KR102302971B1 - Active-based Tetra Peptide Probe for HTRA detection - Google Patents

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KR102302971B1 KR1020200049899A KR20200049899A KR102302971B1 KR 102302971 B1 KR102302971 B1 KR 102302971B1 KR 1020200049899 A KR1020200049899 A KR 1020200049899A KR 20200049899 A KR20200049899 A KR 20200049899A KR 102302971 B1 KR102302971 B1 KR 102302971B1
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Abstract

An HTRA activity-based peptide probe for detecting HTRA and a composition comprising the same according to the present invention have an advantage in that the probe can freely pass through a cell membrane or a mitochondrial membrane, and thus the HTRA activity of living cells can be measured. The intracellular activity of HTRA is involved in removal of abnormal proteins which induce cytotoxicity due to a folding problem, and thus is related to Alzheimer's disease and Parkinson's disease, which are degenerative brain disorders. Therefore, when the HTRA activity-based peptide probe for detecting HTRA and the composition comprising the same according to the present invention are used, it is determined that the probe and the composition can be utilized for an initial diagnosis of a degenerative brain disorder such as Alzheimer's disease and Parkinson's disease, and can be useful to discover a new biomarker related to degenerative brain disorders.

Description

활성 기반 HTRA 검출용 테트라 펩타이드 프로브{Active-based Tetra Peptide Probe for HTRA detection} Active-based Tetra Peptide Probe for HTRA detection

본 발명은 활성 기반 HTRA 검출용 테트라 펩타이드 프로브 및 이를 포함하는 HTRA 활성 측정용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to an activity-based tetrapeptide probe for detecting HTRA and a composition for measuring HTRA activity comprising the same.

HTRA(High tmeperature requirement A) 세린 프로테아제는 포유동물 세포와 미생물의 세포 스트레스 반응 및 단백질 품질 관리(protein quality control)와 관련되어 있다. 사람의 경우 HTRA는 4가지의 아형(isoform)이 존재한다. HTRA의 4가지 아형은 HTRA1, HTRA2, HTRA3 및 HTRA4로 명명되었으며 각 단백질의 도메인은 서로 잘 보존되어 있는 것을 특징으로 한다. HTRA1은 세포막, 세포질 및 세포핵에 위치하는 것으로 알려져 있으며 세포외 기질의 항상성을 조절하기 위하여 세포외로 배출되는 것으로 알려져 있다. HTRA1은 아밀로이드 전구 단백질(amyloid precursor proteins, APP) 프로세스 및 β-아밀로이드(β-amyloid) 및 타우 섬유단백질(tau fibril) 프로세스에 관여된 것을 알려져 있어 알츠하이머병의 치료제로서 가능성이 있는 것으로 알려져 있다. 또한 미토콘드리아 HTRA2는 암세포 침투 및 세포사멸신호와 관련이 있는 것으로 판단되는데 HTRA2 활성의 저하는 파킨슨씨병과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. High tmeperature requirement A (HTRA) serine protease is involved in cellular stress response and protein quality control in mammalian cells and microorganisms. In humans, there are four isoforms of HTRA. The four subtypes of HTRA were named HTRA1, HTRA2, HTRA3 and HTRA4, and the domains of each protein are characterized by being well conserved with each other. HTRA1 is known to be located in the cell membrane, the cytoplasm and the cell nucleus, and is known to be excreted out of the cell to regulate the homeostasis of the extracellular matrix. HTRA1 is known to be involved in amyloid precursor proteins (APP) processes and β-amyloid and tau fibril processes, so it is known to have potential as a therapeutic agent for Alzheimer's disease. In addition, mitochondrial HTRA2 is considered to be related to cancer cell infiltration and apoptosis signals, and a decrease in HTRA2 activity is known to be related to Parkinson's disease.

미생물의 경우 HTRA는 헬리코박터 파이로리(Helicobactor pylori) 종 또는 클라미디아(Chlamydia) 종과 같이 높은 병원성을 가지며 항생제 내성이 높은 종에서 발견되는 것으로 알려져 있다. 미생물 유래 HTRA는 숙주세포에 대한 침투작용에서 역할을 하는 것으로 알려져 있으며 열 스트레스 또는 산스트레스 환경에서 미생물이 생존하는데 관여하는 것으로 알려져 있다. In the case of microorganisms, HTRA is known to be found in highly pathogenic and antibiotic-resistant species, such as Helicobactor pylori species or Chlamydia species. Microbial-derived HTRA is known to play a role in invasive action on host cells, and is known to be involved in the survival of microorganisms in heat stress or acid stress environments.

HTRA는 세린 프로테아제에 속하나 HTRA 특이적인 저분자 억제제, 화학적 프로브 및 기질에 대한 연구는 부족한 실정이다. HTRA1 및 2의 작동기작 및 삼차원 크리스탈 구조는 잘 알려져 있는 형편이나 β-카제인 및 H2-최적화 기질 펩타이드와 같은 몇몇 펩타이드 기질만이 알려져 있을 뿐이다. 특히 상기 알려진 HTRA의 기질들은 그 크기가 커 세포막을 통과할 수 가 없으므로 살아있는 세포에서 HTRA을 검출하거나 HTRA의 활성을 특정할 수 있는 화학적 프로브로 사용하는데 제한이 있었다. 특히, 미토콘드리아에 존재하는 HTRA2는 종래의 화학적 프로브들이 세포막을 통과할 수 없으므로 화학적 또는 물리적인 방법으로 세포막과 미토콘드리아막을 모두 파괴하거나 미토콘드리아만을 따로 동정한 후 이를 용해하여야만 측정이 가능한 한계가 있었다.HTRA belongs to serine proteases, but studies on HTRA-specific small molecule inhibitors, chemical probes and substrates are lacking. The mechanism of action and three-dimensional crystal structure of HTRA1 and 2 are well known, but only a few peptide substrates such as β-casein and H2-optimized substrate peptides are known. In particular, the known substrates of HTRA are large in size and cannot pass through the cell membrane, so there is a limitation in their use as a chemical probe capable of detecting HTRA in living cells or specifying the activity of HTRA. In particular, HTRA2 present in mitochondria cannot pass through the cell membrane with conventional chemical probes, so either destroy both the cell membrane and the mitochondrial membrane by a chemical or physical method, or only the mitochondria are identified and then dissolved. There is a limit that can be measured.

HTRA가 다양한 생리학적 또는 병리학적 프로세스에 상당한 관여를 하고 있다는 점을 고려하면, 살아있는 세포에서 HTRA을 검출하고 호라성을 측정할 수 있는 타겟팅된 화학 프로브가 개발된다면 HTRA의 기능을 연구를 하는데 매우 유용한 도구가 될 것으로 판단되며 나아가 알츠하이머병이나 파킨슨병과 같은 신경퇴행성 질환 및 미생물 감염의 초기 진단에 사용할 있는 바이오마커로서 활용이 가능할 것으로 기대된다. Considering that HTRA is significantly involved in various physiological or pathological processes, it would be very useful to study the function of HTRA if a targeted chemical probe that can detect HTRA in living cells and measure its hormonal properties is developed. It is expected to be a tool, and furthermore, it is expected to be used as a biomarker that can be used for the initial diagnosis of microbial infections and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease and Parkinson's disease.

본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다. The patents and references mentioned herein are hereby incorporated by reference to the same extent as if each publication were individually and expressly specified by reference.

T. Clausen, M. Kaiser, R. Huber and M. Ehrmann, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2011, 12, 152. D. Zurawa-Janicka, T. Wenta, M. Jarzab, J. Skorko-Glonek, P. Glaza, A. Gieldon, J. Ciarkowski and B. Lipinska, Arch. Biochem. Biophys., 2017, 621, 6-23.

