KR101615891B1

KR101615891B1 - 아스팔라틴 또는 노토파긴을 함유하는 패혈증의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101615891B1
Application number: KR1020140156831A
Authority: KR
Inventors: 배종섭
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2014-11-12
Filing date: 2014-11-12
Publication date: 2016-04-27

Abstract

본 발명은 아스팔라틴(Aspalathin) 및 노토파긴(Nothofagin)을 함유하는 패혈증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물은 HMGB1(high mobility group box 1)의 발현을 억제하고, CLP 수술법(cecal ligation and puncture operation)에 따른 마우스의 사망률을 억제하는 효과가 우수하여 패혈증의 예방 또는 치료용 의약 조성물이나 패혈증의 예방 또는 개선용 건강기능식품으로 용이하게 이용가능하다.

Description

아스팔라틴 또는 노토파긴을 함유하는 패혈증의 예방 또는 치료용 조성물 {Composition comprising aspalathin or nothofagin for preventing or treating sepsis}

본 발명은 아스팔라틴(Aspalathin) 또는 노토파긴(Nothofagin)을 함유하는 패혈증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

패혈증(sepsis, 敗血症)은 녹농균, 대장균, 연쇄상구균, 포도상구균, 폐렴균 같은 미생물에 감염되었을 때 미생물이나 그 미생물이 생산한 독소에 의해 오한과 함께 고열, 관절통, 두통, 권태감 등의 전신적인 증상이 나타나는 상태를 말한다. 이러한 증상이 심해지면 저혈압이 동반되고 소변량이 줄며 패혈성 쇼크가 나타나기도 한다(Nat. Med. 2003, 9, 517-524). 미생물의 감염 경로를 잘 알 수 없는 경우도 있으나 맹장염, 중이염, 피부화농증, 욕창, 폐질환, 담낭염, 신우염, 골수염 등이 패혈증의 원인 병소로 알려져 있다. 혈액검사와 소변검사, 뇌척수액 검사 등을 통해 패혈증을 진단할 수 있으며 백혈구 수와 급성염증성물질이 증가한 경우도 패혈증을 진단하는데 도움을 준다.

아직까지 패혈증의 치료를 위한 근본적인 치료제는 확인되지 않은 상태이다. 패혈증은 통상적인 염증 억제 치료방법으로는 잘 낫지 않으며, 유일하게 FDA 승인을 받은 드로트레코긴 알파(drotrecogin alfa, Xigris^®, Engl. J. Med. 2012, 366, 2055-2064)조차도 임상단계에서 패혈증에 대한 치료 효과가 명확하지 않아 이에 대한 연구가 중단되어 있는 실정이다. 현재 패혈증은 주로 항생제나 항진균제 주사로 치료하고, 치료 약제와 기간은 미생물의 종류에 따라 결정한다. 또 환자의 상태에 따라 혈액투석 또는 수혈을 하기도 한다. 항생제와 항진균제가 잘 들으면 패혈증은 완치되기도 하지만, 약제에 내성이 있는 미생물에 감염된 경우와 면역력이 약한 환자인 경우, 또 너무 늦게 치료를 시작한 경우 등에서는 치료가 어려워 환자가 사망하기도 한다. 또한, 패혈증의 사망률은 50~70%에 달해 매우 높은 편이며, 전세계적으로도 사망의 원인 중에서 높은 비중을 차지하는 것으로 알려져 있다(Nat. Med. 2003, 9, 517-524). 패혈증에 대한 합병증이 발생할 경우에는 후유증이 생길 수 있다. 합병증으로 뇌막염이 있는 경우에는 신경학적 후유증이, 화농성 관절염이 함께 나타났을 경우에는 뼈 성장에 이상이 생기기도 한다.

