KR101609451B1 - Simultaneous detection method of three mycoplasma species using PNA probe and FMCA - Google Patents
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Abstract
본 발명은 마이코플라즈마 알기니(Mycoplasma arginini), 마이코플라즈마 퍼멘턴스(Mycoplasma fermentans) 및 마이코플라즈마 오레일(Mycoplasma orale) 동시 진단하기 위한 PNA 프로브에 관한 것이다. 또한 본 발명은 대상 시료에서 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, PCR(polymerase chain reaction)을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 상기 PCR 증폭 산물에 상기 PNA 프로브 세트를 주입하고 real-time PCR을 시키는 단계; 온도를 변화시키면서 상기 실시간 PCR에 의해 증폭된 증폭산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및 상기 융해곡선의 융해온도를 확인하여 마이코플라즈마를 동정하는 단계; 를 포함하는 세 종의 마이코플라즈마를 동시 진단하기 위한 방법에 관한 것이다.
The invention know you Mycoplasma (Mycoplasma arginini), Mycoplasma peomen capacitance (Mycoplasma fermentans) and Mycoplasma oleyl (Mycoplasma The present invention relates to a PNA probe for simultaneous diagnosis. The present invention also relates to a method for separating DNA from a target sample, Amplifying the target sequence by performing PCR (polymerase chain reaction) using the separated DNA as a template; Injecting the PNA probe set into the PCR amplification product and performing real-time PCR; Melting the amplification product amplified by the real-time PCR while changing the temperature to obtain a fusion curve; And identifying the mycoplasma by confirming the melting temperature of the melting curve; The present invention relates to a method for simultaneous diagnosis of three types of mycoplasmas,
Description
본 발명은 PNA(Peptide Nucleic Acid) 프로브 및 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis)를 이용한 마이코플라즈마 알기니, 마이코플라즈마 퍼멘턴스 및 마이코플라즈마 오레일의 동시 진단 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for simultaneous diagnosis of Mycoplasma argini, Mycoplasma pertensis and Mycoplasma oryla using a PNA (Peptide Nucleic Acid) probe and FMCA (Fluorescence Melting Curve Analysis).
최근 건강에 대한 사람들의 관심이 많아지면서 생명과학에 대한 관심이 집중되고 있다. 생명과학의 발전은 사람들의 건강에 대한 관심을 충족시켜주고 있으며, 많은 긍정적인 결과물을 내고 있다. 이러한 결과물들은 대부분 세포 배양 실험을 기초 실험으로 하고 있는 결과물들이 대다수를 차지하고 있다. 세포 배양 실험은 현재까지도 생명과학에서는 없어서는 안될 기술로써 손꼽히고 있으며, 그 중요성과 잠재력이 높은 평가를 받고 있다. 세포 배양 실험은 실험 샘플을 준비하는 기술이다. 좋은 실험 sample을 만드는 것은 좋은 결과와 직결된다. 따라서 세포 배양 실험은 고도의 정확성이 중시된다.Recently, as people's interest in health has increased, attention has been focused on life sciences. The development of life sciences meets the concerns of people's health and produces many positive outcomes. Most of these results are mostly based on cell culture experiments. Cell culture experiments are still regarded as indispensable technologies in life sciences and their importance and potential are highly evaluated. Cell culture experiments are techniques for preparing experimental samples. Making a good experimental sample is directly linked to good results. Therefore, cell culture experiments are highly accurate.
이러한 세포 배양 실험을 수행하는데 있어 가장 큰 문제점으로 떠오르는 것은 오염 요소이다. 배양된 세포가 이러한 오염 요소들에 의해 감염이 진행되면 전체적인 성장속도가 더뎌지고, 전사(transcription), 번역(translation) 전 과정에서 이상이 발생한다. 이러한 오염 요소들 중, 절대적으로 높은 비율을 차지하고 있는 요소는 마이코플라즈마(mycoplasma)라는 미생물이다.One of the biggest problems in performing these cell culture experiments is contamination. When the cultured cells are infected by these pollutants, the overall growth rate is slowed, and abnormalities occur throughout the transcription and translation stages. Among these pollutants, an absolutely high proportion is the microorganism called mycoplasma.
마이코플라즈마는 그 종이 무수히 많은 것으로 알려져 있다. 하지만 세포 배양 실험에서 오염 요소로 발견되는 종은 네 가지 종이 주를 이루고 있으며 이 비율이 배양 세포 오염요소의 98% 이상을 차지하고 있는 것으로 보고 되고 있다. 이 네 가지 종은 mycoplasma arginini , mycoplasma fermentans , mycoplasma orale , mycoplasma hyorhinis이다. 하지만 각각의 종들이 배양된 세포에 어떠한 악영향을 일으키는지, 오염이 어떠한 유입경로를 통해서 이루어지는지에 관한 연구는 진행되고 있지 않다. 만약 이러한 연구가 성공적으로 진행이 된다면, 세포배양에서의 마이코플라즈마의 대비를 더욱 더 철저하게 할 수 있으며 그 대비책도 더 구체화 시킬 수 있다.Maiko Plzma is known to have a myriad of species. However, in the cell culture experiment, four species are found as contaminants, and this ratio is reported to account for more than 98% of the culture cell contaminants. These four species are mycoplasma arginini , mycoplasma fermentans , mycoplasma orale , mycoplasma hyorhinis . However, there is no study of what kind of adverse effects each species has on the cultured cells, and what kind of inflow is caused by contamination. If these studies are successful, the preparation of mycoplasma in cell culture can be made even more thorough, and the preparation can be further specified.
기존의 분자유전학적 종 판별은 대부분 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 통해서 이루어지고 있다. 이 기술은 프라이머와 DNA 사이의 어닐링(annealing)을 기초로 이루어지는 기술이다. 종 판별은 판별하고자 하는 종의 DNA와 100% 상보적인 프라이머를 이용하여 이루어진다. 하지만 프라이머와 DNA는 그 염기서열이 완벽히 상보적이지 않더라도 어닐링이 이루어지는 경우가 대부분이다. 보통 프라이머와 DNA간의 염기서열이 1~3bp만 상보적이지 않다면 어닐링은 발생한다(길이가 20bp 부근인 primer 기준). 그리고 이는 잘못된 종 판별 결과로 이어진다.Most of the existing molecular genetic species discrimination is done through PCR (Polymerase Chain Reaction). This technique is based on the annealing between primer and DNA. The species discrimination is performed using the DNA of the species to be discriminated and the primer which is 100% complementary. However, most of the primers and DNA are annealed even if their nucleotide sequences are not perfectly complementary. Generally annealing will occur if the base sequence between the primer and the DNA is not complementary by 1 to 3 bp (based on a primer with a length of around 20 bp). And this leads to the result of wrong species discrimination.
본 발명에서 다루고 있는 마이코플라즈마 종들의 DNA 염기서열은 그 차이가 거의 없기 때문에 기존의 PCR 방법만으로는 그 종 판별이 어렵다. 또한 섞여있는 여러 종의 마이코플라즈마 DNA를 판별한다는 것은 더욱 어려운 일이다. 하지만 실제 배양된 세포를 판단할 때에는 여러 종의 마이코플라즈마가 섞여 있는 경우가 대부분이다.Since the DNA sequence of the mycoplasma species discussed in the present invention has little difference therebetween, it is difficult to distinguish the species only by the conventional PCR method. It is also more difficult to distinguish the mycoplasma DNA from the mixed species. However, when judging actually cultured cells, many kinds of mycoplasma are mixed.
