KR101610866B1 - 개구리유래 반복서열을 포함하는 재조합 단백질, 이의 생산방법 및 이를 포함하는 섬유제조용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 개구리유래 반복서열 재조합 단백질 기반의 섬유 형태의 제조용 조성물에 관한 것으로, 개구리유래 반복서열 재조합 단백질은 말미잘 유래의 실크유사 단백질과 서열적 상동성을 갖는 10개의 아미노산으로 이루어진 기본 모듈이 1 내지 200번 반복되는 구조를 갖는 특이 단백질이다.　개구리유래 반복서열 재조합 단백질은 산추출을 통해 비교적 높은 순도로 대량생산될 수 있으며, 인공방사를 통해 나노 혹은 마이크로 단위의 섬유사로 제조될 수 있다. 개구리유래 반복서열 재조합 단백질 특유의 물성은 단백질이기에 가능한 생체분해성과 결부되어 넓은 산업분야에 적용을 꾀할 수 있을 것이며, 나아가 새로운 생물종에서 탐색 된 특이 반복구조 단백질이 재조합기술을 통해 대량생산과 제조할 수 있다는 점에서 원천소재의 응용으로서의 중요성도 갖는다.

Description

개구리유래 반복서열을 포함하는 재조합 단백질, 이의 생산방법 및 이를 포함하는 섬유제조용 조성물 {Repetitive recombinant protein derived from frog method for producing the same, and composition for preparing artificial fiber comprising the same}
본 발명은 개구리유래 반복서열을 포함하는 재조합 단백질, 이의 생산방법, 및 이를 포함하는 섬유제조용 조성물에 관한 것이다.
반복서열을 가지는 단백질은 특유의 2차구조와 물성으로 인해 많은 관심을 받고 있다. 일례로 엘라스틴(VPGVG), 콜라겐(GXY), 케라틴(AQQFRNQ), 누에 또는 거미 유래의 실크(GAGAGS, (A)n, GGQ, GAG, GGX)가 대표적인 예이다.
최근에는 곤충의 큐티클에 존재하는 반복서열인 레질린(AQTPSSQYGAP, GYSGGRPGGQDLG)이 재조합 단백질의 형태로 발현된 바 있으며, 해양유래인 조개의 관자(GGFGGM, GGGX) 또는 홍합 족사(GPGGG, GXGPG, XGGPG)에 존재하는 새로운 반복서열이 소개되었다.
특정 아미노산이 집중되어 있는 예측 가능한 반복서열의 배열은 단백질 제조를 더욱 용이하게 하는 근거가 되기도 한다. 뿐만 아니라 반복서열 기반의 단백질은 재조합 단백질 발현기술을 이용하여 대장균, 효모와 같은 생명체 내에서 대량생산을 통해 많은 양을 얻을 수 있다. 인공 폴리머와 달리 자연에서 유래한 천연 단백질 또는 재조합 단백질의 경우는 인공소재에서는 보기 힘든 생체적합성과 생분해성과 같은 장점을 가지고 있어 세포 재생을 위한 지지체로서 세포의 부착, 증식, 분화, 성장 등이 우수한 의료용 소재로서 가능성이 높다. 이러한 단백질은 섬유, 필름, 하이드로 겔, 박막, 스펀지 등과 같은 기존 인공 폴리머의 제조 형태로도 충분히 가공이 가능할 뿐 아니라, 전기소재, 렌즈, 센서, 광학소자, 섬유소재를 비롯한 약물전달담체, 인공장기 대체제, 세포와 효소고정을 위한 지지체, 분리를 위한 투과막 등 적용분야가 넓다.　
천연 소재의 DNA정보를 바탕으로 유전정보를 모사한 재조합 단백질 소재는 100 kDa 이상의 고분자량을 갖는 단백질도 균일한 분자량을 갖도록 조절이 가능하며, 단백질 내의 아미노산 구성을 조절할 수 있을 뿐만 아니라 생체친화성을 갖는 특정 잔기를 도입하거나, 생분해속도를 조절할 수 있고, 다른 종류의 단백질을 융합시켜 새로운 물성과 형태를 갖는 단백질 소재를 창출해 낼 수도 있다. 무엇보다 급등하는 석유값과 한정된 매장량을 생각해볼 때, 인공 합성 폴리머는 한계가 있으며, 보통 보강재나 충진재를 사용함에 따라 분해능이 좋지 못하고 재활용이 힘들어 환경오염의 문제가 수반된다.　 반면 단백질 기반 소재는 생분해가 용이하고, 바이오시스템 하에서 대량생산이 가능함에 따라 친환경적 소재로서의 대안이 되고 있으며, 무엇보다 바이오 물질과의 상호작용이 가능하다는 점이 큰 강점이 될 수 있다.
자연유래의 단백질을 얻는 것이 가장 좋은 방법이 될 수 있으나, 대량으로 얻을 수 있는 자연유래 단백질을 누에의 실크를 제외하고는 그 일례를 찾아보기 힘들다. 따라서 콜라겐, 키틴, 케라틴, 엘라스틴과 같은 천연 단백질 기반 소재를 얻기 위하여 주로 이용되는 방법은 생물체에서 직접 추출을 하는 방법이다. 하지만 직접 추출방법은 소나 돼지 등의 축산동물 또는 어류에서 추출을 통해 얻어내기 때문에 높은 순도가 뒷받침되지 않는 이상 이종이식으로 인한 면역의 문제에서 자유로울 수 없다. 또 다른 방법은 인공합성을 이용하는 것인데, 이 경우는 합성에 들어가는 경제적 비용이 높아 실질적으로 이용하기에 힘들고, 길이가 길어질수록 수율이 떨어져서 얻어지는 단백질의 양적, 질적 향상을 꾀하기 힘들다.
이를 해결할 방법으로 제시되고 있는 것이 반복서열 기반의 단백질을 재조합 단백질 발현기술을 이용하여 얻어내는 것이다. 현재까지 엘라스틴, 실크, 레질린과 같은 반복서열을 갖는 단백질의 일부 서열을 미생물 및 동물세포에서 성공적으로 발현된 사례가 호주와 유럽을 비롯한 외국에서 있었으며, 이를 적용하여 산업적으로 응용하기 위한 실험이 진행되고 있다.
하지만 산업적 적용을 위해서는 물성적 특징이 확보되어야 하는데도 불구하고, 콜라겐의 경우 하이드록시 프롤린과 같은 특정 아미노산의 도입과 트리플 헬릭스와 같은 특이구조의 정확한 모사가 필요한데도 불구하고 특이 아미노산과 구조의 모사가 성공하지 못하였고, 실크단백질의 경우 반복서열로 인한 심한 아미노산의 편향성과 큰 유전자 사이즈가 재조합 단백질의 제조의 한계로 작용하였다. 게다가 실크단백질이 방사과정의 메커니즘이 확실히 알려지지 않아 실험실에서의 인공방사에 어려움이 있다. 무엇보다도 재조합 단백질의 경우 자연상에 존재하는 몇 백 KDa을 갖는 큰 크기까지 발현이 쉽지 않기 때문에 분자량에 따라 증가하는 기계적 물성을 모사하는 것이 어려운 이유이다.