루이보스(Rooibos, Aspalathus linearis)는 콩과 식물에 속하는 침엽수다. 남아프리카 공화국 케이프타운 북쪽에 있는 세더버그(Cederberg) 산맥 일대에만 자생한다. "루이보스"란 아프리칸스어로 "붉은"(rooi)+"관목"(bos)이란 뜻이다. 루이보스의 잎을 건조하여 차로 이용하는데, 단맛이 나고 카페인이 없으며 타닌 농도도 극히 낮고 항산화 작용이 뛰어난 것으로 알려져 있다. 케이프 지방의 원주민 코이산족(Khoisan)은 예로부터 이 루이보스 차의 효능을 알고 있어, 약초로 채집하였다고 한다. 근래에는 루이보스의 각종 생리활성기능이 알려지면서 약학적 용도로의 활용도에 관해 관심이 집중되고 있다. 아스팔라틴(Aspalathin)과 노토파긴(Nothofagin)은 루이보스의 잎에 함유되어 있는 주요 플라보노이드 화합물(Anal. Biochem. 2005, 347, 182-192)로서, 근래에는 이 화합물들의 항산화성과 같은 생리활성에 관한 연구가 활발하게 진행 중이다(Phytother Res. 2007, 21, 1-16).

HMGB1(high mobility group box 1)은 패혈증이 진행되어 혈관의 손상이 있을 때 발현되는 단백질로서(Toxicol. Appl. Pharm. 2012, 262, 91-98; J. Cell. Physio. 2013, 228, 975-982), 본 발명자들은 아스팔라틴(Aspalathin) 또는 노토파긴(Nothofagin) 화합물이 HMGB1의 발현을 억제함으로써 패혈증의 치료 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

한편, 유럽공개특허 제2133088호에는 루이보스의 추출물이 항염 효과가 있음이 개시되어 있으며, [Pediatr Int. 2009, 51(5), 700-704]에도 아스팔라틴과 노토파긴이 포함된 루이보스 차가 항염증 효과가 있음이 개시되어 있기는 하지만, 아스팔라틴과 노토파긴 화합물 자체의 활성을 확인하거나, 패혈증 관련 치료 효과를 확인한 선행문헌은 아직까지 확인되지 않았다.

유럽공개특허 제2133088호 (Rooibos and inflammation, 2009.12.16. 공개)

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본 발명의 목적은 아스팔라틴(Aspalathin) 또는 노토파긴(Nothofagin)을 함유하는 패혈증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 하기 화학식 1의 아스팔라틴(Aspalathin, 화합물 1) 및 노토파긴(Nothofagin, 화합물 2) 중 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 패혈증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

상기 화학식 1의 화합물은 HMGB1(high mobility group box 1)의 발현을 억제하는 효과가 있다. 상기 화합물은 상기 조성물에 0.001~30 중량%로 첨가될 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 화학식 1의 아스팔라틴(Aspalathin, 화합물 1) 및 노토파긴(Nothofagin, 화합물 2) 중 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 패혈증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

상기 건강기능식품은 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 및 비타민 복합제로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 또한, 상기 화합물은 상기 건강기능식품에 0.001~30 중량%로 첨가될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 상기 화학식 1의 아스팔라틴 및 노토파긴 중 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 패혈증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

상기 화합물들은 통상의 방법을 이용하여 실험실에서 합성될 수 있으며, 또는 루이보스 추출물로부터 분리 정제된 것을 사용할 수 있다.

상기 루이보스 추출물은 루이보스를 물, 탄소수 1 내지 4개의 저급 알코올, 각종 유기용매 또는 이들의 혼합용매로 추출 농축하여 얻은 것일 수 있다. 이 외의 추출조건은 제한되지는 않으나, 상기 물, 탄소수 1 내지 4개의 저급 알코올, 각종 유기용매 또는 이들의 혼합용매는 루이보스 중량의 1~20배를 가하는 것이 바람직하며, 추출온도는 20~100℃인 것이 바람직하고, 추출시간은 1시간 내지 7일 이내가 바람직하다. 상기 루이보스 추출물은 상법에 따라, 물 또는 각종 유기용매에 의한 추출, 유기용매와 물의 분배, 칼럼크로마토그래피에 의한 방법 등, 식물체 성분의 분리 추출에 이용되는 공지의 방법을 단독 또는 적합하게 조합한 방법을 이용하여 분획 또는 정제하여 사용할 수 있다.

