KR101619864B1 - 메타게놈 유래 신규 베이어 빌리거 모노옥시게나아제 BVMOsm1 - Google Patents

Abstract

본 발명은 갯벌 토양에서 추출한 메타게놈 유래의 신규한 베이어-빌리거 모노옥시다아제(Baeyer-Villiger monooxygenase, BVMO)에 관한 것으로 더욱 자세하게는, 갯벌에서 추출한 메타게놈 DNA 라이브러리로부터 로봇 기반 초고속 탐색 High-throughput screening (HTS) 방법을 이용하여 선별된 베이어-빌리거 산화 활성을 갖는 신규 BVMO 및 상기 BVMO를 코딩하는 유전자와 상기 유전자로 형질전환된 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 신규 BVMO는 다양한 구조의 케톤화합물을 반응시켜 락톤화합물을 생산할 수 있어, 고가의 다양한 의료용 중간체의 생산 등 유용 락톤 화합물을 전환 혹은 생산하는데 이용될 수 있을 것이다.

Description

메타게놈 유래 신규 베이어 빌리거 모노옥시게나아제 BVMOsm1{Novel Baeyer-Villiger monooxygenase BVMOsm1 from Metagenome}

본 발명은 갯벌 토양에서 추출한 메타게놈 유래의 신규한 베이어-빌리거 모노옥시다아제(Baeyer-Villiger monooxygenase, BVMO)에 관한 것으로 더욱 자세하게는, 갯벌에서 추출한 메타게놈 DNA 라이브러리로부터 로봇 기반 초고속 탐색 High-throughput screening (HTS) 방법을 이용하여 선별된 베이어-빌리거 산화 활성을 갖는 신규 BVMO 및 상기 BVMO를 코딩하는 유전자와 상기 유전자로 형질전환된 재조합 미생물에 관한 것이다.

일반적으로 산화환원 효소는 당뇨병 진단(혈당센서)과 관련한 glucose oxidase가 가장 큰 시장을 형성하고 있었지만, 여러 가지 단점으로 2세대로서 PQQ-GDH(pyrroloquinoline quinone-Glucose Dehydrogenase), 3세대 시장으로서 FAD-GDH(Flavin Adenine Dinuclotide-Glucose Dehydrogenase)로 연구가 진행되고 있으며, 이들 역시 효소 안정성이 떨어지는 등의 문제점이 있다. 이외에도, 다양한 기능을 가진 P450, dehydrogenase, reductase, Baeyer-Villiger monooxygenase, laccase, peroxidase 등은 바이오 합성에 있어서 산업적으로 매우 중요하지만, 산화환원 바이오 물질의 개발 및 활용성이 떨어지는 이유는 조효소인 NADP 혹은 NADPH에 의존적이며 발현이 매우 어렵기 때문이다.

이렇게 다양한 화학 반응에 쓰이는 높은 유용성에도 불구하고 산화화원 바이오 부품의 종류는 매우 제한적이며 이를 효율적으로 스크리닝, 개량할 수 있는 방법은 노동집약적일 뿐만 아니라 고가이며 많은 시간이 요구되고 있는 실정이다. 이러한 높은 산업적 유용성을 지닌 산화환원효소 중 Baeyer-Villiger monooxygenase(BVMOs)는 NADP(H) dependent flavoenzyme으로 linear 또는 cyclic ketones 등 carbonylic 화합물의 탄소 사이에 산소를 첨가하여 에스테르 또는 락톤(lactone)을 생성하는 베이어-빌리거 산화(Baeyer-Villiger oxidation)활성을 갖는 바이오부품이다. 베이어-빌리거 산화 반응은 화학반응 중에서도 매우 독특한 것으로 여겨지고 있으며 화학적으로 접근하기 어려운 유용한 화합물의 chemoenzymatic 합성에 사용될 수 있다.

BVMO는 라쎄믹 케톤체의 산화적 kinetic resolution과 높은 enantioselectivity(거울상선택성)을 가진 prochiral 기질의 desymmetrization을 포함하여 stereoselective 베이어-빌리거 반응에서 촉매제로서 수 십 년 동안 사용되고 있다. 이런 complement 촉매적 베이어-빌리거 과정들은 chiral 합성 촉매에 기반 한다.

베이어-빌리거 산화는 효소를 사용함으로써 산업 공정을 간편하게 할 뿐만 아니라 수송과 저장기간 동안 폭발의 위험을 줄 수 있는 엄청난 양의 산화제 사용을 피할 수 있는 산업적 장점을 지니고 있다.

현재 BVMO의 사용 예로서 생촉매제 분야에 특이사업화한 Codexis사에서는 BVMO enzyme을 이용해 상업적으로 유용한 신규 약물 스크리닝 키트를 제작 판매중이며, 다른 업체에서도 BV산화효소의 시장성을 인식하여 scale-up화 준비 중이다. BVMO 전환 반응에 의한 최종 산물 중의 하나인 카프로락톤은 나일론6의 단량체인 카프로락탐(연간 약 10억kg톤 생산)으로 쉽게 전환할 수 있어 이와 관련된 시장도 향후 추가 연구를 통하여 진출할 수 있을 것으로 예상이 된다.

