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에 첨가되는 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 건강 음료 조성물은 필수성분으로서 상기 지시된 비율로 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로서 함유할 수 있다. 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어, 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당과 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등과 같은 당알콜이 있다. 향미제로서는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 인삼 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 인삼 추출물은 천연 과일 쥬스, 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있고, 이러한 첨가제의 비율은 일반적으로 본 발명의 인삼 추출물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택된다.
또한, 본 발명은 상기 인삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백, 보습, 여드름 개선, 항산화, 노화방지, 항균, 항염, 아토피 등을 위한 피부 외용제 조성물을 제공한다.
상기 피부 외용제 조성물은 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제 함유 클렌징, 오일, 파운데이션 또는 스프레이 형태로 제조될 수 있다. 더욱 구체적으로, 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 팩, 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액, 연고 등이 있고, 본 발명의 인삼 추출물이 함유된 피부 외용제 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.001 내지 90 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 10 중량%로 사용이 가능하다.
또한, 본 발명은 상기 인삼 추출물에 함유된 진세노사이드의 약학적 유효량 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항산화용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인삼 추출물에 함유된 진세노사이드의 약학적 유효량 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 면역력 증진용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말리톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.
상기 약학 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 유제, 시럽제, 액제, 에어로졸, 엑스제, 주사제, 경피 투여제 또는 좌제 형태로 제조될 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분 칼슘카보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 일일 0.0001 내지 100 mg/kg, 바람직하게는 25 내지 100 mg/kg, 더욱 바람직하게는 50 내지 100 mg/kg의 인삼 추출물을 섭취하도록 비경구 또는 경구 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고 수회 나누어 투여할 수도 있으며, 질환의 진행 정도, 환자의 나이, 성별, 신체 상태, 투여 기간, 투여 방법, 환자의 체중, 식사, 배출 속도 등에 따라 용량을 달리하여 투여될 수 있다.
상기와 같은 본 발명에 따른 인삼 추출물의 제조방법은 고함량의 메이저 진세노사이드뿐만 아니라 마이너 진세노사이드도 함유되어 Rg1 및 Rb1의 비율과 Re, Rc, Rb2, Rg2, Rf, Rd, Rh1 및 화합물 k(compound K)의 함량이 높은 상품성이 우수한 인삼 추출물을 제공하는 효과가 있다.
또한, 간단한 제조공정을 통해 활성물질을 용이하게 추출하여 건강기능식품, 피부 외용제 조성물 및 약학 조성물에 다양하게 활용이 가능하다.
하기에 본 발명의 인삼 추출물을 포함하는 여러 가지 제제예 및 제형예를 설명하고 있으나, 이는 본 발명을 제한하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 정제의 제조
실시예의 인삼 추출물...........................100㎎
전분............................................50mg
유당.............................................50mg
스테아린산 마그네슘..............................5mg
상기의 성분들을 혼합하고 통상적인 정제의 제조방법에 따라 습식과립법 또는 건식과립법을 이용하여 정제를 제조하였다.
제제예 2. 캡슐제의 제조
실시예의 인삼 추출물.......................................100㎎
전분.......................................................50mg
유당.......................................................50mg
탈크.......................................................1mg
스테아린산마그네슘......................................... 5mg
상기의 성분들을 혼합하고 통상적인 캡슐제의 제조방법에 따라서 캡슐제를 제조하였다.
제제예 3. 액제의 제조
실시예의 인삼 추출물......................................500㎎
이성화당..................................................10ｇ
자당.......................................................10ｇ
레몬향.....................................................적당량
정제수를 가하여 전체.......................................50㎖
상기의 성분들을 통상적인 액제의 제조방법에 따라서 혼합하여 갈색병에 충전하고 멸균시켜서 액제를 제조하였다.
제제예 4. 주사제의 제조
실시예의 인삼 추출물....................................50㎎
소디움 메타비설파이트...................................2.6㎎
메틸파라벤..............................................0.5㎎
프로필파라벤............................................0.1㎎
주사용 멸균증류수.......................................적당량
상기의 성분들을 혼합하고 통상적인 방법으로 2 ml로 조절한 후, 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조하였다.
제제예 5. 음료의 제조
실시예의 인삼 추출물......................................100㎎
비타민B2....................................................5㎎
비타민B6....................................................5㎎
비타민C....................................................80㎎
식이섬유.................................................1,000㎎
액상과당................................................10,000㎎
유화제.....................................................100㎎
레몬향......................................................50㎎
정제수....................................................적당량
상기의 성분들을 혼합하여 용량이 50 ml가 되도록 하고, 혼합액을 3 μm의 필터로 통과시켜 여과한 최종 혼합액을 90 내지 93 ℃에서 20 초간 1차 살균하여 50 ml 병에 충진하고 80 내지 85 ℃에서 20 분간 2차 살균하여 음료제품을 제조하였다.