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J. Skrko-Glonek, D. Zurawa-Janicka, T. Koper, M. Jarzab, D. Figaj, P. Glaza and B. Lipinska, Curr. Pharm. Des., 2013, 19, 977-1009. S. Grau, A. Baldi, R. Bussani, X. Tian, R. Stefanescu, M. Przybylski, P. Richards, S. A. Jones, V. Shridhar, T. Clausen and M. Ehrmann, Proc. Nat. Acad.Sci., 2005, 102, 6021-6026. S. Poepsel, A. Sprengel, B. Sacca, F. Kaschani, M. Kaiser, C. Gatsogiannis, S. Raunser, T. Clausen and M. Ehrmann, Nat. Chem. Biol., 2015, 11, 862-869. A. Tennstaedt, S. Popsel, L. Truebestein, P. Hauske, A. Brockmann, N. Schmidt, I. Irle, B. Sacca, C. M. Niemeyer, R. Brandt, H. Ksiezak-Reding, A. L. Tirniceriu, R. Egensperger, A. Baldi, L. Dehmelt, M. Kaiser, R. Huber, T. Clausen and M. Ehrmann, J. Biol. Chem., 2012, 287, 20931-20941. P. M. Quiros, T. Langer and C. Lopez-Otin, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2015, 16, 345.
Figure 112020042387741-pat00002
J. M. Jones, P. Datta, S. M. Srinivasula, W. Ji, S. Gupta, Z. Zhang, E. Davies, G. Hajnczky, T. L. Saunders, M. L. Van Keuren, T. Fernandes-Alnemri, M. H. Meisler and E. S. Alnemri, Nature, 2003, 425, 721.
Figure 112020042387741-pat00003
C. Dlle, I. Flønes, G. S. Nido, H. Miletic, N. Osuagwu, S. Kristoffersen, P. K. Lilleng, J. P. Larsen, O.-B. Tysnes, K. Haugarvoll, L. A. Bindoff and C. Tzoulis, Nat. Comm., 2016, 7, 13548.
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S. Backert, S. Bernegger, J. Skrko-Glonek and S. Wessler, Cell Microbiol., 2018, 20, e12845. S. Wessler, G. Schneider and S. Backert, Cell Commun. Signal., 2017, 15, 4. B. Hoy, T. Geppert, M. Boehm, F. Reisen, P. Plattner, G. Gadermaier, N. Sewald, F. Ferreira, P. Briza, G. Schneider, S. Backert and S. Wessler, J. Biol. Chem., 2012, 287, 10115-10120. C. M. Abfalter, M. Schubert, C. Gotz, T. P. Schmidt, G. Posselt and S. Wessler, Cell Commun. Signal., 2016, 14, 30. D. He, M. Zhang, S. Liu, X. Xie and P. R. Chen, Cell Chem. Biol., 2019, 26, 144-150 e143. S. T. Runyon, Y. Zhang, B. A. Appleton, S. L. Sazinsky, P. Wu, B. Pan, C. Wiesmann, N. J. Skelton and S. S. Sidhu, Protein Sci., 2007, 16, 2454-2471. Y. Zhang, B. A. Appleton, P. Wu, C. Wiesmann and S. S. Sidhu, Protein Sci., 2007, 16, 1738-1750. C. Eigenbrot, M. Ultsch, M. T. Lipari, P. Moran, S. J. Lin, R. Ganesan, C. Quan, J. Tom, W. Sandoval, M. van Lookeren Campagne and D. Kirchhofer, Structure, 2012, 20, 1040-1050. L. M. Martins, B. E. Turk, V. Cowling, A. Borg, E. T. Jarrell, L. C. Cantley and J. Downward, J. Biol. Chem., 2003, 278, 49417v49427. M. Fonovic and M. Bogyo, Expert Rev. Proteomics, 2008, 5, 721-730. S. Serim, U. Haedke and S. H. Verhelst, ChemMedChem, 2012, 7, 1146-1159.
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M. Wysocka, A. Wojtysiak, M. Okoska, N. Gruba, M. Jarzb, T. Wenta, B. Lipiska, R. Grzywa, M. Sieczyk and K. Rolka, Anal. Biochem., 2015, 475, 44-52. P. Hauske, M. Meltzer, C. Ottmann, T. Krojer, T. Clausen, M. Ehrmann and M. Kaiser, Biorg. Med. Chem., 2009, 17, 2920-2924. M. L. Sun, L. M. Sun and Y. Q. Wang, J. Mol. Recognit., 2018, 31, e2698. L. Truebestein, A. Tennstaedt, T. Monig, T. Krojer, F. Canellas, M. Kaiser, T. Clausen and M. Ehrmann, Nat. Struct. Mol. Biol., 2011, 18, 386-388. L. Vande Walle, P. Van Damme, M. Lamkanfi, X. Saelens, J. Vandekerckhove, K. Gevaert and P. Vandenabeele, J. Proteome Res., 2007, 6, 1006-1015. M. Uhlen, L. Fagerberg, B. M. Hallstrom, C. Lindskog, P. Oksvold, A. Mardinoglu, A. Sivertsson, C. Kampf, E. Sjostedt, A. Asplund, I. Olsson, K. Edlund, E. Lundberg, S. Navani, C. A. Szigyarto, J. Odeberg, D. Djureinovic, J. O. Takanen, S. Hober, T. Alm, P. H. Edqvist, H. Berling, H. Tegel, J. Mulder, J. Rockberg, P. Nilsson, J. M. Schwenk, M. Hamsten, K. von Feilitzen, M. Forsberg, L. Persson, F. Johansson, M. Zwahlen, G. von Heijne, J. Nielsen and F. Ponten, Science, 2015, 347, 1260419. D. J. Barbosa, J. P. Capela, M. de L. Bastosa and F. Carvalho, Toxicol. Res., 2015, 4, 801. R. E. Gonzalez-Reyes, M. O. Nava-Mesa, K. Vargas-Sanchez, D. Ariza-Salamanca and L. Mora-Munoz, Front. Mol. Neurosci., 2017, 10, 427. S. F. Carter, K. Herholz, P. Rosa-Neto, L. Pellerin, A. Nordberg and E. R. Zimmer, Trends Mol. Med., 2019, 25, 77-95. H. Y. Nam, J. A. Hong, J. Choi, S. Shin, S. K. Cho, J. Seo and J. Lee, Bioconjugate Chem., 2018, 29, 1669-1676. J. Zielonka, J. Joseph, A. Sikora, M. Hardy, O. Ouari, J. Vasquez-Vivar, G. Cheng, M. Lopez and B. Kalyanaraman, Chem. Rev., 2017, 117, 10043-10120. Murwantoko, M. Yano, Y. Ueta, A. Murasaki, H. Kanda, C. Oka and M. Kawaichi, Biochem. J, 2004, 381, 895-904. H. J. Olivos, P. G. Alluri, M. M. Reddy, D. Salony and T. Kodadek, Org. Lett. 2002, 4, 4057-4059. S. Serim, S. V. Mayer and S. H. L. Verhelst, Org. Biomol. Chem. 2013, 11, 5714-5721. H. Y. Nam, J. A. Hong, J. Choi, S. Shin, S. K. Cho, J. Seo and J. Lee, Bioconjugate Chem. 2018, 29, 1669-1676. T. Clausen, M. Kaiser, R. Huber and M. Ehrmann, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2011, 12, 152. D. Zurawa-Janicka, T. Wenta, M. Jarzab, J. Skorko-Glonek, P. Glaza, A. Gieldon, J. Ciarkowski and B. Lipinska, Arch. Biochem. Biophys., 2017, 621, 6-23.
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J. Skrko-Glonek, D. Zurawa-Janicka, T. Koper, M. Jarzab, D. Figaj, P. Glaza and B. Lipinska, Curr. Pharm. Des., 2013, 19, 977-1009. S. Grau, A. Baldi, R. Bussani, X. Tian, R. Stefanescu, M. Przybylski, P. Richards, SA Jones, V. Shridhar, T. Clausen and M. Ehrmann, Proc. Nat. Acad. Sci., 2005, 102, 6021-6026. S. Poepsel, A. Sprengel, B. Sacca, F. Kaschani, M. Kaiser, C. Gatsogiannis, S. Raunser, T. Clausen and M. Ehrmann, Nat. Chem. Biol., 2015, 11, 862-869. A. Tennstaedt, S. Popsel, L. Truebestein, P. Hauske, A. Brockmann, N. Schmidt, I. Irle, B. Sacca, CM Niemeyer, R. Brandt, H. Ksiezak-Reding, AL Tirniceriu, R. Egensperger, A. Baldi, L. Dehmelt, M. Kaiser, R. Huber, T. Clausen and M. Ehrmann, J. Biol. Chem., 2012, 287, 20931-20941. PM Quiros, T. Langer and C. Lopez-Otin, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2015, 16, 345.
Figure 112020042387741-pat00002
JM Jones, P. Datta, SM Srinivasula, W. Ji, S. Gupta, Z. Zhang, E. Davies, G. Hajnczky, TL Saunders, ML Van Keuren, T. Fernandes-Alnemri, MH Meisler and ES Alnemri, Nature , 2003, 425, 721.
Figure 112020042387741-pat00003
C. Dlle, I. Flønes, GS Nido, H. Miletic, N. Osuagwu, S. Kristoffersen, PK Lilleng, JP Larsen, O.-B. Tysnes, K. Haugarvoll, LA Bindoff and C. Tzoulis, Nat. Comm., 2016, 7, 13548.
Figure 112020042387741-pat00004
S. Backert, S. Bernegger, J. Skrko-Glonek and S. Wessler, Cell Microbiol., 2018, 20, e12845. S. Wessler, G. Schneider and S. Backert, Cell Commun. Signal., 2017, 15, 4. B. Hoy, T. Geppert, M. Boehm, F. Reisen, P. Plattner, G. Gadermaier, N. Sewald, F. Ferreira, P. Briza, G. Schneider, S. Backert and S. Wessler, J. Biol. Chem., 2012, 287, 10115-10120. CM Abfalter, M. Schubert, C. Gotz, TP Schmidt, G. Posselt and S. Wessler, Cell Commun. Signal., 2016, 14, 30. D. He, M. Zhang, S. Liu, X. Xie and PR Chen, Cell Chem. Biol., 2019, 26, 144-150 e143. ST Runyon, Y. Zhang, BA Appleton, SL Sazinsky, P. Wu, B. Pan, C. Wiesmann, NJ Skelton and SS Sidhu, Protein Sci., 2007, 16, 2454-2471. Y. Zhang, B. A. Appleton, P. Wu, C. Wiesmann and S. S. Sidhu, Protein Sci., 2007, 16, 1738-1750. C. Eigenbrot, M. Ultsch, MT Lipari, P. Moran, SJ Lin, R. Ganesan, C. Quan, J. Tom, W. Sandoval, M. van Lookeren Campagne and D. Kirchhofer, Structure, 2012, 20, 1040-1050. LM Martins, BE Turk, V. Cowling, A. Borg, ET Jarrell, LC Cantley and J. Downward, J. Biol. Chem., 2003, 278, 49417v49427. M. Fonovic and M. Bogyo, Expert Rev. Proteomics, 2008, 5, 721-730. S. Serim, U. Haedke and SH Verhelst, ChemMed Chem, 2012, 7, 1146-1159.
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M. Wysocka, A. Wojtysiak, M. Okoska, N. Gruba, M. Jarzb, T. Wenta, B. Lipiska, R. Grzywa, M. Sieczyk and K. Rolka, Anal. Biochem., 2015, 475, 44-52. P. Hauske, M. Meltzer, C. Ottmann, T. Krojer, T. Clausen, M. Ehrmann and M. Kaiser, Biorg. Med. Chem., 2009, 17, 2920-2924. ML Sun, LM Sun and YQ Wang, J. Mol. Recognit., 2018, 31, e2698. L. Truebestein, A. Tennstaedt, T. Monig, T. Krojer, F. Canellas, M. Kaiser, T. Clausen and M. Ehrmann, Nat. Struct. Mol. Biol., 2011, 18, 386-388. L. Vande Walle, P. Van Damme, M. Lamkanfi, X. Saelens, J. Vandekerckhove, K. Gevaert and P. Vandenabeele, J. Proteome Res., 2007, 6, 1006-1015. M. Uhlen, L. Fagerberg, BM Hallstrom, C. Lindskog, P. Oksvold, A. Mardinoglu, A. Sivertsson, C. Kampf, E. Sjostedt, A. Asplund, I. Olsson, K. Edlund, E. Lundberg , S. Navani, CA Szigyarto, J. Odeberg, D. Djureinovic, JO Takanen, S. Hober, T. Alm, PH Edqvist, H. Berling, H. Tegel, J. Mulder, J. Rockberg, P. Nilsson, JM Schwenk, M. Hamsten, K. von Feilitzen, M. Forsberg, L. Persson, F. Johansson, M. Zwahlen, G. von Heijne, J. Nielsen and F. Ponten, Science, 2015, 347, 1260419. DJ Barbosa, JP Capela, M. de L. Bastosa and F. Carvalho, Toxicol. Res., 2015, 4, 801. RE Gonzalez-Reyes, MO Nava-Mesa, K. Vargas-Sanchez, D. Ariza-Salamanca and L. Mora-Munoz, Front. Mol. Neurosci., 2017, 10, 427. SF Carter, K. Herholz, P. Rosa-Neto, L. Pellerin, A. Nordberg and ER Zimmer, Trends Mol. Med., 2019, 25, 77-95. HY Nam, JA Hong, J. Choi, S. Shin, SK Cho, J. Seo and J. Lee, Bioconjugate Chem., 2018, 29, 1669-1676. J. Zielonka, J. Joseph, A. Sikora, M. Hardy, O. Ouari, J. Vasquez-Vivar, G. Cheng, M. Lopez and B. Kalyanaraman, Chem. Rev., 2017, 117, 10043-10120. Murwantoko, M. Yano, Y. Ueta, A. Murasaki, H. Kanda, C. Oka and M. Kawaichi, Biochem. J, 2004, 381, 895-904. HJ Olivos, PG Alluri, MM Reddy, D. Salony and T. Kodadek, Org. Lett. 2002, 4, 4057-4059. S. Serim, SV Mayer and SHL Verhelst, Org. Biomol. Chem. 2013, 11, 5714-5721. HY Nam, JA Hong, J. Choi, S. Shin, SK Cho, J. Seo and J. Lee, Bioconjugate Chem. 2018, 29, 1669-1676.

