KR101621963B1

KR101621963B1 - Aimp2의 엑손2 결손체 돌연변이 검출용 분자신호기 및 이를 이용한 aimp2 돌연변이의 검출방법

Info

Publication number: KR101621963B1
Application number: KR1020140026390A
Authority: KR
Inventors: 김학성; 조성민; 박근칠; 김영욱; 민정빈
Original assignee: 한국과학기술원; 사회복지법인 삼성생명공익재단
Priority date: 2014-03-06
Filing date: 2014-03-06
Publication date: 2016-05-17
Also published as: KR20150104719A

Abstract

본 발명은 AIMP2의 엑손2 결손체 돌연변이 검출용 분자신호기에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 AIMP2-DX2의 엑손1과 엑손3의 연결부위에 결합하는 핵산서열과 헤어핀 구조를 형성하는 서로 상보적인 양 말단 서열을 가지는 핵산서열을 포함하는 올리고 핵산의 일측 말단에 형광물질이 결합되어 있고, 타측 말단에는 형광소광제(Quencher)가 결합되어 있는 AIMP2-DX2 검출용 분자신호기 및 이를 이용한 AIMP2-DX2의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 세포의 암화(tumorigenesis) 여부 및 암의 예후 (prognosis)를 판단하는데 중요한 표시물로 여겨지고 있는 AIMP2의 exton 2 결실 돌연변이를 정확하고 신속하게 검출할 수 있어, 암의 조기진단 및 예후 예측에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

AIMP2의 엑손2 결손체 돌연변이 검출용 분자신호기 및 이를 이용한 AIMP2 돌연변이의 검출방법{Moelecular Beacon for Dectecting Mutant of exon2-deleted AIMP2 and Method for Detecting Mutant of exon2-deleted AIMP2 Using thereof}

본 발명은 AIMP2의 엑손2 결손체 돌연변이(이하, 'AIMP2-DX2'라 함) 검출용 분자신호기에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 AIMP2-DX2의 엑손1과 엑손3의 연결부위에 결합하는 핵산서열과 헤어핀 구조를 형성하는 서로 상보적인 양 말단 서열을 가지는 핵산서열을 포함하는 올리고 핵산의 일측 말단에 형광물질이 결합되어 있고, 타측 말단에는 형광소광제(Quencher)가 결합되어 있는 AIMP2-DX2 검출용 분자신호기 및 이를 이용한 AIMP2-DX2의 검출방법에 관한 것이다.

'아미노 아실 전령리보핵산 합성효소복합체-상호작용 다기능 단백질 2'(aminoacyltRNAsynthetase complex-interacting multifunctional protein 2, 이하 AIMP2)은 4개의 엑손(exon)으로 구성된 단백질로, 암을 억제하는 기능을 세포 내에서 수행하고 있다 (Kim et. al., Nature Reviews Cancer, 11:708, 2011).

세포가 종양괴사인자-알파 (tumor necrosis factor-a)를 인지하게 되면,세포 내에서는 '종양괴사인자 수용체 관여 인자 2(tumor necrosisfactor receptor associated factor, 이하 TRAF2)와 '세포자멸 저해 단백질2(cellular inhibitor of apoptosis protein 2, 이하 cIAP2)'가 결합하게 되고, 이 결합이 연쇄신호전달을 일으켜 비정상 세포 또는 암세포에 자멸 명령을 내리게 되는데,이때 AIMP2는 이 두 단백질의 결합을 매개하는 역할을 담당한다. 하지만 엑손2가 결손된 AIMP2 (이하, 'AIMP2-DX2')는 이 두 단백질의 결합을 매개하지 못하기 때문에 비정상 세포 혹은 암세포의 자멸 명령을 전달하는데 방해를 일으키게 되고, 이는 결과적으로 종양세포 사멸의 억제를 가져오게 된다 (Choi et. al., PLoS Genetics, 7:e1001351, 2011)

또한, 세포에는 p53이라는 단백질이 있어 세포의 상태를 점검하여 세포 주기를 진행시키거나, 비정상 세포의 복구 혹은 사멸 명령을 내리게 되는데, 이 단백질은 mouse double minute 2 (MDM2)에 의해 유비키틴화되어 분해됨으로써 세포 내 농도가 조절된다. AIMP2는 이 과정에서 p53을 MDM2로부터 보호하여 유비키틴화를 억제함으로써 세포 내에서 분해되는 것을 막는다. 하지만 AIMP2-DX2는 p53를 보호하는 기능을 상실한 돌연변이체이기 때문에 비정상 세포 혹은 암세포의 세포주기를 진행시키는 것을 막지 못하게 되고, 이는 결과적으로 암세포의 성장 및 분화를 막지 못하게 된다.

이와 같은 특성 때문에 AIMP2-DX2는 세포의 암화(tumorigenesis) 여부 및 암의 예후 (prognosis)를 판단하는데 중요한 표시물로 여겨지고 있다. 따라서 AIMP2-DX2의 존재 여부 및 그 양을 검출해내는 것은 암을 진단하는데 있어서 아주 유용한 길이다. 하지만 현재까지는 AIMP2-DX2를 빠르면서도 정확하게, 그리고 민감하게 검출 해낼 수 있는 기술이 개발되지 않고 있었다.