상업적 효용가치가 높은 락톤의 전환을 위하여, BVMO를 사용한 것으로는 사이클로헥산(cyclohexanone)을 ε-카프로락톤(ε-caprolactone)으로 전환하기 위하여, Acinetobacter 유래의 CHMO(cyclohexanone monooxygenase)를 형질전환하여, whole cell non-growing E. coli 에서 0.79g/L/h 의 ε-카프로락톤을 생산한 것이 보고되고 있다(Walton, AZ and Stewart, JD, Biotechnology Progress, 18:262-268, 2002). 그 후 Acinetobacter calcoaceticus NCIMB 9871 균주를 이용하여 대사적으로 활성된 세포를 가지고 글루코스를 제한한 환경에서 fed-batch 배양한 결과, ε-카프로락톤의 생산이 증가되었다. 또한 BVMO가 NADPH에 의존적이라는 단점을 극복하고자 NADPH 생산효소를 코딩하는 zwf 유전자를 같이 발현시켰을 때 ε-카프로락톤의 생산 농도는 39% 더 증가하였고(Lee, WH et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 76:329-338, 2007), NADH를 인산화하는 카이네이즈를 코딩하는 Pos5p 유전자를 같이 발현시켰을 때는 최대 21.6g/L의 ε-카프로락톤을 얻을 수 있었다(Lee, WH et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 97:4:1561-1569, 2013).

BVMOs를 이용하면 용매 및 고분자로 유도될 수 있는 유용한 중간체인 부틸락톤(butyrolactone)의 생산할 수 있으며, BVMO를 이용하면 prochiral cyclobutanones을 chiral butyrolactones으로 전환할 수 있으며, natural products의 합성을 위한 높은 다용도 플랫폼과 GABA receptor inhibitors, baminoacids, lignans 또는 antagonistic analgesics와 같은 거대한 구조적 다양성을 지닌 바이오액티브 분자의 전환에 유용하다.

Straightforward [2+2] cycloaddition 으로 생성된 몇몇의 케톤 전구체들은 CHMO-와 CPMO type BVMOs가 발현되는 대장균에 의하여 산화되며, BVMO collection에 의하면 optical purity가 높은 enantiocomplementary butyrolactones을 생산할 수 있다. 또한, BVMOs를 이용한 n-butylcyclobutanone의 biooxidation은 실험에서, 모든 실험군에서 높은 수율로 (S)-butyrolactone을 생산해 내는 것이 확인되었다(Rudroff, F. et al., Advanced Synthesis & Catalysis, 349:1436-1444, 2007).

cyclobutanone에서 BVMO에 의해 gamma-butyrolactone(GBL)로 전환이 되는데, GBL은 전자부품, 반도체 제조과정에서 세정제 원료로 쓰이는 C4화합물로 BDO나 THF, PBT등 다른 C4 제품군에 가격이 가장 비싼편이며 다양한 무가가치를 창출하는 상업적 가치가 있다.

신규 BVMO를 이용하여 caprolactone(caprolactam 전환 가능), gamma- butyrolactone 등을 생물학적 전환 공정에 이용 가능하다. 이 경우 caprolactam, gamma- butyrolactone 등의 시장 규모는 모두 나일론 6, 4의 전구체 뿐만 아니라 polycaprolacone등 다양한 화합물 제조의 시장에 진출 가능하다. 카프로락탐(Caprolactam)의 현 시장 규모는 약 $ 14 Bn(가격 $3,800/ton, 시장 381만 톤, ICIS pricing 2011.1)이고, 용도는 주로 나이론-6의 기초 원료 또는 엔지니어링 수지 및 필름 등의 생산을 위한 원료로 사용 가능하며, 엔지니어링 수지 용도로의 수요 증가로 인해 2012년 전 세계 수요가 5백만 톤을 넘을 것으로 전망될 정도로 경제적 가치가 높아(Global Industry Analysts, Inc., 2008) 시장성이 우수하다. GBL의 경우 2008 현재 연간 40만톤 생산되고 있다.

그러나 이러한 높은 유용성에도 불구하고 지금까지 알려진 BVMO의 종류는 매우 제한적이며, 가장 연구가 많이 되고 BVMO activity가 높은 효소인 CHMO는 병원성균주 유래이며, 특허권 때문에 이를 상업적으로 이용하기에는 제한적이며, 새로운 BVMO의 개발이 필요한 실정이다.

또한 BVMO는 고가인 NADPH 조효소 의존적인 문제점을 Whole-cell biotransformation 이란 기법을 이용해 그 단점을 극복할 수 있다. 생물전환반응 (bioconversion 또는 biotransformation) 이란 생체의 기능, 또는 생체가 가지고 있는 생촉매의 기능을 이용하여 새로운 신생물 제품을 생산하거나, 기존 화학합성공정에 의해 합성 및 생산되고 있는 기존 화학제품을 신생물 제품으로 대체하고자 하는 기술을 말하며, 생체 및 생촉매의 기능을 활용하여 의약품, 의약품 원료물질, 비타민, 유용 아미노산, 인지질, 식품 원료, 농업용 화학제품 등을 포함한 다양한 화학제품을 생산해 낼 수 있는 기술이다.

