KR101655949B1 - 콜레스테롤 분석 장치 및 그 분석 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 일실시예에 따른 콜레스테롤 분석 장치는 레이저 광원부; 상기 레이저 광원부의 레이저 조사광이 입사되어 광경로 변환되는 광경로 변환부; 상기 광경로 변환부의 일측에 이격 구비되어, 상기 광경로 변환부로부터 도출된 레이저 조사광을 반사시켜 시료 거치대의 시료로 입사시키는 스캐너부; 상기 광경로 변환부의 타측에 이격 구비되어, 상기 시료로부터 상기 스캐너부와 광경로 변환부를 거쳐 도출되는 반사광으로부터 형광정보를 검출하는 검출부; 및 상기 검출부에 연결되어 상기 형광정보를 콜레스테롤 정보로 분석하는 제어부;를 포함한다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 콜레스테롤 분석 방법은 형광 이미지 픽셀을 이용하여 콜레스테롤의 단일결합 및 이중결합을 별도로 추출하여 실시간으로 모니터링 분석을 통해 더 세밀한 정량 분석을 수행할 수 있는 효과가 있다.

Description

콜레스테롤 분석 장치 및 그 분석 방법{APPARATUS FOR ANALYZING CHOLESTEROL AND ANALYSIS METHOD USING THE SAME}
본 발명은 콜레스테롤 분석 장치 및 그 분석 방법에 관한 것으로, 특히 형광수명정보를 이용하여 콜레스테롤을 분석하는 콜레스테롤 분석 장치 및 그 분석 방법에 관한 것이다.
관상동맥질환(Coronary artery disease)은 관상동맥의 좁아짐과 심장 근육 조직 주변에서 산소-부유 혈류가 제한되는 것에 의해 발생한다. 이때, HDL(high density lipoprotein) 콜레스테롤은 이러한 관상동맥질환의 주요 잠재성 지방 위험 인자로서, 관상심장병의 발생과 역상관성을 갖으며, 이어서 관상동맥질환의 위험성은 동맥경화와 강한 연관성을 갖는다.
구체적으로, 동맥경화는 동맥 내에서 플라크(plaque)가 축적되는 과정으로, 대식세포가 콜레스테롤로 가득 차게 되면 생성되는 대식세포-유래 거품 세포들에 의해 유발된다.
이러한 동맥경화가 동맥의 완전한 폐색으로 이어질 수 있는 상황이 되면 심장마비가 발생하며, 이러한 병리 과정은 LDL(low density lipoprotein)이 콜레스테롤을 동맥 벽에 침전시키는 것으로부터 개시된다.
대식세포는 리포단백질(lipoprotein)의 흡수를 통해 많은 양의 지질을 축적하기 때문에 죽상경화판의 파열, 불안정에 대해 중요한 역할을 한다. 혈관벽의 내막하층에 존재하는 대식세포에서 콜레스테롤이 없어지는 현상을 콜레스테롤 유출이라고 하는데, 이 콜레스테롤 유출 현상이 심혈관계 질환에 큰 영향을 미치기 때문에 아주 중요한 정보라고 할 수 있다.
이러한 콜레스테롤 유출은 LDL을 세포 외부로 반출하는 과정을 나타내므로, 콜레스테롤 유출을 확인하는 것은 보호 차원에서뿐만 아니라 질병의 조기 진단을 위해서도 중요하다.
그러나, HDL이 이러한 콜레스테롤 유출을 자극한다고 알려져 있지만 정확하게 어떤 경로로 얼마나 많은 양의 콜레스테롤을 유출하는지에 대해 정량적으로 분석한 사례가 없다.
또한, 콜레스테롤 유출을 측정하는 종래의 방법은 방사성 동위원소를 이용하여 유출량을 측정하는 것인데, 이 방법은 너무 복잡하고, 건강에 좋지 않은 방사선을 사용하는데다가 오랜 시간이 걸리는 등 측정에 있어서 많은 단점을 갖고 있다.