바람직하게는 상기 루이보스 추출물은 루이보스를 물, 탄소수 1 내지 4개의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출 농축하여 얻은 루이보스 추출물을 루이보스 추출물의 중량의 1~50배의 물을 가하여 현탁한 후, 상기 현탁물에 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 및, 부탄올로 이루어진 군에서 선택되는 용매를 가하여 얻은 루이보스 분획물로 제조할 수 있다. 상기 루이보스 분획물은 바람직하게는, 루이보스를 물, 탄소수 1 내지 4개의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출 농축하여 얻은 루이보스 추출물을 물에 현탁한 후 헥산과 혼합하여 얻은 헥산층의 농축물, 상기 헥산층을 제거하고 남은 잔사(물층)에 클로로포름을 혼합하여 얻은 클로로포름층의 농축물, 또는 상기 클로로포름층을 제거하고 남은 잔사(물층)에 에틸아세테이트를 혼합하여 얻은 에틸아세테이트층의 농축물, 상기 에틸아세테이트층을 제거하고 남은 잔사(물층)에 부탄올을 혼합하여 얻은 부탄올층의 농축물, 또는 상기 부탄올층을 제거하고 남은 잔사(물층)의 농축물일 수 있다. 한편, 이 외의 분획조건은 제한되지는 않으나, 상기 루이보스 추출물에 루이보스 추출물의 중량의 1~50배의 물을 가하여 현탁물을 제조한 후, 상기 물과 동량의 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 및, 부탄올로 이루어진 군에서 선택되는 용매를 가하여 분획할 수 있다. 또한, 헥산층을 제거한 후 남은 잔사에 클로로포름을 가하고, 클로로포름층을 제거하고 남은 잔사에 에틸아세테이트를 가하고, 에틸아세테이트를 제거하고 남은 잔사에 부탄올을 가할 때에도, 단계적으로 이루어 질 때도 역시 잔사와 동량의 각 용매(클로로포름, 에틸아세테이트 또는 부탄올)를 순차적으로 가하여 분획할 수 있다. 이 때의 각 분획시간은 특별히 제한되지는 않으나 10분 내지 1일 이내인 것이 바람직하다.

상기 루이보스 추출물을 분획하거나 이로부터 아스팔라틴 및 노토파긴을 분리할 때 크로마토그래피를 이용할 수 있는데, 상기 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 엘에이취-20 컬럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 이온교환수지 크로마토그래피(ion exchange resin chromatography), 중압 액체 크로마토그래피(MPLC; medium pressure liquid chromatography), 박층 크로마토그래피(TLC; thin layer chromatography), 실리카겔 진공 액체 크로마토그래피(silica gel vacuum liquid chromatography), 역상 크로마토그래피(reversed phase chromatography) 및 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 중에서 선택될 수 있다.

상기 루이보스 추출물은 루이보스의 전초, 뿌리, 잎, 줄기 등으로부터 추출가능하며, 바람직하게는 차로 주로 이용되는 잎을 사용하는 것이 더 좋다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 아스팔라틴 및 노토파긴 중 1종 이상의 화합물 및 약제학적 부형제를 함유하는 패혈증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 약제학적 부형제, 즉, 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 아스팔라틴 및 노토파긴 중 1종 이상의 화합물 및 약제학적 부형제를 함유하는 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01 ㎎/㎏/일 내지 대략 2000 ㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1 ㎎/㎏/일 내지 500 ㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 상기 화합물은 본 발명의 약학 조성물에 바람직하게는 0.001~90 중량%, 더 바람직하게는 0.001~50 중량%, 가장 바람직하게는 0.001~30 중량%로 하여 첨가될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 아스팔라틴 및 노토파긴 중 1종 이상의 화합물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 패혈증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다. 상기 화합물들은 본 발명의 건강기능식품에 바람직하게는 0.001~90 중량%, 더 바람직하게는 0.001~50 중량%, 가장 바람직하게는 0.001~30 중량%로 하여 첨가될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 및 비타민 복합제 등이 있다.

도 1A는 본 발명의 화합물 아스팔라틴(Asp) 및 노토파긴(Not)에 대한 세포독성을 MTT 어세이를 통해 확인한 결과이다.
도 1B는 본 발명의 화합물 아스팔라틴(Asp) 및 노토파긴(Not)이 CLP 수술법(cecal ligation and puncture operation)으로 유도된 패혈증 동물 모델에서 HMGB1의 생성을 억제하는 것을 확인한 결과이다.
도 2A는 본 발명의 화합물 아스팔라틴(Asp) 및 노토파긴(Not)이 HMGB1으로 유도된 패혈증 세포 모델에서 세포벽 손상으로 인해 증가된 투과성을 억제하는 것을 확인한 결과이다.
도 2B는 본 발명의 화합물 아스팔라틴(Asp) 및 노토파긴(Not)이 HMGB1으로 유도된 패혈증 동물 모델에서 혈관 내로 주입된 염료가 복강으로 누출되는 것을 억제하는 것을 확인한 결과이다.
도 3A는 본 발명의 화합물 아스팔라틴(Asp) 및 노토파긴(Not)이 CLP 수술법으로 유도된 패혈증 모델 동물들의 사망률을 줄이는 것을 확인한 결과이다.
도 3B 및 도 3C는 본 발명의 화합물 아스팔라틴(Asp) 및 노토파긴(Not)이 CLP 수술법으로 유도된 패혈증 모델 동물들의 폐 조직 손상을 억제하는 것을 H&E 염색법(Hematoxylin & Eosin staining)으로 확인한 수치상의 결과(도 3B)와 이를 촬영한 사진(도 3C)이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 아스팔라틴 및 노토파긴의 준비>