1-2bp의 DNA 염기서열 차이를 저렴하고, 빠르게 분석 할 수 있는 기술에 관한 연구는 꾸준히 이루어지고 있다. 이러한 기술은 변이가 많으며 종 간 유전적 차이가 크지 않은 미생물의 종들을 판별할 수 있는 원천적 기술이기 때문이다. 미생물의 종 판별이 아니더라도, 유전자 염기서열을 빠르고 값 싸게 분석하는 방법은 여러 방면에서 적용이 가능한 기술이다. 특히 1bp가 다른 DNA 염기서열을 분석하는 기술은 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 분석과 직결되기 때문에 많은 주목을 받고 있으며, 이는 맞춤형 의학시대의 실현과 밀접한 연관이 있다.Researches on techniques to analyze DNA base sequence differences of 1-2bp inexpensively and rapidly have been carried out steadily. This is because this technique is a fundamental technology for discriminating microorganism species that are highly mutated and have little genetic differences among species. Even if it is not the species identification of microorganisms, the method of analyzing the gene base sequence quickly and inexpensively is a technique that can be applied in various fields. In particular, the technique of analyzing different DNA sequences of 1 bp is attracting much attention because it is directly related to SNP (Single Nucleotide Polymorphism) analysis, which is closely related to the realization of customized medical age.
현재 이러한 1-2bp의 염기서열 차이를 저렴하고 빠른 속도로 분석 할 수 있는 기술로써는 이중라벨 프로브(dual labeled probe)의 digestion을 이용한 real-time PCR 기술이 지배적이다. 하지만 이 기술은 한 개의 염기서열 차이를 보기 위해서 두 가지의 프로브를 제작해야 하며, 이는 실험의 양과 비용을 두 배로 증가시키고 있다.Currently, real-time PCR technology using digestion of dual labeled probes is dominant as a technique to analyze such a 1-2 bp nucleotide sequence inexpensively and rapidly. However, this technique requires the production of two probes to see one sequence difference, doubling the amount and cost of the experiment.
또한 이중라벨 프로브 방법의 단점들을 보완하기 위한 방법으로는 FMCA 방법이 많은 주목을 받고 있다. 하지만 기존의 DNA-DNA 결합에서 나오는 Tm값의 변화가 크지 않아 그 분석에 어려움을 겪고 있다. 보통 DNA-DNA 결합에서 1bp가 다를 경우 Tm값이 0.2℃~0.3℃정도 차이가 나는 것으로 연구결과가 보고되어 있다(Primer 및 probe가 20bp일 경우). 이를 극복하기 위해 FMCA 과정에서 온도 조절을 미세하게 하는 HRM(High Resolution Method) 방법도 개발이 되었으나, 역시 많은 실효성을 거두고 있지는 못한 실정이다.Also, the FMCA method has attracted much attention as a method to overcome the disadvantages of the double label probe method. However, the change of Tm value from the existing DNA-DNA binding is not so great and it is difficult to analyze it. It has been reported that when the DNA-DNA binding is different by 1 bp, the Tm value differs from 0.2 ° C to 0.3 ° C (when the primer and probe are 20bp). In order to overcome this problem, the HRM (High Resolution Method) method, which controls the temperature in the FMCA process, has also been developed.
이에 본 발명자들은 PNA프로브 및 FMCA를 이용해 정확한 용해온도 값을 측정함으로써 정밀도를 높인 마이코플라즈마 종 판별방법을 개발하기에 이르렀다.
Therefore, the inventors of the present invention have developed a method for discriminating mycoplasma species by increasing the precision by measuring an accurate dissolution temperature value using a PNA probe and FMCA.
본 발명의 마이코플라즈마 알기니(Mycoplasma arginini), 마이코플라즈마 퍼멘턴스(Mycoplasma fermentans) 및 마이코플라즈마 오레일(Mycoplasma orale) 동시 진단용 PNA 프로브 세트를 제공하는 것이다.Mycoplasmas of the present invention find you (Mycoplasma arginini), Mycoplasma peomen capacitance (Mycoplasma fermentans) and Mycoplasma oleyl (Mycoplasma orale ) simultaneous diagnostic PNA probe set.
본 발명의 다른 목적은 대상 시료에서 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 상기 PCR 증폭 산물에 상기 PNA 프로브 세트를 주입하고 real-time PCR을 시키는 단계; 온도를 변화시키면서 상기 실시간 PCR에 의해 증폭된 증폭산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및 상기 융해곡선의 융해온도를 확인하여 마이코플라즈마를 동정하는 단계; 를 포함하는 세 종의 마이코플라즈마를 동시 진단하기 위한 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method of separating DNA from a target sample, Amplifying the target sequence by performing PCR (polymerase chain reaction) using the separated DNA as a template and using the primer set; Injecting the PNA probe set into the PCR amplification product and performing real-time PCR; Melting the amplification product amplified by the real-time PCR while changing the temperature to obtain a fusion curve; And identifying the mycoplasma by confirming the melting temperature of the melting curve; The present invention provides a method for simultaneously diagnosing three types of mycoplasmas,
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프로브 세트를 포함하는 세 종의 마이코플라즈마 동시 진단 키트를 제공하는 것이다.
Yet another object of the present invention is to provide three kinds of cochlear diagnostics kits comprising the probe set.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은, 서열번호 1로 이루어진 마이코플라즈마 알기니(Mycoplasma arginini) 유전자에 특이적인 PNA 프로브; 서열번호 2로 이루어진 마이코플라즈마 퍼멘턴스(Mycoplasma fermentans) 유전자에 특이적인 PNA 프로브; 및 서열번호 3으로 이루어진 마이코플라즈마 오레일(Mycoplasma orale) 유전자에 특이적인 PNA 프로브; 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 PNA 프로브를 포함하는 마이코플라즈마 알기니, 마이코플라즈마 퍼멘턴스 및 마이코플라즈마 오레일 동시 진단용 PNA 프로브 세트를 제공한다.The present invention provides a PNA probe specific to a Mycoplasma arginini gene of SEQ ID NO: 1; Mycoplasma peomen capacitance (Mycoplasma consisting of SEQ ID NO: 2 specific PNA probe to fermentans) gene; And Mycoplasma < RTI ID = 0.0 > orale gene-specific PNA probes; And a set of PNA probes for simultaneous diagnosis of mycoplasma alginia, mycoplasma pertensinus, and mycoplasma oroyl comprising at least one PNA probe selected from the group consisting of:
본 명세서에서 사용되는 용어, “PNA(Peptide Nucleic Acid)”는 핵산염기가 인산 결합이 아니라 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA를 말한다. PNA는 화학적인 방법으로 합성되고 자연계에서는 발견되지 않는다. PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 일으켜서 겹가닥을 형성한다. 핵산 염기의 수가 같은 경우 PNA/DNA 겹가닥은 DNA/DNA 겹가닥보다, PNA/RNA 겹가닥은 DNA/RNA 겹가닥보다 안정하다. PNA의 기본 골격으로는 N-(2-아미노에틸)글리신이 아미드 결합에 의해 반복적으로 연결된 것이 가장 흔히 쓰이고, 이 경우 펩티드 핵산의 기본 골격(backbone)은 음전하를 띠는 천연 핵산의 기본 골격과 달리 전기적으로 중성이다. PNA에 존재하는 4개의 핵산 염기(nucleobase)는 DNA의 핵산 염기와 비슷한 공간을 차지하고 핵산 염기 사이의 거리도 천연 핵산의 경우와 거의 같다. PNA는 화학적으로 천연 핵산보다 안정할 뿐 아니라 핵산분해효소(Nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다.As used herein, the term " PNA (Peptide Nucleic Acid) " refers to a pseudo-DNA in which a nucleic acid base is connected by a peptide bond rather than a phosphate bond. PNAs are synthesized by chemical methods and are not found in nature. PNA forms a double strand by causing a hybridization reaction with a natural nucleic acid of a complementary base sequence. When the number of nucleic acid bases is the same, the PNA / DNA double strand is more stable than the DNA / DNA double strand, and the PNA / RNA double strand is more stable than the DNA / RNA double strand. The basic backbone of peptide nucleic acids is most often used in the case of N- (2-aminoethyl) glycine repeatedly linked by amide bonds as a basic skeleton of PNA. Unlike the basic structure of a negatively charged natural nucleic acid It is electrically neutral. The four nucleobases present in the PNA occupy a space similar to that of the DNA and the distance between the nucleotides is almost the same as that of the native nucleic acid. PNA is chemically more stable than natural nucleic acid and biologically stable because it is not degraded by nucleases or proteases.