이를 해결하기 위하여 최근에는 유전자 코돈을 다시 디자인하여 DNA상의 반복을 줄인다거나, 다른 폴리머와의 블렌딩을 이용하는 방법이 시도되고 있다. 전체 유전자 서열을 발현하기에 한계가 있다 보니 그 중 일부를 발현시킨 후 in vitro에서 단백질간의 연결을 유도하기도 하는데, 이는 실크, 콜라겐, 엘라스틴과 같은 단백질들이 모두 특이적인 반복 단백질의 모듈을 가지고 있기에 가능하다.
콜라겐의 경우 3개의 아미노산의 반복이며, 엘라스틴의 경우는 5개의 아미노산으로 반복되어 있다. 이러한 모듈들의 반복은 특이 구조뿐만 아니라 강도, 인성과 같은 기계적 물성을 결정하고, 나아가 녹는점, 소수성, 전하, 점성과 같은 물리적인 성질에도 영향을 주는 요소이다. 반복서열의 기본 모듈은 예측이 가능하기에 일반 단백질보다 물성을 엄격하게 조절할 수 있다는 장점도 가지고 있다. 이러한 기술은 최근에 실크-엘라스틴 단백질(SELP: Silk-Elastin like protein)와 같은 새로운 형태의 재조합 단백질의 연구로 이어졌고, 더 나아가 Repeat Sequence Protein Polymer (RSPP) 기술이라는 용어와 함께 새로운 학문 분야를 구축하고 있다.
특이 반복서열을 갖는 실크의 경우 거미나 누에에서 유래한다는 것이 통상적으로 알려져 있으며, 콜라겐의 경우, 동물이나 어류에서 이용되는 것이 보통이었다. 하지만 최근 개미, 벌, 개미, 잠자리, 메뚜기 등의 곤충에서 유래한 새로운 실크단백질과 더불어 홍합, 진주조개, 키조개, 새우 등의 해양생물에 존재하는 실크 또는 콜라겐 유사단백질을 밝히는 연구들이 꾸준히 늘고 있다. 그리고 새로운 실크, 콜라겐 유사 단백질들은 새로운 기계적 물성과 다른 단백질 2차 구조를 보이기 때문에 자연에 존재하는 새로운 단백질과 이들을 가지고 있는 생물종의 발견은 보다 새롭고 다양한 구조와 특성, 물성을 갖는 소재를 찾아내는 시작이 될 수 있다는 데에 그 의의가 있다.
종래 반복서열 재조합 단백질은 아미노산 서열의 반복이 주로 일어나므로 편향적으로 쓰이는 아미노산이 존재하고, 이러한 몇 가지 아미노산이 주로 쓰는 DNA 코돈으로 인해, DNA 서열의 중복이 일어나게 된다. 이러한 DNA 반복서열은 숙주세포 내에서 쉽게 삭제되거나, 전사가 미완성으로 일어나는 경우가 많기 때문에, 높은 단백질 발현을 위해서는 DNA 수준에서 서열의 반복을 막는 것이 중요하다.
본 발명의 목적은 개구리유래 반복서열 재조합 단백질은 말미잘에서 존재하는 실크유사단백질의 유전 정보와 유사한 서열적 특징을 가지며, 형질전환체로부터 재조합 단백질의 대량생산이 가능하며, 강도, 탄성력, 및 인력과 같은 기계적 물성이 우수한 섬유를 제조할 수 있으며, 개구리유래 반복서열을 포함하는 재조합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 재조합 단백질의 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 재조합 단백질을 함유하는 단백질 섬유 제조용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 조성물을 방사하여 섬유를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 재조합 단백질을 함유하는 단백질 섬유를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 구현예는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 반복단위가 1 내지 200회 반복하여 연결된 폴리펩타이드를 포함하는 단백질을 제공하고자 한다. 상기 반복단위는 서열번호 2 내지 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 폴리펩타이드 C-말단, N-말단, 또는 양 말단에, 펩티드 태그(tag)가 추가로 연결될 수 있다. 상기 펩티드 태그는 His 태그(His tag), GST 태그(Glutathione S-transferase tag), 및 MBP 태그(maltose binding protein tag)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 또한, 상기 폴리펩타이드 N-말단에 발현향상 펩티드가 추가로 연결될 수 있다.
상기 단백질은 서열번호 8, 서열번호 9, 또는 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 구현예는 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 구현예는 상기 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다. 상기 세포는 대장균, 효모, 동물세포, 식물세포, 및 곤충세포로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다
본 발명의 또 다른 일 구현예는 상기 형질전환된 세포를 배양하여 상기 개구리유래 반복단위를 포함하는 재조합 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 상기 단백질을 생산하는 방법은, 상기 형질전환된 세포를 배양하여 개구리유래 재조합 단백질을 발현시키는 단계, 및 상기 개구리유래 재조합 단백질을 회수단계를 포함하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 일 구현예는 상기 개구리유래 재조합 단백질을 포함하는 섬유 제조용 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 단백질의 용해용매를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 구현예는 상기 개구리유래 반복단위를 포함하는 재조합 단백질을 함유하는 섬유 제조용 조성물을 방사하여 섬유를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방사는 습식 방사 또는 전기 방사일 수 있다.
개구리유래 반복서열 재조합 단백질은 형질전환체를 이용하여 대량생산이 가능할 뿐 아니라 단백질 본연의 기계적 물성을 확인함으로써 단백질을 기반으로 하는 바이오 소재로서의 가능성을 가지고 있다. 인공방사가 가능한 개구리유래 반복서열 재조합 단백질은 나노 또는 마이크로 단위의 섬유로 제조가 가능하기 때문에 세포 지지용 고정체, 미세 필터, 효소, 약물 캐리어 등과 같은 생체분해 가능한 단백질 기반 기능성 의료소재에 적용될 수 있다.
따라서, 본 발명에서는 대장균 하에서 산업적 적용이 가능한 수율의 재조합 단백질을 얻기 위하여 DNA수준에서의 디자인을 통해 반복을 줄였으며, 이는 최종 단백질서열에는 영향을 주지 않으면서 수율을 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 또한, 산업적 적용을 위한 단백질 생산을 위해서는 쉽게 다량의 단백질을 회수하는 것이 중요한데, 본 발명에서는 간단한 산 추출방법으로 목적 단백질만을 높은 순도로 얻을 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 개구리유래 반복서열 재조합 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 반복단위를 1 내지 200회, 1 내지 200회 반복되어 연결된 폴리펩티드, 더욱 바람직하게는 1 내지 120회 반복되어 연결된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한 상기 1 내지 200회 또는 1 내지 120회 반복되어 연결되는 부분에 다른 아미노산 서열이 포함되어 연결된 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 개구리유래 반복서열 재조합 단백질은 개구리 유래 단백질의 mRNA 서열 중 전체 또는 일부의 코돈 서열을 재배치하여 최적화 한 후, 최적화된 반복서열 재조합 단백질의 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하고, 상기 발현벡터를 숙주세포에 삽입하여 형질전환체를 제조한 후, 형질전환체로부터 생산되는 것이다.