아스팔라틴(Aspalathin)은 Sigma(St. Louis, MO, USA) 제품(Catalog No. 6027-43-6)을 구입하였고, 노토파긴(Nothofagin)은 Chem Faces(Wuhan, China) 제품(Catalog No. CFN92888)을 구입하였다.

<실시예 2. 세포독성 확인>

본 발명의 화합물들이 세포독성이 있는지를 확인하기 위해, MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 어세이를 수행하였다. HUVEC을 96웰 플레이트에 웰당 5×10³개로 분주한 후, 24시간 후에, ESM(effective screening medium) 배양액으로 교체하였다. 이 때 본 발명의 화합물 아스팔라틴(Asp, 화합물 1) 및 노토파긴(Not, 화합물 2)을 최종농도가 30 μM이 되도록 처리하고, 48시간 후, 100 ㎕의 1 ㎎/㎖ MTT 용액을 세포에 더하여 4시간 동안 반응시켰다.

이 후 DMSO(dimethyl sulfoxide) 150 ㎕를 더하여, 세포 내에 생성된 포마잔염(formazan salt)을 용해시킨 후, 이 포마잔의 양을 Microplate reader(Tecan Austria GmbH, Austria)를 이용하여 540 nm에서 측정하였으며 이에 대한 결과를 도 1A에 나타내었다.

도 1A를 참고하면, 본 발명의 화합물 아스팔라틴(Asp, 화합물 1) 및 노토파긴(Not, 화합물 2) 모두 세포독성이 없는 것으로 확인된다.

<실시예 3. CLP 수술법을 이용한 패혈증 동물모델 유도>

마우스의 맹장을 터트리는 CLP 수술법(cecal ligation and puncture operation)을 이용하여 마우스에 패혈증을 유도하였다. CLP 수술에 이용된 마우스는 수컷 C57BL/6 마우스를 이용하였고, 각 군당 10마리씩 이용하였다(6~7주령 및 체중 18~20g의 마우스를 구입하고 12일간 실험실에서 순응화한 후 사용, Orient Bio Co. Sungnam, Kyungki-Do, Republic of Korea). 마우스를 졸레틸 50(zoletil 50) 및 3%(w/v) 이소플루란(isoflurane, Forane^®, Choongwae Pharma. Corp., Seoul, Korea)으로 마취시켰다. 패혈증 모델을 유도하기 위해 배 부위 2㎝ 절개를 하여 맹장과 근처의 창자를 노출시켰다. 맹장 끝으로부터 5 ㎜ 부위의 맹장을 3.0-실크 봉합선으로 강하게 묶고, 22-게이지 바늘로 이를 터트렸다. 맹장을 부드럽게 짜 내어 천공 부위를 통해 소량의 배설물(장내 소화물)이 누출되게 하였고, 이 배설물을 복강에 노출시켰으며, 개복부위를 4.0-실크 봉합선으로 봉합하였다. 대조군(sham, sham-operated mice)은 맹장을 묶고 터트리는 단계를 수행하지 않고 단순히 배만 절개하고 다시 봉합하였다. 각 마우스들은 CLP 수술 24시간 후부터 패혈증 증상에 노출되었는데, 전율(shivering)이 있거나 털이 곤두서거나(bristled hair) 또는 무기력증(weakness) 등의 현상이 나타났다.

<실시예 4. 패혈증 동물모델에서의 혈중 HMGB1 농도 확인>

실시예 3의 방법으로 CLP 수술을 수행한 마우스에 본 발명의 화합물 아스팔라틴(Asp, 화합물 1) 및 노토파긴(Not, 화합물 2)(10, 30 μM/mouse)을 정맥투여하였다(CLP 수술을 수행 후 12시간 후에 투여).

