KR101641597B1 - 신규한 세포 이동 조절 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 세포 이동 조절 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포 이동 조절 유전자의 스크리닝 방법을 통해 동정된 신규한 세포 이동 촉진 유전자인 Arid4a 유전자는 넉다운 될 경우 세포 이동을 억제하는 효과를 가지고 있다. 따라서 상기 Arid4a 유전자 또는 이의 억제제는 조직 재생, 상처 치료, 항암, 암 전이 등 세포 이동과 관련된 다양한 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규한 세포 이동 조절 유전자 및 이의 용도 {Novel cell migration-regulating gene and usage thereof}

본 발명은 신규한 세포 이동 조절 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

세포 이동은 배아 발달, 상처 회복, 염증 반응 및 종양 전이에 필수적인 과정이다. 세포 이동은 이동 방향으로 연장된 돌출부의 형성을 포함하며, 액틴 세포골격 및 포컬 부착 (focal adhesion)에 의해 유도되는 복잡하고 매우 조화된 과정이다. 또한, 세포 이동은 많은 유전자에 의해 매개되는 복잡한 조절 메커니즘의 제어 하에 있을 것으로 여겨지고 있다.

한편, siRNA는 이중 가닥의 RNA가 dicer에 의해 절단되어 생성되는 수십 nt 크기의 작은 RNA 조각으로 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 단백질 발현을 억제한다. 이와 같이 외부의 이중 가닥의 RNA를 숙주세포에 주입하였을 때 세포 내부의 mRNA와 서열 특이적으로 결합해 유전자 침묵을 유도하는 현상을 RNA 간섭(RNA i)라고 부른다. 유전체학, 단백질체학 등을 비롯해 유전자들의 발현 패턴을 대량으로 분석할 수 있는 다양한 기술이 개발되었으며, 최근에는 벡터 시스템을 이용하여 특정 유전자의 발현을 안정적으로 억제할 수 있는 shRNA를 이용하여 유전자의 기능을 스크리닝하는 방법에 대한 연구가 계속되고 있다.

이에 본 발명자들은 세포 이동 과정을 조절하는 신규 유전자를 동정하기 위해, shRNA 라이브러리를 이용한 스크리닝을 수행하여, 신규한 세포 이동 촉진 유전자인 Arid4a 유전자를 동정하고, 상기 유전자를 넉다운 시켰을 때 세포 이동이 억제됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신규한 세포 이동 조절 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 세포 이동 조절 유전자의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Arid4a의 단백질, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포 이동 촉진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 Arid4a의 단백질, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조직 재생 또는 상처 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 Arid4a의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 항암 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) shRNA 라이브러리로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 형질감염된 세포를 트랜스웰 배양 인서트(transwell culture insert)의 상부 표면에 접종하고 배양하는 단계; (c) 멤브레인을 통해 트랜스웰 배양 인서트의 하부 표면으로 이동한 세포 및 상부 표면에 남아있는 세포를 각각 분리하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 분리한 세포 내의 DNA를 분리하여 세포 내에 존재하는 shRNA를 동정하는 단계;를 포함하는 세포 이동 촉진 또는 억제 유전자의 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (a’) Arid4a 를 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하는 세포에 시료를 접촉시키는 단계; 및 (b’) 상기 세포 내에서 Arid4a의 발현량을 측정하여, 대조군에 비해 발현량이 증가하는 시료를 선별하는 단계;를 포함하는 세포 이동 촉진 활성을 갖는 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 세포 이동 조절 유전자의 스크리닝 방법을 통해 동정된 신규한 세포 이동 촉진 유전자인 Arid4a 유전자는 넉다운 될 경우 세포 이동을 억제하는 효과를 가지고 있다. 따라서 상기 Arid4a 유전자 또는 이의 억제제는 조직 재생, 상처 치료, 항암, 암 전이 등 세포 이동과 관련된 다양한 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 세포 이동 조절 유전자의 스크리닝 과정을 나타낸 도이다.
도 2는 세포 이동 조절 유전자의 스크리닝에서 이용된 렌티바이러스 벡터의 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 3은 NIH3T3 섬유아세포를 Arid4a 유전자의 siRNA로 트렌스펙션한 후, 상처 치료 어세이를 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 NIH3T3 섬유아세포를 Arid4a 유전자의 siRNA로 트렌스펙션한 후, RT-PCR을 통해 세포 내 유전자의 발현 정도를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5 및 도 6은 NIH3T3 섬유아세포를 Arid4a 유전자의 siRNA로 트렌스펙션한 후, 세포 이동 어세이를 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 L929 섬유아세포 및 MEF 를 Arid4a 유전자의 siRNA로 트렌스펙션한 후, 세포 이동 어세이를 수행한 결과를 나타낸 도이다.