특허문헌 : 국내공개특허공보 제 2005-7010592 호
본 발명은 상기 문제점을 해소하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 형광수명정보를 이용하여 콜레스테롤을 분석하는 콜레스테롤 분석 장치를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 콜레스테롤 분석 장치를 통해 검출된 형광수명정보를 이용하여 콜레스테롤을 분석하는 콜레스테롤 분석 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 콜레스테롤 분석 장치는 레이저 광원부; 상기 레이저 광원부의 레이저 조사광이 입사되어 광경로 변환되는 광경로 변환부; 상기 광경로 변환부의 일측에 이격 구비되어, 상기 광경로 변환부로부터 도출된 레이저 조사광을 반사시켜 시료 거치대의 시료로 입사시키는 스캐너부; 상기 광경로 변환부의 타측에 이격 구비되어, 상기 시료로부터 상기 스캐너부와 광경로 변환부를 거쳐 도출되는 반사광으로부터 형광정보를 검출하는 검출부; 및 상기 검출부에 연결되어 상기 형광정보를 콜레스테롤 정보로 분석하는 제어부;를 포함한다.
본 발명의 일실시예에 따른 콜레스테롤 분석 장치에서 상기 레이저 광원부는 레이저 광원, 상기 레이저 광원의 광축을 따라 순차적으로 배치된 제 1 콜리메이트(collimator) 및 제 1 필터를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 따른 콜레스테롤 분석 장치에서 상기 제 1 필터는 SPF(Short Pass Filter)를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 따른 콜레스테롤 분석 장치에서 상기 광경로 변환부는 다이크로익 필터(Dichroic filter)를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 따른 콜레스테롤 분석 장치에서 상기 스캐너부는 광축을 따라 상기 광경로 변환부로부터 도출된 상기 레이저 조사광을 반사시키는 스캐너, 스캔 렌즈 및 튜브 렌즈를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 따른 콜레스테롤 분석 장치에서 상기 검출부는 상기 반사광으로부터 상기 형광정보를 필터링하는 제 2 필터; 광축을 따라 상기 제 2 필터에 인접한 제 2 콜리메이트; 상기 형광정보를 전기 신호로 전이하는 PMT(photo-multiplier tube); 상기 PMT로부터 받은 전기신호를 상기 형광정보로 복원하기 위한 GLPF(Gaussian Lowpass Filter filter); 상기 GLPF로부터 받은 형광정보를 증폭하는 증폭기; 및 상기 증폭기에서 처리된 형광정보를 디지털화하는 디지타이저(Digitizer);를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 콜레스테롤 분석 방법은 (A) 제어부가 시료 거치대의 시료에 레이저 광원부의 여기광을 조사(照射)하는 단계; (B) 상기 제어부가 검출부를 통해 상기 시료로부터 발생하는 형광정보를 수집하는 단계; 및 (C) 상기 제어부가 상기 형광정보를 이용하여 상기 시료의 콜레스테롤 정보를 분석하는 단계;를 포함한다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 콜레스테롤 분석 방법에서 상기 (A) 단계는 상기 여기광을 광경로 변환부와 스캐너부를 거쳐 상기 시료에 조사하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 콜레스테롤 분석 방법은 상기 (B) 단계에서 상기 형광정보로서 형광 광자에 관한 형광 이미지를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 콜레스테롤 분석 방법에서 상기 (C) 단계는 (C-1) 상기 시료로부터 발생하는 형광 광자의 형광수명을 연산하는 단계; (C-2) 상기 시료의 콜레스테롤 결합형태를 분석하는 단계; 및 (C-3) 상기 시료의 콜레스테롤 유출을 정량분석하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 콜레스테롤 분석 방법은 상기 (C-2) 단계에서 상기 콜레스테롤 결합형태로서 콜레스테롤 단일 결합 및 콜레스테롤 이중 결합을 포함하고, 상기 콜레스테롤 이중 결합의 형광 수명은 상기 콜레스테롤 단일 결합의 형광 수명의 2배인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 콜레스테롤 분석 방법에서 상기 콜레스테롤 단일 결합의 형광 수명은 1.9 ~ 2.1 ns의 편차범위를 갖고, 상기 콜레스테롤 이중 결합의 형광 수명은 3.8 ~ 4.2 ns의 편차범위를 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 콜레스테롤 분석 방법은 상기 (C-3) 단계에서 상기 시료의 콜레스테롤 유출로서 상기 시료로부터 발생하는 형광 광자의 형광 이미지 픽셀 개수를 이용하여 정량분석하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 특징 및 이점들은 첨부도면에 의거한 다음의 상세한 설명으로 더욱 명백해질 것이다.