이에, 본 발명자들은 세포 내의 AIMP2-DX2를 정확하고 신속하게 검출하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, AIMP2-DX2의 엑손1과 엑손3의 연결부위에 결합하는 핵산서열과 헤어핀 구조를 형성하는 서로 상보적인 양 말단 서열을 가지는 핵산서열을 포함하는 올리고 핵산의 일측 말단에 형광물질이 결합되어 있고, 타측 말단에는 형광소광제(Quencher)가 결합되어 있는 AIMP2-DX2 검출용 분자신호기를 사용하는 경우, 리얼타임 PCR 또는 in situ 세포이미징 기법으로 정확하고 신속하게 AIMP2-DX2를 검출할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 AIMP2-DX2를 정확하고 신속하게 검출할 수 있는 분자신호기를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 분자신호기를 이용하여, 실시간 PCR 기법으로 AIMP2-DX2를 검출하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 분자신호기를 이용하여 in situ 세포이미징 기법으로 AIMP2-DX2를 검출하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 분자신호기와 나노전달체가 결합된 나노복합체 및 상기 나노복합체를 이용한 세포 내 AIMP2-DX2의 검출방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 AIMP2-DX2의 엑손1과 엑손3의 연결부위에 결합하는 핵산서열과 헤어핀 구조를 형성하는 서로 상보적인 양 말단 서열을 가지는 핵산서열을 포함하는 올리고 핵산의 일측 말단에 형광물질이 결합되어 있고, 타측 말단에는 형광소광제(Quencher)가 결합되어 있는 AIMP2-DX2 검출용 분자신호기를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 AIMP2-DX2 검출용 분자신호기와 샘플 DNA를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응(리얼타임-PCR)을 수행하는 것을 특징으로 하는 AIMP2-DX2의 검출방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 AIMP2-DX2 검출용 분자신호기와 환자 유래 세포 샘플을 이용하여, in situ 세포 이미징을 수행하는 것을 특징으로 하는 세포 내 AIMP2-DX2의 검출방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 AIMP2-DX2 검출용 분자신호기와 세포내 나노전달체가 결합된 나노복합체를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 나노복합체를 이용하는 것을 특징으로 하는 세포 내의 AIMP2-DX2의 검출방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 세포의 암화(tumorigenesis) 여부 및 암의 예후 (prognosis)를 판단하는데 중요한 표시물로 여겨지고 있는 AIMP2의 exton 2 결실 돌연변이를 정확하고 신속하게 검출할 수 있어, 암의 조기진단 및 예후 예측에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 AIMP2의 정상적은 형태(wild type)과 돌연변이 타입(mutant type)의 서열을 비교한 것으로, 정상 AIMP2는 exon 1, exon2 및 exon3 이 연속적으로 연결되어 있고(서열번호 2 및 서열번호 3), AIMP2-DX2는 exon2가 결손되어, exon 1과 exon 3이 연결된 서열(서열번호 4)을 가지는 것을 나타내었다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 사용한 AIMP2-DX2용 분자신호기의 올리고 핵산 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 AIMP2-DX2 검출용 분자신호기의 작동원리를 나타낸 것이다.
도 4는 실시간 중합효소 반응을 이용하여 AIMP2-DX2를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 in situ 세포 이미징법을 이용해 AIMP2-DX2를 세포수준에서 검출한 결과를 나타낸 것으로, A는 AIMP2-DX2가 존재하는 H460 세포주의 분자신호기 신호를 나타낸 것이고, B는 H460 세포주의 분자신호기 신호와 핵에서 발산하는 DAPI의 신호를 합한 것이다. C는 AIMP2-DX2가 극미량 존재하는 WI-26 세포주의 분자신호기 신호를 나타낸 것이고, D는 WI-26 세포주의 분자신호기 신호와 핵에서 발산하는 DAPI의 신호를 합한 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 나노전달체와 분자신호기가 결합된 나노복합체를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에서 제조된 엽산이 결합된 나노복합체가 암세포의 엽산 수용체를 인식하고, 이를 매개로 세포 내로 수송되어 분자신호기를 세포 내로 전달한 후 AIMP2-DX2를 검출하는 방법을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 나노복합체를 이용하여, 세포 내의 AIMP2-DX2를 검출한 결과를 나타낸 것으로, A는 엽산이 수식된 나노복합체가 처리된 세포의 분자신호기 신호를 나타낸 것이고, B는 엽산은 수식되지 않은 나노복합체가 처리된 세포의 분자신호기 신호를 나타낸 것이다. C는 엽산이 수식되고 AIMP2-DX2에 결합하지 않는 분자신호기가 탑재된 나노복합체가 처리된 세포의 분자신호기 신호를 나타낸 것이고, D는 엽산이 수식되지 않고 AIMP2-DX2에 결합하지 않는 분자신호기가 탑재된 나노복합체가 처리된 세포의 분자신호기 신호를 나타낸 것이다.