본 명세서에서 사용되는 용어, “PNA 프로브”는 PNA 기반의 프로브를 이용해 표적 뉴클레오티드를 검출하는 마커이다. PNA프로브는 골격에 전하가 없기 때문에 음전하를 가진 상보적인 DNA 올리고머와의 결합에 있어서 반발력이 적어, DNA 프로브보다 빠르고 강하게 표적 뉴클레오티드 서열과 결합할 수 있으며, 효소들에 의한 손상이 없어 높은 안정성을 보인다.As used herein, the term " PNA probe " is a marker that detects a target nucleotide using a PNA-based probe. Since the PNA probe has no charge on the skeleton, it has a low repulsive force for binding to a complementary DNA oligomer with a negative charge. It can bond with the target nucleotide sequence more quickly and strongly than the DNA probe, and shows high stability without being damaged by enzymes .
본 발명의 구체예에서는, 상기 PNA(Peptide Nucleic Acid) 프로브를 이용하여 마이코플라즈마 종 판별의 정확성을 증가시킴으로써 상기한 종래의 문제점을 해결하였다. PNA-DNA 결합은 DNA-DNA와는 달리 1bp만 상보적이지 않아도 그 Tm(melting temperature) 값이 급격하게 떨어지는 경향을 갖는다. 이러한 Tm 값의 급격한 감소는 특정 온도에서의 PNA-DNA 사이의 어닐링(annealing)을 불가능하게 만든다.In the embodiments of the present invention, the above-described problems have been solved by increasing the accuracy of mycoplasma species discrimination using the PNA (Peptide Nucleic Acid) probe. Unlike DNA-DNA, PNA-DNA binding tends to have a sharp fall in the Tm (melting temperature) value even though it is not complementary to 1 bp. This sharp decrease in Tm makes annealing between PNA-DNA at a certain temperature impossible.
Tm 값의 감소 정도는 상보적이지 않은 염기서열의 종류와 그 위치, 그 개수에 따라서 달라지게 된다. 본 발명에서는 이러한 Tm 값의 감소 정도를 이용하여 종 판별을 정확하게 하기 위해 real-time PCR 기술의 응용분야인 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis)를 변형 및 적용하였다.The degree of reduction of the Tm value depends on the type, position, and number of non-complementary base sequences. In the present invention, FMCA (Fluorescence Melting Curve Analysis), which is an application field of real-time PCR technology, is modified and applied in order to accurately discriminate species by using the degree of decrease of Tm value.
본 명세서에서 사용되는 용어, “FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis)”는 형광물질을 이용하여 증폭 곡선의 검출을 통해 증폭 산물을 확인하는 기술을 말한다. 융해 곡선 분석에서는 PCR 후에 PCR 반응액의 온도를 서서히 올려, 형광물질의 형광 시그널을 모니터링한다. 처음에는 PCR 증폭 산물이 이중 가닥(double strand)를 형성해 형광 시그널을 나타내지만, 어느 일정한 온도에 이르면 단일가닥으로 분리되어 형광 신호가 급격하게 저하한다. 이 때의 온도가 융해 온도(Tm값)이며, 증폭 산물 서열의 고유 값이다. 본 발명의 구체예에서, 마이코플라즈마 알기니, 마이코플라즈마 퍼멘턴스 및 마이코플라즈마 오레일은 각각 고유의 Tm 값을 가지며, 본 발명의 PNA 프로브를 이용한 real-time PCR 및 FMCA를 통해 특정 Tm값에서 각각의 마이코플라즈마 종을 동시에 판별할 수 있다(도 3 내지 도 5).As used herein, the term " FMCA (Fluorescence Melting Curve Analysis) " refers to a technique for detecting an amplification product by detecting an amplification curve using a fluorescent substance. In the melting curve analysis, the temperature of the PCR reaction solution is gradually increased after the PCR, and the fluorescent signal of the fluorescent substance is monitored. Initially, the PCR amplification product forms a double strand to show a fluorescence signal, but when it reaches a certain temperature, it is separated into a single strand and the fluorescence signal rapidly drops. The temperature at this time is the melting temperature (Tm value) and is the eigenvalue of the amplification product sequence. In an embodiment of the present invention, mycoplasma algini, mycoplasma pertansorum and mycoplasma oryla have unique Tm values, respectively, and can be detected at specific Tm values by real-time PCR and FMCA using the PNA probes of the present invention, The mycoplasma species can be discriminated at the same time (Figs. 3 to 5).
본 발명의 구체예에서, PNA 프로브의 어닐링 여부를 가시화시키는 방법으로는 이중라벨 프로브(Dual labeled probe)를 사용할 수 있다. 즉 본 발명의 PNA 프로브는 리포터 물질(reporter molecule) 및 소광물질(quencher molecule)에서 선택된 하나 이상의 물질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 이중라벨 프로브는 PNA 프로브 양 끝에 각각 리포터 물질인 형광원(fluorophore)과 소광물질(quencher)를 라벨링(labeling)하는 방식이다. 이러한 이중라벨 프로브 는 상보적인 DNA 염기서열이 없는 경우, 내적인 염기서열간의 인력으로 인해 꼬임 구조를 갖게 된다. 따라서 상보적인 DNA 염기서열이 없는 경우, 형광과 quencher간의 거리가 가까워져 형광신호가 나타나지 않는다. 하지만 상보적인 DNA 염기서열이 존재하는 경우, 그 구조가 일자 구조를 취하게 된다. 따라서 상보적인 DNA 염기서열이 있는 경우, 형광과 quencher 간의 거리가 멀어져 형광신호가 나오게 된다.In an embodiment of the present invention, as a method of visualizing whether or not the PNA probe is annealed, a dual labeled probe may be used. That is, the PNA probe of the present invention may further comprise at least one substance selected from a reporter molecule and a quencher molecule. The double label probe is a method of labeling a fluorophore and a quencher, which are reporter substances, at both ends of the PNA probe. In the absence of complementary DNA sequences, these double-label probes will have a twisted structure due to the attraction between the internucleotide sequences. Thus, in the absence of complementary DNA sequences, the distance between the fluorescence and the quencher approaches and the fluorescence signal does not appear. However, if a complementary DNA sequence exists, its structure becomes a linear structure. Thus, if there is a complementary DNA sequence, the distance between the fluorescence and the quencher becomes farther away, resulting in a fluorescence signal.
본 발명의 구체예에서, 상기 리포터 물질은 FAM( 6-carboxyfluorescein), HEX(2', 4', 5', 7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), TRITC(tetramethyl rhodamine isothiocyanate), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), JOE(6-carboxy-4', 5'-dichloro-2', 7'-dimetoxyfluorescein), ROX(6-carboxy-X-rhodamine), 텍사스 레드(Texas Red), TET(2', 7'-dichloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), TAMRA(N,N,N',N'-tetramethyl-6-carboxyrhodamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.In an embodiment of the present invention, the reporter material is selected from the group consisting of 6-carboxyfluorescein, HEX (2 ', 4', 5 ', 7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein, fluorescein ), Fluorescein chlorotriazinyl, rhodamine green, rhodamine red, TRITC (tetramethyl rhodamine isothiocyanate), FITC (fluorescein isothiocyanate), Oregon green, X-rhodamine, Texas Red, TET (6-carboxy-4 ', 5'-dichloro-2', 7'- dimetoxyfluorescein) 2 ', 7'-dichloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein, TAMRA (N, N, N', N'-tetramethyl-6-carboxyrhodamine), cyanine dyes and cyan dicarbocyanine (thiadicarbocyanine) dyes, but are not limited thereto.