이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이고, 사전적인 의미로 해석되어서는 아니 되며, 발명자가 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합되는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
본 발명의 일실시예에 따른 콜레스테롤 분석 장치는 시료의 콜레스테롤에 결합한 형광물질에 대한 형광 수명을 검출할 수 있고, 이러한 형광 수명 검출 결과를 이용하여 시료의 콜레스테롤 정보를 용이하게 검출 분석할 수 있는 효과가 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 콜레스테롤 분석 방법은 인체에 무해한 시료를 사용하여 안전하며, 속도에 있어서 매우 용이하다는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 다른 실시예에 따른 콜레스테롤 분석 방법은 형광 이미지 픽셀을 이용하여 콜레스테롤의 단일결합 및 이중결합을 별도로 추출하여 실시간으로 모니터링 분석을 통해 더 세밀한 정량 분석을 수행할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 콜레스테롤 분석 장치의 구성도.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 콜레스테롤 분석 방법을 설명하기 위한 순서도.
도 3은 본 발명이 적용되는 콜레스테롤의 작용을 나타낸 예시도.
도 4는 본 발명의 다른 실시예에 따른 콜레스테롤 분석 방법을 설명하기 위한 예시도.
도 5a는 본 발명의 다른 실시예에 따른 콜레스테롤 분석 방법에 따라 검출된 평균 형광수명의 그래프.
도 5b는 본 발명의 다른 실시예에 따른 콜레스테롤 분석 방법에 따라 검출된 콜레스테롤 단일결합 및 콜레스테롤 이중결합의 픽셀수에 관한 그래프.
도 6은 종래의 콜레스테롤 분석 방법에 관한 비교예와 본 발명의 다른 실시예에 따른 콜레스테롤 분석 방법에 관한 실시예 각각의 결과 그래프.
도 7은 도 6의 결과 그래프를 콜레스테롤 유출비율로 도시한 막대 그래프.
본 발명의 목적, 특정한 장점들 및 신규한 특징들은 첨부된 도면들과 연관되는 이하의 상세한 설명과 바람직한 실시예로부터 더욱 명백해질 것이다. 본 명세서에서 각 도면의 구성요소들에 참조번호를 부가함에 있어서, 동일한 구성 요소들에 한해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 번호를 가지도록 하고 있음에 유의하여야 한다. 또한, 제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 콜레스테롤 분석 장치의 구성도이다.
본 발명의 일실시예에 따른 콜레스테롤 분석 장치(100)는 레이저 광원부(110), 레이저 광원부(110)의 조사광이 입사되어 광경로 변환되는 광경로 변환부(120), 광경로 변환부(120)로부터 도출된 레이저 조사광을 반사시켜 시료 거치대(140)의 시료로 입사시키는 스캐너부(130), 시료로부터 스캐너부(130)와 광경로 변환부(120)를 거쳐 도출되는 광으로부터 형광수명정보를 검출하는 검출부(150) 및 검출부(150)에 연결되어 형광수명정보를 콜레스테롤 정보로 분석하는 제어부(160)를 포함한다.
레이저 광원부(110)는 레이저 광원(111), 레이저 광원(111)의 광축을 따라 순차적으로 배치된 제 1 콜리메이트(collimator: 112) 및 제 1 필터(113)를 포함할 수 있다.
구체적으로, 레이저 광원(111)은 시간에 대한 펄스 형태를 갖는 레이저 광원(Laser source)으로, 레이저 광원(111)의 레이저광은 싱글모드 광섬유(single mode fiber: 도시하지 않음), 제 1 콜리메이트(112) 및 제 1 필터(113)를 거쳐서 광경로 변환부(120)로 입사될 수 있다. 여기서, 제 1 필터(113)는 제 1 콜리메이트(112)를 거친 레이저광에 대해 설정된 단파장의 조사광 만을 통과시키는 SPF(Short Pass Filter)를 포함할 수 있다.