일 관점에서, 본 발명은 AIMP2-DX2의 엑손1과 엑손3의 연결부위에 결합하는 핵산서열과 헤어핀 구조를 형성하는 서로 상보적인 양 말단 서열을 가지는 핵산서열을 포함하는 올리고 핵산의 일측 말단에 형광물질이 결합되어 있고, 타측 말단에는 형광소광제(Quencher)가 결합되어 있는 AIMP2-DX2 검출용 분자신호기에 관한 것이다.

본 발명의 AIMP2-DX2 검출용 분자신호기는 검출 목표 물질인 AIMP2-DX2의 디옥시리보핵산(DNA)과 전령 리보핵산(mRNA)서열이 존재하지 않을 때는 헤어핀과 유사한 형태의 2차 구조를 이루고 있다가, 검출 목표 물질이 존재하게 되면 상기 올리고 핵산이 AIMP2-DX2에 결합하여, 이차구조가 변형되어 형광물질과 형광소광제의 물리적 거리가 멀어져, 형광을 나타내게 된다.

AIMP2-DX2 핵산 서열은 엑손1과 엑손3이 연결된 서열로서,도 1에 나타낸 바와 같이,엑손1과 엑손2 및 엑손3이 연결된 정상형태의 AIMP2 타입의 핵산서열과 구별되는 차이가 있다.

따라서, 본 발명의 일 양태에서는 도 2에 나타난 바와 같이, AIMP2의 엑손1과 엑손3의 연결부위에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 서열을 가진 분자신호기를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 분자신호기를 구성하는 올리고 핵산의 구성물질은 DNA,RNA, 펩타이드핵산(peptide nucleic acids, PNA) 또는 잠김 핵산 (locked nucleic acid) 인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에서는AIMP2-DX2의 핵산서열에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드 서열 이외에도 분자신호기가 헤어핀의 구조를 이루게 하는 서열을 함께 가딘다.

본 발명의 다른 양태에서는 도 3에 나타난 바와 같이, 검출 목표 물질인 AIMP2-DX2의 특정 서열 (엑손1-엑손3 결합부위 서열)이 존재하지 않을 때에는 분자신호기의 양끝 부분의 6개의 올리고뉴클레오티드 서열이 서로 상보적으로 결합하여 머리핀 구조를 이루고 있는다. 이 경우, 올리고뉴클레오티드 양쪽 끝 각각에 부착된 형광물질과 형광 소광제가 서로 근접하고 있게 되는데,이 때문에 형광물질로부터 방출되는 빛 에너지를 형광 소광제가 상당량 흡수하기 때문에 분자 신호기로부터 신호가 나오지 않는다. 하지만 검출 목표 물질인 AIMP2-DX2의 특정 서열, 즉 엑손1-엑손3 결합부위 서열이 존재할 경우 상보적으로 결합되어 있던 분자신호기 양끝 6개의 올리고뉴클레오티드가 떨어지면서 머리핀 모양의 구조가 열린 구조가 된다.이때는 올리고뉴클레오티드 양쪽 끝에 각각 부착된 형광물질과 형광 소광제의 거리가 멀어지기 때문에 형광 소광제가 빛 에너지를 흡수하지 않게 되므로 분자 신호기는 형광 신호를 발산하게 된다. 이 때 형광물질과 형광소광제는 핵산올리고의 양끝 말단에 각각 위치하며, 바람직하게는 형관물질이 분자신호기의 5 말단에, 형광 소광제는 분자신호기의 3 말단에 표지될 수 있으며, 반대로 표지될 수도 있다.

또한,분자 신호기에 사용되는 형광물질은 FAM, TET, HEX, Cy3, TMR, ROX, Texas red, Cy5, Cy 5.5, JOE, VIC, NED, CAL Fluor Orange 560, CAL Fluor Red 590, CAL Fluor Red 610, Quasar 570, Oyster 556, Oyster 645, LC red 640, LC red 670, LC red 705 또는 양자점 (Quantum dot)인 것이 바람직하며, 형광 소광제로는 DDQ-I, DDQ- I I, Dabcyl, Eclipse, Iowa black FQ, Iowa black RQ, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, QSY-21, QSY-7, 0.5 nm 크기에서 500 nm 사이의 직경을 가지는 금 나노입자, 탄소나노튜브, 그래핀, FAM, TET, HEX, Cy3, TMR, ROX, Texas red, Cy5, Cy 5.5, JOE, VIC, NED, CAL Fluor Orange 560, CAL Fluor Red 590, CAL Fluor Red 610, Quasar 570, Oyster 556, Oyster 645, LC red 640, LC red 670, LC red 705 또는 양자점 (Quantum dot)을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에서 제공하는 분자신호기의 서열은 AIMP2-DX2 돌연변이 검출에 최적화 되어있는 서열로써, 이에 대비해서 다른 길이를 가지거나, 염기의 구성이 하나만 다르게 되어도 AIMP2-DX2 돌연변이를 검출하는 기능을 크게 상실한다. 본 발명에서 제공하는 분자신호기는 총 35개의 염기서열로 구성되어 있는데 바닥신호 대비 검출신호의 비율 (signal-to-noise ratio, S/N ratio)은 11.71 이다. 하지만 이보다 짧은 18개의 염기서열을 가지는 분자신호기의 S/N ratio는 4.83이고, 34개의 염기서열을 가지는 분자신호기는 5.76의 S/N ration를 보인다. 또한, 본 발명에서 제공하는 분자신호기와 길이는 같지만 29번째 염기서열만 시토신에서 아데닌으로 바뀐 것의 경우에도 S/N ratio는 5.2를 보여, 본 발명에서 제공하는 분자신호기에 비해 AIMP2-DX2 검출능이 크게 저하되었다.