이에, 본 발명자들은 조효소 의존적인 문제점을 해소할 수 있는 새로운 BVMO 효소를 개발하고자 예의 노력한 결과, HTS(High Throughput Screening System)를 사용하여 메타게놈 자원으로부터 형광기반한 BVMO 대상군을 선별하는 스크리닝 방법을 통해 신규 BVMO을 확보하고, whole-cell biotransformation에 의해 BVMO의 조효소인 NADPH의 재생 문제를 해결할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 조효소 의존적인 문제점을 해소할 수 있는 새로운 베이어-빌리거 모노옥시게나아제(BVMO)를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 베이어-빌리거 모노옥시게나아제(Baeyer-Villiger monooxygenase)를 코딩하는 유전자 및 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 베이어-빌리거 모노옥시게나아제의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 베이어-빌리거 모노옥시게나아제 또는 상기 재조합 미생물을 이용하여 카르보닐 화합물을 베이어-빌리거 산화시키는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 베이어-빌리거 모노옥시게나아제(Baeyer-Villiger monooxygenase)를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 베이어-빌리거 모노옥시게나아제(Baeyer-Villiger monooxygenase)를 코딩하는 유전자 및 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 베이어-빌리거 모노옥시게나아제를 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 베이어-빌리거 모노옥시게나아제를 수득하는 단계를 포함하는 베이어-빌리거 모노옥시게나아제의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 베이어-빌리거 모노옥시게나아제 또는 상기 재조합 미생물을 이용하여 카르보닐 화합물을 베이어-빌리거 산화시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 신규 BVMO는 다양한 구조의 케톤화합물을 반응시켜 락톤화합물을 생산할 수 있어, 고가의 다양한 의료용 중간체의 생산 등 유용 락톤 화합물을 전환 혹은 생산하는데 이용될 수 있을 것이다.

도 1은 BVMO에 의한 베이어-빌리거 산화반응 및 BVMO에 의하여, 2-coumaryloxycyclopentanone에서 형광을 띠는 umbelliferone이 생성되는 과정을 도식화 한 것이다.
도 2는 본 발명의 BVMO 스크리닝을 위한 BVMOdml 활성 측정방법을 나타낸 것이다.
도 3은 신규 BVMO의 샷건 클로닝을 위하여, Fosmid DNA에 BfuCΙ을 처리한 후 3~5kb 사이즈를 선택한 것을 나타낸 것이다.
도 4는 BVMO를 함유하는 PCR 단편 및 BVMO를 함유하는 재조합 벡터를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 재조합 대장균 BVMOsm1을 이용하여 비성장 조건에서 Cyclobutanone을 r-Butyrolactone으로 전환하는 전환율을 시간에 따라 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 BVMOsm1의 기질 반응을 GC로 분석한 결과를 나타낸 것이다.]
도 7은 재조합 대장균 BVMOsm1의 배양액에서 분리된 BVMOsm1 단백질의 정제과정을 SDS-PAGE 상에서 확인한 것이다(M; protein size marker(kDa), T; total cell, S; Soluble protein, IS; Insoluble protein, W; Wash-out, P; Purified protein).

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

일 관점에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 베이어-빌리거 모노옥시게나아제(Baeyer-Villiger monooxygenase)에 관한 것이다.

본 발명의 BVMO는 유기합성을 위한 상보적 거울상선택성 생촉매제로서 사용되며, 다양한 고가의 의료용 intermediate 등 유용 락톤화학합물을 전환 혹은 생산하는데 이용하여 바이오액티브 산물과 재료의 합성을 할 수 있으며, homochiral ε-caprolactone 등 chiral building block을 생산할 수 있으며, 케톤구조를 높은 입체선택성을 가지고 다양하게 배열할 수 있는 능력을 가지고, 대사경로에서 BVMO 효소의 촉매적 역할과 프로드럭의 활성 촉진에 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명에서는 갯벌 토양에서 메타게놈(metagenome) DNA 추출하여 fosmid library를 구축하고, High-throughput screening based on robot system(da Cruz GF et al.,Appl Microbiol Biotechnol, 87:319-329, 2010)으로, 형광 기질(2-coumaryloxycyclopentanone)을 이용하여 BVMO를 스크리닝 하여, BVMO 활성이 높은 클론을 확보하고, 염기서열 분석을 통하여, 그 중 신규한 BVMO를 선별하였다.

선별된 신규 BVMO는 염기서열 분석결과를 토대로 ORF를 찾아 NCBI의 Blast X를 이용하여 분석 한 결과, 가장 상동성이 높은 서열이 61%로, 신규한 서열임을 확인하였다.

다른 관점에서, 본 발명은 상기 베이어-빌리거 모노옥시게나아제(Baeyer-Villiger monooxygenase)를 코딩하는 유전자 및 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 Sambrook, et. al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법 (electroporation)(Neumann, et. al., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다. 당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 재조합벡터 내에 포함되게 된다. 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 재조합벡터는 진핵 발현숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

상술한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.

물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.

또 다른 관점에서,본 발명은 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명의 신규 BVMO 효소는 조효소로 NADH를 필요로 하는 효소로서, 전환반응에 고가의 NADH가 필요하며, 이러한 조효소를 재생시키는 시스템이 요구된다.

이에, 본 발명에서는 NADH를 재생할 수 있는 Whole cell system을 사용하여, 상기 조효소 재생문제를 해결하였다.

그러므로, 상기 재조합 미생물은 NADH 재생능을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 양태에서는 신규 BVMO 효소인 BVMOsm1 유전자를 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 대장균 BVMOsm1과 Cyclobutanone 및 Cyclohexanone을 기질로 각각 반응시키는 경우, 추가적인 NADH 공급 없이도 γ-bytyrolactone 및 ε-caprolactone으로 각각 전환되는 것을 확인하였다.