본 발명의 구체예에서, 상기 소광물질은 답실(Dabcyl), 카르복시테트라메틸로다민(TAMRA), 이클립스® 딥 다크 퀸처®(DDQ®), QSY®, 블랙베리®퀸처(Blackberry®Quencher), 블랙홀®퀸처(Black Hole®Quencher), 아이오와 블랙®FQ(Iowa black®FQ), 아이오와 블랙®RQ(Iowa black®RQ) 및 IRDye®QC-1 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.In the embodiment, the small mineral is dapsil (Dabcyl), carboxy-tetramethyl-rhodamine (TAMRA), Eclipse ® deep dark quencher ® (DDQ ®), QSY ®, BlackBerry ® quencher (Blackberry ® Quencher), Black Hole ® quencher (black Hole ® quencher), Iowa black ® FQ (Iowa black ® FQ) , Iowa black ® RQ (Iowa black ® RQ) and IRDye ® QC-1 can use one or more selected from the group, but not limited to .
또한 본 발명은,Further, according to the present invention,
대상 시료에서 DNA를 분리하는 단계;Separating the DNA from the target sample;
상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, PCR(polymerase chain reaction)을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;Amplifying the target sequence by performing PCR (polymerase chain reaction) using the separated DNA as a template;
상기 PCR 증폭 산물에 서열번호 3 내지 서열번호 5 중 어느 하나 이상을 포함하는 PNA 프로브 세트를 주입하고 real-time PCR을 시키는 단계;Injecting a set of PNA probes comprising any one or more of SEQ ID NOS: 3 to 5 into the PCR amplification product and performing real-time PCR;
온도를 변화시키면서 상기 real-time PCR에 의해 증폭된 증폭산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및Melting the amplification product amplified by the real-time PCR while changing the temperature to obtain a melting curve; And
상기 융해곡선의 융해온도를 확인하여 마이코플라즈마를 동정하는 단계;Identifying the microwave plasma by confirming the melting temperature of the melting curve;
를 포함하는 마이코플라즈마 알기니, 마이코플라즈마 퍼멘턴스 및 마이코플라즈마 오레일 동시 진단 방법을 제공한다.
And a method for simultaneous diagnosis of Mycoplasma alginia, Mycoplasma pertensitis, and Mycoplasma oryzae.
본 발명의 상기 방법을 이용하는 경우, 현재 세포배양에서 가장 빈번하게 발견되며, 가장 위협적인 오염요소인 마이코플라즈마 알기니, 마이코플라즈마 퍼멘턴스 및 마이코플라즈마 오레일 세 종을 판별할 수 있다. 보통 상기 종 판별을 위해서는 시퀀싱(sequencing)이 필요하다. 시퀀싱은 시료의 순도가 높지 않으면 DNA를 분석할 수 없다는 단점이 있다. 보통 시료의 순도를 높이기 위해서는 PCR을 사용한다. 하지만 분석하고자 하는 mycoplasma 세 종은 그 유전적 관계가 가까워 염기서열이 많이 차이가 나지 않아 선택적인 PCR이 어렵다. 결과적으로 이와 같은 기술은 오염원들의 DNA와 세포의 DNA가 섞인 시료에서는 적용이 불가능하다. 그러나 본 발명의 상기 방법을 사용하는 경우, 불순물이 섞인 시료에서도 정확하게 세 종의 마이코플라즈마를 분리할 수 있다.Using the method of the present invention, it is possible to distinguish among the most threatening pollutants, mycoplasma argini, mycoplasma pertansense and mycoplasma orrei, which are most frequently found in current cell cultures. Usually, sequencing is necessary for the species discrimination. Sequencing has the disadvantage that DNA can not be analyzed unless the purity of the sample is high. Usually, PCR is used to increase the purity of the sample. However, the mycoplasma species to be analyzed have a genetic relationship so that the nucleotide sequence is not much different and selective PCR is difficult. As a result, this technique is not applicable to samples with contaminating DNA and cellular DNA. However, when the above method of the present invention is used, it is possible to accurately separate three types of mycoplasma even in samples containing impurities.
본 발명의 구체예에서, 상기 PCR단계는 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 수행할 수 있다.In an embodiment of the present invention, the PCR step may be performed using a primer set consisting of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5.
본 발명의 상기 PCR 프라이머는 세 가지 마이코플라즈마 종이 공통적으로 가지고 있는 DNA 염기서열 부분을 표적으로 한다. 본 발명의 구체예에서, 상기 PCR 프라이머는 서열번호 4의 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 역방향 프라이머를 포함할 수 있다. 본 발명의 구체예에서, PCR 효율을 높이기 위해 여러 쌍의 프라이머를 넣지 않고 유니버셜 프라이머(universal primer) 기법을 사용할 수 있다. 상기 정방향 및 역방향 프라이머 안의 DNA 염기서열 부분은 종 특이적인 부분을 포함하도록 디자인 한다. 이 종 특이적인 염기서열 부분은 이중라벨 PNA 프로브와 상보적인 부분으로 적용된다. 본 발명의 구체예에서, 상기 PCR 프라이머로 인하여 증폭되는 PCR 산물은 PCR 증폭시간 단축과 FMCA에서의 효율을 위해 200bp 가량으로 제작할 수 있다.The PCR primer of the present invention targets a DNA sequence portion common to three mycoplasma species. In an embodiment of the present invention, the PCR primer may comprise the forward primer of SEQ ID NO: 4 and the reverse primer of SEQ ID NO: 5. In an embodiment of the present invention, a universal primer technique can be used without adding multiple pairs of primers to increase PCR efficiency. The DNA sequence portions in the forward and reverse primers are designed to include species specific portions. This species-specific base sequence portion is applied as a complementary part to the double-labeled PNA probe. In an embodiment of the present invention, the PCR product amplified by the PCR primers can be prepared in an amount of about 200 bp for shortening of the PCR amplification time and efficiency in the FMCA.
본 발명의 구체예에서, 이중라벨PNA 프로브 발광원리에 FMCA기술을 적용하기 위해 비대칭 PCR(Asymmetric PCR) 기술을 사용할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “비대칭 PCR”은 단일 가닥(single strand)의 DNA를 양산하는 기술이다. 본 발명의 PNA 프로브는 양산된 단일 가닥DNA에 상보적인 염기서열이 존재할 경우, 이에 결합하여 형광신호를 나타내게 된다.In embodiments of the present invention, asymmetric PCR (Asymmetric PCR) techniques may be used to apply the FMCA technique to the double label PNA probe luminescence principle. As used herein, the term " asymmetric PCR " is a technique for producing DNA of a single strand. The PNA probe of the present invention exhibits a fluorescent signal in the presence of a complementary base sequence to the produced single stranded DNA.
본 발명의 구체예에서, 프로브가 어닐링할 단일 가닥을 양산하기 위해서 PCR시 역방향 프라이머를 정방향 프라이머에 비해 약9배 내지 11배, 보다 바람직하게는 10배 더 넣어줄 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 상기 비대칭 PCR(asymmetric PCR)은 증폭효율이 일반 PCR보다 떨어질 수 있기 때문에 약 50cycles의 PCR을 수행할 수 있다. 이로 인해 역방향 프라이머로부터 생산되는 단일가닥이 많아 지고, 이중라벨 PNA 프로브가 어닐링될 수 있는 상보적인 염기서열 부분이 형성될 수 있다.In an embodiment of the present invention, the reverse primer can be inserted into the probe at a rate of about 9 to 11 times, more preferably 10 times more than that of the forward primer in order to produce a single strand to be annealed. In an embodiment of the present invention, the asymmetric PCR can perform a PCR of about 50 cycles because the amplification efficiency may be lower than that of a general PCR. This increases the number of single strands produced from the reverse primer, and a complementary base sequence portion can be formed in which double label PNA probes can be annealed.