한편, 각 화합물의 동물 투여 농도의 μM/mouse 값은 ㎍/mouse로 표현하였을 때, 하기와 같으며, 이후의 동물 실험에서는 이들 화합물의 농도값을 모두 μM/mouse로 기재하였다.

* 아스팔라틴 : 10 μM/mouse = 9.1 ㎍/mouse,

30 μM/mouse = 27.1 ㎍/mouse.

노토파긴 : 10 μM/mouse = 8.7 ㎍/mouse,

30 μM/mouse = 26.2 ㎍/mouse.

CLP 수행 24시간 후 마우스를 희생하여 혈액을 채취한 후 2000×g에서 5분간 원심분리하여 혈청 샘플을 얻었다. 상기 혈청 샘플을 이용하여 ELISA(competitive enzyme-linked immunosorbent assays)를 수행하기 위해 96웰 플레이트(96-well plastic flat microtiter plates, Corning, NY, USA)에 HMGB1 단백질(Taipei City, Taiwan, 20mM carbonate/bicarbonate buffer[pH 9.6] containing 0.02%[w/v] sodium azide)을 코팅하여 4℃에서 18시간 이상 밤을 지새워 반응하였다. 이 후, 플레이트를 PBS-T(PBS-0.05%[w/w] Tween 20)로 3번 세척한 후, PBS-T를 넣어서 4℃에서 18시간 이상 밤을 지새워 보관하였다.

한편, HMGB1 단백질(Taipei City, Taiwan, 단백질 정량용, PBS-T에 희석), 마우스의 혈청 샘플은 각각 96웰 플레이트에서 항-HMGB1 항체(Santa Cruz, CA, PBS-T에 1:1000 희석)와 37℃에서 90분간 전반응시켰다. 상기 마우스의 혈청 샘플은 1mM PMSF, 1mM Na₃VO₄, 1mM NaF, 1㎍/㎖ 아프로티닌(aprotinin), 1㎍/㎖ 펩스타틴(pepstatin), 1㎍/㎖ 류펩틴(leupeptin) 및 10% RIPA lysis buffer(Upstate Biotechnology, USA)를 함유하고 있는 단백질 분리 시약을 이용해 4℃에서 1시간 동안 볼텍싱(vortexing)하여 분해시킨 후 원심분리(15000rpm, 4℃, 20분)하여 얻은 상층액이다.

상기 항체가 전반응된 HMGB1 단백질, 마우스 혈청 샘플을 HMGB1이 코팅된 플레이트로 옮겨 실온에서 30분간 반응시켰다. 이 후, 각 플레이트들은 PBS-T로 3번 세척하였고, 실온에서 90분간 2차 항체(peroxidase-conjugated anti-goat IgG antibodies, R&D Systems, PBS-T에 1:2000 희석)와 반응시켰다.

각 플레이트들을 PBS-T로 3번 세척한 후, 실온의 암실에서 60분간 200㎕씩의 기질용액(100㎍/㎖ o-phenylenediamine & 0.003% H₂O₂)을 처리하였다. 다음으로는 50㎕의 8N H₂SO₄으로 모든 반응을 중단시킨 후, 490nm에서 흡광도를 확인하였으며, 이에 대한 결과는 도 1B에 나타내었다.

도 1B를 참고하면, CLP 수술법으로 유도된 패혈증 동물에서 본 발명의 화합물 아스팔라틴(Asp, 화합물 1) 및 노토파긴(Not, 화합물 2)이 HMGB1의 발현을 현저하게 억제하는 효과가 있는 것으로 확인된다.

<실시예 5. 패혈증 세포 모델에서의 혈관세포의 투과성 억제 효과 확인>

HUVEC 세포를 Cambrex Bio Science(Charles City, IA, USA)에서 구입하였으며, EBM-2 기본 배지(basal media) 및 이에 공급되는 성장 보충물(Cambrex Bio Science)을 첨가하여 배양하였다.