광경로 변환부(120)는 예컨대 다이크로익 필터(Dichroic filter)를 포함할 수 있다. 여기서, 다이크로익 필터는 입사된 광원을 파장에 따라 선택적으로 통과시키는 광 필터로서, 레이저 광원부(110)으로부터 입사되는 레이저광에 해당하는 파장 대역은 반사시키고 시료 거치대(140)의 시료로부터 스캐너부(130)를 거쳐 입사되는 형광 광자에 해당하는 파장 대역은 통과시키는 특성이 있다.
스캐너부(130)는 광경로 변환부(120)로부터 도출된 레이저 조사광을 반사시키는 스캐너(131), 스캔 렌즈(132) 및 튜브 렌즈(133)를 통해 시료 거치대(140)의 시료로 입사시킬 수 있다. 이때, 스캐너부(130)는 예컨대 공초점 레이저 현미경(confocal laser microscopy)의 원리에 따라 레이저 조사광의 경로를 변경하며 시료에 입사시켜 제어부(160)에서 2차원 이미지를 획득하게 할 수 있다. 이렇게 시료에 입사된 레이저 조사광은 시료로부터 형광 광자를 포함한 형광정보를 생성하고, 생성된 형광정보는 다시 튜브 렌즈(133), 스캔 렌즈(132) 및 스캐너(131)를 거쳐 광경로 변환부(120)로 입사된다.
검출부(150)는 광경로 변환부(120)를 거쳐 도출되는 형광 광자를 포함한 형광정보를 필터링하는 제 2 필터(151), 제 2 콜리메이트(152), 형광정보를 전기 신호로 전이하는 PMT(photo-multiplier tube: 153), PMT(153)로부터 받은 전기신호를 형광정보로 복원하기 위한 GLPF(Gaussian Lowpass Filter filter: 154), GLPF(154)로부터 받은 형광정보를 증폭하는 증폭기(155) 및 증폭기(155)에서 처리된 형광정보를 디지털화하는 디지타이저(Digitizer: 156)를 포함할 수 있다.
여기서, 제 2 필터(151)는 장파장의 광을 통과시키는 LPF(Long Pass Filter)를 포함할 수 있고, 형광정보의 형광 광자만 선별할 수 있도록 필터링 한다. 예를 들어, 제 2 필터(151)는 490nm 컷 오프(cut off) 작용으로 불필요한 광을 차단할 수 있다.
이때, PMT(153)에서 전기신호로 전이된 형광정보는 복원을 위해 2 GS/s 이상의 높은 샘플링 주파수를 요구하지만, 이 경우 데이터를 저장할 수 있는 메모리의 한계가 있고, 또한 방대한 데이터 양에 의해 많은 데이터 처리 시간을 요구하게 된다. 따라서, 이러한 문제점을 해결하기 위해, PMT(153)와 증폭기(155) 사이에 제 3 필터로서 GLPF(154)를 구비할 수 있고, GLPF(154)는 PMT(153)로부터의 전기적 펄스 신호를 시간적으로 증폭하여 형광정보로 복원한다.
디지타이저(156)는 형광 광자를 포함한 형광정보를 아날로그 형태에서 디지털 형태로 변환시키는 고주파수 샘플링이 가능한 고성능의 디지타이저이다.
제어부(160)는 이러한 디지타이저(156)에 연결되어 전달받은 형광정보를 통해 시료에 함유된 형광물질 각각에 대한 형광수명을 정확하게 연산하며, 형광 이미지 정보와 함께 형광수명 결과를 이용하여 시료의 콜레스테롤 유출 정도, 콜레스테롤 결합 형태 등과 같은 콜레스테롤 정보를 검출 분석할 수 있다.
이와 같이 구성된 본 발명의 일실시예에 따른 콜레스테롤 분석 장치(100)는 시료의 콜레스테롤에 결합한 형광물질에 대한 형광 수명을 검출할 수 있고, 이러한 형광 수명 검출 결과를 이용하여 시료의 콜레스테롤 정보를 용이하게 검출 분석할 수 있다.