이하 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 Arid4a(AT rich interactive domain 4A (RBP1-like))의 단백질, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포 이동 촉진용 조성물을 제공한다.

상기 Arid4a 의 단백질은 바람직하게는 인간 또는 마우스 유래 단백질로, 서열번호 1 (NCBI Accession No. NP_002883) 또는 2 (NCBI Accession No. AAI58110)로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다.

상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1또는 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. 또한, 본 발명의 단백질에는 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 단백질의 변이체란 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성 (Merrifleld, J. Amer. chem. Soc. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다 (Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).

상기 Arid4a 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3 또는 4로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있으며, 이의 변이체를 포함한다.

본 발명에서 세포는 당업계에 공지된 모든 종류의 세포를 포함하며, 예를 들어, 섬유아세포, 상피세포, 염증세포, 면역세포, 암세포, 줄기세포 등을 포함하고, 바람직하게는 섬유아세포이나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는 Arid4a 유전자가 넉다운 될 경우 상처 치료 및 세포 이동이 억제됨을 확인하였다.

따라서 본 발명은 Arid4a의 단백질, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조직 재생 또는 상처 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 Arid4a의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 항암 또는 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 발현 억제제는 Arid4a 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, shRNA(short hairpin RNA), siRNA(small interfering RNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상 일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

상기 활성 억제제는 Arid4a 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상 일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

상기 안티센스 뉴클레오티드는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍에 정의된 바에 따라, DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합(혼성화)하여 DNA에서 단백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것이다. 표적 서열에 특이성이 있는 안티센스 뉴클레오티드의 성질은 그것들을 예외적으로 다기능이 되도록 한다. 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 RNA 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다.

상기 siRNA는 Arid4a 유전자의 mRNA의 염기서열 내에서 선택되는 15 내지 30머(mer)의 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성되며, 이때, 상기 센스 서열은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 약 25개의 염기로 구성되는 것이 바람직하다.

상기 펩티드 모방체(Peptide mimetics)는 Arid4a 단백질의 결합 도메인을 억제하여 Arid4a 단백질의 활성을 억제하는 것이다. 펩티드 모방체는 펩티드 또는 비펩티드일 수 있고, psi 결합(Benkirane, N., et al. J.Biol. Chem., 271:33218-33224, 1996)과 같은, 비펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산으로 구성될 수 있다. 또한, "구조적으로 강제된(conformationally constrained)" 펩티드, 사이클릭 모방체(cyclic mimetics), 적어도 하나의 엑소사이클릭 도메인(exocyclic domain), 결합 부분(결합 아미노산) 및 활성 부위를 포함하는 사이클릭 모방체일 수 있다. 펩티드 모방체는 Arid4a 단백질의 이차구조 특성과 유사하게 구조화되고 항체(Park, B. W. et al. Nat Biotechnol 18, 194-198, 2000) 또는 수용성 수용체(Takasaki, W. et al. Nat Biotechnol 15, 1266-1270, 1997)와 같은 거대한 분자의 억제 특성을 모방할 수 있으며, 천연의 길항제와 동등한 효과로 작용할 수 있는 신규한 소분자일 수 있다(Wrighton, N. C. et al. Nat Biotechnol 15, 1261-1265, 1997).

상기 앱타머(aptamer)는 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서, SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고 뉴클레오티드 (oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득할 수 있다(C. Tuerand L. Gold, Science 249, 505 - 510, 2005; A. D. Ellington and J. W. Szostak, Nature 346, 818 - 822, 1990; M. Famulok, et. al., Acc. Chem. Res. 33, 591 - 599, 2000; D. S. Wilson and Szostak, Annu. Rev. Biochem. 68, 611 - 647, 1999). 앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정할 수 있는데, 예컨대, 결합을 통하여 표적의 기능을 차단할 수 있다.