본 발명에 따른 개구리유래 반복서열 재조합 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열이 1회 이상 연결된 폴리펩티드, 바람직하게는 1 내지 200회 반복되어 연결된 폴리펩티드, 더욱 바람직하게는 1 내지 120회 반복되어 연결된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한 상기 1 내지 200회 또는 1 내지 120회 반복되어 연결되는 부분에 다른 아미노산 서열이 포함되어 연결된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 서열번호 1의 개구리유래 반복단위의 아미노산 서열이며, 하기 일반식을 가진다.
[일반식 I]
Q-Q-Y-L-Xaa1-K-G-P-V-Xaa2 (서열번호 1)
상기 일반식 I에서, Xaa1는 Thr(T) 또는 Ser(S)이고, Xaa2는 Ser(S), Phe(F), 또는 Leu(L)이다.
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 반복단위의 구체적인 예는 서열번호 2 내지 서열번호 7에 표시하였으며, 구체적으로 하기 표 1에 표시하였다.
서열번호 아미노산 서열 (N-말단 -> C말단)
서열번호 2 Q-Q-Y-L-T-K-G-P-V-S
서열번호 3 Q-Q-Y-L-T-K-G-P-V-F
서열번호 4 Q-Q-Y-L-T-K-G-P-V-L
서열번호 5 Q-Q-Y-L-S-K-G-P-V-S
서열번호 6 Q-Q-Y-L-S-K-G-P-V-F
서열번호 7 Q-Q-Y-L-S-K-G-P-V-L
본 발명의 개구리유래 반복서열 재조합 단백질은 말미잘의 촉수와 피부에 주로 존재하는 실크유사단백질(NCBI Reference Sequence: XP_001621085.1)을 기본으로 하여 상동성이 높은 반복서열을 찾아낸 결과이다. NCBI를 통해 얻은 개구리유래 반복서열 재조합 단백질은 서열번호 9로 나타내었다.
상기 폴리펩타이드 C-말단, N-말단, 또는 양 말단에, 펩티드 태그(tag)가 추가로 연결될 수 있다. 상기 펩티드 태그는 His 태그(His tag), GST 태그(Glutathione S-transferase tag), 및 MBP 태그(maltose binding protein tag)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 또한, 상기 폴리펩타이드 N-말단에 발현향상 펩티드가 추가로 연결될 수 있다. 상기 "발현향상 펩티드"라는 용어는 번역 개시 효율을 향상시켜 재조합 단백질의 발현을 수준을 높이는 역할을 하는 아미노산 서열을 뜻하며, 대장균의 트립토판 오페론(trp operon)으로부터 유래한 8개의 아미노산으로 이루어진 번역 개시 펩티드일 수 있다.
상기 단백질은 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질일 수 있다.
상기 생산된 개구리유래 반복서열 재조합 단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열을 가지며, 발현벡터로 만들어질 경우 상기 서열번호 9의 아미노산 서열 N-말단에 6개의 히스티딘이 연결(6 x His 정제 tag 서열; HHHHHH)되어 있으며, 이를 서열번호 10으로 표시한다. 서열번호 10의 아미노산 서열의 경우, 알파파(Medicago sativa)의 프롤린-다량 세포벽 단백질과 31.4%의 동일성을 갖는 것으로 확인되었다.
본 발명의 개구리유래 반복서열 재조합 단백질은, 상업적으로 제조된 벡터에 목적 유전자를 삽입함으로써 형질전환체 내에서 대량생산이 가능하다. 본 발명의 개구리유래 반복서열 재조합 단백질의 생산방법에 대해 상세히 설명하면 아래와 같다.
먼저 개구리유래 반복서열 재조합 단백질의 mRNA 서열 중 주요 코돈의 반복은 형질전환체 내에서 불완전환 전사를 야기할 수 있으므로, 이를 피하기 위한 코돈 서열 재배치를 실행한다. DNA 서열은 높은 발현양을 위해 숙주 내에서 가장 최적화 된 코돈으로 중복을 최소화하여 치환될 수 있다. 개구리유래 반복서열 재조합 단백질 최적화된 DNA서열은 화학적으로 합성되고, 양 말단에 Nde1, Xho1의 제한효소 사이트를 삽입하여 발현용 프로모터 T7(pT7)을 포함하는 발현벡터 pET23b(+)에 클로닝 하여 제조한다.
상기 용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들명, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ 프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
상기 단백질을 생산하는 방법은 더욱 자세하게는,
서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 개구리유래 반복서열 재조합 단백질의 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계,
상기 발현벡터를 숙주세포에 삽입하여 형질전환체를 제조하는 단계,
상기 형질전환체로부터 개구리유래 반복서열 재조합 단백질을 생산하는 단계, 및
상기 생산된 개구리유래 반복서열을 포함하는 재조합 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함할 수 있다.
목적 단백질이 삽입된 발현벡터를 숙주세포에 삽입함으로써 재조합 단백질을 생산하는 형질전환체를 만들 수 있으며, 상기 형질전환체는 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 발현벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있다.
본 발명에서 사용된 숙주세포로는 대장균, 효모, 동물세포, 식물세포, 또는 곤충세포 등을 포함할 수 있으며, 원핵세포로는, 예를 들어, E.coli JM109, E.coli BL21, E.coli RR1, E.coli LE392, E.coli B, E.coli X 1776, E.coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
본 발명의 일 예에서, 숙주세포로서 대장균을 사용하여 형질전환체의 제조 및 이로부터 개구리유래 반복서열 재조합 단백질의 생산방법에 대해 상세히 설명하도록 한다. 상기 대장균으로서 BLR(DE3), BL21(DE3)균, 또는 BLR(DE3)pLysS를 이용할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 상기 제조된 발현벡터를 열충격 방법으로 숙주세포에 삽입하여 개구리유래 반복서열 재조합 단백질을 생산하는 형질전환체를 제조한다. 상기 형질전환체를 앰피실린이 첨가된 LB 배지에 접종하여 진탕배양한다.
개구리유래 반복서열 재조합 단백질의 발현을 유도하기 위하여, 배양액의 흡광도(OD600)가 600㎚에서 0.4 내지 1.0, 바람직하게는 0.8 내지 1.0이 되었을 때 단백질 발현 유도물질인 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 0.1 내지 10 mM로 첨가하고, 추가로 배양한다. 배양액으로부터 세포를 회수한다.
상기 회수된 세포를 용해 용액에 부유시키고 초음파 분쇄기 또는 고압분질기를 이용하여 파쇄한다. 파쇄 된 세포의 일부를 전세포 파쇄액(whole cell lysate), 수용성 분액(soluble fraction) 및 불용성 분액(insoluble fraction)으로 나누고, 나머지 전세포 파쇄액은 원심분리한다. 불용성 분액만을 회수하며, 회수된 분액은 히스-태그 컬럼(His-tag column)을 이용하여 발현되는 개구리유래 반복서열 재조합 단백질을 분리 및 정제한다. 구체적으로, 숙주세포에서 생산된 개구리유래 반복서열 재조합 친화도 크로마토그래피를 실시하여, 컬럼에 결합한 단백질을 용출하여 얻을 수 있다. 바람직하게는, 개구리유래 반복서열 재조합 단백질을 세포파쇄용액으로 파쇄하고, 파쇄된 세포의 수용성 분액을 니켈-NTA(nitrilotriacetic acid) 컬럼에 주입하고 세척용액으로 컬럼에 결합하지 않은 단백질을 세척한다. 용출완충액으로 단백질을 컬럼에서 분리하고 정제한다.