본 발명에서 상기 유전자를 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있으며, 비바이러스 전달 방법은 전기천공법, 리포펙션, 미세주사, 탄도법, 비로솜, 리포솜, 면역리포솜, 다가 양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 바이론 및 화학물질 촉진 DNA 유입을 포함한다. 소소노포레이션, 예를 들어 Sonitron 2000 시스템(Rich-Mar)을 이용한 방법도 핵산의 전달에 사용할 수 있으며, 다른 대표적인 핵산 전달 시스템은 Amaxa Biosystems(Cologne, Germany), Maxcyte, Inc.(Rockville, Maryland) 및 BTX Molesular Syetem(Holliston, MA)의 방법을 포함한다. 리포펙션 방법은 미국특허 제5,049,386호, 미국특허 제4,946,787호 및 미국특허 제4,897,355호에 명시되어 있으며 리포펙션 시약은 상업적으로 시판되고 있으며, 예를 들어, Transfectam^TM 및 Lipofectin^TM 이 있다. 폴리뉴클레오티드의 효과적인 리셉터-인식 리포펙션에 적당한 양이온 또는 중성 지질은 Felgner의 지질을 포함하며 (WO91/17424 및 WO91/16024), 생체 외 도입을 통해 세포로, 생체 내 도입을 통해 표적 조직으로 전달할 수 있다. 면역지질 복합체 등 표적 리포솜을 포함하는 지질:핵산 복합체의 제조 방법은 당해 업계에 잘 알려져 있다 (Crystal, Science., 270:404-410, 1995; Blaese et al., Cancer Gene Ther., 2:291-297, 1995; Behr et al., Bioconjugate Chem., 5:382389, 1994; Remy et al., Bioconjugate Chem., 5:647-654, 1994; Gao et al., Gene Therapy., 2:710-722, 1995; Ahmad et al., Cancer Res., 52:4817-4820, 1992; 미국특허 제4,186,183호; 미국특허 제4,217,344호; 미국특허 제4,235,871호; 미국특허 제4,261,975호; 미국특허 제4,485,054호; 미국특허 제4,501,728호; 미국특허 제4,774,085호; 미국특허 제4,837,028호; 미국특허 제4,946,787호).

레트로바이러스의 친화성은 외부 외피 단백질과 일체화함으로써 변할 수 있어 표적 세포의 종류를 확대시킬 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비분열 세포를 형질도입 또는 감염시켜서 고바이러스 역가를 생성하는 레트로바이러스 벡터이다. 표적 조직에 따라 레트로바이러스 유전자 잔달 시스템이 결정된다. 레트로바이러스 벡터는 6-10kb 외부 서열을 포장할 수 있는 시스 액팅 긴 말단 반복을 포함한다. 벡터의 복제와 포장을 위해 충분한 최소의 시스 액팅 LTR은 영구적인 트랜스젠 발현을 위해 치료 유전자가 표적 세포로 통합되도록 사용할 수 있다. 널리 사용되는 레트로바이러스 벡터는 쥐 백혈병 바이러스(MuLV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 및 그들의 조합 바이러스를 포함한다 (Buchscher et al., J. Virol., 66:2731-2739, 1992; Johann et al., J. Virol., 66:1635-1640 1992; Sommerfelt et al., Virol., 176:58-59, 1990; Wilson et al., J. Virol., 63:2374-2378, 1989; Miller et al., J. Virol., 65:2220-2224, 1991; PCT/US94/05700).

수크로오스 포스포릴라아제 단백질을 일시적으로 발현하는 경우에는 아데노바이러스 기반 시스템을 더욱 많이 이용하며, 아데노바이러스계 벡터는 많은 세포들에서 고효율로 형질도입을 일으키지만 세포 분열을 필요로 하지 않는다. 상기 벡터를 이용하면 높은 역가와 높은 수준의 발현을 얻을 수 있고, 간단한 시스템에서 대량으로 생산될 수 있다. 또한 아데노 부속 바이러스(AAV) 벡터는 표적 핵산을 가진 세포로 형질도입하는데 이용되는데, 예를 들면 생체 외 상에서 핵산과 펩티드의 생산 및 생체 내 및 생체 외 상에서 유전자 치료에 이용되며 (West et al., Virology., 160:38-47, 1987; 미국특허 제4,797,368호; WO93/24641; Kotin, Human Gene Therapy., 5:793-801, 1994; Muzyczka, J. Clin. Invest., 94:1351, 1994), 재조합 AAV 벡터의 구성은 이미 알려져 있다 (미국특허 제 5,173,414호; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol., 5:3251-3260, 1985; Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol., 4:20722081, 1984; Hermonat & Muzyczka, PNAS., 81:6466-6470, 1984; Samulski et al., J Virol., 63:038223828, 1989).

재조합 아데노 연관 바이러스 벡터(rAAV)는 결함 있고 비병원성인 제2형 파르보바이러스 아데노 연관 바이러스를 기반으로 하는 유망한 대체 유전자 전달 시스템이다. 모든 벡터는 트랜스젠 발현 카세트 측면에 위치하는 AAV 145 bp 역위 말단 반복을 보유한 플라스미드로부터 유래한다. 형질도입된 세포의 게놈으로 통합에 기인하는 효율적인 유전자 전달 및 안정한 트랜스젠 전달은 상기 벡터 시스템의 큰 장점이다 (Wagner et al., Lancet., 351:9117-17023, 1998; Kearns et al., Gene Ther., 9:748-55, 1996).