상기 PCR 과정이 종료되면, 각각의 tube에 제작한 이중라벨 PNA 프로브들을 주입하는 단계를 포함할 수 있다. 그 후, real-time PCR 장비를 이용하여 FMCA 과정을 실시할 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 상기 FMCA 첫 과정에서는 온도를 25℃에서 약 5분간 인큐베이션(incubation) 시킨다. 이는 DNA와 PNA 프로브들을 완전히 부착시키기 위함이다. 이 후, 25℃부터 80℃까지 온도를 올려가면서 형광의 세기를 측정할 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 상기 형광 세기 측정은 1℃ 온도 상승을 10초 유지한 후 진행할 수 있다. 이는 이중라벨 PNA 프로브가 붙을 시간적 여유를 제공하기 위함이다.When the PCR process is completed, it may include injecting double-labeled PNA probes prepared in each tube. The FMCA procedure can then be performed using a real-time PCR instrument. In an embodiment of the invention, in the first FMCA procedure, the temperature is incubated at 25 DEG C for about 5 minutes. This is to completely adhere DNA and PNA probes. Thereafter, the intensity of fluorescence can be measured while raising the temperature from 25 ° C to 80 ° C. In an embodiment of the present invention, the fluorescence intensity measurement can be carried out after a temperature rise of 1 DEG C is maintained for 10 seconds. This is to provide a time margin to attach the double-label PNA probe.
상기 FMCA 과정이 종료되면, 온도 대비 형광 값을 분석하는 단계를 포함한다. 본 발명의 구체예에서, 상기 형광 값은 미분 값을 취한 후 그 값들을 음수 처리 하여 분석할 수 있다. 이는 Tm값을 분석하기 위함이다. 본 발명의 구체예에서, 상기 미분 및 음수 처리한 값을 세로 축으로, 온도 값을 가로 축으로 설정하여 융해곡선 그래프를 새로 그리는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 후, Tm 값을 분석하여 판별된 마이코플라즈마 종이 무엇인지 확인할 수 있다.When the FMCA process is terminated, the step of analyzing the fluorescence value with respect to temperature may be included. In an embodiment of the present invention, the fluorescence value can be analyzed by taking a derivative value and then processing the values by a negative number. This is to analyze the Tm value. In an embodiment of the present invention, it is possible to further include a step of newly drawing the melting curve graph by setting the value obtained by subjecting the differential and negative values to the vertical axis and the temperature value to the horizontal axis. Thereafter, the Tm value is analyzed to determine what kind of mycoplasma species are discriminated.
본 발명의 구체예에서, 한 종의 PNA 프로브를 이용하여 FMCA 그래프를 그린 경우; 두 종의 PNA 프로브를 이용하여 FMCA 그래프를 그린 경우; 세 종의 PNA 프로브를 이용하여 FMCA 그래프를 그려 마이코플라즈마 종의 Tm 값을 분석할 수 있다(도 3 내지 도 5).
In an embodiment of the present invention, when an FMCA graph is drawn using one kind of PNA probe; When two kinds of PNA probes are used to draw FMCA graphs; The Tm values of mycoplasma species can be analyzed by plotting FMCA graphs using three kinds of PNA probes (FIG. 3 to FIG. 5).
본 발명의 구체예에서 상기 융해온도가 45~47 ℃ 인 경우, 바람직하게는 46 ℃ 인 경우 마이코플라즈마 오레일; 상기 융해온도가 66~68 ℃ 인 경우, 바람직하게는 67 ℃ 인 경우 마이코플라즈마 알기니; 및 상기 융해온도가 71~73 ℃ 인 경우, 바람직하게는 72 ℃ 인 경우 마이코플라즈마 퍼멘턴스로 판별할 수 있다.In the embodiment of the present invention, when the melting temperature is 45 to 47 DEG C, preferably 46 DEG C, mycoplasma oleyl; When the above-mentioned melting temperature is 66 to 68 DEG C, preferably 67 DEG C, the mycoplasma alginate; And in the case where the melting temperature is 71 to 73 ° C, preferably 72 ° C, it can be determined as mycoplasma fermentation.
본 발명에서는 Tm값의 패턴을 보고 종 판별을 진행하기 때문에 한 튜브 내에서 한 가지 형광을 통해 다수의 종 판별이 가능하다는 장점을 지닌다.
In the present invention, since classification of the Tm values is performed, classification of a plurality of species can be performed through one fluorescence in one tube.
또한 본 발명은 상기 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함하는 프라이머 세트 및 상기 서열번호 3 내지 서열번호 5 중 하나 이상의 프로브 세트를 포함하는 마이코플라즈마 알기니, 마이코플라즈마 퍼멘턴스 및 마이코플라즈마 오레일 동시 진단용 키트를 제공한다. 상기 키트를 이용하여, 본 발명의 상기 방법에 적용함으로써 분석하고자 하는 시료 내의 세가지 마이코플라즈마 종을 간단하고 정확하게 판별할 수 있다.
The present invention also relates to a method for simultaneous diagnosis of Mycoplasma argini, mycoplasma pertensinus and mycoplasma orrai comprising a primer set comprising SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and a probe set of at least one of SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: Provide a kit. By applying the kit to the method of the present invention, it is possible to easily and accurately discriminate three mycoplasma species in a sample to be analyzed.
본 발명은 배양된 세포를 오염시키는 주요 원인인 마이코플라즈마 알기니, 마이코플라즈마 퍼멘턴스 및 마이코플라즈마 오레일로 구성된 3종의 마이코플라즈마 종을 신속하고 정확하게 판별할 수 있다. 구체적으로, 높은 염기적 상보성을 갖는 PNA 및 FMCA를 이용하여, 혼입 시료에 DNA가 섞여 있더라도 한가지 형광을 통해 각각의 종 판별이 가능하며, 한 튜브 내에서 한번에 3종의 마이코플라즈마를 판별할 수 있는 효과를 제공한다.
The present invention can quickly and accurately discriminate three kinds of mycoplasma species composed of mycoplasma argini, mycoplasma pertensin and mycoplasma oroyl, which are main causes of contamination of cultured cells. Specifically, it is possible to discriminate each species through one fluorescence even if DNA is mixed in a mixed sample using PNA and FMCA having high basic complementarity, and it is possible to identify three kinds of mycoplasma in one tube in one tube Effect.
도 1은 PNA와 FMCA를 이용하여 3종의 mycoplasma를 종 판별 하는 원리를 도식화 한 것이다: 본 발명의 구체예에서, FMCA protocol의 처음 부분인 25℃ 부근에서는 낮은 온도로 인하여 모든 이중라벨 PNA 프로브가 부착되어 있다. 따라서 모든 PNA 프로브가 일자 형태를 띄게 되고 이로 인해 형광물질과 소광물질이 떨어지면서 형광이 발생한다. 온도가 올라가면서 46℃ 부근에 도달하게 되면 mycoplasma orale의 PNA 프로브는 Tm값 부근에 도달하게 되어 주형으로부터 분리가 된다. 분리가 되면 내적인 염기서열의 인력으로 인하여 형광물질과 소광물질이 부착된다. 이로 인해 mycoplasma orale의 PNA 프로브의 시그널(signal)은 급격하게 낮아지게 된다. 본 발명은 상기한 형광신호의 급격한 감속원리를 적용하여 종 판별을 진행한다. Mycoplasma arginini , mycoplasma fermentans 역시 동일한 원리가 적용된다(67℃, 72℃ 부근).
도 2는 본 발명의 구체예에 따른 프라이머를 이용한 세 종의 마이코플라즈마 16s rRNA gene의 증폭결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 구체예에 따른 한 종의 PNA 프로브를 이용하여 FMCA 그래프를 그린 결과를 나타낸다. 즉, 음성대조군(NEGATIVE); 마이코플라즈마 알기니 PNA 프로브; 마이코플라즈마 퍼멘턴스 PNA 프로브; 마이코플라즈마 오레일 PNA 프로브 각각을 이용한 FMCA 그래프 결과이다.