또한, 숙주세포에서 생산된 개구리유래 반복서열 재조합 단백질은 산추출을 통하여 정제할 수 있다. 파쇄된 세포의 불용성 분액을 세척을 한 후, 원심분리하여 다시 얻어진 불용성 분액을 인산 또는 포름산에 녹인다. 원심분리 후, 얻어진 수용성 분액을 가지고 물에 투석하면 염과 같은 단백질 이외의 성분이 제거된 재조합 단백질을 얻어낼 수 있다.
본 발명에 따른 개구리유래 반복서열을 포함하는 단백질을 포함하는 섬유 제조용 조성물은 단백질 용해용매를 포함할 수 있다. 개구리유래 반복서열 재조합 단백질의 방사를 위해서는 목적 단백질이 용매에 응집체 없이 완벽한 액체 상태여야 한다.
상기 단백질의 용해용매는 산성용매 및 유기용매로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단백질의 용해용매이며, 상기 산성용매는 인산, 아세트산, 포름산, 염산, 황산, 질산, 시트르산 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 유기용매는 HFIP(hexafluoroisopropanol), HFP (hexafluoropropanol), HFA(hexafluoroacetone), TFA(trifluoroacetic acid), 디아이소프로필 에틸아민(diisopropylethylamine), 메틸이미다졸리움 클로라이드(methylimidazolium chloride) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서는 산성용매로는 인산 또는 포름산, 유기용매로는 HFIP(hexafluoroisopropanol)이 바람직하다.
이때, 상기 용매에 용해된 개구리유래 반복서열 재조합 단백질의 농도는 5 내지 40 %(w/v), 바람직하게는 5 내지 20 %(w/v)이다. 만일 개구리유래 반복서열 재조합 단백질의 농도가 상기 범위를 벗어날 경우 방사가 일어나지 않을 수 있다.
본 발명에 따른 섬유 제조용 조성물은, 섬유의 재질로서 개구리유래 반복단위를 포함하는 재조합 단백질에 더하여, 고분자 화합물, 알부미노이드(albuminoid), 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함할 수 있다.
상기 고분자 화합물은 PEO(poly-ethylene oxide), PEG (polyethylene glycol), PCL(polycaprolactone), PLA(polylactic acid), PLGA(poly-lactic-co-glycolic acid), PLLA(poly-L-lactide acid), 및 키토산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 상기 알부미노이드는 케라틴, 글루텐, 락트알부민, 콜라겐, 및 이들의 재조합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 일 구현예는 상기 개구리유래 반복단위를 포함하는 재조합 단백질을 함유하는 섬유 제조용 조성물을 방사하여 섬유를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 섬유 제조용 조성물은 전기방사 또는 습식방사법으로 섬유를 제조방법에 사용될 수 있다.
또한, 상기 섬유를 생산하는 방법은 방사 후 또는 방사와 동시에 섬유를 응고용매와 접촉시키는 단계를 추가로 포함 할 수 있다.
상기 응고용매는 물, 메탄올, 에탄올, 및 아이소프로판올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매일 수 있으며, 상기 응고용매에 다이메틸설폭사이드(DMSO), 과산화수소(H2O2), 글루타치온(glutathione), 및 글루타알데히드(Glutaraldehyde)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 첨가물이 쓰일 수 있다.
상기 섬유는 고분자 화합물, 알부미노이드(albuminoid), 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함할 수 있다. 상기 고분자 화합물은 PEO(poly-ethylene oxide), PEG (polyethylene glycol), PCL(polycaprolactone), PLA(polylactic acid), PLGA(poly-lactic-co-glycolic acid), PLLA(poly-L-lactide acid), 및 키토산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 상기 알부미노이드는 케라틴, 글루텐, 락트알부민, 콜라겐, 및 이들의 재조합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
습식방사로 제조된 섬유의 표면은 매끈하고 두께가 일정하여 손으로 연신하기에도 쉬운 이점이 있다. 습식방사는 용해용매에 용해한 재조합 단백질을 응고용매가 함유된 용액으로 방사하여, 상기 응고용매에 의한 방사된 섬유가 경화되어 섬유가 얻어진다. 개구리유래 반복서열 재조합 단백질의 성공적인 습식방사에 영향을 주는 요인은 덩어리 없이 단백질을 완벽하게 녹일 수 있는 용해용매와 단백질용액의 빠른 상 전환을 위한 응고용매다.
습식 방사법으로 섬유를 방사하는 경우 방사 속도가 1 내지 25㎖/hr, 10 내지 15㎖/hr, 또는 10 ㎖/hr일 수 있다.
습식 방사법으로 제조되는 경우 섬유의 단면직경이 20,000 내지 100,000 nm, 바람직하게는 20,000 내지 50,000 nm인 단백질 섬유일 수 있다. 얻어진 습식방사 섬유는 응고용매를 사용하여 섬유의 강도를 증가시킬 수 있으며, 구체적으로 응고용매를 증기 또는 용액의 형태로 첨가시키거나 이들의 반복적인 건조와 습윤을 통해 섬유의 강도 증가를 도모할 수 있다.
전기 방사법으로 제조되는 섬유의 형상은 개구리유래 반복서열 재조합 단백질은 용해되는 용매의 종류, 단백질의 농도, 가해진 전압 등에 따라 크게 달라진다. 따라서, 개구리유래 반복서열 재조합 단백질의 전기방사를 위해서는 목적 단백질이 용매에 응집체 없이 완벽한 액체 상태여야 하고, 전압 하에서만 나노섬유로 분리될 수 있을 정도로 적합하게 높은 점성을 가져야 한다. 상기 용매에 용해된 개구리유래 반복서열 재조합 단백질의 적합한 점성은 단백질의 농도가 5 내지 40 %(w/v), 또는 5 내지 20 %(w/v)인 경우이다.
상기 전기방사의 조건, 예를 들면 용매의 종류, 단백질의 농도, 가해진 전압 이 특정 조건에 부합하지 않은 경우, 섬유사 모양이 아닌 불규칙적인 덩어리들의 조합 또는 막이 형성되기도 한다. 때로는 용매가 그대로 흘러서 특정한 모양을 형성하지 않고 흐르기도 하다. 따라서, 섬유사 형태를 얻기 위해서는 적합한 용매의 선택과 함께 적당한 점성을 갖는 단백질의 농도, 방사 성능이 좋은 범위의 전압을 찾아내는 것이 중요하다.