다른 관점에서, 본 발명은 상기 AIMP2-DX2 검출용 분자신호기와 샘플 DNA를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응(리얼타임-PCR)을 수행하는 것을 특징으로 하는 AIMP2-DX2의 검출방법에 관한 것이다.

AIMP2-DX2 검출용 분자신호기를 이용한 PCR방법은 일 양태로, 반응튜브에 taq 중합효소, 완충용액, 마그네슘클로라이드, 두 종류의 프라이머, 증류수, 증폭하고자 하는 목표 물질(DNA, RNA), 그리고 분자신호기를 넣고 중합효소연쇄반응을 수행하면서 실시간으로 형광성의 변화를 측정한다. 이때 분자신호기의 농도는 바람직하게는 1 fM ~ 1 mM, 더욱 바람직하게는 100 fM ~ 10 nM, 가장 바람직하게는 1 pM ~ 1 nM 인 것이 좋다. 1 fM 보다 낮은 농도에서는 분자 신호기로부터 발산되는 신호가 약해 측정이 되지 않고, 1 mM 보다 높은 농도에서는 분자신호기부터 발산되는 기본 신호가 강하여 AIMP2-DX2의 존재 유무에 따른 신호의 차이가 발생하지 않는다. 또한, 중합효소 연쇄반응은 3단계로 이루어진다. 첫 번째 단계로는 90 ~ 99℃의 온도조건에서 1시간 이하의 시간 동안 노출시켜 반응튜브 안의 모든 핵산을 변성시킨다. 두 번째 단계로는 90 ~ 99℃ 온도조건에서 5분 이하의 시간 동안 노출시켜 핵산을 추가로 변성시키고 25 ~ 80 ℃ 온도 조건에서 5분 이하의 시간 동안 노출시켜 프라이머 또는 분자신호기가 변성된 핵산에 결합할 수 있게 한 후 50 ~ 80 ℃의 온도에 다시 노출시켜 중합효소 연쇄반응이 일어나도록 한다. 두 번째 단계는 20 ~ 60회 수행한다. 마지막 세 번째 단계에서는 50 ~ 80 ℃ 의 온도조건에 30분 이하의 시간 동안 노출시켜 마지막으로 증폭을 시킨다. 상기의 온도조건을 벗어나서 중합효소연쇄반응을 수행할 경우 AIMP2-DX2의 검출이 이루어지지 않는다.

상기 방법을 이용하면 도 4에 나타난 바와 같이, 반응튜브내에 존재하는 AIMP2-DX2를 검출할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 AIMP2-DX2 검출용 분자신호기와 환자 유래 세포 샘플을 이용하여, in situ 세포 이미징을 수행하는 것을 특징으로 하는 세포 내 AIMP2-DX2의 검출방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 양태에서의 in situ 세포 결합 이미징법은 우선 분석하고자 하는 세포를 슬라이드 표면에 부착시킨 후 파라포름알데히드, 아세톤, 또는 알코올을 이용하여 세포를 고정화한다. 그 후, 분자신호기를 고정화된 세포에 처리하여, 세포 내에 존재하는 AIMP2-DX2 mRNA 또는 DNA에 결합시킨다. 이때 분자신호기의 농도는 바람직하게는 1 fM ~ 1 M, 더욱 바람직하게는 1 pM ~ 1 mM, 가장 바람직하게는 1 nM ~ 1 μM 이 좋다. 1 fM 보다 낮은 농도에서는 분자 신호기로부터 발산되는 신호가 약해 측정이 되지 않고, 1 M 보다 높은 농도에서는 분자신호기부터 발산되는 기본 신호가 강하여 AIMP2-DX2의 존재 유무에 따른 신호의 차이가 발생하지 않는다. 또한 분자신호기를 결합시키는 온도는 바람직하게는 20 ~ 80℃, 더욱 바람직하게는 30 ~ 70 ℃, 가장 바람직하게는 35 ~ 65 ℃ 인 것이 좋다. 20 ℃보다 낮은 온도에서는 분자신호기의 구조를 이루는 힘이 강하여 AIMP2-DX2 핵산에 결합하지 않기 때문에 긍정적인 신호 (positive signal)를 발산하지 못하며, 80 ℃ 보다 높은 온도에서는 분자신호기의 구조가 쉽게 변성되어 잘못된 긍정적 신호 (false positive signal)를 발산하게 된다. 분자신호기가 처리된 세포는 형광을 관찰할 수 있는 현미경, 또는 공촛점 레이저 현미경, 그리고 슬라이드 분석기 등을 이용하여 형광성을 측정하거나 또는 세포의 이미지를 얻어낸다.