패혈증 세포 모델은 HUVEC 세포에 HMGB1을 처리하여 유도하였다. 이를 위해, 본 발명의 화합물 아스팔라틴(Asp, 화합물 1) 및 노토파긴(Not, 화합물 2)을 농도별(2.5~30 μM)로 처리한 후 각 화합물이 HMGB1을 통해 유도된 혈관벽 손상(혈관의 미세한 천공으로 인해 투과성이 생김)을 복구하는지를 다시 한번 확인하였다. 이를 위해 HUVEC에 대한 투과성을 확인하였으며, 2-챔버 모델(2-compartment chamber model, Blood 2011, 118, 3952-3959)을 이용해 배양된 세포층에서의 에반스 블루와 결합된 알부민(Evans blue-bound albumin)의 흐름을 정량적으로 측정하였다.

HUVEC은 5×10⁴/웰(well)로 3 μm pore size의 12 ㎜ 직경의 트랜스웰( transwell)에서 3일 동안 배양되었다. 세포가 각 트랜스웰에 가득 차면 각각의 화합물을 6시간 동안 처리하였고, 이 후 다시 HMGB1(1 ㎍/㎖)을 처리하여 16시간 동안 반응시켰다. 이 후 각 트렌스웰을 PBS(pH 7.4)로 세척하였고, 4%(w/v) BSA가 포함된 세포배양배지에 희석된 0.5 ㎖의 에반스 블루 용액(0.67 ㎎/㎖)을 준비하였다. 신선한 세포배양배지가 하단의 챔버에 더해졌고, 상단의 챔버에는 상기 에반스 블루 용액으로 교체되었다. 10분 후, 하단 챔버의 OD(Optical density)를 650 nm에서 측정하였고 이에 대한 결과는 도 2A에 나타내었다.

도 2A를 확인하면, 본 발명의 아스팔라틴(Asp, 화합물 1) 및 노토파긴(Not, 화합물 2)이 모두 세포손상으로 인한 염료의 투과성을 억제하는 것을 확인할 수 있으며, HMGB1 유도된 패혈증 세포 모델에서의 혈관 손상 억제 효과가 우수함을 알 수 있다.

<실시예 6. HMGB1을 이용한 패혈증 동물 모델에서의 혈관세포의 투과성 억제 효과 확인>

수컷 C57BL/6 마우스를 준비하고(각 군당 10마리씩 준비), 6-7주령 및 체중 18~20g의 마우스를 구입하고 12일간 실험실에서 순응화한 후 사용, Orient Bio Co. Sungnam, Kyungki-Do, Republic of Korea), 상기 마우스에 HMGB1(2 ㎍/mouse)를 정맥주사한 후, 16시간 후에 아스팔라틴(Asp, 화합물 1)(10, 30 μM/mouse) 및 노토파긴(Not, 화합물 2)(10, 30 μM/mouse)을 정맥주사를 통해 처리하고 6시간 후 살린(saline) 용액에 녹인 1%(w/v) 에반스 블루 용액을 정맥주사하였다.

에반스 블루 용액을 정맥주사한 지 2시간 후 마우스를 희생시키고, 복강을 5㎖의 살린 용액으로 세척하면서 복막 삼출물(peritoneal exudate)을 모아 200×g에서 10분간 원심분리하였다. 상기 원심분리물의 상청액(supernatant)의 흡광도는 650nm에서 확인하였다. 이는 에반스 블루 용액의 염료가 복강 내로 흘러나온 것을 통해 혈관세포에 생긴 미세천공으로 인한 투과성을 확인할 수 있기 때문이다(Int. Immunopharmacol. 2009, 9, 268-276). 상기 결과는 도 2B에 나타내었다.

상기 도 2B를 참고하면, HMGB1이 처리된 마우스에서 다량의 염색약 누출이 있는 것을 알 수 있는데, 상기 마우스에 아스팔라틴(Asp, 화합물 1) 및 노토파긴(Not, 화합물 2)이 처리된 군에서는 염색약의 누출이 현저하게 억제되었음을 알 수 있다. 이에 패혈증 세포 모델 실험에서와 마찬가지로 상기 화합물들이 혈관벽 손상을 보호함으로써 패혈증을 억제함을 입증할 수 있다.