본 발명의 목적은 HTRA의 활성부위와 특이적으로 공유결합을 하며 형광표지를 가져 형광이미징 분석을 통하여 세포내에 존재하는 HTRA을 정성적 또는 정량적으로 분석이 가능한 테트라 펩타이드 프로브로서, 그 크기가 작아 세포막 및 미토콘드리아막을 자유롭게 통과하므로 살아있는 세포의 세포내 또는 미토콘드리아내의 HTRA 활성을 분석가능한 HTRA 검출용 테트라 펩타이드 프로브 및 이를 포함하는 HTRA 검출용 조성물을 제공하는데 있다.An object of the present invention is a tetrapeptide probe that specifically covalently binds to the active site of HTRA and has a fluorescent label to qualitatively or quantitatively analyze HTRA present in a cell through fluorescence imaging analysis. And to provide a tetrapeptide probe for HTRA detection capable of analyzing HTRA activity in cells or mitochondria of living cells because it freely passes through the mitochondrial membrane, and a composition for detecting HTRA comprising the same.

본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다. Other objects and technical features of the present invention are more particularly set forth by the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명은 HTRA(high temperature requirement A)의 기질 결합 도메인과 공유결합하는 테트라 펩타이드(tetra peptide); 상기 테트라 펩타이드의 C-말단(terminal)에 중합된 디페닐포스포네이트(diphenyl phosphonate) 작용기; 및 상기 테트라 펩타이드의 N-말단(terminal)에 중합된 형광표지;를 포함하는 HTRA 활성 기반 HTRA 검출용 펩타이드 프로브 및 이를 포함하는 HTRA 활성 측정용 조성물을 제공한다.The present invention provides a tetra peptide covalently bound to the substrate binding domain of HTRA (high temperature requirement A); a diphenyl phosphonate functional group polymerized at the C-terminal of the tetrapeptide; and a fluorescent label polymerized at the N-terminal of the tetrapeptide; provides a peptide probe for HTRA activity-based HTRA detection comprising the same, and a composition for measuring HTRA activity comprising the same.

상기 테트라 펩타이드는 C-말단으로부터 P1, P2, P3, 및 P4 아미노산 위치를 가지며 상기 P1 위치는 Valine 또는 Leucine인 것을 특징으로 하며, 상기 P1 위치가 Valine인 테트라 펩타이드의 아미노산 시퀸스는 Phenylalanine-Isoleucine-Methionine-Valine(FIMV), Phenylalanine-Lysine-Leucine-Valine(FKLV), Alanine-Serine-Proline-Valine(ASPV), 또는 Leucine-Isoleucine-Phenylalanine-Valine(LFLV)이며, 상기 P1 위치가 Leucine인 테트라 펩타이드의 아미노산 시퀸스는 Leucine-Phenylalanine-Leucine-Leucine(LFLL), Phenylalanine-Isoleucine-Methionine-Leucine(FIML), 또는 Alanine-Serine-Proline-Leucine(ASPL)인 것을 특징으로 한다. The tetrapeptide has P 1 , P 2 , P 3 , and P 4 amino acid positions from the C-terminus , and the P 1 position is valine or leucine, and the P 1 position is valine amino acid sequence of a tetrapeptide is Phenylalanine-Isoleucine-Methionine-Valine ( FIMV), Phenylalanine-Lysine-Leucine-Valine (FKLV), Alanine-Serine-Proline-Valine (ASPV), or Leucine-Isoleucine-Phenylalanine-Valine ( LFLV), wherein P 1 The amino acid sequence of the tetrapeptide at the Leucine position is Leucine-Phenylalanine-Leucine-Leucine (LFLL), Phenylalanine-Isoleucine-Methionine-Leucine (FIML), or Alanine-Serine-Proline-Leucine (ASPL).

상기 HTRA 활성 기반 HTRA 검출용 펩타이드 프로브는 세포막을 통과하여 인간 세포내에 존재하는 인간 HTRA1 또는 미생물 세포내에 존재하는 미생물 유래 HTRA의 활성을 측정하는 것을 특징으로 하며, 상기 테트라 펩타이드의 N-말단(terminal)에 미토콘드리아 타겟팅 모이어티(moiety)를 더 포함하게 되면 세포막과 미토콘드리아막을 통과하여 미토콘드리아 내부에 존재하는 인간 HTRA2의 활성을 측정하는 것을 특징으로 한다.The HTRA activity-based peptide probe for detecting HTRA is characterized in that it passes through a cell membrane and measures the activity of human HTRA1 present in human cells or HTRA derived from microorganisms present in microbial cells, and the N-terminal of the tetrapeptide. When it further includes a mitochondrial targeting moiety (moiety), it is characterized in that it passes through the cell membrane and the mitochondrial membrane and measures the activity of human HTRA2 present inside the mitochondria.