본 발명에 따른 세포 이미징 벅을 이용하면, 도 5에 나타난 바와 같이, 세포질내에 AIMP2-DX2가 존재할 경우 분자신호기가 발산하는 신호가 나타나게 되고 존재하지 않거나 검출한도 이하로 존재 할 경우 신호가 나타나지 않는다.

또다른 관점에서, 본 발명은 AIMP2-DX2 검출용 분자신호기와 세포내 나노전달체가 결합된 나노복합체 및 이를 이용한 세포 내의 AIMP2-DX2의 검출방법에 관한 것이다.

한편, 본 발명에서는 암세포만을 선택적으로 인식하여 분자 신호기를 암세포내로 전달시키는 나노전달체에 결합시켜, 나노복합체를 제조하고, 이를 이용한 세포이미징을 통하여 AIMP2-DX2의 단일세포 수준에서의 검출할 수 있다.

도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 나노복합체는 다이올레오일-포스포에탄올아민 (dioleoyl-phosphatidylethanolamine; DOPE),다이메틸아미노에탄-카바모일콜레스테롤 (N-(N′, N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl] cholesterol; DC-Chol), 다이스테로일-글리세로-포스포에탄올아민-폴리에틸렌글리콜2000-메톡시(1,2-distearoyl-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[poly(ethyleneglycol)2000-methoxy])(DSPE-PEG2000), 다이스테로일-글리세로-포스포에탄올아민-폴리에틸렌글리콜5000-엽산 (1,2-distearoyl-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[poly(ethyleneglycol)5000]-folate)] (DSPE-PEG5000-folate)와 AIMP2-DX2 검출용 분자신호기로 구성된다. 이때 엽산은 나노복합체를 세포내로 수송하는 역할을 한다.

한편, 본 발명의 나노전달체의 제조에 있어서 구성하는 DOPE 분자와 DC-Chol 분자의 몰 비율은 9:1 ~ 1:9인 것이 바람직하다. 이 범위를 벗어나게 되면 수십~수백나노 크기의 균일한 전달체가 제조되지 않는다.

또한,나노전달체 내에서 DSPE-PEG2000가 차지하는함량은 몰 함량으로 바람직하게는 0.005% ~ 20%, 더욱 바람직하게는 0.05% ~ 5%, 가장 바람직하게는 0.5~ 2% 인 것이 좋다. 20%보다 높을 경우 세포로의 전달 효율이 낮아지고 나노전달체의 형성에 장애가 발생하게되고 0.005 %보다 낮은 함량일 경우 세포로의 비특이적 흡수가 증가하게 된다.

DSPE-PEG5000-folate의 나노전달체 내 함량은 바람직하게는 0.005% ~ 20%, 더욱 바람직하게는 0.05% ~ 5%, 가장 바람직하게는 0.5~ 2% 인 것이 좋다. 20%보다 높을 경우 세포로의 전달 효율이 낮아지고 나노전달체의 형성에 장애가 발생한다.

0.005 %보다 낮은 함량일 경우 엽산수용체를 통한 암세포로의 특이적 수송이 거의 일어나지 않게 된다. 나노전달체에 탑재하는 분자신호기의 양은 100㎍의 나노전달체를 기준으로 바람직하게는 0.02 ~ 200 nmol, 더욱 바람직하게는 0.2 ~ 20 nmol, 가장 바람직하게는 1~5 nmol인 것이 좋다. 200nmol 보다 높을 경우, 나노복합체의 응집이 발생할 뿐만 아니라 탑재되지 않는 분자신호기의 양이 늘어나게 되고, 0.02nmol보다 작은 양일 경우 세포 내로 전달되는 분자신호기의 양이 작아 AIMP-DX2를 검출하는 것이 용이하지 않다.

본 발명에서는, 바닥에 부착되어 있는 살아있는 세포에 분자신호기가 탑재된 나노전달체를 처리한다. 이때 처리하는 나노복합체의 농도는 바람직하게는 0.1 fg/mL ~ 0.1 g/mL, 더욱바람직하게는 0.1 ng/mL ~ 0.1 mg/mL, 가장 바람직하게는 0.1㎍/mL ~ 10 ㎍/mL 이다. 0.1g/mL 보다 많은 양을 세포에 처리할 경우 세포가 죽거나 과량의 분자신호기가 세포 내로 전달되어 바탕신호가 증가하게 되므로 AIMP2-DX2의 검출을 할 수 없게 되고, 0.1 fg/mL 보다 적은 농도의 나노전달체를 처리할 경우 충분하지 않은 양의 분자신호기가 세포 내로 수송되기 때문에 발산되는 신호가 약하므로 AIMP2-DX2를 검출할 수 없게 된다. 또한 나노복합체를 세포에 처리하는 시간은 10 분 ~ 24시간이 가장 바람직하다.