이하, 본 발명의 다른 실시예에 따른 콜레스테롤 분석 방법에 대해 도 2 내지 도 7을 참조하여 설명한다. 도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 콜레스테롤 분석 방법을 설명하기 위한 순서도이고, 도 3은 본 발명이 적용되는 콜레스테롤의 작용을 나타낸 예시도이며, 도 4는 본 발명의 다른 실시예에 따른 콜레스테롤 분석 방법을 설명하기 위한 예시도이며, 도 5a는 본 발명의 다른 실시예에 따른 콜레스테롤 분석 방법에 따라 검출된 평균 형광수명의 그래프이며, 도 5b는 본 발명의 다른 실시예에 따른 콜레스테롤 분석 방법에 따라 검출된 콜레스테롤 단일결합 및 콜레스테롤 이중결합의 픽셀수에 관한 그래프이며, 도 6은 종래의 콜레스테롤 분석 방법에 관한 비교예와 본 발명의 다른 실시예에 따른 콜레스테롤 분석 방법에 관한 실시예 각각의 결과 그래프이며, 도 7은 도 6의 결과 그래프를 콜레스테롤 유출비율로 도시한 막대 그래프이다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 콜레스테롤 분석 방법은 먼저 본 발명의 일실시예에 따른 콜레스테롤 분석 장치(100)를 시동하여, 시료 거치대(140)의 시료에 레이저 광원(111)의 여기광을 조사(照射)한다(S210).
구체적으로, 레이저 광원(111)의 여기광을 제 1 콜리메이트(112) 및 SPF(Short Pass Filter)의 제 1 필터(113)를 거쳐서 광경로 변환부(120)로 입사시키고, 광경로 변환부(120)에서 반사된 여기광을 스캐너부(130)를 통해 시료 거치대(140)의 시료로 입사한다.
여기서, 본 발명의 콜레스테롤 분석을 구체적으로 설명하기 위해 시료는 HDL을 넣어준 실시예의 시료와 HDL를 넣지 않은 비교예의 시료를 준비하고, 콜레스테롤 유출 및 콜레스테롤 결합 형태를 분석한다.
먼저, 콜레스테롤 유출은 도 3에 도시된 바와 같이 LDL 및 HDL 농도와 강한 연관성을 갖는데, 특히 HDL은 전반적인 콜레스테롤 유출 현상에서 중요한 역할을 담당한다. 첫째로, HDL은 콜레스테롤 역수송과 관련이 있으며, 둘째로, HDL은 염증을 조절하고, 셋째로, HDL은 심혈관 현상과 역상관성을 갖는다.
이때, ABCD1 및 ABCG1이 콜레스테롤 유출 메카니즘을 HDL과 연결하는 가장 효과적인 수송 단백질들로서, HDL은 콜레스테롤 수용체와 함께 수송 단백질들을 보조하여 콜레스테롤 유출을 더욱 증진시킨다. 정상적인 HDL 단백질들은 Apo A-I 및 Apo A-II로 구성되며, Apo B를 갖지 않는다. HDL과는 대조적으로, LDL은 Apo B로 구성되며, Apo A를 갖지 않는다. Apo A-I은 ATP-결합 카세트(ABC) 수송물질 ABCA1에 의해서 HDL과 분리될 수 있다. 이러한 지방에서 지방으로의 열악한 Apo A-I 수송은 새로운 HDL 입자들의 형성에 의해서 발생한다. 그러므로, HDL의 주된 기능은 ATP-결합 카세트 수송물질들인 ABCA1 및 ABCG1과 함께 콜레스테롤 유출 및 역-콜레스테롤 수송을 가속시키는 것이다.
따라서 HDL을 넣어준 시료에 관한 실시예 및 HDL을 넣지 않은 시료에 관한 비교예를 설정하여, 본 발명의 콜레스테롤 분석방법을 설명한다.
실시예
실시예의 시료는 J774 대식세포(ATCC(American Type Culture Collection)에서 제공함)를 사용하고, 형광체는 25-NBD-콜레스테롤을 사용한다.