상기 항체는 Arid4a 단백질에 특이적이고 직접적으로 결합하여 Arid4a의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다. 상기 Arid4a에 특이적으로 결합하는 항체로는 폴리클로날(polyclonal) 항체 또는 모노클로날(monoclonal) 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 항체는 당업자에게 알려진 공지의 방법으로 제작하여도 무방하며, 상업적으로 알려진 Arid4a 항체를 구입하여 사용할 수 있다. 상기 항체는 당업자에게 알려진 종래 방법에 따라 면역원인 Arid4a 단백질을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 랫트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근육 내, 복강 내 또는 피하 주사방법으로 주사되며, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여할 수 있으며, 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 형성된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하여 항체를 분리할 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 Arid4a의 억제제와 함께 Arid4a의 발현 또는 활성 억제 효과를 갖는 공지의 유효성분 또는 세포 이동 관련 질환의 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1 종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위하여 여러 가지 제제로 제형화될 수 있다. 본 발명에 포함될 수 있는 부형제는 비독성이고 불활성인 약제학적으로 적합한 고상, 준고상 또는 액상의 모든 유형의 제형 보조물로서, 예를 들면, 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 분산제, 계면활성제 또는 희석제 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 개체의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 투여기간 또는 간격, 배설율, 체질 특이성, 제제의 성질 등에 따라 그 범위가 다양하다.

또한, 본 발명은

(a) shRNA 라이브러리로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 형질감염된 세포를 트랜스웰 배양 인서트(transwell culture insert)의 상부 표면에 접종하고 배양하는 단계;

(c) 멤브레인을 통해 트랜스웰 배양 인서트의 하부 표면으로 이동한 세포 및 상부 표면에 남아있는 세포를 각각 분리하는 단계; 및

(d) 상기 (c) 단계에서 분리한 세포 내의 DNA를 분리하여 세포 내에 존재하는 shRNA를 동정하는 단계;를 포함하는 세포 이동 촉진 또는 억제 유전자의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 방법이 세포 이동 촉진 유전자의 스크리닝 방법일 경우, 상기 (b) 단계의 배양은 3 내지 10시간 수행되는 것이 바람직하다.

상기 방법이 세포 이동 억제 유전자의 스크리닝 방법일 경우, 상기 (b) 단계의 배양은 12 내지 48시간 수행되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은

(a’) Arid4a 를 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하는 세포에 시료를 접촉시키는 단계; 및

(b’) 상기 세포 내에서 Arid4a의 발현량을 측정하여, 대조군에 비해 발현량이 증가하는 시료를 선별하는 단계;를 포함하는 세포 이동 촉진 활성을 갖는 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. shRNA를 이용한 세포 이동 조절 유전자의 동정

먼저, NIH3T3 마우스 섬유아세포를 100 ml 세포 배양 플레이트에 1ⅹ10⁶ 세포/플레이트의 농도로 심은 후, 폴리브렌 (8 μg/ml)의 존재 하에서 1 MOI(multiplicity of infection)의 농도로 렌티바이러스(lentiviral) shRNA 라이브러리(63996 개)를 감염시켰다. 상기 NIH3T3 마우스 섬유아세포는 10% FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml의 스트렙토마이신을 포함하고 있는 DMEM 배지에서 유지하였다. 감염 2일 후, 상기 세포를 6일간 퓨로마이신 (10 ng/ml)을 이용하여 선별하고, 분리된 세포(약 4 x 10⁴세포/트렌스웰 배양 인서트/웰)를 24웰 플레이트의 트렌스웰 배양 인서트(transwell culture insert)(8 ㎛ 공극 멤브레인; Millipore, Billerica, MA)에 접종하고, 37℃에서 5시간 또는 24시간 동안 배양하였다. 이 때, 5시간의 배양 시점은 세포 이동을 증가시키는 유전자를 선별하기 위한 것이며, 24시간의 배양 시점은 세포 이동을 억제하는 유전자를 선별하기 위한 것으로, 본 발명자가 수차례의 실험을 통해 세포 이동 조절 유전자를 스크리닝하기 위한 적정 배양 시간으로 선택한 것이다. 트렌스웰의 상부 및 하부 챔버는 세포의 이동을 유도하기 위하여 각각 0% 또는 10% FBS를 포함하는 배지로 채워졌다. shRNA에 감염된 세포(약 3 x 10 ⁶개)를 나눈 후, 72 트렌스웰 배양 인서트에 위치시켰다. 트랜스웰 배양 인서트의 하부 또는 상부 표면에 각각 부착된, 이동 또는 이동하지 않은 세포를 트립신 처리를 통해 수집한 후, 트렌스웰 배양 인서트에 재접종하였다. 세포 증균을 위해 상기 과정을 5회 반복하고, 세포를 수집하였다.