또 다른 관점에서, 본 발명은 (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 베이어-빌리거 모노옥시게나아제를 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 베이어-빌리거 모노옥시게나아제를 수득하는 단계를 포함하는 베이어-빌리거 모노옥시게나아제의 제조방법에 관한 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 베이어-빌리거 모노옥시게나아제 또는 상기 재조합 미생물을 이용하여 탄소화합물을 베이어-빌리거 산화시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 화합물은 카르보닐 화합물, 특히, linear 또는 cylclic 케톤화합물일 수 있으나, 화합물의 탄소 사이에 산소를 첨가하여 에스테르 또는 락톤(lactone)산화되는 베이어 빌리거 산화가 일어날 수 있는 화합물이라면, 제한없이 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 베이어-빌리거 산화는 재조합 미생물의 성장조건 또는 비성장조건에서 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에서, 재조합 대장균 BVMOsm1을 배양액에서 세포가 자라면서 기질과 반응하는 성장조건(growing condition)과 분리한 세포를 버퍼에 현탁한 후 기질과 반응시키는 비성장조건(non-growing condition)으로 나누어 기질전환율을 비교한 결과, cyclobutanone 기질에 대한 gamma butyrolactone 산물 전환율은, 성장배지에서 지속적으로 성장시키고, 기질첨가 후 24시간 동안 전환율을 보는 growing cell biotransformation 조건에서 81%이였던 것에 비하여, 비성장 조건에서 100%로 증가하는 것으로 나타났다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 메타게놈 라이브러리의 제작

전라북도 새만금 갯벌 토양에서 메타게놈(metagenome) DNA 추출하여 fosmid library를 구축하였다.

먼저, 토양시료 10g을 50㎍/ml RNase A와 100㎕의 proteinase K (10 mg/ml)를 포함하는 추출버퍼(100 mM Tris-HCl [pH 8.0], 100 mM sodium EDTA [pH 8.0], 100 mM sodium phosphate [pH 8.0], 1.5 M NaCl, 1% CTAB) 27 ml에 현탁한 후, 37℃에서 30분간 교반하고, 20% SDS 3ml을 첨가하여 65℃에서 2시간 반응시킨 다음, 원심분리(10000 rpm, 20 min, 4℃) 하였다.

상등액을 새로운 튜브에 담고 동량의 phenol/chloroform/isoamylalcohol (25/24/1)를 넣고 invert 한 뒤, 원심분리하여 상등액을 새로운 튜브에 담고 humic substances를 제거하기 위해 상등액의 1/10배의 3M sodium acetate (pH 5.3)를 넣고 1배의 isopropanol을 넣은 뒤 30분 동안 -20℃에서 침전시켰다.

원심분리 후, 침전물을 TE 버퍼에 녹이고 추출된 DNA의 농도를 측정하였다. DNA 전기영동 젤에서, 25-40kb의 DNA를 포함하는 부분을 잘라 gelase enzyme을 넣어 45℃에서 1시간 반응한 후 에탄올을 넣어 DNA를 분리하였다.

순수 정제된 DNA를 end-repaired 후 CopyControl pCCFOS vector(epicentre, USA)에 상온에서 2시간 라이게이션 시켰다. Ligation된 DNA 10㎕에 MaxPlax Lamda Packaging extract(epicentre, USA) 25㎕를 넣고 30℃에서 90분간 반응시킨 후 다시 25㎕의 Packaging extract를 넣고 30℃에서 90분간 반응시켰다.

invert 후 chloroform 4㎕ 넣고 4℃에 보관하였다. infection을 위하여 우선 파지의 숙주로 사용할 E. coli EPI300(epicentre, USA) 단일콜로니를 packaging하기 전날 LB broth에 접종하여 밤새 배양한 후, 아침에 최종 농도가 10mM MgSO₄와 0.2% maltose가 되도록 첨가된 LB broth에 다시 접종하여 37 ℃에서 진탕 배양 후, 준비된 EPI300-T1 cell과 phaged particle은 10 : 1의 비율이 되게 섞어준 후, 37 ℃에서 20분간 infection을 수행한 후, 12.5㎍/ml chloramphenicol이 포함된 LB agar 배지에 도말하여, 37 ℃에서 colony들이 충분히 자랄　때까지 약 30시간 배양하고 회수하여 메타게놈 라이브러리를 제작하였다.

실시예 2: 형광기질을 이용하여 HTS 방법으로 BVMO 스크리닝

형광 기질을 이용하여 BVMO를 스크리닝 하기 위하여 2-coumaryloxycyclopentanone을 합성하여 사용하였다(㈜진켐, 대한민국). 상기 2-coumaryloxycyclopentanone 기질은 cyclopentanone에 umbelliferone이 수식되어 있는 기질로서, 상기 기질을 이용하면 BVMO 반응에 의해서 free umbelliferone이 생성되어 365/460nm 파장에서 형광을 측정하여 신규 BVMO를 스크리닝할 수 있다(da Cruz GF et al.,Appl Microbiol Biotechnol, 87:319-329, 2010; Geitner, K et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 88:1087-1093, 2010; Rial, DV et al., Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 50:61-68, 2008) (도 1) .

실시예 1에서 제작된 메타게놈 라이브러리로부터 BVMO 스크리닝은 다음과 같은 방법으로 진행하였다.

12.5㎍/ml 클로람페니콜 항생제가 포함된 LB 액체배지에 유도용액(0.002% arabinose)과 50μM의 2-coumaryloxycyclopentanone을 첨가한 후, 96-well plate에 200㎕ 분주를 하고 라이브러리가 도말된 플레이트로부터 단일 콜로니를 취하여, 각 웰에에 접종한 후 37℃에서 16시간 300rpm shaking 조건에서 진탕배양하였다.

상기 배양액 100㎕를 96 well-black plate에 분주하고 100㎕의 100mM tris-HCl buffer pH 8.8을 추가로 넣어준 후 λ_ex=365nm , λ_em=460nm에서 형광을 측정하였다(도 2).