J774 대식세포는 DMEM(Dulbecoo's modified Eagle's medium)에 10%의 FBS (Fetal Bovine Serum) 및 1%의 항생제(antibiotic)와 함께 넣고 37℃에서 5% CO2 분위기에서 8 챔버 슬라이드에서 1×104 cell/well 만큼 배양한다.
이후, DMEM을 제거한 후 10 μM/㎖의 25-NBD-콜레스테롤을 넣어서 세포를 염색하고, 다음날 PBS(Phosphate buffer saline)로 J774 대식세포를 두 번 씻어주며, 100 μM/㎖의 HDL을 넣어준 시료를 준비한다.
비교예
비교예의 시료는 실시예에서처럼 J774 대식세포를 8 챔버 슬라이드에서 1×104 cell/well 만큼 배양하고, 25-NBD-콜레스테롤을 사용하여 염색하며, PBS를 이용하여 두 번 씻어 준비한다.
이러한 비교예는 HDL을 시료에 넣어주지 않는다는 점에서 차이가 있다.
이렇게 준비한 실시예의 시료와 비교예의 시료에 대해 레이저 광원부(110)의 여기광을 조사함에 따라, 제어부(160)는 검출부(150)를 통해 각각의 시료로부터 발생하는 형광정보를 수집한다(S220).
즉, 시료의 25-NBD-콜레스테롤에서 생성된 형광 광자를 포함한 형광신호는 스캐너부(130), 광경로 변환부(120) 및 검출부(150)를 거쳐 제어부(160)로 전달된다. 이때, 제어부(160)는 검출부(150)를 통해 25-NBD-콜레스테롤에서 생성된 형광 광자를 포함한 형광 이미지를 동시에 수집한다.
이후, 제어부(160)는 수집된 형광정보에 대해 형광수명(τ)을 연산하면서, 콜레스테롤 유출, 콜레스테롤 결합 형태와 비율 등의 콜레스테롤 분석을 수행한다(S230).
형광수명 연산
형광수명(τ)은 형광물질이 에너지를 받아 기저상태(ground state)에서 여기상태(excited state)로 여기되고 다시 기저상태로 떨어지면서 광을 방출시킬 때, 여기상태에 머무르는 시간으로 정의한다.
이러한 형광수명(τ)은 아래의 [수학식 1]에 기재된 바와 같이 형광 신호의 평균 지연에 대해 시료가 없는 장치 응답의 평균지연을 감산하여 추출할 수 있다.
Figure 112015002226518-pat00001
여기서, ie(t)는 형광물질에 대해 측정된 시간적 형광 신호이고, iirf(t)는 콜레스테롤 분석 장치(100)의 레이저 광원부(110)에 대한 임펄스 응답 함수(impulse response function: IRF)이다. < Te >와 < Te 0>는 각각 형광 신호 및 IRF의 평균 지연으로 정의된다.
콜레스테롤 분석 장치(100)의 IRF는 시료 거치대(140)에 시료를 구비하지 않고 검출된 형광광자 없이 레이저 광원부(110)의 레이저 광원 펄스를 측정하여 검출할 수 있다.
이러한 형광수명 연산에 따라, 도 5a에 도시된 바와 같이 제어부(160)는 실시예의 시료에 대해 예를 50분 동안 레이저 광을 조사하면서 4분 마다 평균 형광수명(τ)을 검출할 수 있다.
콜레스테롤 결합 형태와 비율 분석
도 4에 도시된 바와 같이, 인지질에 25-NBD-콜레스테롤이 단일 결합(Ⅰ)한 경우와 이중 결합(Ⅱ)한 경우에 각각 에너지 준위(Energy state)가 변하므로 방출되는 형광의 스펙트럼이 달라진다. 이에 따라, 시료의 평균형광수명 값은 단일 결합(Ⅰ)과 이중 결합(Ⅱ)의 평균값으로 볼 수 있다.
특히, 단일 결합(Ⅰ)한 경우의 형광 수명은 1.9 ~ 2.1 ns의 편차범위를 갖고, 이중 결합(Ⅱ)한 경우의 형광 수명은 단일 결합(Ⅰ)의 형광 수명에 대해 2배를 가져 3.8 ~ 4.2 ns의 편차범위를 갖는 특징이 있다.