본 발명의 HTRA 활성 기반 HTRA 검출용 펩타이드 프로브 및 이를 포함하는 조성물은 상기 프로브가 세포막 또는 미토콘드리아막을 자유롭게 통과할 수 있어 살아있는 세포의 HTRA 활성을 측정할 수 있는 장점이 있다.The HTRA activity-based peptide probe for detecting HTRA of the present invention and a composition comprising the same have an advantage in that the probe can freely pass through a cell membrane or a mitochondrial membrane, and thus HTRA activity of living cells can be measured.

상기 HTRA의 세포내 활성은 접힘에 문제가 있어 세포독성을 유도하는 비정상 단백질의 제거에 관여하므로 퇴행성 뇌질환인 알츠하이머병 및 파킨슨씨병과 관련이 있다. 따라서 본 발명의 HTRA 활성 기반 HTRA 검출용 펩타이드 프로브 및 이를 포함하는 조성물을 이용하면 알츠하이머병 및 파킨슨씨병과 같은 퇴행성 뇌질환의 초기 진단에 활용될 수 있을 것으로 판단되며, 퇴행성 뇌질환에 관련된 새로운 바이오 마커를 발굴하는데 유용하게 사용될 것으로 판단된다. The intracellular activity of HTRA is related to Alzheimer's disease and Parkinson's disease, which are degenerative brain diseases, since it is involved in the removal of abnormal proteins that induce cytotoxicity due to a folding problem. Therefore, using the HTRA activity-based peptide probe for detecting HTRA of the present invention and a composition comprising the same, it is determined that it can be utilized for the initial diagnosis of degenerative brain diseases such as Alzheimer's disease and Parkinson's disease, and a new biomarker related to degenerative brain disease. It is considered to be useful for discovering

도 1은 본 발명의 HTRA 활성 기반 HTRA 검출용 펩타이드 프로브의 화학적 구조를 보여준다.
도 2는 본 발명의 HTRA 활성 기반 HTRA 검출용 펩타이드 프로브를 이용하여 재조합 세린 프로테아제를 표지한 결과를 보여준다. 패널(a)는 본 발명의 프로브의 세린 프로테아제에 대한 반응성을 측정한 결과를 보여주며, 패널(b)는 본 발명의 LFLV-프로브가 용량의존적으로 HTRA1, HTRA2 및 DegP를 표지하는 결과를 보여준다.
도 3은 본 발명의 HTRA 활성 기반 HTRA 검출용 펩타이드 프로브를 이용하여 살아있는 HeLa 세포의 HTRA1을 표지한 결과를 보여준다. 패널(a)는 본 발명의 프로브를 이용하여 살아있는 HeLa 세포의 HTRA1을 표지한 결과를 보여주며, 패널(b)는 본 발명의 FKLV-프로브와 반응시킨 HeLa 세포의 용해물에 대하여 면역침강분석을 실시한 결과를 보여주며, 패널(c)는 본 발명의 FKLV-프로브를 이용하여 HeLa 세포의 용해물에서 표지된 활성 HTRA2(왼쪽) 및 미토콘드리아 용해물에서 표지된 활성 HTRA2(오른쪽)를 보여준다. 상기 프로브들은 5μM의 농도로 HeLa 세포에 첨가한 후 1.5시간 동안 반응시켰다.
도 4는 본 발명의 HTRA 활성 기반 HTRA 검출용 펩타이드 프로브를 이용하여 U-87MG 세포에서 활성 HTRA를 표지한 결과를 보여준다. 패널(a)는 상기 U-87MG 세포에 LFLV-프로브 10μM을 첨가하여 1.5시간 동안 반응시킨 후 카이닉산을 50μM 농도로 첨가하고 8시간 동안 반응시키거나, 오카다산을 25nM 농도로 첨가하고 6시간 동안 반응시키거나, Aβ1-42를 10μM 농도로 첨가하고 48시간 동안 반응시켜 형광을 측정한 결과를 보여주며, 패널(b)는 상기 패널(a)의 세포를 용해한 후 SDS-PAGE상에서 활성 HTRA1을 측정한 결과를 보여준다. 패널(c)는 패널(b)에서 나타난 각 밴드의 형광신호세기를 정량하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 HTRA 활성 기반 HTRA 검출용 펩타이드 프로브를 이용하여 살아있는 세포(HeLa 세포)의 HTRA를 표지한 결과를 공초점 현미경으로 분석한 것을 보여준다. 패널(a)는 LFLV-프로브를 1.5시간동안 처리한 살아있는 HeLa 세포에 대한 결과를 보여주며, 패널(b)는 LFLV-프로브를 1.5시간동안 처리한 살아있는 U-87MG 세포에 대한 결과를 보여주며, 패널(c)는 Aβ1-42 10μM을 48시간동안 전처리한 후 LFLV-프로브를 1.5시간동안 처리한 살아있는 U-87MG 세포에 대한 결과를 보여준다. 상기 Mitotracker는 미토콘드리아에 대한 형광표지이다.
도 6은 본 발명의 HTRA 활성 기반 HTRA 검출용 펩타이드 프로브를 이용하여 살아있는 세포(SH-SY5Y 세포)의 HTRA를 표지한 결과를 공초점 현미경으로 분석한 것을 보여준다. 패널(a)는 Mitotracker 50nM을 15분 동안 전처리한 후 LFLV-프로브 10μM를 1.5시간동안 처리한 살아있는 SH-SY5Y 세포에 대한 결과를 보여주며, 패널(b)는 Mitotracker 50nM을 15분 동안 전처리한 후 MTP-LFLV-프로브 5μM를 1시간동안 처리한 살아있는 SH-SY5Y 세포에 대한 결과를 보여준다. 노란색 화살표는 MTP-LFLV-프로브와 Mitotracker가 겹쳐진 부분을 보여준다.1 shows the chemical structure of a peptide probe for HTRA detection based on HTRA activity of the present invention.
2 shows the results of labeling the recombinant serine protease using the HTRA activity-based peptide probe for HTRA detection of the present invention. Panel (a) shows the results of measuring the reactivity of the probe of the present invention to serine protease, and panel (b) shows the results of the LFLV-probe of the present invention labeling HTRA1, HTRA2 and DegP in a dose-dependent manner.
3 shows the results of labeling HTRA1 in living HeLa cells using the HTRA activity-based peptide probe for HTRA detection of the present invention. Panel (a) shows the results of labeling live HeLa cells with HTRA1 using the probe of the present invention, and panel (b) shows the immunoprecipitation analysis of the HeLa cell lysate reacted with the FKLV-probe of the present invention. The results are shown, and panel (c) shows the labeled active HTRA2 in the lysate of HeLa cells (left) and the labeled active HTRA2 in the mitochondrial lysate (right) using the FKLV-probe of the present invention. The probes were added to HeLa cells at a concentration of 5 μM and reacted for 1.5 hours.
4 shows the results of labeling active HTRA in U-87MG cells using the HTRA activity-based HTRA detection peptide probe of the present invention. Panel (a) shows the U-87MG cells by adding 10 μM of the LFLV-probe and reacting for 1.5 hours, then adding kynic acid at a concentration of 50 μM and reacting for 8 hours, or adding okadaic acid at a concentration of 25 nM and reacting for 6 hours reacted or Aβ 1-42 was added at a concentration of 10 μM and reacted for 48 hours to measure fluorescence, and panel (b) shows active HTRA1 on SDS-PAGE after lysing the cells of panel (a). Show the measurement results. Panel (c) is a graph showing the quantification of the fluorescence signal intensity of each band shown in panel (b).
5 shows the results of HTRA labeling of living cells (HeLa cells) analyzed by confocal microscopy using the HTRA activity-based peptide probe for HTRA detection of the present invention. Panel (a) shows the results for live HeLa cells treated with LFLV-probe for 1.5 hours, panel (b) shows the results for live U-87MG cells treated with LFLV-probe for 1.5 hours, Panel (c) shows the results for live U-87MG cells treated with LFLV-probe for 1.5 hours after pretreatment with Aβ 1-42 10 μM for 48 hours. The Mitotracker is a fluorescent label for mitochondria.
FIG. 6 shows the results of HTRA labeling of living cells (SH-SY5Y cells) analyzed by confocal microscopy using the HTRA activity-based peptide probe for HTRA detection of the present invention. Panel (a) shows the results for live SH-SY5Y cells treated with LFLV-probe 10 μM for 1.5 hours after pretreatment with 50 nM of Mitotracker for 15 minutes, and panel (b) shows results on live SH-SY5Y cells treated with 50 nM of Mitotracker for 15 minutes after pretreatment with 50 nM of Mitotracker for 15 minutes Results are shown for live SH-SY5Y cells treated with MTP-LFLV-probe 5 μM for 1 hour. The yellow arrow shows the overlap of the MTP-LFLV-probe and Mitotracker.