전기 방사법으로 섬유를 방사하는 경우 방사 속도는 0.1 내지 5 ㎖/hr, 0.1 내지 1 ㎖/hr, 또는 0.5 ㎖/hr 이고, 전압은 10 내지 20 kV이며, 또는 15 내지 20 kV인 것일 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 단백질 섬유가 전기 방사법으로 제조되는 경우, 섬유의 단면직경이 500 내지 20,000 nm, 또는 500 내지 1,000 nm일 수 있다.
전기 방사법을 이용하여 섬유를 제조할 경우, 방사가 시작되는 실린지와 바닥 면과의 거리는 5 내지 20 cm로 할 수 있다. 전기방사에 의해 나노수준의 단면 직경을 갖는 섬유를 얻을 수 있다.
구체적인 단백질 섬유의 제조방법은, 섬유 제조용 조성물을 방사하는 단계를 수행하기 전에, 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 개구리유래 반복서열 재조합 단백질의 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계, 상기 발현벡터를 숙주세포에 삽입하여 형질전환체를 제조하는 단계, 상기 형질전환체로부터 개구리유래 반복서열 재조합 단백질을 발현하는 단계, 및 상기 제조된 재조합 단백질을 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 수행할 수 있다.
상기 섬유는 상기 개구리유래 반복단위를 포함하는 단백질을 방사하여 제조되며, 제조된 섬유의 단면직경이 500nm 내지 50,000 nm인 단백질 섬유일 수 있다. 상기 섬유가 전기 방사법으로 제조되는 경우, 섬유의 단면직경이 500 내지 1,000 nm일 수 있으며, 습식 방사법으로 제조되는 경우 섬유의 단면직경이 20,000 내지 50,000 nm인 단백질 섬유일 수 있다.
개구리유래 반복서열 재조합 단백질은 형질전환체를 이용하여 대량생산이 가능할 뿐 아니라 단백질 본연의 기계적 물성을 확인함으로써 단백질을 기반으로 하는 바이오 소재로서의 가능성을 가지고 있다. 인공방사가 가능한 개구리유래 반복서열 재조합 단백질은 나노 또는 마이크로 단위의 섬유로 제조가 가능하기 때문에 세포 지지용 고정체, 미세 필터, 효소, 약물 캐리어 등과 같은 생체분해 가능한 단백질 기반 기능성 의료소재에 적용될 수 있다.
본 발명에 따른 개구리유래 반복서열 재조합 단백질은 말미잘에서 존재하는 실크유사단백질의 유전 정보와 유사한 서열적 특징을 가지며, 편향된 아미노산 구성과 뚜렷한 반복성으로 인하여 단백질을 인공적으로 제조하기에 용이하여 산업분야에 유용하게 적용될 수 있으며, 개구리유래 반복서열 재조합 단백질을 이용하여 제조된 섬유는 강도, 탄성력, 및 인력과 같은 기계적 물성이 우수하여 단백질 기반 소재로서의 장점을 갖는 신소재가 될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 개구리유래 반복서열 재조합 단백질(Xetro 군)의 유전자를 포함하는 발현벡터의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 산 추출 정제 후, 개구리유래 반복서열 재조합 단백질(Xetro 군)을 실버 염색법으로 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 산 추출 정제 후, 개구리유래 반복서열 재조합 단백질(Xetro 군)을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 개구리유래 반복서열 재조합 단백질(Xetro 군)의 산 추출 정제 후, 아미노산 조성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5a은 본 발명의 일실시예에 따른 습식 방사된 개구리유래 반복서열 재조합 단백질의 섬유의 측면을 주사전자현미경(SEM)으로 관찰한 이미지이다.
도 5b는 본 발명의 일실시예에 따른 습식 방사된 개구리유래 반복서열 재조합 단백질의 섬유의 단면을 주사전자현미경(SEM)으로 관찰한 이미지이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 개구리유래 반복서열 재조합 단백질의 섬유의 인장강도 측정실험을 통해 얻어진 기계적 물성을 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 전기 방사된 개구리유래 반복서열 재조합 단백질의 섬유를 주사전자현미경(SEM)으로 관찰한 이미지이다.
다음의 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하겠으나, 이는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명이 다음의 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 개구리유래 반복서열 재조합 단백질 발현벡터의 제조
1-1. 재조합 단백질의 DNA 서열 최적화
본 실시예에 사용된 개구리유래 반복서열 재조합 단백질은 NCBI Reference Sequence의 정보를 토대로 검색된 가설의 단백질(hypothetical protein)이다(XP_002935738.1).
개구리유래 반복서열 재조합 단백질(Xetro)은 글루타민(20.1%), 발린(10.4%), 루신(10.0%)이 주로 존재하는 총 300개의 아미노산으로 이루어진 단백질로서, 10개의 아미노산으로 이루어진 반복단위가 27번 연속되는 구조를 포함하고 있다 [개구리유래 반복서열 재조합 단백질(변형된 것 포함) - QQYL(T/S)KGPV(S/F); 주로 QQYLTKGPVS, QQYLTKGPVF 등].
개구리유래 반복서열 재조합 단백질은 아미노산 서열의 반복이 주로 일어나므로 편향적으로 쓰이는 아미노산이 존재하고, 이러한 몇 가지 아미노산이 주로 쓰는 DNA 코돈으로 인해, DNA 서열의 중복이 일어나게 된다. 이러한 DNA 반복서열은 대장균 내에서 쉽게 삭제되거나, 전사가 미완성으로 일어나는 경우가 많기 때문에, 높은 단백질 발현을 위해서는 DNA 수준에서 서열의 반복을 막는 것이 중요하다. 따라서, 반복서열 재조합 단백질의 mRNA 서열 중 일부의 코돈 서열의 반복을 피할 수 있도록 하여 서열을 최적화하여 디자인한 후, 화학적으로 합성하였다.
1-2. 재조합 단백질의 발현벡터의 제조
상기 실시예에서 최적화한 개구리유래 반복서열 재조합 단백질의 DNA를 Nde1, Xho1 제한 효소를 이용하여 T7(pT7)과　C-말단에 히스티딘 태그(histidine tag, 6 x His 정제 tag 서열; HHHHHH)를 포함하는 발현벡터 pET23b(+)에 도입하였다.
제조된 개구리유래 반복서열 재조합 단백질은 서열번호 10를 포함한다.
상기 제조된 개구리유래 반복서열 재조합 단백질의 유전자를 포함하는 발현벡터의 모식도를 도 1에 나타내었다.
실시예 2. 재조합 단백질을 생산하는 형질전환된 대장균의 제조
본 실시예에서는 통상적으로 클로닝에 많이 사용되는 대장균 TOP10(Invitrogen)과 단백질 발현용으로 사용되는 대장균 BL21(DE3)을 CaCl2 완충액을 사용하여 반응성 있는 세포를 만들었다.
그 다음, 상기 실시예 1에서 제조한 발현벡터를 도입하기 위하여 42 ℃에서 2분간 열충격을 가하는 방법으로 대장균에 도입하였다.
상기 대장균을 50 ㎎/㎖의 앰피실린(ampicillin)이 첨가된 LB 배지에 접종하여 5l 용량의 배양기에서 12시간 동안 37 ℃에서 진탕 배양하여 형질전환된 대장균을 선별하였다.