수집된 세포 내에 삽입된 shRNA를 동정하기 위하여, 세포로부터 DNA를 분리한 후 이를 주형으로 PCR을 수행하였다. PCR 반응물(453 bp)을 정제하고, 서열을 분석하였으며, 22 내지 27 nt 길이의 염기서열은 shRNA의 반(half)-헤어핀을 의미하는 것이기 때문에, shRNA를 동정하는데 이용하였다. shRNA 부분을 증폭시키기 위해 PCR 에서 이용한 프라이머의 서열을 표 1에 나타내었다.

프라이머	염기서열 (5'-3')
정방향 프라이머 JH353F	TAGTGAAGCCACAGATGTA
역방향 프라이머 BC1R	CCTCCCCTACCCGGTAGA 14

이상의 세포 이동 조절 유전자의 스크리닝 과정을 도 1에 도식화하였으며, 렌티바이러스 shRNA 라이브러리로 이용된 렌티바이러스 벡터(pHAGE-mir30-RFP-shRNA vector)의 벡터맵을 도 2에 나타내었다.

실험 결과, 세포 이동을 조절하는 91개의 shRNA를 동정하였으며, 이 중 종래 공지된 세포 이동 조절 유전자를 제외하고, 신규한 세포 이동 조절 유전자인 Arid4a를 동정하였다. 동정된 Arid4a shRNA의 정보를 하기 표 2에 나타내었다.

실시예 2. 세포 이동 조절 유전자의 기능 검증

상기 실시예 1의 스크리닝 방법을 통해 동정된 세포 이동 조절 유전자인 Arid4a의 기능을 검증하기 위하여, siRNA를 매개로 한 넉다운 방법을 이용한 실험을 수행하였다. 이때 오프 타겟 효과를 피하기 위하여, Arid4a 유전자에 대한 5개의 siRNA를 합성하였으며, 구체적인 정보를 하기 표 3에 나타내었다.

2-1. 상처 치료 어세이(wound healing assay)

먼저, NIH3T3 섬유아세포에 세포 이동 조절 유전자인 Arid4a의 siRNA로 트렌스펙션하고 24시간 동안 배양하였다. 단일층으로 충분히 자란 세포에 10 μl 피펫 팁으로 스크래치를 만들었다. 그 후, 10% FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml의 스트렙토마이신을 포함하고 있는 DMEM 배지를 첨가한 후, 37℃에서 배양하였다. 상처 치료 정도는 현미경 (Olympus CK2; magnification, x 100) 하에서 단층에 형성된 상처의 너비를 측정하고 이 값을 초기 값으로부터 뺄셈하여 결정하였다. 다른 세포 증식의 효과를 배제하기 위하여 상처를 만들기 2시간 전 공지된 유사분열 억제제인 mitomycin-C(10 μg/ml)를 세포에 처리하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, Arid4a의 siRNA는 대조군에 비해 세포의 이동을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.

2-2. RT-PCR

상기 실시예 2-1의 NIH3T3 섬유아세포로부터 TRIzol 시약 (Invitrogen)을 이용하여 공지된 방법에 따라 총 RNA를 추출하였다. 역전사(Reverse transcription)는 Superscript II (Invitrogen) 및 올리고-dT 프라이머를 이용하여 수행하였다. PCR은 DNA Engine Tetrad Peltier Thermal Cycler (MJ Research, Waltham, MA)를 이용하여 수행하였으며, 55 내지 60℃의 어닐링 (annealing) 온도에서 20 내지 30 회 실시하였다. β-액틴은 내부 대조군으로 이용되었다. 그 결과를 도 4에 나타내었으며, PCR에 이용된 프라이머 서열을 하기 표 4에 나타내었다.

도 4 에 나타낸 바와 같이, Arid4a의 siRNA에 의해 세포 내 각 유전자의 발현이 억제되었으며, 이를 통해 siRNA를 이용한 넉다운이 정상적으로 이루어졌음을 확인하였다.