본 발명은 HTRA(high temperature requirement A)의 기질 결합 도메인과 공유결합하는 테트라 펩타이드(tetra peptide); 상기 테트라 펩타이드의 C-말단(terminal)에 중합된 디페닐포스포네이트(diphenyl phosphonate) 작용기; 및 상기 테트라 펩타이드의 N-말단(terminal)에 중합된 형광표지;를 포함하는 HTRA 활성 기반 HTRA 검출용 펩타이드 프로브를 제공한다.The present invention provides a tetra peptide covalently bound to the substrate binding domain of HTRA (high temperature requirement A); a diphenyl phosphonate functional group polymerized at the C-terminal of the tetrapeptide; and a fluorescent label polymerized at the N-terminal of the tetrapeptide; provides a peptide probe for HTRA activity-based HTRA detection comprising a.

상기 HTRA는 세포내 단백질 접힘 스트레스를 조절하는 세린 프로테아제류에 속하는 효소 단백질 패밀리를 의미하며 접힘에 문제가 있는 다양한 단백질을 제거하여 세포의 항상성을 유지하는 것으로 알려져 있다. 상기 HTRA는 180여개의 세린프로테아제로 이루어져 있으며 활성부위가 서로 잘 보존된 특징이 있다. The HTRA refers to a family of enzyme proteins belonging to serine proteases that regulate intracellular protein folding stress, and is known to maintain cell homeostasis by removing various proteins having problems with folding. The HTRA is composed of about 180 serine proteases, and the active sites are well conserved.

본 발명의 HTRA 활성 기반 HTRA 검출용 펩타이드 프로브는 인간 HTRA1, 인간 HTRA2 및 미생물 유래 HTRA를 활성 기반으로 검출하는 것을 특징으로 한다. 상기 인간 HTRA1는 인간 세포의 세포막, 부근, 세포질, 핵등에 존재하는 HTRA이며, 상기 인간 HTRA2는 인간세포의 미토콘드리아 내부에 존재하는 HTRA이며, 상기 미생물 유래 HTRA는 E.coli 유래 HTRA이다. 상기 인간 HTRA1 및 2의 세포내 활성 증가는 단백질 접힘에 문제가 있는 단백질의 양이 증가하는 것을 의미한다. The peptide probe for HTRA activity-based HTRA detection of the present invention is characterized in that it detects human HTRA1, human HTRA2 and microorganism-derived HTRA based on activity. The human HTRA1 is HTRA present in the cell membrane, vicinity, cytoplasm, and nucleus of human cells, the human HTRA2 is HTRA present in the mitochondria of human cells, and the microorganism-derived HTRA is E. coli-derived HTRA. The increase in the intracellular activity of human HTRA1 and 2 means that the amount of the protein having a problem in protein folding increases.

신경세포 또는 성상세포등에서 상기 단백질 접힘문제가 발생하면 세포독성을 유도하므로 알츠하이머병 또는 파킨슨씨병과 같은 퇴행성 뇌질환의 원인이 된다. 알려진 결과에 따르면 인간 HTRA1은 알츠하이머병의 원인물질로 알려진 Aβ1-42가 발견되는 신경세포등에서 그 활성이 높은 것으로 확인되며, 인간 HTRA2는 ATP 합성을 담당하는 미토콘드리아에 이상이 있는 신경세포 또는 성상세포에서 그 활성이 증가하며 이는 파킨슨씨병의 발병과 깊은 연관이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 인간세포, 특히 신경세포 또는 성상세포 등에서 상기 인간 HTRA1 및 인간 HTRA2의 활성을 정량적으로 측정하게 되면 알츠하이머병 및 파킨슨씨병의 초기 진단자료로서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 판단된다.When the protein folding problem occurs in nerve cells or astrocytes, it induces cytotoxicity, which causes degenerative brain diseases such as Alzheimer's disease or Parkinson's disease. According to the known results, human HTRA1 is confirmed to have high activity in neurons in which Aβ 1-42 , known as the causative agent of Alzheimer's disease, is found, and human HTRA2 is a neuron or astrocyte with abnormalities in mitochondria responsible for ATP synthesis. Its activity is increased in , which is known to be closely related to the onset of Parkinson's disease. Therefore, it is judged that when the activity of human HTRA1 and human HTRA2 is quantitatively measured in human cells, particularly neurons or astrocytes, it can be usefully used as early diagnostic data for Alzheimer's disease and Parkinson's disease.

또한 본 발명의 HTRA 활성 기반 HTRA 검출용 펩타이드 프로브를 이용하여 상기 E.coli HTRA이 활성을 측정할 수 있는데, 이는 병원성 E.coli의 인체내 존재여부 또는 감염여부를 판단할 수 있으므로 E.coli로 인한 혈액, 소변 및 조직의 오염 및 이로 인한 감염증을 진단하는 기초 자료로서 사용 될 수 있다. In addition, as there is the E.coli HTRA using HTRA active peptides based HTRA detection probe of the present invention can measure the activity, which it is possible to determine whether a human body in the presence or infection of pathogenic E.coli E.coli It can be used as a basic data for diagnosing contamination of blood, urine and tissue caused by infection and infection.

본 발명의 테트라 펩타이드는 C-말단으로부터 P1, P2, P3, 및 P4 아미노산 위치를 가지며 상기 P1 위치는 Valine 또는 Leucine인 것을 특징으로 한다. 상세하게는 상기 P1 위치가 Valine인 테트라 펩타이드의 아미노산 시퀸스는 Phenylalanine-Isoleucine-Methionine-Valine(FIMV), Phenylalanine-Lysine-Leucine-Valine(FKLV), Alanine-Serine-Proline-Valine(ASPV), 또는 Leucine-Isoleucine-Phenylalanine-Valine(LFLV)인 것을 특징으로 하며, 상기 P1 위치가 Leucine인 테트라 펩타이드의 아미노산 시퀸스는 Leucine-Phenylalanine-Leucine-Leucine(LFLL), Phenylalanine-Isoleucine-Methionine-Leucine(FIML), 또는 Alanine-Serine-Proline-Leucine(ASPL)인 것을 특징으로 한다. The tetrapeptide of the present invention has P1, P2, P3, and P4 amino acid positions from the C-terminus, and the P1 position is valine or leucine. Specifically, the amino acid sequence of the tetrapeptide in which the P1 position is Valine is Phenylalanine-Isoleucine-Methionine-Valine (FIMV), Phenylalanine-Lysine-Leucine-Valine (FKLV), Alanine-Serine-Proline-Valine (ASPV), or Leucine -Isoleucine-Phenylalanine-Valine (LFLV), characterized in that the amino acid sequence of the tetrapeptide in which the P1 position is Leucine is Leucine-Phenylalanine-Leucine-Leucine (LFLL), Phenylalanine-Isoleucine-Methionine-Leucine (FIML), or It is characterized in that it is Alanine-Serine-Proline-Leucine (ASPL).

상기 테트라 펩타이드 시퀸스는 알려진 HTRA의 활성부위를 특이적으로 인식할 수 있는 장점이 있으며 상기 펩타이드의 C-말단(terminal)에 디페닐포스포네이트(diphenyl phosphonate) 작용기를 중합하여 HTRA의 활성부위의 세린 친핵체(serine nucleophile)를 선택적으로 인식하고 결합 할 수 있도록 하였다. The tetrapeptide sequence has the advantage of specifically recognizing the known active site of HTRA, and by polymerizing a diphenyl phosphonate functional group at the C-terminal of the peptide, serine at the active site of HTRA It allowed selective recognition and binding of serine nucleophiles.

본 발명의 실시예에 따르면, 상기 테트라 펩타이드 시퀸스 중 FKLV-프로브는 다른 세린 프로테아제에 대비하여 인간 HTRA1, 인간 HTRA2, 및 E.coli HTRA(DegP)에 특이적인 것으로 확인 되었으며, 상기 LFLV-프로브는 다른 세린 프로테아제에 대비하여 인간 HTRA1 및 인간 HTRA2에 특이적인 것으로 확인되었다. According to an embodiment of the present invention, it was confirmed that the FKLV-probe in the tetrapeptide sequence was specific for human HTRA1, human HTRA2, and E. coli HTRA (DegP) compared to other serine proteases, and the LFLV-probe was It was found to be specific for human HTRA1 and human HTRA2 against serine proteases.