이러한 특징을 이용하여, 제어부(160)는 수집된 형광정보 중 디지타이저(156)에서 검출된 형광 이미지에 대해 단일 결합(Ⅰ)의 형광 이미지와 이중 결합(Ⅱ)의 형광 이미지를 각각 픽셀 단위로 검출할 수 있다. 이렇게 검출된 단일 결합(Ⅰ)의 형광 이미지 픽셀 개수와 이중 결합(Ⅱ)의 형광 이미지 픽셀 개수를 도 5b에 도시된 바와 같이 시간별로 그래프로 분석 도시할 수 있다.
이때, 도 5b의 "A" 부분에서 단일 결합(Ⅰ)의 형광 이미지 픽셀 개수가 증가한 것을 알 수 있는데 이것은 단일 결합(Ⅰ)도 감소하지만 이중 결합(Ⅱ)에서 단일 결합(Ⅰ)으로 감소하는 수가 상당히 많기 때문에 오히려 단일 결합(Ⅰ)이 증가하는 것처럼 보인다.
이러한 형광 이미지 픽셀을 이용한 과정을 통해 콜레스테롤의 단일 결합(Ⅰ)과 이중 결합(Ⅱ)을 분석하고 각각의 개수와 비율을 확인할 수 있다.
콜레스테롤 유출 분석
종래에 콜레스테롤 유출의 분석은 아래의 [수학식 2]에서처럼 콜레스테롤에 방사성동위원소인 삼중수소(3H)를 결합시킨 후 일정시간이 지난 후에 세포 내부에 방출되는 방사선량(Ii)과 세포 밖에서 나오는 방사선량(IO)을 각각 측정하여, 콜레스테롤 유출이 일어난 정도를 유출 효율로 나타낸다.
Figure 112015002226518-pat00002
반면에, 본 발명의 다른 실시예에 따른 콜레스테롤 유출의 정량 분석은 아래의 [수학식 3]에 기재된 바와 같이 디지타이저(156)에서 검출된 형광 이미지 픽셀 개수를 사용하여, 초기의 형광 이미지 픽셀 개수(Pi)와 최종 형광 이미지 픽셀 개수(Pf)를 사용한다. 이때 총 픽셀 개수는 단일 결합(Ⅰ)과 이중 결합(Ⅱ)의 각 픽셀 수를 합한 값을 사용한다.
Figure 112015002226518-pat00003
이러한 [수학식 2] 및 [수학식 3] 각각의 연산식을 이용하여, HDL을 넣어준 실시예의 시료와 HDL을 넣지 않은 비교예의 시료 각각에 대한 콜레스테롤 유출 비율(%)과 편차를 측정하면 아래의 [표 1]에서처럼 나타낼 수 있고, 이와 동시에 도 6에 도시된 바와 같이 시간별로 형광 이미지의 총 픽셀 개수의 변동을 측정할 수 있다. 이때, 1~7번은 [수학식 3]을 이용한 결과이고, 8~10은 [수학식 2]를 이용한 결과이다.
측정횟수 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
비교예 80.6 88 80.9 89.5 84.6 80.9 77.3 11.3 8.3 5.3
실시예 88.6 96.2 91.5 95.6 94.9 94 87.2 23.1 15.2 12.7
편차 8 8.2 10.6 6.1 10.3 13.1 9.9 11.8 6.9 7.4
이러한 [표 1]의 결과를 분석하면, [수학식 2]의 방사성 동위원소를 이용한 종래의 콜레스테롤 유출 분석결과 및 [수학식 3]의 형광 이미지 픽셀을 이용한 본 발명의 콜레스테롤 유출 분석결과는 도 7에 도시될 수 있다.
구체적으로, 도 7에서 [수학식 3]의 형광 이미지 픽셀을 이용한 본 발명의 콜레스테롤 유출 분석결과는 (a)에 막대 그래프로 도시되고, [수학식 2]의 방사성 동위원소를 이용한 종래의 콜레스테롤 유출 분석결과는 (b)에 막대 그래프로 도시될 수 있다.