제형예 1. 유연 화장수(스킨 로션)
실시예의 인삼 추출물..................2.0
글리세린...............................3.5
올레일알코올...........................1.5
에탄올.................................5.5
폴리솔베이트 80........................3.2
카르복실비닐폴리머.....................1.0
부틸렌 글리콜..........................2.0
프로필렌 글리콜........................2.0
방부제, 향료...........................적량
정제수.................................잔량
계......................................100
상기의 조성에 따라 통상적인 방법으로 유연 화장수를 제조하였다(단위 중량%).
제형예 2. 영양 화장수(밀크 로션)
실시예의 인삼 추출물..........................2.0
글리세린......................................3.0
부틸렌글리콜..................................3.0
프로필렌글리콜................................3.0
카르복시비닐폴리머.............................0.1
밀납...........................................4.0
폴리솔베이트 60................................1.5
카프릴릭/카프릭 리글리세라이드..................5.0
스쿠알란.......................................5.0
솔비타세스퀴올레이트............................1.5
세테아릴 알코올.................................1.0
트리에탄올아민..................................0.2
방부제, 향료....................................적량
정제수...........................................잔량
계...............................................100
상기의 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양 화장수를 제조하였다(단위 중량%).
제형예 3. 영양 크림
실시예의 인삼 추출물...........................2.0
글리세린.......................................3.5
부틸렌글리콜...................................3.0
유동파라핀.....................................7.0
베타글루칸.....................................7.0
카보머..........................................0.1
카프릴릭/카프릭 리글리세라이드..................3.0
스쿠알란........................................5.0
세테아릴 글루코사이드............................1.5
소르비탄 스테아레이트............................0.4
폴리솔베이트 60..................................1.2
트리에탄올아민...................................0.1
방부제, 향료.....................................적량
정제수...........................................잔량
계................................................100
상기의 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양 크림을 제조하였다(단위 중량%).
제형예 4. 팩
실시예의 인삼 추출물.........................2.0
글리세린.....................................4.0
폴리비닐알콜.................................15.0
히알루론산 추출물............................5.0
베타글루칸...................................7.0
알란토인......................................0.1
노닐 페닐에테르...............................0.4
폴리솔베이트 60...............................1.2
방부제, 향료..................................적량
정제수........................................잔량
계.............................................100
상기의 조성에 따라 통상적인 방법으로 팩을 제조하였다(단위 중량%).
제형예 5. 국소 투여용 약제(패취제)
실시예의 인삼 추출물.........................................2.0
베타-1,3-글루칸..............................................3.0
디에틸아민...................................................0.7
아황산나트륨.................................................0.1
폴리옥시에틸렌라우릴에테르(E.O=9)............................1.0
폴리히드록시에틸렌세틸스테아릴에테르(Cetomacrogol 1000)......1.0
점성의 파라핀 오일............................................2.5
카프릴산에스테르/카프르산에스테르(Cetiol LC)..................2.5
폴리에틸렌글리콜 400..........................................3.0
폴리아크릴산(Carbopol 934P)...................................1.0
정제수........................................................잔량
계............................................................100
상기의 조성에 따라 통상적인 방법으로 국소 투여용 약제를 제조하였다(단위 중량%).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예. 인삼 추출물의 제조
본 발명의 실시예에서는 표 1에 나열된 상업적으로 이용 가능한 효소 셀룰라아제(from Trichoderma reesei ATCC26921 - Sigma C2730), α-아밀라아제(from Bacillus licheniformis - Sigma A3403), 펙티나아제(from Aspergillus aculeatus - Sigma P2611), 비스코자임 L(Sigma V2010) 및 셀로비아제(from Aspergillus niger - Sigma C6105)와 4년근, 6년근 금산 인삼 및 4년근 풍기 인삼을 이용하였다.