도 4는 본 발명의 구체예에 따른 두 종의 PNA 프로브를 이용하여 FMCA 그래프를 그린 결과를 나타낸다. 즉, 마이코플라즈마 알기니 PNA 프로브 및 마이코플라즈마 퍼멘턴스 PNA 프로브를 이용한 FMCA 그래프; 마이코플라즈마 퍼멘턴스 PNA 프로브 및 마이코플라즈마 오레일 PNA 프로브를 이용한 FMCA 그래프; 마이코플라즈마 알기니 PNA 프로브 및 마이코플라즈마 오레일 PNA 프로브를 이용한 FMCA그래프; 결과이다.
도 5는 본 발명의 구체예에 따른 세 종의 마이코플라즈마 알기니 PNA 프로브, 마이코플라즈마 퍼멘턴스 PNA 프로브 및 마이코플라즈마 오레일 PNA 프로브 전부를 이용하여 FMCA 그래프 결과이다.Figure 1 illustrates the principle of classifying three mycoplasmas using PNA and FMCA: In the embodiment of the present invention, due to the low temperature around 25 C, which is the first part of the FMCA protocol, all double-labeled PNA probes Respectively. Therefore, all PNA probes are in the form of a date, resulting in fluorescence as fluorescence and minerals are separated. When the temperature rises to about 46 캜, mycoplasma The PNA probe of orale reaches near the Tm value and is separated from the template. When separated, phosphorus and minerals adhere due to the internal base sequence attraction. This causes mycoplasma the signal of the PNA probe of the orale is drastically lowered. The present invention applies the sudden deceleration principle of the above-mentioned fluorescent signal to proceed with class discrimination. Mycoplasma arginini , mycoplasma fermentans The same principle applies (67 [deg.] C, around 72 [deg.] C).
FIG. 2 shows amplification results of three kinds of mycoplasma 16s rRNA genes using primers according to an embodiment of the present invention.
Figure 3 shows the results of FMCA graphing using one kind of PNA probe according to embodiments of the present invention. A negative control (NEGATIVE); Mycoplasma alginia PNA probes; Mycoplasma Permanent PNA probe; And FMCA graph results using mycoplasma oroyl PNA probes, respectively.
FIG. 4 shows the result of drawing FMCA graphs using two kinds of PNA probes according to the embodiment of the present invention. That is, an FMCA graph using a Mycoplasma arginine PNA probe and a Mycoplasma permantance PNA probe; An FMCA graph using a Mycoplasma fermentation PNA probe and a Mycoplasma oroyl PNA probe; FMCA graph using mycoplasma alginate PNA probe and mycoplasma oroyl PNA probe; Results.
FIG. 5 shows FMCA graph results using all three types of mycoplasma arginine PNA probes, mycoplasma permutane PNA probes, and mycoplasma oleyl PNA probes according to an embodiment of the present invention.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically by way of examples. It should be noted, however, that the following examples are provided to further illustrate the present invention and are not intended to limit the scope of the present invention.
실시예Example 1. One. PNAPNA 및 And FMCAFMCA 를 이용한 세 종의 Three species using 마이코플라즈마Maiko Plasma 판별 Discrimination
실시예Example 1-1. 3종의 1-1. Three kinds of 마이코플라즈마Maiko Plasma 16s 16s rRNArRNA genegene 을 증폭시키기 위한 To amplify 유니버Universal 셜 Shal 프라이머primer (( universaluniversal primerprimer ) 제작Production
PCR 프라이머는 세 가지 마이코플라즈마(mycoplasma) 종이 공통적으로 가지고 있는 DNA 염기서열 부분을 표적(target)으로 하였다. 이때, PCR 효율을 높이기 위해 여러 쌍의 프라이머를 넣지 않고 유니버셜 프라이머(universal primer) 기법을 사용하였다. 양 프라이머 안의 DNA 염기서열 부분은 종 특이적인 부분을 포함하도록 디자인 하였다.PCR primers were targeted to DNA sequence sequences common to the three mycoplasma species. At this time, universal primer technique was used without increasing the number of pairs of primers in order to increase the PCR efficiency. The DNA base sequence part in both primers was designed to contain species specific parts.
(정방향 프라이머)SEQ ID NO: 4
(Forward primer)
(역방향 프라이머)SEQ ID NO: 5
(Reverse primer)
상기 종 특이적인 염기서열 부분은 이중라벨 PNA 프로브와 상보적인 부분으로 적용된다.The species-specific base sequence portion is applied as a complementary portion to the double-labeled PNA probe.
유니버셜 프라이머의 효율을 검증하기 위한 PCR을 실시하였다(표 2 및 표 3). 먼저 PCR mixture 제작하였다. PNA qPCR 프리믹스(premix) (Cat. PNAQ-E1001, PANAGENE, Korea) 10μl 에 증류수(D.W.) 8μl 주입하고, 프라이머 믹스쳐(Primer mixture) 1μl 주입하였다. 상기 프라이머 믹스쳐 1ul는 정방향 프라이머(forward primer) 0.5pmole, 역방향 프라이머(reverse primer) 5pmole으로 구성하였다. 상기 방법으로 제작한 PCR mixture에 미지의 시료 샘플(genomic DNA) 1μl를 주입하고 PCR을 실시하였다.PCR was performed to verify the efficiency of the universal primers (Table 2 and Table 3). First, a PCR mixture was prepared. 8 μl of distilled water (D.W.) was injected into 10 μl of PNA qPCR premix (Cat. PNAQ-E1001, PANAGENE, Korea) and 1 μl of primer mixture was injected. 1ul of the primer mixer was composed of 0.5 pmole of a forward primer and 5 pmole of a reverse primer. 1 μl of an unknown sample (genomic DNA) was injected into the PCR mixture prepared by the above method and PCR was performed.
35 cycles
35 cycles
상기 PCR 결과, 본 발명의 유니버셜 프라이머를 이용하는 경우 마이코플라즈마 알기니(mycoplasma arginini) , 마이코플라즈마 퍼멘턴스(mycoplasma fermentans) 및 마이코플라즈마 오레일(mycoplasma orale) 의 세 가지 마이코플라즈마 종을 동시에 선명하게 검출할 수 있는 것으로 나타났다(도 1).
As a result of the PCR, when using the universal primer of the present invention, mycoplasma arginini), Mycoplasma peomen capacitance (mycoplasma fermentans) and Mycoplasma oleyl (mycoplasma orale ) at the same time (FIG. 1).
실시예Example 1-2. 비대칭 1-2. Asymmetry PCRPCR (( asymmetricasymmetric PCRPCR ) 실시) Conducted
실시예 1-1에 따른 PCR 프라이머로 인하여 증폭되는 PCR 산물(product)은 PCR 증폭시간 단축과 FMCA에서의 효율을 위해 200bp 가량으로 제작하였다. 프로브가 어닐링(annealing)할 단일가닥(single strand)을 양산하기 위해서 PCR시 역방향 프라이머(reverse primer)를 정방향 프라이머(forward primer)에 비해 10배 더 넣어주었다. 하기 표 4 및 표 5의 구성으로 비대칭 PCR을 실시하였다. 이러한 비대칭 PCR은 증폭효율이 일반 PCR보다 떨어질 수 있기 때문에 50 사이클의 PCR을 수행하였다. 이로 인해 역방향 프라이머(reverse primer)로부터 생산되는 단일가닥이 많아 지고, 이중라벨 PNA 프로브가 어닐링 될 수 있는 상보적인 염기서열 부분이 형성되었다.The PCR product amplified by the PCR primer according to Example 1-1 was prepared at a level of 200 bp for shortening the PCR amplification time and for the efficiency in the FMCA. To produce a single strand annealing the probe, a reverse primer was added 10 times more than the forward primer during PCR. Asymmetric PCR was performed with the structures shown in Tables 4 and 5 below. This asymmetric PCR performed 50 cycles of PCR because the amplification efficiency may be lower than the general PCR. This increased the number of single strands produced from the reverse primer and formed a complementary base sequence region in which double label PNA probes could be annealed.