<실시예 7. CLP 수술한 패혈증 동물모델에서의 생존율 확인>

실시예 3의 방법으로 CLP 수술을 수행한 마우스에 본 발명의 아스팔라틴(Aspalathin, 화합물 1, 30 μM/mouse) 및 노토파긴(Nothofagin, 화합물 2, 30 μM/mouse)을 2회 정맥투여하였다(CLP 수술을 수행 후 12시간 및 50시간, 총 2회 투여)(각 군당 20마리). 마우스의 생존은 CLP 수술을 수행한 지 6시간 후부터 132시간까지 확인하였고(카플란-마이어의 생존 분석법[Kaplan-Meier survival analysis]에 따라 관찰), 시간에 따른 마우스의 생존결과는 도 3A에 나타내었다.

도 3A를 참고하면, 본 발명의 아스팔라틴(Aspalathin, 화합물 1) 및 노토파긴(Nothofagin, 화합물 2)을 투여한 마우스 그룹은 CLP 수술 이후 132시간 째에 각각 30~50%의 생존율을 갖는 것으로 확인되어 패혈증의 치료 효과가 우수함을 알 수 있다.

< 실시예 8. H&E 염색법을 이용한 마우스 폐의 조직상태 확인>

실시예 3의 방법으로 CLP 수술을 수행한 마우스에 본 발명의 아스팔라틴(Aspalathin, 화합물 1, 30 μM/mouse) 및 노토파긴(Nothofagin, 화합물 2, 30 μM/mouse)을 2회 정맥투여하였다(CLP 수술을 수행 후 12시간 및 50시간, 총 2회 투여)(각 군당 20마리).

CLP 수술 96시간 후에 마우스를 희생시킨 후, 각 마우스의 폐 상태를 확인하였다. 이를 위해 각 폐 샘플을 CLP 수술을 한 마우스로부터 절제한 후, PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4)로 3번 세척하여 혈액을 제거한 후, PBS에 녹인 4% 포름알데히드(formaldehide, Junsei, Tokyo, Japan) 용액으로 4℃에서 20시간 동안 처리하여 각 조직을 고정하였다. 고정 이후, 에탄올에 여러번 세척하여 각 샘플의 수분을 제거한 후 각 샘플을 파라핀에 채워넣었고, 4μm의 두께로 얇게 잘라냈다. 이 후, 각 샘플 슬라이스를 60℃ 오븐에 넣어 파라핀을 제거하였고, 샘플 슬라이스에 다시 수분을 보충한 후, 헤마톡실린(hematoxylin, Sigma)으로 10분간 염색하였다.

각 조직에서 과염색된 염색약을 제거하기 위해서는 각 조직 슬라이스를 3번 0.3% 산성 알코올(acid alcohol)에 살짝 담근 후, 에오신(eosin, Sigma)으로 1분간 대비염색(counterstain)하였다. 이 후, 과염색된 것들을 에탄올과 자일렌(xylene)을 이용해 세척하여 모두 제거하였고, 현미경 관찰을 위해 커버슬립으로 밀봉하였다. 폐 조직의 상태는 [Shock, 2003, 19, 366-372]에 제시된 정상 폐 조직 형태, 조직 부종, 염증성 세포의 침입 등을 구분하여 나타낸 유형을 따라 관찰하였는데, 그 기준은 다음과 같다.

1점 : 정상 폐의 형태.

2점 : 소량의 호중성 백혈구(neutrophil leukocyte)의 침입.

3점 : 보다 많은 호중성 백혈구의 침입.

4점 : 다량의 호중성 백혈구의 침입. 혈관 주위에 일부 부종의 형성.

5점 : 다량의 호중성 백혈구의 침입, 혈관 주위의 부종의 형성, 정상적인 폐 조직 형태의 일부 파괴.

6점 : 다량의 호중성 백혈구의 침입, 고름집 형성, 정상적인 폐 조직의 완전한 파괴.

한편, 각 결과는 합산한 후, 평균값으로 나타낸다.

이 결과는 도 3B 및 도 3C에 나타내었는데, CLP 이후 아스팔라틴(Aspalathin, 화합물 1) 및 노토파긴(Nothofagin, 화합물 2)을 투여한 마우스 그룹은 폐 조직 상태가 CLP를 수행하지 않은 군(Sham)의 폐 조직과 유사한 형태로 회복이 되는 것을 확인할 수 있다.