400 g의 4년근 금산 인삼 뿌리를 잘게 썰어 혼합 그라인더를 이용하여 용매 2 L의 멸균 증류수와 균질화한 후, 시트르산으로 현탁액의 pH를 4.0 내지 4.8로 조절하였다. 이후, 표 2에서 나열된 바와 같이 효소를 조합하여 현탁액 100 부피부에 대하여 2 내지 4 부피부의 효소를 상기 pH가 조절된 현탁액과 혼합하고, 혼합액을 유연한 벽면을 지닌 플라스틱 용기에 채워 밀봉하여 초고압 장비(HHP machine, TFS-2L, Toyo-Koatsu Innoway Co. Ltd., Hiroshima, Japan)로 45 ℃에서 24 시간 동안 0.1, 25, 50, 75, 100 MPa의 상압 또는 초고압(high hydrostatic pressure; HHP) 처리를 실시하여 추출물을 제조하였다.
또한, 효소를 처리하지 않은 대조군(control)도 HHP 및 AP에서 각각 처리하여 비교하였다.
이후, 효소를 불활성화시키기 위해 추출물을 80 ℃에서 30 분간 처리하고 얼음물 욕조에서 냉각시킨 다음, 250 ㎛의 체(sieve)로 압착여과한 후 48 내지 72 시간 동안 동결건조하여 농축시키고, 분석을 위해 -20 ℃에서 저장하여 하기와 같은 실험을 진행하였다.
실험예 1. 전체 사포닌(진세노사이드) 함량 측정
추출된 전체 진세노사이드의 함량은 Wei, S.E., 2011(Isolation and determination of anti-nutritional compounds from root and shells of Peanut (Arachis hypogaea), Department of Chemical Science, Faculty of Science. Universiti Tunku Abdul Rahman, Selangor, Malaysia, p. 104.)에 개시된 방법에 따라 측정하였다.
각각의 시료 100 ㎕에 농도가 80 %인 메탄올 수용액을 첨가하여 0.25 ml가 되도록 조절한 후, 농도가 8 %인 바닐린 시약 0.25 ml와 농도가 72 %인 황산 2.5 ml를 첨가하여 혼합하였다. 이후, 60 ℃의 수욕조에서 10 분간 처리하고 상온에서 냉각시켜 544 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 곡선은 표준 사포닌으로서 다이오스게닌(diosgenin)의 다양한 농도를 이용하여 얻었고, 표준 사포닌 용액은 80 %의 메탄올 수용액을, 시약바탕시료(reagent blank)는 추출물이 함유된 시료 대신 80 %의 메탄올 수용액 0.25 ml를 이용하였다.
실험예 2. 인삼 사포닌(진세노사이드)의 HPLC 분석
초고압(HHP) 및 상압(AP)에서 추출된 인삼 추출물을 같은 부피를 갖는 n-부탄올과 상온에서 20 분간 흔들어 혼합한 다음, 상 분리를 위해 5 분간 13,000 g에서 원심분리하여 부탄올 층을 모아 진공 증발기에서 건조시킨 후, HPLC 분석을 위해 메탄올에 용해시켰다.
HPLC 분석은 4.5 mm × 25 cm의 Sunfire C18 column을 이용하여 Waters HPLC system에서 수행되었으며, HPLC용 아세토나이트릴과 물을 이동상으로 이용하고 1 ml/min의 이동상 흐름 속도로 수행되었다. 또한, 각각의 시료 20 μl를 C18 column에 주입하기 전에 0.25 μm PTFE 필터로 여과하였다.
다양한 진세노사이드의 용출이 203 nm에서 관찰되었고, 진세노사이드의 용출 순서와 양은 표준 진세노사이드 혼합물(Cerillant co., USA)의 크로마토그램과의 비교에 의해 산출되었다. 각각의 샘플에 대한 HPLC 분석은 정확성을 위해 세 번 반복하였다.
실험결과.
(1) 압력의 변화에 따른 진세노사이드 추출 결과.
상기 실시예에서 다양한 압력에 따라 추출된 진세노사이드의 함량은 도 2에 나타내었다.
그 결과, 0.1 내지 100 MPa에서 추출할 경우 진세노사이드의 함량은 12 내지 24 mg/g, 50 내지 100 MPa에서 추출할 경우 진세노사이드의 함량은 18 내지 24 mg/g으로 압력이 증가할수록 추출되는 진세노사이드의 함량은 증가되었고, 100 MPa에서 최대값을 나타내었다.
(2) 인삼의 종류에 따른 진세노사이드 추출 결과.
상기 실시예의 방법으로 4년근 금산 인삼, 6년근 금산 인삼 및 4년근 풍기 인삼을 각각 상압(0.1 MPa) 및 초고압(100 MPa)에서 처리하여 전체 진세노사이드 함량을 비교하였다.
그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이 100 MPa의 초고압으로 처리한 4년근 금산 인삼이 가장 높은 전체 진세노사이드 함량을 갖는 것으로 나타났고, HPLC 분석 결과 4년근 금산 인삼이 가장 높은 메이저 진세노사이드(major ginsenoside) 함량을 나타냈다.