한편, 도 7에 나타난 바와 같이, 분자신호기가 탑재된 나노복합체는, 암세포에 특이적으로 과발현되는 표면 단백질 중 하나인 엽산 수용체에 결합하게 되고, 수용체 매개 막동수송 (receptor-mediated endocytosis)에 의해 암세포 내로 이동하게 된다. 암세포 내에서 나노전달체는 양자스폰지 효과에 의해 엔도솜을 탈출하여 세포질로 이동한다. 세포질로 이동된 나노전달체로부터 분자 신호기가 유리되어 나오면, 세포질 내에 존재하는 AIMP2-DX2 mRNA와 분자신호기가 만나서 결합하게 되고, 형광 신호를 발산하게 된다. 이 세포를 상기의 형광을 관찰할 수 있는 현미경, 또는 공촛점 레이저 현미경, 그리고 슬라이드 분석기 등을 이용하여 형광성을 측정하거나 또는 세포의 이미지를 얻어낸다. 이 방법을 이용하면 도 8에 나타난 바와 같이, 엽산수용체와 AIMP2-DX2가 존재하는 세포의 세포질에서 분자신호기의 신호가 나타나게 된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 분자신호기를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 통한 AIMP2-DX2의 검출

이하의 실시예에서는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 올리고 핵산의 5' 말단에 FAM 형광물질이, 3' 말단에 Dabcyl이 표지된 분자신호기를 사용하였으며, Bioneer (대전, 대한민국) 회사에서 합성한 것을 사용하였다.

본 실시예에서는 중합효소연쇄반응 시에 분자신호기를 함께 첨가하여 실시간으로 형광을 측정함으로써 AIMP2-DX2를 검출하였다.

주형 샘플 DNA는, H460 세포주 (ATCC HTB-177^TM)로부터 추출된 전형리보핵산을 역전사하여 얻어진 것으로 사용하였다.

DNA 증폭을 위하여, 목표 DNA의 양쪽 끝에 교잡(hybiridization)할 수 있는 한 쌍의 프라이머 각각 10 pmole, taq 중합효소(taq polymerase) 2.5 unit, 중합효소에 맞게 제공되는 완충용액,염화마그네슘(최종농도 5 mM), 4종류의 디옥시리보핵산염기 (아데닌, 구아닌, 시토신, 티민, 각각 최종농도가 0.1 mM 농도가 되도록), 증폭하고자 하는 목표 DNA 5 ng, 그리고 분자신호기 5 pmole를 총 25 μL의 부피가 되도록 혼합하고 이를 PCR 반응 튜브에 넣었다. 이를 실시간 중합효소 반응기 (Biorad, IQ5 thermal cycler, USA)를 이용하여 중합효소 연쇄 반응을 수행한다. 이 때 온도 조건은, 95 ℃에 5분, 그리고 95 ℃ 30초, 66 ℃ 30초, 72 ℃ 30초로 45회 순환하여, 형광은 66℃ 조건일 때 측정하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 0.3pg의 돌연변이 함유 샘플에서도 AIMP2-DX2를 검출할 수 있는 것을 확인하였다.

실시예 2: 열변성법을 이용한 분자신호기의 AIMP2 - DX2 검출능 평가

본 실시예에서는 총 4가지의 분자신호기, 즉 서열번호 1에 서열을 가지는 35 뉴클레오타이드의 분자신호기, 18 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 분자신호기, 34 뉴클레오타이드의 서열을 가지는 분자신호기, 그리고 서열번호 1과 유사하지만 29번째 염기서열이 아데닌으로 치환된 분자신호기의 AIMP2-DX2 검출능을 평가하였다.

분자신호기의 결합목표물질인 주형 DNA 25 pmole (서열번호 4: Bioneer, 한국), PCR 완충용액, 염화마그네슘(최종농도 5 mM), 그리고 분자신호기 5 pmole을 넣고 95 ℃에서 5분간 변성시켰다. 그리고 나서 25 ℃의 온도까지 분당 1℃의 속도로 온도를 내린다(Biorad, IQ5 thermal cycler, USA). 주형 DNA가 들어있지 않는 것을 본 실시예의 대조군으로하며, 대조군의 결과를 바닥 신호로 두고, 실험군의 결과를 검출신호로 하여 그 차이를 계산한다. 기준 형광값은 25℃에서 측정하였다. 각각의 분자신호기가 가지는 서열과 실시예의 결과는 표 1에 나타내었다.