상기 테트라 텝타이드 시퀸스는 N-말단(terminal)에 형광표지가 중합되어 있어 현미경이나 SDS-PAGE 상에서 형광을 측정하는 방법으로 HTRA의 세포내 위치 및 농도를 측정하거나 SDS-PAGE 상에서 분리된 HTRA의 농도를 측정할 수 있는 장점이 있다. 상기 형광표지는 6-아미노헥사노일(6-aminohexanoyl)을 매개로 중합된 5(6)-카르복시플루오레신(5(6)-carboxyfluorescein)인 것을 특징으로 하며 상기 테트라펩타이드가 활성이 있는 HTRA의 활성부위만을 특이적으로 인식하므로 형광을 통해 측정한 HTRA의 양은 모두 실제 세포내에서 활성을 가지고 기능을 수행하는 HTRA로 판단할 수 있다.The tetrateptide sequence has a fluorescent label polymerized at the N-terminus, so the intracellular location and concentration of HTRA is measured by a method of measuring fluorescence under a microscope or SDS-PAGE, or the concentration of HTRA separated on SDS-PAGE It has the advantage of being able to measure The fluorescent label is characterized in that it is 5(6)-carboxyfluorescein (5(6)-carboxyfluorescein) polymerized through 6-aminohexanoyl, and the tetrapeptide is active in HTRA. Since only the active site is specifically recognized, the amount of HTRA measured through fluorescence can be determined as HTRA that has activity and functions in the actual cell.

본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명의 HTRA 활성 기반 HTRA 검출용 펩타이드 프로브는 900 내지 2000Da의 크기를 가져 세포막을 자유롭게 투과하여 세포를 용해하지 않고도 세포내에 위치하는 HTRA를 표지 할 수 있는 장점이 있다. According to an embodiment of the present invention, the HTRA activity-based peptide probe for detecting HTRA of the present invention has a size of 900 to 2000 Da, so it has the advantage of being able to freely penetrate the cell membrane and label HTRA located in the cell without dissolving the cell. .

인간 HTRA2의 경우 미토콘드리아 내부에 위치한다. 상기 미토콘드리아는 자체적인 막을 더 포함하고 있으므로 종래의 프로브로는 투과가 어려운 한계가 있었다. 이에 본 발명에서는 상기 프로브에 미토콘드리아 타겟팅 모이어티(moiety)를 더 추가하여 세포막을 통과한 프로브가 미토콘드리아에 타겟팅되어 이동할 뿐 아니라 미토콘드리아막을 투과하여 그 내부에 존재하는 인간 HTRA2를 표지할 수 있도록 하였다.Human HTRA2 is located inside the mitochondria. Since the mitochondria further include their own membranes, there is a limitation in that penetration is difficult with conventional probes. Accordingly, in the present invention, a mitochondrial targeting moiety was further added to the probe so that the probe passing through the cell membrane was targeted to the mitochondria and moved, as well as penetrating the mitochondrial membrane to label human HTRA2 present therein.

상기 미토콘드리아 타겟팅 모이어티는 상기 테트라 펩타이드의 N-말단(terminal)에 더 포함되며 미토콘드리아 타겟팅 펩토이드(mitochondria-targeting peptoid) 또는 트리페닐포스포늄(triphenylphosphonium)이 사용되는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 본 발명의 미토콘드리아 타겟팅 모이어티는 미토콘드리아 타겟팅 펩토이드(mitochondria-targeting peptoid)이며 그 크기가 900 내지 2000Da의 크기를 가져 세포막 및 미토콘드리아막을 자유롭게 투과할 수 있는 특징이 있다.The mitochondrial targeting moiety is further included in the N-terminal of the tetrapeptide, and a mitochondria-targeting peptoid or triphenylphosphonium is used. Preferably, the mitochondrial targeting moiety of the present invention is a mitochondria-targeting peptoid, and has a size of 900 to 2000 Da, and has a feature of being able to freely penetrate cell membranes and mitochondrial membranes.

본 발명은 HTRA 활성 기반 HTRA 검출용 펩타이드 프로브를 포함하는 HTRA 활성 측정용 조성물을 제공한다.The present invention provides a composition for measuring HTRA activity comprising a peptide probe for HTRA activity-based HTRA detection.

본 발명의 HTRA 활성 기반 HTRA 검출용 펩타이드 프로브를 포함하는 HTRA 활성 측정용 조성물은 세포용해물 또는 살아있는 세포에 모두 적용 가능하며 5 내지 10μM 수준의 낮은 농도로 사용되어도 형광측정이 가능하다. 따라서 상기 조성물은 본 발명의 프로브가 5 내지 10μM로 존재하는 경우 침전이 발생하지 않는 조건이며, 세포용해물에 존재하는 HTRA 및 살아있는 세포가 안정하게 존재할 수 있는 조건의 완충용액이라면 제한 없이 사용 가능하다. 추가적으로 미토콘드리아 내부의 인간 HTRA2의 활성을 측정하는 경우라면 상기 프로브의 운반체로서 DMSO를 더 포함할 수 있으며 이 경우 상기 DMSO는 0.2% 미만이 되도록 하는 포함하는 것이 바람직하다.The composition for measuring HTRA activity comprising the HTRA activity-based peptide probe for HTRA detection of the present invention is applicable to both cell lysates or living cells, and fluorescence measurement is possible even when used at a low concentration of 5 to 10 μM. Therefore, the composition can be used without limitation as long as it is a buffer solution under conditions in which precipitation does not occur when the probe of the present invention is present in an amount of 5 to 10 μM, and HTRA and living cells present in the cell lysate can be stably present. . Additionally, if the activity of human HTRA2 inside mitochondria is measured, DMSO may be further included as a carrier of the probe.

하기 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다.The present invention will be described in detail through the following examples.

실시예 Example

1. 실험방법1. Experimental method

1) 용어의 정리1) Terminology

먼저 본 발명에서 사용한 용어를 정리하면 하기와 같다.First, the terms used in the present invention are summarized as follows.

약어Abbreviation 전체이름full name HTRA HTRA high temperature requirement Ahigh temperature requirement A APPAPP amyloid precursor proteinsamyloid precursor proteins Aβ Aβ β-amyloid 또는 amyloid ββ-amyloid or amyloid β ADAD Alzheimer’s diseaseAlzheimer's disease PD PD Parkinson’s diseaseParkinson's disease H2-OPTH2-OPT H2-optimal substrate peptide H2-optimal substrate peptide CMTCMT human chymotrypsin Chuman chymotrypsin C NENE human neutrophil elastasehuman neutrophil elastase Aβ1-42 Aβ 1-42 β-amyloid peptides 1-42β-amyloid peptides 1-42 IMSIMS intermembrane spaceintermembrane space BocBoc tert-butoxycarbonyltert-butoxycarbonyl Fmocfmoc 9-fluorenylmethoxycarbonyl9-fluorenylmethoxycarbonyl TFATFA trifluoroacetic acid trifluoroacetic acid DMFDMF N,N-dimethylformamide N,N-dimethylformamide DICDIC N,N’-diisopropylcarbodiimideN,N’-diisopropylcarbodiimide TISTIS triisopropylsilanetriisopropylsilane DIEADIEA N,N-diisopropylethylamineN,N-diisopropylethylamine PbfPbf 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl tButBu tert-butyltert-butyl HATUHATU trityl (Trt); 1-[bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxid hexafluorophosphatetrityl (Trt); 1-[bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxid hexafluorophosphate HBTUHBTU N,N,N’,N’-tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate N,N,N’,N’-tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate NMPNMP N-methyl-2-pyrrolidoneN-methyl-2-pyrrolidone HOBtHOBt 5(6)-carboxyfluorescein (CF); 1-hydroxybenzotriazole hydrate5(6)-carboxyfluorescein (CF); 1-hydroxybenzotriazole hydrate Fmoc-PEG4-OHFmoc-PEG4-OH 15-(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)amino-4,7,10,13-tetraoxa-pentadecanoic acid15-(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)amino-4,7,10,13-tetraoxa-pentadecanoic acid DMSODMSO dimethyl sulfoxidedimethyl sulfoxide DPPDPP diphenyl (1-amino-2-methylpropyl) phosphonatediphenyl (1-amino-2-methylpropyl) phosphonate MTPMTP mitochondria-targeting peptoidmitochondria-targeting peptoid TPPTPP triphenylphosphoniumtriphenylphosphonium SDS-PAGESDS-PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresissodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis PBSPBS phosphate-buffered salinephosphate-buffered saline RIPARIPA radioimmunoprecipitationradioimmunoprecipitation BCABCA bicinchoninicbicinchoninic HPLCHPLC high-performance liquid chromatographyhigh-performance liquid chromatography