실시예 1의 메타게놈 라이브러리의 7,290 콜로니를 High-throughput screening based on robot system(da Cruz GF et al.,Appl Microbiol Biotechnol, 87:319-329, 2010)을 이용하여 분석한 결과, BVMO 활성을 갖는 몇 클론을 찾을 수 있었다. 이들을 alkaline lysis를 이용하여 fosmid preparation을 한 후 제한효소 BamHI을 처리 후 패턴 확인을 통해 중복을 피하고 그 중에 가장 활성이 좋은 것을 선별하였다.

활성을 갖는 Hit으로부터 얻어진 fosmid DNA를 제한효소 BfuCⅠ을 이용하여 분해하여 전기영동을 실시한 후 3~5kb 크기의 DNA를 선택하여 insert DNA을 확보하였다. 확보된 insert DNA를 이용하여 pHSG298 벡터(TAKARA, Japan)에 라이게이션하여 샷건 라이브러리를 제작하고, 상기와 동일한 형광기질 기반 BVMO HTS 방법을 통해 다시 한번 스크리닝을 실시하였다. 그 결과, 활성을 갖는 Hit의 플라스미드를 분리하여, 염기서열을 분석하였다(도 3).

최종적으로 메타게놈 라이브러리에서 스크리닝된 BVMO 후보 hit의 염기서열을 서열번호 2에 나타내었으며, 상기 나타낸 염기서열을 갖는 유전자를 BVMOsm1 로 명명하였다.

염기서열 분석결과를 토대로 ORF를 찾아 NCBI의 Blast X를 이용하여 분석 한 결과, 61%의 상동성이 가장 높은 상동성을 갖는 서열이었으며, Caulobacter sp. AP07의 putative flavoprotein involved in K+ transport 이었다.

분석된 sequence를 기반으로 ,Forward BVMOsm1-NdeⅠ프라이머 및 Reverse BVMOsm1-HindIII 프라이머를 각각 제작하고, 상기 프라이머와 BVMOsm1를 포함하는 단편을 주형으로 하여, 변성 95℃ 30초, 어닐링 56℃ 30초, 신장 2분 조건에서 PCR을 수행하였고 NdeⅠ, HindIII 를 이용하여 pET22b 벡터(Novagen, 미국)에 클로닝하였다. 대장균 BL21(DE3)에 transformation하여 형질전환된 대장균 BVMOsm1을 제조하였다 (도 4).

Forward BVMOsm1-NdeⅠ: GGAGATATACATATGGATCATGTCGACGTAGTCATTATCG(서열번호 3)

Reverse BVMOsm1-HindIII: GTGCGGCCGCAAGCTTGGCCGCGGTACGCGTTG(서열번호 4)

실시예 3: BVMOsm1의 Whole-cell biotransformation

실시예 2에서 제조한 재조합 대장균 BVMOsm1을 케톤기질과 반응시켜 락톤 생성물 전환에 실험을 Whole-cell을 이용하여 실시하였다.

Whole-cell을 이용한 방법은 반응에 필요한 조효소인 NADPH의 재생문제를 해결하며 반응액으로부터 cell을 원심분리를 통해 쉽게 분리 가능하고 단백질 정제가 필요 없는 장점을 갖는 방법이다(Walton, AZ and Stewart, JD, Biotechnology Progress, 18:262-268, 2002). 배양액에서 세포가 자라면서 기질과 반응하는 성장조건(growing condition)과 분리한 세포를 버퍼에 현탁한 후 기질과 반응시키는 비성장조건(non-growing condition)으로 나누어 실험을 진행하였다.

250ml 둥근플라스크에 50ml의 R/2 defined medium(KH₂PO 4, 13.5 g; (NH₄)2HPO₄, 4.0 g: MgSO₄ 7H₂O, 1.4 g; citric acid, 1.7 g, trace metal solution (FeSO₄ 7H₂O, 10.0 g; CaCl₂ 2H₂O, 2.0 g; ZnSO₄ 7H₂O, 2.2 g; MnSO4 4H₂O, 0.5 g; CuSO₄ 5H₂O, 1.0 g; (NH₄)6Mo₇O₂₄ 4H₂O, 0.1g; and Na₂B₄O₇ 10H₂O, 0.02 g) 10.0 ml, (per liter of 5 M HCI)에 10g/L의 글루코오스와 1g/L의 효모추출물 및 50㎍/ml의 ampicillin을 각각 넣고 재조합 대장균 BVMOsm1을 접종하여, 37℃에서 진탕배양하고, 600nm에서 배양액의 흡광도가 0.4~0.5일 때 최종 농도가 0.4 mM 이 되도록 IPTG를 넣어 3시간 더 배양 시킨 뒤 기질로 사용될 각각의 기질(Cyclobutanone, Cyclopentanone, Cyclohexanone, Cycloheptanone, Cyclooctanone; Sigma and aldrich)이 1 g/L 가 되도록 넣고(기질은 ethanol에 농축하여 제조하여 반응액과 1% v/v 이 되게 하여 첨가함) 25℃ 에서 24 시간 반응 시켰다.

대조군으로는 대장균 BL21을 사용하였으며, 대조군과 BVMOsm1에 대해 각각 5가지 기질에 대한 성장조건(growing condition)에서 Whole-cell biotransformation 반응을 실시한 후 생성물로의 전환율을 나타내었다(표 1).

표 1에 나타난 바와 같이, BVMOsm1은 cyclobutanone 기질에 가장 높은 특이성을 보였고, cyclohexanone 기질에서 caprolactone으로의 전환율도 약 60% 정도 보여주었다.