분자신호기	서열	S/N ratio
서열번호1의 분자신호기	CCGCAGCCGCCCCGTAATCCTGCACGTGCCTGCGG	11.71
18 뉴클레오타이드의 분자신호기	CTCGTAATCCTGCACGAG (서열번호 5)	4.83
34 뉴클레오타이드의 분자신호기	CCATCGCCCGTAATCCTGCACGTGGCCACGATGG (서열번호 6)	5.67
서열번호1에서 29번 염기가 아데닌으로 치환된 분자신호기	CCGCAGCCGCCCCGTAATCCTGCACGTGACTGCGG (서열번호 7)	5.2

서열번호 1의 분자신호기는 바닥신호 대비 검출신호의 비율 (signal-to-noise ratio, S/N ratio)은 11.71 이다. 하지만 이보다 짧은 18개의 염기서열을 가지는 분자신호기의 S/N ratio는 4.83이고, 34개의 염기서열을 가지는 분자신호기는 5.76의 S/N ration를 보인다. 또한, 본 발명에서 제공하는 분자신호기와 길이는 같지만 29번째 염기서열만 시토신에서 아데닌으로 바뀐 것의 경우에도 S/N ratio는 5.2를보였다. 결과적으로 서열번호 1의 분자신호기가 AIMP2-DX2 검출능이 가장 탁월하였다.

실시예 3: in situ 세포 이미징을 통한 AIMP2 - DX2 의 검출

H460 세포주를 8-채널 슬라이드에 이틀 동안 배양하여 세포를 준비하였다. 준비된 세포에 70%의 에탄올을 15분간 처리하여 세포를 고정화시켰다. 인산완충용액을 이용하여 2차례 세척한 후, 200 nM 분자신호기가 녹아있는 pH 8.3 완충용액을 넣고 45 분간 반응시켰다. 이 때, 온도 조건은 60 ℃로 하였다. 45분 후 인산완충용액을 이용하여 3회 세척한 후 다이아미딘-페닐인돌-다이하이드로클로라이드 (4',6'-diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride; DAPI)가 포함된 마운팅 용액을 넣고 커버슬라이드로 덮었다. 이렇게 만들어진 시료를 공촛점 레이저 현미경 (Carl Zeiss, LSM 710, Germany)을 이용하여 측정하였다.

그 결과를 도 5에 나타내었으며, 도 5에서 A는 AIMP2-DX2가 존재하는 H460 세포주의 분자신호기 신호를 나타낸 것이고, B는 H460 세포주의 분자신호기 신호와 핵에서 발산하는 DAPI의 신호를 합한 것이다. C는 AIMP2-DX2가 극미량 존재하는 WI-26 세포주의 분자신호기 신호를 나타낸 것이고, D는 WI-26 세포주의 분자신호기 신호와 핵에서 발산하는 DAPI의 신호를 합한 것이다. 세포질 내에 AIMP2-DX2가 존재할 경우 분자신호기가 발산하는 신호가 나타나게 되고, 존재하지 않거나 검출한도 이하로 존재할 경우 신호가 나타나지 않았다.

실시예 4: 분자신호기가 탑재된 나노전달체의 제조

DOPE 300 μL (7.44 mg/mL in chloroform), DC-Chol200 μL (5.32 mg/mL in chloroform), DSPE-PEG2000 56 μL (10 mg/mL in chloroform), DSPE-PEG5000-folate 162 μL (1 mg/mL in chloroform)를 혼합하여 둥근바닥 플라스크에 넣고 진공오븐을 이용하여 건조시킨다. 건조시킨 고체를 600 μL 부피의 HEPES 완충용액 (10 mM)을 이용하여 수화시킨 후, 10분동안 욕조형(bath type) 초음파기를 이용하여 균질화시켰다. 만들어진 나노전달체는 최종적으로 1.2 mg/mL의 농도가 되도록 맞추었다. 이렇게 만들어진 나노전달체 80 μL에, 10 μL의 분자신호기 (100 μM), 그리고 10배 농축된 인산염완충용액(10X PBS) 10 μL을 넣고 20분간 배양시킨다. 나노전달체에 탑재되지 않은 분자신호기는 300K 원심분리 필터기를 이용하여 5000 rpm에서 제거하였다.

실시예 5: 분자신호기가 탑재된 나노전달체를 이용하여 세포의 AIMP2 - DX2 를 검출하는 방법

HeLa 세포주를 8채널 슬라이드에서 이틀간 배양하였다. 여기에 10μL의 나노전달체와 150 μL의 세포배양액을 혼합하여 세포에 처리하였다. 이 때 세포로의 처리시간은 3시간으로 하였다. 3시간 후 완충용액을 이용하여 3차례 세척한 후 4%의 파라포름알데히드를 이용하여 세포를 고정화시켰다. 고정화된 세포를 1시간 동안 60 ℃의 온도조건에 노출시켰다. 그리고 나서 인산완충용액으로 다시 1회 세척한 후 DAPI가 포함된 마운팅용액을 처리한다. 이렇게 만들어진 세포 슬라이드는 공촛점 레이저 현미경을 이용하여 관찰하였다.