(3) 용매에 대한 인삼 농도의 변화에 따른 진세노사이드 추출 결과.
고함량의 진세노사이드 추출을 위한 용매에 혼합되는 인삼 슬러리의 농도를 알아보기 위해, 상기 실시예의 방법으로 증류수 100 중량부에 대하여 인삼 뿌리 2, 5, 10, 15, 20 및 25 중량부를 각각 혼합하고 100 MPa로 초고압 처리하여 인삼 추출물을 제조하였다.
그 결과, 도 4에서 보는 바와 같이 증류수 100 중량부에 대하여 20 중량부의 인삼을 첨가하였을 때 추출되는 전체 진세노사이드 함량이 가장 높은 것으로 나타났다.
(4) 다양한 효소의 조합에 따른 진세노사이드 추출 결과.
상기 실시예의 방법으로 다양한 효소의 조합에 따른 상압(0.1 MPa) 및 초고압(100 MPa)에서 추출된 전체 진세노사이드 함량을 도 5에 나타내었다.
그 결과, 펙티나아제 및 셀룰라아제 또는 펙티나아제, 셀룰라아제 및 셀로비아제를 첨가하였을 때 25 mg/g 이상의 높은 진세노사이드 함량을 갖는 것으로 나타났다.
(5) 현탁액의 pH에 따른 진세노사이드 추출 결과.
첨가된 세포벽 분해효소 반응을 위한 최적의 pH를 알아보기 위해, 상기 실시예에서 인삼 슬러리(인삼 뿌리)와 용매를 혼합하여 균질화한 현탁액의 pH를 변화(2 M의 시트르산으로 pH 4, 4.5, 4.8, 5로 조절, 2 M의 시트르산삼나트륨으로 pH 5.5, 6, 6.5, 7로 조절)시켜 12 시간 동안 45 ℃의 초고압(100 MPa)에서 추출된 진세노사이드의 수율을 비교한 결과, pH가 4.8일 때 진세노사이드의 수율이 가장 우수한 것으로 나타났다(도 6 참조).
(6) 압력 처리 온도에 따른 진세노사이드 추출 결과.
상기 실시예의 방법으로 인삼 추출물을 제조하되, 초고압 처리 온도를 25 내지 60 ℃에서 다양하게 변화시켜 초고압(100 MPa)에서 추출된 진세노사이드의 수율을 비교한 결과, 45 ℃에서 100 MPa로 처리할 경우 진세노사이드의 수율이 가장 우수한 것으로 나타났다(도 7 참조).
(7) 압력 처리 시간에 따른 진세노사이드 추출 결과.
상기 실시예의 방법으로 인삼 추출물을 제조하되, 상압(0.1 MPa) 및 초고압(100 MPa)에서 각각 12 시간, 24 시간 처리하여 제조된 추출물에 함유된 진세노사이드를 도 8에 나타내었다.
(8) 당 분해효소로 아밀라아제, 셀룰라아제 및 펙티나아제를 첨가한 결과.
상기 실시예의 방법으로 인삼 추출물을 제조하되, 효소로 아밀라아제(5 Unit/ml), 셀룰라아제(0.5 Unit/ml) 및 펙티나아제(2 Unit/ml)를 혼합하여 상압(0.1 MPa) 및 초고압(100 MPa)에서 추출할 경우, 도 9에서 보는 바와 같이 Rg1과 Rb1이 같은 비율로 추출되고 그 수율이 크게 증가하는 것을 알 수 있었다.
(9) 당 분해효소로 셀룰라아제, 펙티나아제 및 셀로비아제를 첨가한 결과.
상기 실시예의 방법으로 인삼 추출물을 제조하되, 효소로 셀룰라아제(2 Unit/ml), 펙티나아제(2 Unit/ml) 및 셀로비아제(2 Unit/ml)를 첨가하여 12, 18 및 24 시간 동안 각각 상압(0.1 MPa) 및 초고압(100 MPa)에서 추출하였다.
그 결과, Rd와 함께 Rg1, Re, Rc, Rb2 및 Rb1이 추출되었고, 도 10에서 보는 바와 같이 18 및 24 시간 동안 추출했을 때 Rd 함량이 크게 증가하였으며, 24 시간 동안 초고압(HHP-CPC)에서 추출했을 때 상압(AP-CPC)에서 추출했을 때보다 Rd 함량이 1.73 배 증가된 2.57±0.128 mg/g인 것으로 나타났다.