비성장조건(non-growing condition)에서는 IPTG induction 후 4시간을 진탕 배양시키고 원심분리를 이용하여 세포를 수확하고, 20mM Sodium phosphate 버퍼로 1 회 세척한 후, 50ml의 20mM Sodium phosphate 버퍼(pH 6.8)에 현탁시키고 각각의 기질을 넣어 동일하게 25℃에서 24시간 반응시켰다(Geitner, K et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 88:1087-1093). cyclobutanone 기질에 대한 gamma butyrolactone 산물 전환율은, 성장배지에서 지속적으로 성장시키고, 기질첨가 후 24시간 동안 전환율을 보는 growing cell biotransformation 조건에서 81%이였던 것에 비하여, 비성장 조건에서 100%로 증가하였다(도 5) .

비성장조건(non-growing condition) 반응 후 원심분리를 통해 세포를 분리하고 배양 후의 배지 1 ml과 동일한 양의 ethylacetate(EA)를 잘 혼합하여 추출하고 원심분리한 후 상층액인 유기상(organic phase)을 취하여 이를 GC로 분석하였다. GC 분석조건은 Agilent19091J-413 (capillary 30.0 M x 320μM x 0.25 μM) 칼럼을 사용하여 50℃ 2분, 70℃(5℃/min) 2분, 250℃(10℃/min) 5분의 조건으로, 온도를 증가시키며 분석하였다. 그 결과, cyclobutanone 기질 첨가시 r-butyrolatone으로 100% 전환되는 것으로 나타났다(도 6).

대장균 BVMOsm1을 배양한 후, 0.4mM IPTG로 3시간 동안 BVMOsm1을 발현유도 시킨 후, BVMOsm1 단백질을 His-tag magnetic resin을 이용하여 분리하였다(도 7). 상기 분리된 BVMOsm1 단백질과 대장균 BVMOsm1을 초음파 파쇄한 lysate를 가지고 스크리닝에서 사용했던 형광기질인 2-coumaryloxycyclopentanone을 이용하여 NADPH와 같이 반응시켜 형광기반 활성분석을 수행하였다.