2) 실험재료2) Experimental materials

(1) 시약의 준비(1) Preparation of reagents

본 발명에서 사용한 용매와 시약은 모두 상업적으로 구입 가능한 것이다. 2-Chlorotrityl chloride 레진, 1% DVB (100-200mesh, 1.14m㏖/g) 및 Fmoc-Rink Amide MBHA 레진 (100-200mesh, 0.65m㏖/g)은 Novabiochem (San Diego, CA, USA)에서 구매하였다. Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, 및 Fmoc-Pro-OH는 Merck Millipore (Billerica, MA, USA)에서 구입하였으며 Fmoc-Met-Wang은 Advanced ChemTech (Louisville, KY, USA)에서 구입하였다. Fmoc-Pro-OH은 Merck Millipore (Billerica, MA, USA)에서 구입하였고 Fmoc-Met-Wang은 Advanced ChemTech (Louisville, KY, USA)에서 구입하였다. HATU 및 HBTU는 ChemImpex Inc. (Wood Dale, IL, USA)에서 구입하였으며 DIC, DIEA, 및 TIS는 TCI (Chuo-Ku, Japan)에서 구입하였다. TFA, DMF, 및 acetonitrile은 Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)에서 구입하였고 Fmoc-PEG4-OH는 Quanta BioDesign (Plain City, OH, USA)에서 구입하였다. 상기 언급되지 않은 나머지 시약은 모두 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. All solvents and reagents used in the present invention are commercially available. 2-Chlorotrityl chloride resin, 1% DVB (100-200mesh, 1.14mmol/g) and Fmoc-Rink Amide MBHA resin (100-200mesh, 0.65mmol/g) were purchased from Novabiochem (San Diego, CA, USA). did. Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc- Ser(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, and Fmoc-Pro-OH were purchased from Merck Millipore (Billerica, MA, USA) and Fmoc-Met-Wang was obtained from Advanced ChemTech (Louisville, KY, USA). was purchased from Fmoc-Pro-OH was purchased from Merck Millipore (Billerica, MA, USA) and Fmoc-Met-Wang was purchased from Advanced ChemTech (Louisville, KY, USA). HATU and HBTU are trademarks of ChemImpex Inc. (Wood Dale, IL, USA) and DIC, DIEA, and TIS were purchased from TCI (Chuo-Ku, Japan). TFA, DMF, and acetonitrile were purchased from Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) and Fmoc-PEG4-OH was purchased from Quanta BioDesign (Plain City, OH, USA). All other reagents not mentioned above were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

(2) 실험기기 및 조건(2) Experimental equipment and conditions

고체상 펩타이드 합성은 펩타이드 합성기(Protein Technologies Inc., Tucson, AZ, USA)를 사용하였다. 펩타이드와 색소(dye)의 컨쥬게이션은 광섬유온도프로브 및 상온분위기의 자석교반기가 구비된 CEM MARS 230/60 마이크로파 반응 시스템(microwave reaction system)에서 수행하였다. 분석용 HPLC 크로마토그램은 C18 컬럼이 장착된 워터스 역상 HPLC system (2489 UV/visible 측정기, 1525 바이너리 HPLC 펌프, 2707 오토샘플러, 및 5 채널 컬럼 오븐)을 사용하였으며 컬럼 오븐의 온도는 40이었으며 바이너리 이동상 시스템(A binary mobile phase system: A상: 증류수+0.1% TFA, B상: CH3CN+0.1% TFA)을 사용하였다. 모든 펩타이드는 25℃에서 워터스 분취용 HPLC 시스템(Waters preparative HPLC system: 2489 UV/visible 측정기, 2545 Quaternary HPLC 펌프, fraction collector III)을 사용하여 정제하였으며 유량(flow rate)은 14㎖/min이었다. 바이너리 이동상 시스템(binary mobile phase system: A상: 증류수+0.1% TFA, B상: CH3CN+0.1% TFA)은 B상 5%로 5분간 수행 후 30분간 B상이 5%에서 100%로 선형 증가하도록 gradient 설정을 하였으며 B상이 100%에 도달하면 5분간 100%를 유지시켰다. 샘플 elution은 흡광도 220 내지 250nm에서 모니터링 하였으며 analytical HPLC를 이용하여 각 fraction의 순도가 98%이상임을 확인하였다. 전자 분무 이온화 질량 분석법(Electrospray ionization mass spectrometry)은 Agilent 6120 single quadrupole mass spectrometer가 장착된 model 1260 Infinity liquid chromatography system (Agilent, Santa Clara, CA, USA)을 사용하였으며 순수한 샘플을 분리하고 이를 동결건조한 후 -80℃에 보관하였다.Solid-phase peptide synthesis was performed using a peptide synthesizer (Protein Technologies Inc., Tucson, AZ, USA). The conjugation of the peptide and the dye was performed in a CEM MARS 230/60 microwave reaction system equipped with an optical fiber temperature probe and a magnetic stirrer at room temperature. Analytical HPLC chromatograms were prepared using a Waters reverse-phase HPLC system equipped with a C18 column (2489 UV/visible meter, 1525 binary HPLC pump, 2707 autosampler, and 5-channel column oven), the column oven temperature was 40, and the binary mobile phase system. (A binary mobile phase system: A phase: distilled water + 0.1% TFA, B phase: CH 3 CN + 0.1% TFA) was used. All peptides were purified using a Waters preparative HPLC system (Waters preparative HPLC system: 2489 UV/visible meter, 2545 Quaternary HPLC pump, fraction collector III) at 25° C., and the flow rate was 14 ml/min. Binary mobile phase system (phase A: distilled water + 0.1% TFA, phase B: CH 3 CN + 0.1% TFA) is carried out at 5% of phase B for 5 minutes and then phase B is linear from 5% to 100% for 30 minutes The gradient was set to increase, and when phase B reached 100%, it was maintained at 100% for 5 minutes. Sample elution was monitored at an absorbance of 220 to 250 nm, and it was confirmed that the purity of each fraction was 98% or more using analytical HPLC. Electrospray ionization mass spectrometry was performed using a model 1260 Infinity liquid chromatography system (Agilent, Santa Clara, CA, USA) equipped with an Agilent 6120 single quadrupole mass spectrometer. Stored at 80°C.

(3) 펩타이드의 합성(3) synthesis of peptides

본 발명의 펩타이드 합성에 사용한 방법(general procedure)은 하기와 같다. The method (general procedure) used for the peptide synthesis of the present invention is as follows.

표준 고체상 펩타이드의 합성은 펩타이드 합성기를 이용하여 수행하였다. 2-chlorotrityl chloride 레진(100-200mesh), 1% DVB (1.14m㏖/g, 228㎎, 0.26m㏖)을 사용하였으며 상기 레진은 CH2Cl2(5.0㎖)에서 상온으로 30분간 담구어 팽창시킨 후 사용하였다. 펩타이드 커플링 반응을 위하여 아미노산(amino acid)을 20% DIEA (742㎎, 1.0㎖, 5.7m㏖, d=0.74g/㎖)가 포함된 CH2Cl2(5.0㎖)용액에 용해시켜 아미노산 용액을 제조하였다. 상기 아미노산 용액은 6시간 동안 강하게 교반한 후 DMF와 CH2Cl2를 이용하여 세척하였다. 상기 세척 후 20% piperidine (862㎎, 1.0㎖, 10.0m㏖, d=0.86g/㎖)이 포함된 DMF(5.0㎖)용액을 이용하여 Fmoc 탈보호반응(deprotection reaction)을 수행하였으며 반응이 끝난 반응물은 DMF 및 CH2Cl2로 세척하였다. The synthesis of standard solid phase peptides was performed using a peptide synthesizer. 2-chlorotrityl chloride resin (100-200mesh), 1% DVB (1.14 mmol/g, 228 mg, 0.26 mmol) was used, and the resin was swelled by immersion in CH 2 Cl 2 (5.0 mL) at room temperature for 30 minutes. It was used after For the peptide coupling reaction, an amino acid solution was dissolved in a CH 2 Cl 2 (5.0 mL) solution containing 20% DIEA (742 mg, 1.0 mL, 5.7 mmol, d = 0.74 g/mL). was prepared. The amino acid solution was stirred vigorously for 6 hours and then washed with DMF and CH 2 Cl 2 . After the washing, the Fmoc deprotection reaction was performed using a DMF (5.0 mL) solution containing 20% piperidine (862 mg, 1.0 mL, 10.0 mmol, d = 0.86 g/mL), and the reaction was completed. The reaction was washed with DMF and CH 2 Cl 2 .

상기 Fmoc 탈보호반응이 끝난 반응물에 대하여 펩타이드 커플링 반응을 수행하였다. 상기 펩타이드 커플링 반응은 합성을 원하는 아미노산(0.78m㏖)과 HATU(300㎎, 0.78m㏖)을 20% DIEA(5.0㎖)가 포함된 DMF용액에 첨가하고 이를 혼합하는 방법으로 수행하였다. 상기 펩타이드 커플링 반응은 원하는 아미노산 시퀸스의 펩타이드가 형성될 때까지 반복 수행하였으며 마지막 단계에서 Fmoc 탈보호반응을 수행하였다. A peptide coupling reaction was performed on the reactant after the Fmoc deprotection reaction was completed. The peptide coupling reaction was performed by adding the desired amino acid (0.78 mmol) and HATU (300 mg, 0.78 mmol) to a DMF solution containing 20% DIEA (5.0 mL) and mixing them. The peptide coupling reaction was repeated until a peptide of the desired amino acid sequence was formed, and Fmoc deprotection reaction was performed in the last step.