< 실시예 9. 독성실험>

실시예 9-1. 급성독성

본 발명의 화합물 1(아스팔라틴)을 단기간에 과량을 섭취하였을 때 급성적(24시간 이내)으로 동물체내에 미치는 독성을 조사하고, 치사율을 결정하기 위하여 본 실험을 수행하였다. 일반적인 마우스인 ICR 마우스 계통을 각 군당 10마리씩 배정하였다. 대조군에는 PEG-400:Tween-80:에탄올(8:1:1, v:v:v) 만을 투여하고, 실험군은 본 발명의 화합물 1을 상기 PEG-400:Tween-80:에탄올(8:1:1, v:v:v)에 녹여 각각 경구투여하였다. 투여 24시간 후에 각각의 치사율을 조사한 결과, 대조군과 2g/㎏/day 농도의 본 발명의 화합물 1을 투여한 실험군에서 마우스가 모두 생존하는 것으로 확인되었다.

실시예 9-2. 실험군 및 대조군의 장기 및 조직 독성 실험

장기 독성 실험은 본 발명의 화합물 1(아스팔라틴)을 각 농도로 8주 동안 수컷 C57BL/6J 마우스(각 군당 10마리)에 투여하여 실험하였다. 동물의 각 장기(조직)에 미치는 영향을 조사하기 위하여 본 발명의 화합물 1을 투여한 실험군과 PEG-400:Tween-80:에탄올(8:1:1, v:v:v)만을 투여한 대조군의 동물들로부터 8주 후 혈액을 채취하여 GPT(glutamate-pyruvate transferase) 및 BUN(blood urea nitrogen)의 혈액 내 농도를 Select E(Vital Scientific NV, Netherland) 기기를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 간독성과 관계있는 것으로 알려진 GPT와 신장독성과 관계있는 것으로 알려진 BUN의 경우, 대조군과 비교하여 실험군은 별다른 차이를 보이지 않았다. 또한, 각 동물로부터 간과 신장을 절취하여 통상적인 조직절편 제작과정을 거쳐 광학현미경으로 조직학적 관찰을 시행하였으며 모든 조직에서 특이한 이상이 관찰되지 않았다.

<제제예 1. 약학적 제제>

제제예 1-1. 정제의 제조

본 발명의 화합물 1(아스팔라틴) 200 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10%(w/v) 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

제제예 1-2. 주사액제의 제조

본 발명의 화합물 1(아스팔라틴) 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

<제제예 2. 식품 제조>

제제예 2-1. 조리용 양념의 제조

본 발명의 화합물 1(아스팔라틴)을 조리용 양념에 1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

제제예 2-2. 밀가루 식품의 제조

본 발명의 화합물 1(아스팔라틴)을 밀가루에 0.1 중량%로 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

제제예 2-3. 스프 및 육즙(gravies)의 제조

본 발명의 화합물 1(아스팔라틴)을 스프 및 육즙에 0.1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 수프 및 육즙을 제조하였다.

제제예 2-4. 유제품(dairy products)의 제조

본 발명의 화합물 1(아스팔라틴)을 우유에 0.1 중량%로 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

제제예 2-5. 야채주스 제조

본 발명의 화합물 1(아스팔라틴) 0.5 g을 토마토주스 또는 당근주스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.

제제예 2-6. 과일주스 제조

본 발명의 화합물 1(아스팔라틴) 0.1 g을 사과주스 또는 포도주스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 과일주스를 제조하였다.

Claims

하기 화학식 1의 아스팔라틴(Aspalathin, 화합물 1) 및 노토파긴(Nothofagin, 화합물 2) 중 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 패혈증의 예방 또는 치료용 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서,
상기 화합물은 HMGB1(high mobility group box 1)의 발현을 억제하는 효과가 있는 것을 특징으로 하는 패혈증의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화합물은 상기 조성물에 0.001~30 중량%로 첨가되는 것을 특징으로 하는 패혈증의 예방 또는 치료용 조성물.
하기 화학식 1의 아스팔라틴(Aspalathin, 화합물 1) 및 노토파긴(Nothofagin, 화합물 2) 중 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 패혈증의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
[화학식 1]
제4항에 있어서,
상기 화합물은 HMGB1(high mobility group box 1)의 발현을 억제하는 효과가 있는 것을 특징으로 하는 패혈증의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제4항에 있어서,
상기 건강기능식품은 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 및 비타민 복합제로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 패혈증의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제4항에 있어서,
상기 화합물은 상기 건강기능식품에 0.001~30 중량%로 첨가되는 것을 특징으로 하는 패혈증의 예방 또는 개선용 건강기능식품.