50 cycles
50 cycles
실시예Example 1-3. 이중라벨 1-3. Double label PNAPNA 프로브Probe 주입 및 Injection and realreal -- timetime PCRPCR 을 이용해 Using FMCAFMCA 실시 practice
실시예 1-2의 PCR 과정이 종료된 후, PCR 튜브를 꺼내어서, 각각의 튜브(tube)에 제작한 이중라벨 PNA 프로브들을 주입하였다. 마이코플라즈마 알기니(M. arginini) 판별(detection)용 PNA 프로브 5pmole, 마이코플라즈마 퍼멘턴스(M. fermentans) 판별용 PNA 프로브 5pmole, 마이코플라즈마 오레일(M. orale) 판별용 PNA 프로브 5pmole을 주입하였다. 그 후, real-time PCR 장비를 이용하여 FMCA 과정을 실시하였다.After the PCR procedure of Example 1-2 was completed, the PCR tubes were taken out and double-labeled PNA probes prepared in each tube were injected. A Mycoplasma you know (M. arginini) determination (detection) PNA probe 5pmole, Mycoplasma peomen capacitance (M. Fermentans) determine PNA probe 5pmole, Mycoplasma oleyl determine PNA probe for 5pmole (M. orale) was injected for . The FMCA procedure was then performed using real-time PCR instrument.
본 실시예에 사용된 이중라벨 PNA 프로브는 다음의 표 6과 같다.The double label PNA probe used in this embodiment is shown in Table 6 below.
* = Ala-gamma
* = Ala-gamma
FMCA 첫 과정에서는 온도를 25℃에서 5분간 인큐베이션(incubation) 시켰다. 이는 DNA와 PNA 프로브들을 완전히 부착시키기 위함이다. 이 후, 25℃부터 80℃까지 온도를 올려가면서 형광의 세기를 측정하였다(표 7). 형광 세기 측정은 1℃ 상승을 10초 유지 후 진행하였으며, 온도 1℃ 상승 당 한번 이루어지도록 설정하였다. 이는 이중라벨 PNA 프로브가 붙을 시간적 여유를 제공하기 위함이다. 또한 형광측정은 FAM, HEX를 동시에 측정하도록 설정하였다.In the first FMCA procedure, the temperature was incubated at 25 ° C for 5 minutes. This is to completely adhere DNA and PNA probes. Thereafter, the intensity of fluorescence was measured while raising the temperature from 25 ° C to 80 ° C (Table 7). The fluorescence intensity measurement was carried out after maintaining the temperature rise of 1 ° C for 10 seconds and once per temperature rise of 1 ° C. This is to provide a time margin to attach the double-label PNA probe. In addition, fluorescence measurement was set to measure FAM and HEX simultaneously.
실시예Example 2. 세 가지 2. Three 마이코플라즈마Maiko Plasma 종의 온도 대비 형광 값 분석 결과 Fluorescence analysis results of species relative to temperature
실시예 1-3의 FMCA 과정이 종료된 후, 온도 대비 형광 값을 분석하였다. 이 때 형광 값은 미분 값을 취한 후 그 값들을 음수 처리 하였다. 이는 Tm값을 분석하기 위함이다. 이 미분 및 음수 처리한 값을 세로 축으로, 온도 값을 가로 축으로 설정하여 그래프를 새로 그렸다(도 3 내지 도5).After completion of the FMCA procedure of Example 1-3, fluorescence values versus temperature were analyzed. In this case, fluorescence values were taken as differential values and then treated as negative values. This is to analyze the Tm value. The graph was newly drawn by setting the value obtained by performing the differential and negative processing on the vertical axis and the temperature value on the horizontal axis (Fig. 3 to Fig. 5).
먼저 한 종의 PNA 프로브를 이용하여 그래프를 그렸다. 즉 음성대조군(NEGATIVE); 마이코플라즈마 알기니 PNA 프로브; 마이코플라즈마 퍼멘턴스 PNA 프로브; 마이코플라즈마 오레일 PNA 프로브 각각을 이용한 FMCA 그래프를 그렸다(도 3). 또한 두 종의 PNA 프로브를 이용하여 그래프를 그렸다. 즉, 마이코플라즈마 알기니 PNA 프로브 및 마이코플라즈마 퍼멘턴스 PNA 프로브를 이용한 FMCA 그래프; 마이코플라즈마 퍼멘턴스 PNA 프로브 및 마이코플라즈마 오레일 PNA 프로브를 이용한 FMCA 그래프; 마이코플라즈마 알기니 PNA 프로브 및 마이코플라즈마 오레일 PNA 프로브를 이용한 FMCA그래프;를 그렸다(도 4). 또한 세 종의 마이코플라즈마 알기니 PNA 프로브, 마이코플라즈마 퍼멘턴스 PNA 프로브 및 마이코플라즈마 오레일 PNA 프로브 전부를 이용하여 FMCA 그래프를 그렸다(도 5).First, we plotted a PNA probe of one kind. A negative control (NEGATIVE); Mycoplasma alginia PNA probes; Mycoplasma Permanent PNA probe; The FMCA graph using each of mycoplasma oroyl PNA probes was drawn (Fig. 3). We also plotted two PNA probes. That is, an FMCA graph using a Mycoplasma arginine PNA probe and a Mycoplasma permantance PNA probe; An FMCA graph using a Mycoplasma fermentation PNA probe and a Mycoplasma oroyl PNA probe; FMCA graph using Mycoplasma alginate PNA probe and mycoplasma oroyl PNA probe (FIG. 4). In addition, FMCA graphs were drawn using all three kinds of mycoplasma alginate PNA probes, mycoplasma permantance PNA probes, and mycoplasma oroyl PNA probes (FIG. 5).
이 후, Tm 값을 분석하여 판별된 종이 무엇인지 확인하였다. 그 결과는 도 3 내지 5과 같다. 튜브에 마이코플라즈마 알기니(M. arginini) 게노믹 DNA가 존재 시, FAM 시그널(signal)에서 67℃의 피크가 형성되었으며, 마이코플라즈마 퍼멘턴스(M. fermentans) 게노믹 DNA가 존재 시, HEX 시그널에서 72℃의 피크가 형성되었다. 또한 튜브에 마이코플라즈마 오레일(M. orale) 게노믹 DNA가 존재 시, HEX 시그널에서 47℃의 피크가 형성되는 것을 알 수 있었다. 또한 세 종의 프로브를 전부 이용하여 실험을 진행한 경우에도 특정 온도에 따라 각 마이코플라즈마 종을 정확하게 판별할 수 있었다(도 5).After this, the Tm value was analyzed to confirm what kind of paper was discriminated. The results are shown in FIGS. When the M. arginini genomic DNA was present in the tube, a peak of 67 ° C was formed in the FAM signal. When the M. fermentans genomic DNA was present, the HEX signal Lt; RTI ID = 0.0 > 72 C. < / RTI > In addition, when M. oralegenomic DNA was present in the tube, a peak of 47 DEG C was formed in the HEX signal. In addition, even when the experiment was conducted using all three kinds of probes, it was possible to accurately discriminate each mycoplasma species according to a specific temperature (FIG. 5).
상기 결과는 본 발명의 PNA 프로브 및 FMCA를 이용한 방법을 사용하는 경우, 빠르고 정확하게 마이코플라즈마 세 종을 검출할 수 있는 것을 나타낸다.The above results show that the method using the PNA probe of the present invention and the FMCA can detect the mycoplasma species rapidly and accurately.