실시예 3. 재조합 단백질의 발현 및 정제
3-1. 재조합 단백질의 발현
상기 실시예 2에서 선별된 형질전환 대장균에서 개구리유래 반복서열 재조합 단백질의 발현을 유도하기 위해, 배양액의 흡광도(OD600)가 600 ㎚에서 0.6 내지 1.0 정도가 되었을 때 유도물질인 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, 1mM)를 첨가하였다.
상기 배양된 세포를 4000 rpm에서 10분간 원심 분리한 다음 상등액을 제거하고 세포를 회수하였다. 상기 회수된 세포를 용해 용액 (lysis buffer, pH 8.0, 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl)에 부유시킨 다음 초음파 분쇄기(sonicator) 또는 고압분질기(homogenizer)를 이용하여 파쇄하였다.
개구리유래 반복서열 재조합 단백질의 발현 여부를 SDS-PAGE 상에서 확인하기 위하여, 파쇄된 단백질은 전세포 파쇄액(whole cell lysate), 수용성 분액(soluble fraction), 및 불용성 분액(insoluble fraction)으로 나누어 SDS-PAGE를 이용한 전기영동으로 확인하였다.
3-2. 히스 -태그 컬럼(His-tag column)을 이용한 재조합 단백질의 정제
상기 실시예 3-1에서 회수된 불용성 분액(insoluble fraction)은 히스-태그 컬럼을 이용하여, 발현된 개구리유래 반복서열 재조합 단백질을 분리 및 정제하였다.
요소가 포함된 세척용액(100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris·Cl, 8 M Urea, pH 6.3)으로 세척한 후, 용출 완충액(100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris·Cl, 8 M Urea, pH 4.5)으로 단백질을 용출시킨다. 용출된 단백질은 물로 투석한 후, 동결건조를 통하여 보다 농축된 형태의 단백질로 생산하였다. 히스-태그 컬럼을 이용하여 분리된 단백질의 생산량은 리터당 10 mg이하이다.
3-3. 산추출법을 이용한 재조합 단백질의 정제 방법
개구리유래 반복서열 재조합 단백질의 또 다른 분리 및 정제 방법으로 산추출법을 이용하였다.
구체적으로는, 상기 실시예 3-1의 파쇄된 세포에서 불용성 분액만을 회수하고 세척용액(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, pH 8.0)을 이용하여 씻어낸 후, 원심분리를 이용하여 세척된 불용성 분액을 얻는다. 얻어진 불용성 분액은 포름산을 비롯한 산성용액에 녹인 후, 물로 투석하고 동결건조하여 생산하였다. 산추출로 얻어진 개구리유래 반복서열 재조합 단백질의 생산량은 리터당 500 mg내외이다.
상기 형질전환된 대장균으로부터 생산된 개구리유래 반복서열 재조합 단백질은 이론 등전점은 9.96이며, 히스태그가 붙은 단백질의 이론 분자량은 34.58 kDa이다.
실시예 4. 정제된 개구리유래 반복서열 재조합 단백질의 확인
4-1. 실버 염색법과 웨스턴 블롯
상기 실시예 3에서 얻은 각 분액들과 정제된 샘플은 SDS-PAGE용 완충액 (1M Tris-HCl (pH 6.8), 10 % 글리세롤, 2 % SDS, 5 % β-머캅토에탄올, 0.25 % 브로모페놀블루)에 희석하고, 100 ℃에서 5분 동안 반응시켜 변성시켰다. 그리고 실험 샘플을 12 % SDS-폴리 아크릴아미드 겔에 전기영동하여 분자량별로 크기를 분리하였다. 분리된 단백질은 실버 염색법 또는 웨스턴 블롯을 통하여 발현 확인이 이루어졌다.
개구리유래 반복서열 재조합 단백질의 발현 정도를 실버 염색법과 웨스턴 블롯으로 확인한 결과는 도 2와 도 3에 각각 나타내었다.
도 2와 도 3에 나타낸 바와 같이, 약 35 kDa 부근에서 밴드가 확인되었으며, 히스태그가 붙은 단백질의 이론 분자량은 34.58 kDa인바, 이와 일치함을 알 수 있다.
4-2. 재조합 단백질의 아미노산 조성 분석
실시예 3-3에서 산추출법을 이용하여 분리된 개구리유래 반복서열 재조합 단백질의 순도를 확인하기 위한 하나의 방법으로 아미노산 조성분석이 수행하였다.
구체적으로는, 개구리유래 반복서열 재조합 단백질을 6N 염산과 페놀에 녹이고 아미노산 정량 분석 키트(standard solution amino acids for Hydrolysate Program (H), Sykam)를 이용하여 추출된 단백질의 아미노산의 조성값을 이론값과 비교하여 분석을 수행하였다.
개구리유래 반복서열 재조합 단백질의 아미노산 조성 분석 결과는 도 4에 나타내었으며, 아미노산 조성 분석 결과의 측정값을 이론값과 비교한 값은 표 1에 나타내었다.
　 Xetro
　 측정 값 이론 값
Asx 4.4 0.3
Thr 6.6 8.1
Ser 6 8.4
Glx 17.2 20.1
Cys 0 0.3
Gly 10.1 8.8
Ala 4.7 0.3
Val 9.1 10.1
Met 0.7 0.6
Ile 2.4 1
Leu 9.2 10.1
Tyr 7.3 8.8
Phe 2.4 1.6
His 2 2.3
Lys 8.7 9.1
Pro 6.6 9.4
Arg 2.5 0.6
아미노산 분석방법은 실제 실험에 이용된 단백질의 아미노산 성분비를 알 수 있는 방법이다. 따라서 단백질서열을 알고 있는 단백질의 이론상의 아미노산 성분비와 실험에 사용된 아미노산 성분비를 비교하면, 실험에 사용된 단백질의 대략적인 순도측정도 가능하다. 만약 두 성분비가 판이하게 다를 경우, 실험에 쓰이는 단백질은 목적단백질이 주가 되지 않는다는 의미이며, 이는 분리나 정제과정에 있어 잡다한 단백질이 상대적으로 많이 존재함을 의미할 수 있다.
특히 본 연구에서 사용된 단백질의 아미노산 구성의 이론값과 얻어진 재조합 단백질의 아미노산 구성의 측정값은 주요 단백질 서열에서 Glx, Gly, Val, Leu, Tyr, Lys, Pro와 같이 큰 비중을 차지하는 경우, 일치도가 높음을 확인하였다.
실시예 5. 습식방사법에 의한 섬유의 제조
상기 실시예 3-3에서 산추출법으로 얻은, HFIP에 용해된 재조합 단백질의 습식방사양상을 응고용매 하에서 관찰해보았다. 그 결과, 응고용매로서 99 %(v/v)의 메탄올 용액을 응고 욕조에 채우고, HFIP에 용해된 개구리유래 반복서열 재조합 단백질을 습식 방사한 경우가 결과가 좋은 것으로 확인하였다. 얻어진 습식방사 섬유의 표면은 매끈하고 두께가 일정하여 손으로 연신하기에도 쉬운 이점이 있었다. 따라서, HFIP를 이용한 단백질 용해와 메탄올 용매를 이용한 단백질 응고조건을 습식방사조건으로 결정하였다.