그 결과를 도 8에 나타내었으며, 도 8에서 A는 엽산이 수식된 나노복합체가 처리된 세포의 분자신호기 신호를 나타낸 것이고, B는 엽산은 수식되지 않은 나노복합체가 처리된 세포의 분자신호기 신호를 나타낸 것이다. C는 엽산이 수식되고 AIMP2-DX2에 결합하지 않는 분자신호기가 탑재된 나노복합체가 처리된 세포의 분자신호기 신호를 나타낸 것이고, D는 엽산이 수식되지 않고 AIMP2-DX2에 결합하지 않는 분자신호기가 탑재된 나노복합체가 처리된 세포의 분자신호기 신호를 나타낸 것이다. 엽산수용체와 AIMP2-DX2가 존재하는 세포의 세포질에서 분자신호기의 신호가 나타났다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Advanced Instutute of Science and Technology <120> Moelecular Beacon for Dectecting Mutant of exon2-deleted AIMP2 and Method for Detecting Mutant of exon2-deleted AIMP2 Using thereof <130> P13-B074 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Molecular beacon <400> 1 ggcgtccgtg cacgtcctaa tgccccgccg acgcc 35 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> partial sequnce of Wild type AIMP2(Exon1-Exon2) <400> 2 gctggccacg tgcaggaaga gtctaacctg 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> partial sequnce of Wild type AIMP2(Exon2-Exon3) <400> 3 tcagtgcttg ggaaggatta cggggcgctg 30 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> partial sequnce of AIMP2-DX2 <400> 4 ggcgtccgtg cacgtcctaa tgccccgccg acgcc 35 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> molecular beacon <400> 5 ctcgtaatcc tgcacgag 18 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> molecular beacon <400> 6 ccatcgcccg taatcctgca cgtggccacg atgg 34 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> molecular beacon <400> 7 ccgcagccgc cccgtaatcc tgcacgtgac tgcgg 35

Claims

AIMP2-DX2의 엑손1과 엑손3의 연결부위에 결합하는 핵산서열과 헤어핀 구조를 형성하는 서로 상보적인 양 말단 서열을 가지는 핵산서열을 포함하는, 서열번호 1의 염기서열을 가지는 올리고 핵산의 일측 말단에 형광물질이 결합되어 있고, 타측 말단에는 형광소광제(Quencher)가 결합되어 있는 AIMP2-DX2 검출용 분자신호기.
제1항에 있어서, 올리고 핵산은 올리고 디옥시리보핵산, 올리고 리보핵산, 올리고 펩타이드핵산(peptide nucleic acids, PNA) 및 잠김 핵산 (locked nucleic acid) 으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 AIMP2-DX2 검출용 분자신호기.
제1항에 있어서, 형광물질은 FAM, TET, HEX, Cy3, TMR, ROX, Texas red, Cy5, Cy 5.5, JOE, VIC, NED, CAL Fluor Orange 560, CAL Fluor Red 590, CAL Fluor Red 610, Quasar 570, Oyster 556, Oyster 645, LC red 640, LC red 670, LC red 705 및 양자점 (Quantum dot)으로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 AIMP2-DX2 검출용 분자신호기.
제2항에 있어서, 형광소광제(Quencher)는 DDQ-I, DDQ- I I, Dabcyl, Eclipse, Iowa black FQ, Iowa black RQ, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, QSY-21, QSY-7, 금 나노입자, 탄소나노튜브, 그래핀, FAM, TET, HEX, Cy3, TMR, ROX, Texas red, Cy5, Cy 5.5, JOE, VIC, NED, CAL Fluor Orange 560, CAL Fluor Red 590, CAL Fluor Red 610, Quasar 570, Oyster 556, Oyster 645, LC red 640, LC red 670, LC red 705 및 양자점 (Quantum dot)으로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 AIMP2-DX2 검출용 분자신호기.
삭제
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 AIMP2-DX2 검출용 분자신호기와 샘플 DNA를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응(리얼타임-PCR)을 수행하는 것을 특징으로 하는 AIMP2-DX2의 검출방법.
제6항에 있어서, 분자신호기는 1 fM ~ 1 mM 농도로 사용하는 것을 특징으로 하는 AIMP2-DX2의 검출방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 AIMP2-DX2 검출용 분자신호기와 환자 유래 세포 샘플을 이용하여, in situ 세포 이미징을 수행하는 것을 특징으로 하는 세포 내 AIMP2-DX2의 검출방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 AIMP2-DX2 검출용 분자신호기와 세포내 나노전달체가 결합된 나노복합체.
제9항에 있어서, 나노복합체는 다이올레오일-포스포에탄올아민 (dioleoyl-phosphatidylethanolamine; DOPE), 다이메틸아미노에탄-카바모일 콜레스테롤 (N-(N′, N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl] cholesterol; DC-Chol), 다이스테로일-글리세로-포스포에탄올아민-폴리에틸렌글리콜2000-메톡시 (1,2-distearoyl-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[poly(ethyleneglycol)2000-methoxy])(DSPE-PEG2000) 및 다이스테로일-글리세로-포스포에탄올아민-폴리에틸렌글리콜5000-엽산 (1,2-distearoyl-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[poly(ethyleneglycol)5000]-folate)] (DSPE-PEG5000-folate)와 AIMP2-DX2 검출용 분자신호기가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 나노복합체.
제9항의 나노복합체를 이용하는 것을 특징으로 하는 세포 내의 AIMP2-DX2의 검출방법.