그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, 조효소 의존적인 BVMO 특성대로 NADPH의 양이 많아질수록 형광의 활성이 높았으며, negative control과 비교해 월등한 BV-산화 반응을 보여주었다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태을 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechology <120> Novel Baeyer-Villiger monooxygenase BVMOsm1 from Metagenome <130> P14-B185 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 502 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> metageome <400> 1 Met Asp His Val Asp Val Val Ile Ile Gly Ala Gly Leu Ser Gly Ile 1 5 10 15 Gly Ala Ala Arg Gln Leu Gln Asp Gln Cys Pro Asp Lys Thr Phe Ala 20 25 30 Ile Leu Glu Ala Arg Asp Ala Ile Gly Gly Thr Trp Asp Leu Phe Arg 35 40 45 Tyr Pro Gly Ile Arg Ser Asp Ser Asp Met Tyr Thr Met Gly Tyr Asn 50 55 60 Ser Lys Pro Trp Thr Glu Pro Lys Ala Ile Ala Asp Gly Pro Ser Ile 65 70 75 80 Leu Ser Tyr Val Val Glu Ala Ala Gln Glu Arg Gly Leu Thr Glu Lys 85 90 95 Ile Arg Phe Gly His His Val Lys Ala Ala Ala Trp Ser Ser Arg Asp 100 105 110 Ala Thr Trp Thr Leu Asp Ala Glu Thr Lys Asp Gly Glu Arg Arg Gln 115 120 125 Ile Ser Cys Asn Val Leu Phe Val Cys Ser Gly Tyr Tyr Asn Tyr Asp 130 135 140 His Gly Tyr Thr Pro Thr Phe Ala Gly Ile Asp Asp Phe Thr Gly Thr 145 150 155 160 Val Val His Pro Gln His Trp Pro Gln Asp Leu Asp Tyr Ala Gly Lys 165 170 175 Arg Val Val Ile Ile Gly Ser Gly Ala Thr Ala Met Thr Leu Val Pro 180 185 190 Ala Met Ala Lys Thr Ala Ala Asn Val Thr Met Leu Gln Arg Ser Pro 195 200 205 Thr Tyr Val Val Ser Met Pro Ala Val Asp Pro Ile Ala Lys Leu Ile 210 215 220 Asn Ala Val Leu Pro Glu Arg Leu Ala Tyr Arg Leu Ile Arg Trp Lys 225 230 235 240 Asn Val Gln Phe Gln Arg Tyr Phe Tyr Gly Gln Thr Arg Lys His Pro 245 250 255 Glu Lys Val Lys Arg Lys Leu Leu Gly Met Leu Arg Lys Gln Leu Gly 260 265 270 Pro Asp Tyr Asp Ile Gly Lys His Phe Thr Pro Ser Tyr Lys Pro Trp 275 280 285 Asp Gln Arg Leu Cys Leu Val Pro Asp Ala Asp Leu Phe Lys Ala Ile 290 295 300 Arg Ser Gly Lys Ala Asp Val Val Thr Asp Glu Ile Glu Arg Ile Thr 305 310 315 320 Glu Arg Gly Ile Ala Leu Lys Ser Gly Glu His Leu Glu Ala Asp Val 325 330 335 Ile Val Thr Ala Thr Gly Leu Glu Leu Glu Val Leu Gly Gly Ala Lys 340 345 350 Tyr Thr Val Asp Gly Gln Pro Val Ser Phe Pro Asp Thr Tyr Ser Tyr 355 360 365 Lys Gly Met Met Phe Ser Gly Val Pro Asn Leu Ile Tyr Thr Ile Gly 370 375 380 Tyr Ile Asn Ala Ser Trp Thr Leu Arg Ser Glu Leu Val Ala Glu Phe 385 390 395 400 Val Cys Arg Leu Val Asn Arg Met Ser Glu Leu Gly Thr Arg Arg Cys 405 410 415 Val Pro Arg Leu Arg Asp Glu Asp Gln Gly Met Pro Glu Tyr Arg Met 420 425 430 Ile Glu Asp Phe Ser Pro Gly Tyr Met Gln Arg Gly Met His Leu Phe 435 440 445 Pro Lys Gln Gly Asp Arg Asp Pro Trp Arg Asn Thr Gln Asn Tyr Thr 450 455 460 Leu Asp Lys Glu Ile Ile Arg Asn Ala Pro Ile Asp Asp Gly Val Leu 465 470 475 480 Asp Phe Ser Asp Glu Pro Ala Ala Thr Gly Ala Glu Asp Ala Ala Glu 485 490 495 Ala Thr Arg Thr Ala Ala 500 <210> 2 <211> 1509 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> metageome <400> 2 atggatcatg tcgacgtagt cattatcggc gctggcctgt ccggcatcgg cgcagcacgg 60 cagttgcagg atcaatgtcc tgacaaaacg tttgcgatcc tcgaagcgcg cgacgcaatc 120 ggcggcacct gggatttgtt ccgctacccg ggcatccgct ccgacagcga catgtatacg 180 atgggctaca actcgaagcc gtggaccgaa ccgaaggcga ttgccgatgg cccgtcgatc 240 ctgtcctacg tggtcgaggc cgcgcaagaa cgcggcctga ccgaaaaaat acgctttggt 300 catcacgtga aagccgcggc atggtcgagc agggacgcaa catggacgct cgacgcggaa 360 acgaaggacg gtgaacgtcg gcagatttcg tgcaacgtgc ttttcgtctg cagcggttac 420 tacaactacg atcatggtta cacgccgacg ttcgcgggta tcgacgattt taccggcacg 480 gtcgttcatc cgcagcactg gccgcaggac ctcgattacg cgggcaagcg cgtcgtgatc 540 atcggcagtg gcgcaacggc aatgacgctc gtgccggcga tggcgaaaac ggctgcaaac 600 gtcacgatgc tgcagcgctc cccaacctac gttgtttcca tgccggcagt cgatcccatc 660 gcgaagctga tcaacgcggt gttgccggag cggctcgcct atcgtctgat ccgctggaag 720 aacgtgcagt tccagcggta tttctacggg cagacgcgca aacatccgga gaaggtgaaa 780 cgaaaactgc tcggcatgct gcgcaagcaa ctcggtccgg actatgacat cggcaaacat 840 ttcacgccga gctacaaacc ctgggatcag cgtctgtgcc tcgtgccgga cgccgatttg 900 ttcaaggcca ttcgttccgg caaagccgac gtcgtgaccg acgaaatcga acggatcacc 960 gagcgcggca tcgcgctgaa atccggcgaa catcttgagg ccgatgtcat cgtcacggcg 1020 accgggctcg aactcgaggt gctcggcggc gcgaaataca ccgttgatgg gcagccggtc 1080 agctttccgg atacttattc ctacaagggc atgatgtttt ccggcgtacc gaacctcatt 1140 tacacgatcg gttacatcaa cgcgtcatgg acgctgcgtt cggaactcgt cgcggagttc 1200 gtctgccggc tcgttaatcg catgagcgaa ctcggtacgc gccgctgtgt gccgcgcctg 1260 cgggacgagg accagggcat gccggaatac cgcatgatcg aggacttctc gcccggctac 1320 atgcagcgcg gcatgcattt gttcccgaaa cagggggacc gcgatccctg gcgcaacacg 1380 cagaattaca cgctcgacaa ggagatcatt cgcaacgcgc cgatcgacga cggggtgctg 1440 gatttcagcg atgaaccggc agcaaccggc gcggaggatg cggccgaagc aacgcgtacc 1500 gcggcctga 1509 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggagatatac atatggatca tgtcgacgta gtcattatcg 40 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gtgcggccgc aagcttggcc gcggtacgcg ttg 33

Claims (10)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 베이어-빌리거 모노옥시게나아제(Baeyer-Villiger monooxygenase).
   
2. 제1항의 베이어-빌리거 모노옥시게나아제(Baeyer-Villiger monooxygenase)를 코딩하는 유전자.
   
3. 제2항에 있어서, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 유전자.
   
4. 제2항의 유전자를 함유하는 재조합 벡터.
   
5. 제2항의 유전자 또는 제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물.
   
6. 제5항에 있어서, NADH 재생능을 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
   
7. 다음 단계를 포함하는 베이어-빌리거 모노옥시게나아제의 제조방법:
   (a) 제5항의 재조합 미생물을 배양하여 베이어-빌리거 모노옥시게나아제를 생성시키는 단계; 및
   (b) 상기 생성된 베이어-빌리거 모노옥시게나아제를 수득하는 단계.
   
8. 제1항의 베이어-빌리거 모노옥시게나아제를 이용하여 탄소화합물을 베이어-빌리거 산화시키는 방법.
   
9. 제5항의 재조합 미생물을 이용하여 탄소화합물을 베이어-빌리거 산화시키는 방법.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 산화반응은 재조합 미생물의 성장조건 또는 비성장조건에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.

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