이러한 도 7의 그래프를 통해, 방사성 동위원소를 이용한 종래의 콜레스테롤 유출 분석과 형광 이미지 픽셀을 이용한 본 발명의 콜레스테롤 유출 분석은 서로 유사한 결과를 갖는 것을 확인할 수 있고, 특히 HDL를 첨가한 경우에 콜레스테롤 유출이 발생하며 그 편차 결과가 서로 동일하게 분석된다는 점을 확인할 수 있다.
이러한 분석 결과를 통해, 형광 이미지 픽셀을 이용한 본 발명의 콜레스테롤 유출 분석은 방사성 동위원소를 이용한 종래의 콜레스테롤 유출 분석에 비해 정확도가 떨어지지 않으며, 인체에 무해한 시료를 사용하여 안전하며, 속도에 있어서 매우 용이하다는 장점이 있다.
또한, 형광 이미지 픽셀을 이용한 본 발명의 콜레스테롤 유출 분석은 콜레스테롤의 단일결합 및 이중결합을 별도로 추출하여 실시간으로 모니터링 분석도 가능하기 때문에 훨씬 더 세밀한 정량 분석을 수행할 수 있다는 장점이 있다.
본 발명의 기술사상은 상기 바람직한 실시예에 따라 구체적으로 기술되었으나, 전술한 실시예들은 그 설명을 위한 것이며, 그 제한을 위한 것이 아님을 주의하여야 한다.
또한, 본 발명의 기술분야의 통상의 전문가라면 본 발명의 기술사상의 범위 내에서 다양한 실시가 가능함을 이해할 수 있을 것이다.
100: 콜레스테롤 분석 장치 110: 레이저 광원부
111: 레이저 광원 112: 제 1 콜리메이트
113: 제 1 필터 120: 광경로 변환부
130: 스캐너부 131: 스캐너
132: 스캔 렌즈 133: 튜브 렌즈
140: 시료 거치대 150: 검출부
151: 제 2 필터 152: 제 2 콜리메이트
153: PMT 154: GLPF
155: 증폭기 156: 디지타이저
160: 제어부

Claims (13)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. (A) 제어부가 시료 거치대의 시료에 레이저 광원부의 여기광을 조사(照射)하는 단계;
    (B) 상기 제어부가 검출부를 통해 상기 시료로부터 발생하는 형광정보를 수집하는 단계; 및
    (C) 상기 제어부가 상기 형광정보를 이용하여 상기 시료의 콜레스테롤 정보를 분석하는 단계;
    를 포함하고,
    상기 (C) 단계는
    (C-1) 상기 시료로부터 발생하는 형광 광자의 형광수명을 연산하는 단계;
    (C-2) 상기 시료의 콜레스테롤 결합형태를 분석하는 단계; 및
    (C-3) 상기 시료의 콜레스테롤 유출을 정량분석하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 콜레스테롤 분석 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 (A) 단계는 상기 여기광을 광경로 변환부와 스캐너부를 거쳐 상기 시료에 조사하는 것을 특징으로 하는 콜레스테롤 분석 방법.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 (B) 단계에서 상기 형광정보는 형광 광자에 관한 형광 이미지를 포함하는 것을 특징으로 하는 콜레스테롤 분석 방법.
  10. 삭제
  11. 제 7 항에 있어서,
    상기 (C-2) 단계에서 상기 콜레스테롤 결합형태는 콜레스테롤 단일 결합 및 콜레스테롤 이중 결합을 포함하고,
    상기 콜레스테롤 이중 결합의 형광 수명은 상기 콜레스테롤 단일 결합의 형광 수명의 2배인 것을 특징으로 하는 콜레스테롤 분석 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 콜레스테롤 단일 결합의 형광 수명은 1.9 ~ 2.1 ns의 편차범위를 갖고, 상기 콜레스테롤 이중 결합의 형광 수명은 3.8 ~ 4.2 ns의 편차범위를 갖는 것을 특징으로 하는 콜레스테롤 분석 방법.
  13. 제 7 항에 있어서,
    상기 (C-3) 단계에서 상기 시료의 콜레스테롤 유출은 상기 시료로부터 발생하는 형광 광자의 형광 이미지 픽셀 개수를 이용하여 정량분석하는 것을 특징으로 하는 콜레스테롤 분석 방법.
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