<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University ERICA Campus <120> Simultaneous detection method of three mycoplasma species using PNA probe and FMCA <130> p131624 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mycoplasma arginini PNA probe <400> 1 acacctggtt gag 13 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mycoplasma fermentans PNA probe <400> 2 gattttgttt tgacggt 17 <210> 3 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mycoplasma orale PNA probe <400> 3 acagttagtt g 11 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> universal forward primer <400> 4 actcctacgg gaggcagcag ta 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> universal reverse primer <400> 5 actcctacgg gaggcagcag ta 22 <110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University ERICA Campus <120> Simultaneous detection method of three mycoplasma species using PNA probe and FMCA <130> p131624 <160> 5 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mycoplasma arginini PNA probe <400> 1 acacctggtt gag 13 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mycoplasma fermentans PNA probe <400> 2 gattttgttt tgacggt 17 <210> 3 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mycoplasma orale PNA probe <400> 3 acagttagtt g 11 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> universal forward primer <400> 4 actcctacgg gaggcagcag ta 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> universal reverse primer <400> 5 actcctacgg gaggcagcag ta 22
Claims (12)
서열번호 2로 이루어진 마이코플라즈마 퍼멘턴스(Mycoplasma fermentans) 유전자에 특이적인 PNA 프로브; 및
서열번호 3으로 이루어진 마이코플라즈마 오레일(Mycoplasma orale) 유전자에 특이적인 PNA 프로브;
를 모두 포함하는 마이코플라즈마 알기니, 마이코플라즈마 퍼멘턴스 및 마이코플라즈마 오레일 동시 검출용 PNA 프로브 세트. A PNA probe specific to the Mycoplasma arginini gene of SEQ ID NO: 1;
A PNA probe specific to a Mycoplasma fermentans gene consisting of SEQ ID NO: 2; And
A PNA probe specific to the Mycoplasma orale gene of SEQ ID NO: 3;
A set of PNA probes for simultaneous detection of mycoplasma alginia, mycoplasma fermentation, and mycoplasma oroi.
상기 PNA 프로브는 리포터 물질(reporter molecule) 및 소광물질(quencher molecule)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 마이코플라즈마 알기니, 마이코플라즈마 퍼멘턴스 및 마이코플라즈마 오레일 동시 검출용 PNA 프로브 세트. The method according to claim 1,
Wherein the PNA probe further comprises a reporter molecule and a quencher molecule. 2. The PNA probe of claim 1, wherein the PNA probe further comprises a reporter molecule and a quencher molecule. The PNA probe for simultaneous detection of mycoplasma arginine, mycoplasma pertensin and mycoplasma orylae.
상기 리포터 물질은 FAM( 6-carboxyfluorescein), HEX(2', 4', 5', 7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), TRITC(tetramethyl rhodamine isothiocyanate), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), JOE(6-carboxy-4', 5'-dichloro-2', 7'-dimetoxyfluorescein), ROX(6-carboxy-X-rhodamine), 텍사스 레드(Texas Red), TET(2', 7'-dichloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), TAMRA(N,N,N',N'-tetramethyl-6-carboxyrhodamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 마이코플라즈마 알기니, 마이코플라즈마 퍼멘턴스 및 마이코플라즈마 오레일 동시 검출용 PNA 프로브 세트. 3. The method of claim 2,
The reporter material may be selected from the group consisting of 6-carboxyfluorescein, HEX (2 ', 4', 5 ', 7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), fluorescein, Rhodamine green, rhodamine red, TRITC (tetramethyl rhodamine isothiocyanate), FITC (fluorescein isothiocyanate), Oregon green, Alexa Fluor, 6-carboxy-X-rhodamine, Texas Red, TET (2 ', 7'-dichloro-2', 7'-dimethoxyfluorescein) 6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein, TAMRA (N, N, N ', N'-tetramethyl-6-carboxyrhodamine), cyanine dyes and thiadicarbocyanine dyes And a PNA probe set for simultaneous detection of mycoplasma arginine, mycoplasma pertensin and mycoplasma oryla.
상기 소광물질은 답실(Dabcyl), 카르복시테트라메틸로다민(TAMRA), 이클립스(Eclipse), 딥 다크 퀸처(DDQ), QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), 아이오와 블랙 FQ(Iowa black FQ), 아이오와 블랙 RQ(Iowa black RQ) 및 IRDye QC-1 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 마이코플라즈마 알기니, 마이코플라즈마 퍼멘턴스 및 마이코플라즈마 오레일 동시 검출용 PNA 프로브 세트. 3. The method of claim 2,
The minerals may be selected from the group consisting of Dabcyl, TAMRA, Eclipse, Deep Dark Quencher, QSY, Blackberry Quencher, Black Hole Quencher, (Iowa black FQ), Iowa black RQ (Iowa black RQ), and IRDye QC-1. The set of PNA probes for simultaneous detection of mycoplasma arginine, mycoplasma pertensin and mycoplasma oryra.
상기 분리된 DNA를 주형으로 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;
상기 PCR 증폭 산물에 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 PNA 프로브 세트를 주입하고 real-time PCR을 시키는 단계;
온도를 변화시키면서 상기 real-time PCR에 의해 증폭된 증폭산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및
상기 융해곡선의 융해온도를 확인하여 마이코플라즈마를 동정하는 단계;
를 포함하는 마이코플라즈마 알기니, 마이코플라즈마 퍼멘턴스 및 마이코플라즈마 오레일 동시 검출 방법. Separating the DNA from the target sample;
Amplifying the target sequence by performing PCR (polymerase chain reaction) using the separated DNA as a template;
Introducing into the PCR amplification product a set of PNA probes according to any one of claims 1 to 4 and performing real-time PCR;
Melting the amplification product amplified by the real-time PCR while changing the temperature to obtain a melting curve; And
Identifying the microwave plasma by confirming the melting temperature of the melting curve;
A method for detecting mycoplasma alginia, mycoplasma pertansense, and mycoplasma oryla simultaneously.
상기 PCR은 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법. 6. The method of claim 5,
Wherein the PCR is carried out using a primer set consisting of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5.
상기 PCR은 비대칭PCR(Asymmetric PCR)로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법. 6. The method of claim 5,
Wherein the PCR is performed by asymmetric PCR.
상기 비대칭 PCR은 역방향 프라이머를 정방향 프라이머에 비해 9배 내지 11배로 더 넣어 수행하는 것을 특징으로 하는 방법. 8. The method of claim 7,
Wherein the asymmetric PCR is performed by inserting the reverse primer 9 to 11 times more than the forward primer.
상기 융해곡선을 얻는 단계는 온도를 증가시키면서 형광세기를 측정하여, 온도 대비 형광 값을 분석하여 얻는 것을 특징으로 하는 방법 6. The method of claim 5,
Wherein the step of obtaining the melting curve is obtained by measuring fluorescence intensity with increasing temperature while measuring fluorescence intensity relative to temperature
상기 형광세기의 측정은 25℃ 내지 80℃로 온도를 증가시키면서 측정하는 것을 특징으로 하는 방법. 10. The method of claim 9,
Wherein the measurement of the fluorescence intensity is performed while increasing the temperature to 25 to 80 캜.
상기 융해온도가 45~47 ℃ 인 경우, 마이코플라즈마 오레일;
상기 융해온도가 66~68 ℃ 인 경우, 마이코플라즈마 알기니; 및
상기 융해온도가 71~73 ℃ 인 경우, 마이코플라즈마 퍼멘턴스로 판별하는 것을 특징으로 하는 방법. 6. The method of claim 5,
When the melting temperature is 45 to 47 占 폚, mycoplasma oleyl;
When the melting temperature is from 66 to 68 DEG C, the mycoplasma alginate; And
Wherein when the melting temperature is 71 to 73 占 폚, it is determined as mycoplasma fermentation.
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