구체적으로 실시예 3-3에서 산추출법으로 얻어진 개구리유래 반복서열 재조합 단백질을 HFIP에 용해시켜 15 % (w/v) 농도의 방사 용액을 제조하고, 상기 방사용액을 메탄올에서 10 내지 15 ㎖/hr 속도로 습식방사하여, 비교적 균일한 직경을 갖는 섬유사 형태의 단백질을 얻을 수 있었다.
얻어진 섬유사 형태의 단백질을 응고용매 내에서 2시간 동안 보관하여 완벽히 경화시킨 후, 손으로 직접 2배가 되는 길이로 연신(drawing)시켰다. 양 끝을 고정한 섬유는 상온에서 하루 동안 건조하였다.
습식 방사된 개구리유래 반복서열 재조합 단백질의 섬유의 주사전자현미경 이미지는 도 5에 나타내었다. 습식방사 후 얻어진 개구리유래 반복서열 재조합 단백질 섬유사의 전자주사현미경의 관찰 결과, 20 내지 50 ㎛의 직경을 갖는 섬유임을 확인하였다.
실시예 6. 전기방사법에 의한 섬유의 제조
실시예 3-1에서 산추출법으로 얻은 개구리유래 반복서열 재조합 단백질의 전기방사능을 확인하기 위해 우선적으로 용매에 대한 단백질의 용해도를 확인하였다. 기존의 실험정보를 기준으로 하여, 단백질의 용해도를 고려하여 산성용매는 인산, 아세트산, 포름산을 이용하였고, 유기용매는 HFIP(hexafluoroisopropanol), HFA(hexafluoroacetone), TFA(trifluoroacetic acid)를 이용하였다. HFIP를 이용하여 전기방사를 시도했을 경우, 균일한 나노섬유를 얻는데 성공하여 HFIP를 용매로 선정하였다.
개구리유래 반복서열 재조합 단백질의 성공적인 전기방사를 위해서는 목적 단백질이 용매에 응집체 없이 완벽한 액체 상태여야 하고, 전압 하에서만 나노섬유로 분리될 수 있을 정도로 적합하게 높은 점성을 가져야 한다. HFIP에 녹인 10 %(w/v)의 단백질 용매는 0.1 ml/h 속도와 15 kV의 전압 하에서 균일한 나노섬유의 형상을 보였으며, 약 600 nm 내지 1000 nm의 크기를 갖는 것으로 확인되었다.
전기방사 후 얻어진 개구리유래 반복서열 재조합 단백질의 섬유를 전자주사현미경으로 관찰한 결과는 도 7에 나타내었다. 도 7에서 볼 수 있듯이 균일한 나노섬유의 형상을 보였으며, 섬유의 단면 직경이 약 500 nm 내지 1000 nm의 크기를 갖는 것으로 확인되었다.
실시예 7. 섬유의 물성 시험
실시예 5에서 습식 방사로 제조된 섬유를 INSTRON(모델명: 3544)를 이용한 인장강도실험(tensile test)를 실행하여 얻어진 응력 변형도 곡선(stress-strain curve)을 얻을 수 있으며, 이로써 소재의 기본적 물성인 강도(strength), 탄력성(extensibility), 경도(stiffness), 인성(toughness) 등의 물성을 확인하였고, 이로서 소재의 기본적 물성을 확인할 수 있다.
구체적으로, 응력 변형도 곡선에서 시편의 파단이 일어난 시점에 대한 X축의 값은 늘어난 길이를 초기 시편의 길이로 나눈 값을 의미하며, 이는 탄력성(extensibility)으로 정의된다. Y축의 값은 파단이 일어나기 위해 필요한 힘을 의미하므로 강도(strength)로 정의할 수 있으며, 경도(stiffness)는 파단이 일어나기 전 비례하게 증가하는 부분으로, 초기 그래프의 기울기로 정의될 수 있다. 시편의 파단을 위해 필요한 에너지는 인성(toughness)이라고 정의하며, 이는 그래프의 면적을 계산하여 구할 수 있다.
습식 방사된 개구리유래 반복서열 재조합 단백질의 섬유의 인장강도 그래프는 도 6에 나타내었으며, 인장강도 실험결과 얻어진 강도, 탄력성, 경도, 인성의 물성값은 표 3에 제시되었다.
강도 (MPa) 탄력성(%) 경도(MPa) 인성(MJ/M3)
109.83 (±8.02) 2.10 (±0.08) 8.53 (±1.58) 1.65 (±0.19)
상기 개구리유래 반복서열 재조합 단백질의 인장강도는 약 110Mpa로서, 같은 단위면적의 콜라겐(~120MPa)와 비슷한 수준이며, 거미의 점착성 실크(viscid silk) (~500MPa)보다는 약한 수준으로 나타났다. 또한, 탄력성은 약 2.1%로 풀잠자리의 난병(egg stalk) 단백질(~3%)과 비슷한 수준으로 보인다.