2-3. 세포 이동 어세이 (cell migration assay)

세포 이동은 트랜스웰 배양 인서트 (transwell culture insert) (8 ㎛ 공극 멤브레인; Millipore)를 이용하여 공지된 방법에 따라 측정하였다. 먼저, NIH3T3 섬유아세포를 세포 이동 조절 유전자인 Arid4a의 siRNA로 트렌스펙션하고 24시간 동안 배양하였다. 트립신을 이용하여 세포를 모은 후, DMEM 배지에 현탁하고, 다시 세포 (4 x 10⁴ 세포/웰)를 상부 챔버에 접종한 후, 9시간 동안 배양하였다. 트랜스웰 배양 인서트의 내부면에 존재하는 이동하지 않은 세포는 면봉으로 제거하였다. 트랜스웰 배양 인서트의 하부면으로 이동한 세포는 10분간 메탄올로 고정하고 Mayer's Hematoxylin (Dakocytomation.; Glostrup, Denmark)으로 20분간 염색하였다. 임의적으로 선택된 5개 필드에 대한 사진 (Olympus CK2; magnification, x 100)을 취하여 세포를 계수한 후 이동된 세포의 평균 개수를 계산하였다. 결과는 대조군에 대한 증감으로 나타내었다. 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.

도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, NIH3T3 섬유아세포에서 Arid4a의 siRNA에 의해 세포 이동이 억제됨을 확인하였다.

또한, 상기 과정을 통해 확인한 세포 이동조절 활성을 다른 세포에서도 재 확인하기 위하여, L929 마우스 섬유아세포 및 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast, MEF)를 이용하여 동일한 방법으로 세포 이동 어세이를 수행하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, L929 섬유아세포 및 MEF 에서 Arid4a의 siRNA에 의해 세포 이동이 억제되었으며, 이를 통해 Arid4a의 세포 이동 조절 효과는 세포의 종류에 관계없이 이루어지는 것임을 확인하였다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation KYUNGPOOK NATIONAL UNIVERSITY HOSPITAL <120> Novel cell migration-regulating gene and usage thereof <130> 234 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1257 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Lys Ala Ala Asp Glu Pro Ala Tyr Leu Thr Val Gly Thr Asp Val 1 5 10 15 Ser Ala Lys Tyr Arg Gly Ala Phe Cys Glu Ala Lys Ile Lys Thr Val 20 25 30 Lys Arg Leu Val Lys Val Lys Val Leu Leu Lys Gln Asp Asn Thr Thr 35 40 45 Gln Leu Val Gln Asp Asp Gln Val Lys Gly Pro Leu Arg Val Gly Ala 50 55 60 Ile Val Glu Thr Arg Thr Ser Asp Gly Ser Phe Gln Glu Ala Ile Ile 65 70 75 80 Ser Lys Leu Thr Asp Ala Ser Trp Tyr Thr Val Val Phe Asp Asp Gly 85 90 95 Asp Glu Arg Thr Leu Arg Arg Thr Ser Leu Cys Leu Lys Gly Glu Arg 100 105 110 His Phe Ala Glu Ser Glu Thr Leu Asp Gln Leu Pro Leu Thr Asn Pro 115 120 125 Glu His Phe Gly Thr Pro Val Ile Ala Lys Lys Thr Asn Arg Gly Arg 130 135 140 Arg Ser Ser Leu Pro Val Thr Glu Asp Glu Lys Glu Glu Glu 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Claims (13)

1. 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 Arid4a(AT rich interactive domain 4A (RBP1-like))의 단백질, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 섬유아세포 이동 촉진용 조성물.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 Arid4a의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3 또는 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
4. 삭제
5. 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 Arid4a의 단백질, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조직 재생 또는 상처 치료용 약학적 조성물.
   
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. (a') 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 Arid4a를 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하는 섬유아세포에 시료를 접촉시키는 단계; 및
    (b') 상기 섬유아세포 내에서 Arid4a의 발현량을 측정하여, 대조군에 비해 발현량이 증가하는 시료를 선별하는 단계;를 포함하는 섬유아세포 이동 촉진 활성을 갖는 후보물질의 스크리닝 방법.
    
    

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