(10) 당 분해효소로 셀룰라아제, 아밀라아제 및 셀로비아제를 첨가한 결과.
상기 실시예의 방법으로 인삼 추출물을 제조하되, 효소로 셀룰라아제(2 Unit/ml), 아밀라아제(2 Unit/ml) 및 셀로비아제(2 Unit/ml)를 첨가하여 12, 18 및 24 시간 동안 각각 상압(0.1 MPa) 및 초고압(100 MPa)에서 추출하였다.
그 결과, Rh1 및 화합물 k와 함께 Rg1, Re, Rc, Rb2 및 Rb1이 추출되었고, 24 시간 동안 초고압(HHP-CAC)에서 추출했을 때 가장 높은 마이너 진세노사이드 Rh1 및 화합물 k 함량을 나타내었다. 본 발명에 따른 인삼 추출물의 제조방법에 따르면, 효소로 셀룰라아제, 아밀라아제 및 셀로비아제를 첨가하여 초고압으로 처리할 경우 메이저 진세노사이드의 추출과 함께 메이저 진세노사이드를 마이너 진세노사이드로 전환시켜 Rh1 및 화합물 k를 추출할 수 있는 효과가 있다(표 3 참조). 하기 표 3은 24 시간 동안 상압(0.1 MPa) 및 초고압(100 MPa)에서 추출한 결과를 나타낸다.
(11) 당 분해효소의 불활성화에 따른 진세노사이드 추출 결과.
상기 실시예에서 100 MPa의 초고압 처리 후 효소를 불활성화하는 온도 및 시간을 80 ℃에서 30 분간, 100 ℃에서 30 분간, 121 ℃에서 15 분간으로 처리하여 각각의 인삼 추출물을 제조하였다.
그 결과, 추출물을 80 ℃에서 30 분간 처리하였을 때 효소를 불활성화하는 동안 발생하는 진세노사이드의 농도 변화 없이 진세노사이드를 추출할 수 있었다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
Claims (9)
- (1) 인삼속(Panax species) 식물의 뿌리, 줄기, 잎 및 열매를 포함하는 군에서 선택되는 1 이상의 원료 10 내지 25 중량부;와 물 및 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올을 포함하는 군에서 선택되는 1 이상의 용매 100 중량부;가 혼합되어 있는 현탁액을 제조하는 단계;
(2) 상기 (1)단계에서 제조한 현탁액을 당 분해효소와 혼합하여 혼합액을 제조하되, 당 분해효소는 셀룰라아제(cellulase) 및 펙티나아제(pectinase)의 혼합효소이고, 생리학적으로 허용되는 산을 첨가하여 pH를 4.5 내지 4.8로 조절하고, 당 분해효소는 현탁액 100 부피부에 대하여 1 내지 5 부피비로 혼합하는 단계;
(3) 상기 (2)단계에서 제조한 혼합액을 37 내지 55 ℃에서 0.1 내지 100 MPa로 처리하여 진세노사이드가 함유된 추출물을 제조하는 단계; 및
(4) 상기 (3)단계에서 제조한 추출물에서 당 분해효소를 불활성화시키고 동결건조하여 농축시키는 단계;를 포함하는 인삼 추출물의 제조방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 (2)단계의 당 분해효소는,
기존 셀룰라아제(cellulase) 및 펙티나아제(pectinase)에 셀로비아제(cellobiase)를 더 첨가한 것을 특징으로 하는 인삼 추출물의 제조방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 (2)단계의 당 분해효소는,
기존 셀룰라아제(cellulase) 및 펙티나아제(pectinase)에 비스코자임(viscozyme)을 더 첨가한 것을 특징으로 하는 인삼 추출물의 제조방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 (1)단계에서 인삼속 식물은,
고려인삼(Panax ginseng), 화기삼(Panax quinquefolium), 전칠삼(Panax notoginseng), 죽절삼(Panax japonicum), 삼엽삼(Panax trifolium), 히말라야삼(Panax pseudoginseng) 또는 베트남삼(Panax vietnamensis)인 것을 특징으로 하는 인삼 추출물의 제조방법.
- 제 1항에 있어서,
상기 생리학적으로 허용되는 산은,
염산, 황산 및 인산을 포함하는 무기산과 옥살산, 아세트산, 숙신산, 타르타르산, 아스코르브산, 시트르산, 글루탐산, 메타설폰산 및 에탄설폰산을 포함하는 유기산으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 인삼 추출물의 제조방법.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 추출된 인삼 추출물.
- 제 6항의 인삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품.
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