<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Repetitive recombinant protein derived from frog method for producing the same, and composition for preparing artificial fiber comprising the same <130> DPP20141364KR <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 1 Gln Gln Tyr Leu Xaa Lys Gly Pro Val Xaa 11 15 20 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 2 Gln Gln Tyr Leu Thr Lys Gly Pro Val Ser 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 3 Gln Gln Tyr Leu Thr Lys Gly Pro Val Phe 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 4 Gln Gln Tyr Leu Thr Lys Gly Pro Val Leu 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 5 Gln Gln Tyr Leu Ser Lys Gly Pro Val Ser 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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Gly Pro Val Ser Gln Gln Tyr Leu Thr Lys Gly Pro Val Ser 145 150 155 160 Gln Gln Tyr Leu Thr Lys Gly Pro Val Ser Gln Gln Tyr Leu Ser Lys 165 170 175 Gly Pro Val Phe Gln Gln Tyr Leu Thr Lys Gly Pro Val Ser Gln Gln 180 185 190 Tyr Leu Thr Lys Gly Pro Val Ser Gln Gln Tyr Leu Thr Lys Gly Pro 195 200 205 Val Ser Gln Gln Tyr Leu Thr Lys Gly Pro Val Ser Gln Gln Tyr Leu 210 215 220 Thr Lys Gly Pro Val Phe Gln Gln Tyr Leu Thr Lys Gly Pro Val Ser 225 230 235 240 Gln Gln Tyr Leu Ser Lys Gly Pro Val Phe Gln Gln Tyr Leu Thr Lys 245 250 255 Gly Pro Val Ser Gln Gln Tyr Leu Thr Lys Gly Pro Val Ser 260 265 270 <210> 9 <211> 299 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 9 Arg Val Pro His Gln Gln Tyr Leu Thr Lys Gly Pro Val Ser Gln Gln 1 5 10 15 Tyr Leu Thr Lys Gly Pro Val Leu Gln Gln Tyr Leu Thr Lys Gly Pro 20 25 30 Val Ser Gln Gln Tyr Leu Thr Lys Gly Pro Val Ser Gln Gln Tyr Leu 35 40 45 Thr Lys Gly Pro Val Ser Gln Gln Tyr Leu Thr Lys Gly Pro Val Ser 50 55 60 Gln Gln Tyr Leu Thr Lys Gly Pro Val Phe Gln Gln Tyr Leu Thr Lys 65 70 75 80 Gly Pro Val Ser Gln Gln Tyr Leu Thr Lys Gly Pro Val Ser Gln Gln 85 90 95 Tyr Leu Thr Lys Gly Pro Val Ser Gln Gln Tyr Leu Thr Lys Gly Pro 100 105 110 Val Ser Gln Gln Tyr Leu Thr Lys Gly Pro Val Phe Gln Gln Tyr Leu 115 120 125 Thr Lys Gly Pro Val Ser Gln Gln Tyr Leu Thr Lys Gly Pro Val Ser 130 135 140 Gln Gln Tyr Leu Thr Lys Gly Pro Val Ser Gln Gln Tyr Leu Thr Lys 145 150 155 160 Gly Pro Val Ser Gln Gln Tyr Leu Thr Lys Gly Pro Val Ser Gln Gln 165 170 175 Tyr Leu Ser Lys Gly Pro Val Phe Gln Gln Tyr Leu Thr Lys Gly Pro 180 185 190 Val Ser Gln Gln Tyr Leu Thr Lys Gly Pro Val Ser Gln Gln Tyr Leu 195 200 205 Thr Lys Gly Pro Val Ser Gln Gln Tyr Leu Thr Lys Gly Pro Val Ser 210 215 220 Gln Gln Tyr Leu Thr Lys Gly Pro Val Phe Gln Gln Tyr Leu Thr Lys 225 230 235 240 Gly Pro Val Ser Gln Gln Tyr Leu Ser Lys Gly Pro Val Phe Gln Gln 245 250 255 Tyr Leu Thr Lys Gly Pro Val Ser Gln Gln Tyr Leu Thr Lys Gly Pro 260 265 270 Val Ser Gln Gln Leu 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Gly Pro Val Ser Gln 165 170 175 Gln Tyr Leu Ser Lys Gly Pro Val Phe Gln Gln Tyr Leu Thr Lys Gly 180 185 190 Pro Val Ser Gln Gln Tyr Leu Thr Lys Gly Pro Val Ser Gln Gln Tyr 195 200 205 Leu Thr Lys Gly Pro Val Ser Gln Gln Tyr Leu Thr Lys Gly Pro Val 210 215 220 Ser Gln Gln Tyr Leu Thr Lys Gly Pro Val Phe Gln Gln Tyr Leu Thr 225 230 235 240 Lys Gly Pro Val Ser Gln Gln Tyr Leu Ser Lys Gly Pro Val Phe Gln 245 250 255 Gln Tyr Leu Thr Lys Gly Pro Val Ser Gln Gln Tyr Leu Thr Lys Gly 260 265 270 Pro Val Ser Gln Gln Leu Ser Ala Gln Cys Pro Val Ile Gln Ser Val 275 280 285 Ser Ile Gln Val Leu Glu Ile Lys Asn Met Arg Gln Leu Glu His His 290 295 300 His His His His 305

Claims (22)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 반복단위가 1 내지 200회 반복하여 연결된 폴리펩타이드로 이루어진 단백질을 포함하는 섬유 제조용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 C-말단, N-말단, 또는 양 말단에, His 태그(His tag), GST 태그(Glutathione S-transferase tag), 및 MBP 태그(maltose binding protein tag)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 추가로 연결된 것인, 섬유 제조용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 N-말단에 발현향상 펩티드가 추가로 연결된 것인, 섬유 제조용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 반복단위는 서열번호 2 내지 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 섬유 제조용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 섬유 제조용 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 조성물 중 단백질의 농도는 5 내지 40 %(w/v)인 것인, 섬유 제조용 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 상기 단백질의 용해용매를 추가로 포함하는 것인, 섬유 제조용 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 용해용매는 인산, 아세트산, 포름산, 염산, 황산, 질산, 시트르산, 헥사플루오로아이소프로판올 (hexafluoroisopropanol, HFIP), 헥사플루오로프로판올 (hexafluoropropanol, HFP), HFA(hexafluoroacetone), 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA), 디아이소프로필 에틸아민(diisopropylethylamine), 및 메틸이미다졸리움 클로라이드(methylimidazolium chloride) 로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것인, 섬유 제조용 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 고분자 화합물, 알부미노이드(albuminoid), 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함하는 것인, 섬유 제조용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 고분자 화합물은 PEO(poly-ethylene oxide), PEG (polyethylene glycol), PCL(polycaprolactone), PLA(polylactic acid), PLGA(poly-lactic-co-glycolic acid), PLLA(poly-L-lactide acid), 및 키토산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 물질이고, 상기 알부미노이드는 케라틴, 글루텐, 락트알부민, 콜라겐, 및 이들의 재조합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것인, 섬유 제조용 조성물.
  11. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 반복단위가 1 내지 200회 반복하여 연결된 폴리펩타이드로 이루어진 단백질을 포함하는 단백질 섬유.
  12. 제11항에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 C-말단, N-말단, 또는 양 말단에, His 태그(His tag), GST 태그(Glutathione S-transferase tag), 및 MBP 태그(maltose binding protein tag)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 추가로 연결된 것인, 단백질 섬유.
  13. 제11항에 있어서, 상기 폴리펩타이드의 N-말단에 발현향상 펩티드가 추가로 연결된 것인, 단백질 섬유.
  14. 제11항에 있어서, 상기 반복단위는 서열번호 2 내지 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 단백질 섬유.
  15. 제11항에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 단백질 섬유.
  16. 제1항에 조성물을 방사하여 섬유를 생산하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 방사는 습식 방사 또는 전기 방사인 것인, 섬유를 생산하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 섬유를 생산하는 방법은 방사 후 또는 방사와 동시에 섬유를 응고용매와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것인, 섬유를 생산하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 응고용매는 물, 메탄올, 에탄올, 및 아이소프로판올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것인, 섬유를 생산하는 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 응고용매는 다이메틸설폭사이드(DMSO), 과산화수소(H2O2), 글루타치온(glutathione) 및 글루타알데히드(Glutaraldehyde)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 첨가물이 추가로 포함된 것인, 섬유를 생산하는 방법.
  21. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 섬유는 고분자 화합물, 알부미노이드(albuminoid), 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함하는 것인, 단백질 섬유.
  22. 제21항에 있어서, 상기 고분자 화합물은 PEO(poly-ethylene oxide), PEG (polyethylene glycol), PCL(polycaprolactone), PLA(polylactic acid), PLGA(poly-lactic-co-glycolic acid), PLLA(poly-L-lactide acid), 및 키토산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 물질이고,
    상기 알부미노이드는 케라틴, 글루텐, 락트알부민, 콜라겐, 및 이들의 재조합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것인, 단백질 섬유.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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