마이크로파-보조 고체상 서브모노머 합성(Microwave-assisted solid-phase submonomer synthesis)를 사용하여 6-아미노헥산산(6-aminohexanoic acid, Ahx)과 5(6)-카르복시플루오레신(5(6)-carboxyfluorescein, CF)을 컨쥬게이트 하였다. 이를 위하여 펩타이드 레진(펩타이드 농도: 0.26m㏖)을 DMF(5.0㎖)에 현탁시켜 펩타이드 레진 용액을 제조하였으며 Fmoc-Ahx-OH(276㎎, 0.78m㏖), DIEA(262㎎, 0.36㎖, 2.1m㏖, d=0.74g/㎖), 및 HATU(300㎎, 0.78m㏖)을 DMF(5.0㎖)에 현탁시켜 Fmoc-Ahx-OH-HATU 용액을 제조한 후 이를 혼합하였다. 상기 혼합물은 마이크로파(75°C, 400W max power, 75%, ramp 4분, hold 56분)를 가해주며 교반(stirring level 3)하였다. 6-aminohexanoic acid (Ahx) and 5(6)-carboxyfluorescein using microwave-assisted solid-phase submonomer synthesis , CF) was conjugated. To this end, a peptide resin (peptide concentration: 0.26 mmol) was suspended in DMF (5.0 mL) to prepare a peptide resin solution, and Fmoc-Ahx-OH (276 mg, 0.78 mmol), DIEA (262 mg, 0.36 mL, 2.1) mmol, d=0.74 g/ml), and HATU (300 mg, 0.78 mmol) were suspended in DMF (5.0 ml) to prepare a Fmoc-Ahx-OH-HATU solution, followed by mixing. The mixture was stirred (stirring level 3) while applying microwave (75°C, 400W max power, 75%, ramp 4 min, hold 56 min).

상기 반응이 끝난 펩타이드 레진은 MeOH, DMF, 및 CH2Cl2로 세척하고 Fmoc 탈보호(deprotection)반응을 수행하였다. 상기 Fmoc 탈보호 반응이 끝난 펩타이드 레진은 5(6)-카르복시플루오레신(488㎎, 1.3m㏖), DIC(164㎎, 0.20㎖, 1.3m㏖, d=0.81g/㎖) 및 HOBt(176㎎, 1.3m㏖)을 DMF(5.0㎖)에 현탁시켜 제조한 5(6)-카르복시플루오레신 용액과 혼합하였으며 상온에서 12시간 이상 교반하며 반응시키는 방법으로 염료(CF)가 컨쥬게이티드 펩타이드(CF-Ahx 컨쥬게이티드 펩타이드)를 합성하였다. 상기 반응 후 CF-Ahx 컨쥬게이티드 펩타이드가 합성된 레진을 세척하고 절단(cleavage)칵테일(2,2,2-trifluoroethanol:acetic acid:CH2Cl2=1:1:8, v/v/v)을 이용하여 CF-Ahx 컨쥬게이티드 펩타이드를 레진으로부터 분리하였다. 상기 분리된 CF-Ahx 컨쥬게이티드 펩타이드는 HPLC를 이용하여 정제한 후 동결건조하여 보관하였다. After the reaction, the peptide resin was washed with MeOH, DMF, and CH 2 Cl 2 , and Fmoc deprotection reaction was performed. The peptide resin after the Fmoc deprotection reaction was completed was 5(6)-carboxyfluorescein (488 mg, 1.3 mmol), DIC (164 mg, 0.20 ml, 1.3 mmol, d=0.81 g/ml) and HOBt ( 176 mg, 1.3 mmol) was mixed with a 5(6)-carboxyfluorescein solution prepared by suspending in DMF (5.0 mL), and the dye (CF) was conjugated by stirring at room temperature for more than 12 hours. A peptide (CF-Ahx conjugated peptide) was synthesized. After the reaction, the resin in which the CF-Ahx conjugated peptide was synthesized was washed and a cleavage cocktail (2,2,2-trifluoroethanol:acetic acid:CH 2 Cl 2 =1:1:8, v/v/v) ) to separate the CF-Ahx conjugated peptide from the resin. The isolated CF-Ahx conjugated peptide was purified using HPLC, then lyophilized and stored.

1-aminoalkylphosphonate diaryl ester(16㎎, 51μ㏖)의 브롬화 수소산염(hydrobromide salt)과 DIEA(13㎎, 17㎕, 102μ㏖, d=0.74g/㎖)를 DMSO(1.0㎖)에 현탁하여 브롬화 수소산염 용액을 제조하였다. 상기 브롬화 수소산염 용액에 상기 CF-Ahx 컨쥬게이티드 펩타이드(17μ㏖)을 HOBt(14㎎, 102μ㏖) 및 DIC(13㎎, 17㎕, 102μ㏖, d=0.81g/㎖)가 용해된 DMSO용액(1.0㎖)에 첨가하고 상온에서 48시간동안 반응시켰다. 상기 반응이 끝난 CF-Ahx 컨쥬게이티드 펩타이드는 HPLC를 이용하여 정제한 후 동결건조 하였으며 상기 동결건조된 CF-Ahx 컨쥬게이티드 펩타이드는 TFA:CH2Cl2=1:1(v/v)에서 상온으로 2시간 반응시켜 탈보호 반응을 수행하였다. 탈보호반응이 수행된 반응용액은 질소가스 하에서 농축하고 HPLC를 이용하여 CF-Ahx 컨쥬게이티드 펩타이드만을 정제하였으며 정제된 펩타이드의 순도는 98%이상이었다.Hydrobromide salt of 1-aminoalkylphosphonate diaryl ester (16 mg, 51 μmol) and DIEA (13 mg, 17 μl, 102 μmol, d=0.74 g/ml) were suspended in DMSO (1.0 mL) to produce hydrogen bromide A salt solution was prepared. DMSO in which HOBt (14 mg, 102 μmol) and DIC (13 mg, 17 μl, 102 μmol, d=0.81 g/ml) were dissolved in the hydrobromide solution with the CF-Ahx conjugated peptide (17 μmol) It was added to the solution (1.0 mL) and reacted at room temperature for 48 hours. After the completion of the reaction, the CF-Ahx conjugated peptide was purified using HPLC and then lyophilized. The lyophilized CF-Ahx conjugated peptide was TFA:CH 2 Cl 2 =1:1 (v/v). The deprotection reaction was performed by reacting at room temperature for 2 hours. The reaction solution subjected to the deprotection reaction was concentrated under nitrogen gas, and only the CF-Ahx conjugated peptide was purified using HPLC. The purity of the purified peptide was 98% or more.

(4) CF-Ahx-FIMV-DPP 및 CF-Ahx-FIML-DPP의 합성(4) Synthesis of CF-Ahx-FIMV-DPP and CF-Ahx-FIML-DPP

펩타이드 커플링 반응은 상기의 방법을 사용하되, 레진은 Fmoc-Met-Wang 레진(100-200mesh, 0.80m㏖/g, 325㎎, 0.26m㏖)을 사용하였다. 상기 레진에 대한 절단반응은 절단용액(TFA:TIS:H2O=95:2.5:2.5(v/v/v))으로 상온 2시간동안 수행하였다. 상기 절단된 펩타이드는 HPLC를 이용하여 정제하였다. For the peptide coupling reaction, the above method was used, but as the resin, Fmoc-Met-Wang resin (100-200mesh, 0.80 mmol/g, 325 mg, 0.26 mmol) was used. The cleavage reaction of the resin was performed with a cleavage solution (TFA:TIS:H 2 O=95:2.5:2.5 (v/v/v)) at room temperature for 2 hours. The cleaved peptide was purified using HPLC.

(5) NH(5) NH 22 -Leu-DPP 및 NH-Leu-DPP and NH 22 -Val-DPP의 합성-Synthesis of Val-DPP

diphenyl (1-amino-3-methylbutyl) phosphonate (NH2-Leu-DPP) 및 diphenyl (1-amino-2-methylpropyl) phosphonate (NH2-Val-DPP)을 합성하였다. 합성물의 브롬화 수소산염은 상기 알려진 방법에 따라 합성하였으며 상기 합성물들은 백색의 파우더 상태로 분리하였으며 각각 상기 두 단계를 거치는 동안 56 내지 60%의 수율을 보였다. diphenyl (1-amino-3-methylbutyl) phosphonate (NH 2 -Leu-DPP) and diphenyl (1-amino-2-methylpropyl) phosphonate (NH 2 -Val-DPP) were synthesized. The hydrobromide salt of the compound was synthesized according to the known method, and the compounds were isolated in a white powder state, and yields of 56 to 60% were obtained during each of the two steps.

(6) 3-maleimidopropionic acid-Lys (5/6-FAM)-Leu-Phe-Leu-OH의 합성(6) Synthesis of 3-maleimidopropionic acid-Lys (5/6-FAM)-Leu-Phe-Leu-OH

상기 고체상 펩타이드 합성법을 이용하여 3-maleimidopropionic acid-Lys (5/6-FAM)-Leu-Phe-Leu-OH을 합성하였다. 먼저 2-chlorotrityl chloride 레진(500㎎, 0.32m㏖)을 20분간 DMF에 담구어 팽창시켰다. 그 후 Fmoc-Leu-OH (339㎎, 0.96m㏖, 레진에 약 1m㏖/g가 충진됨)을 DMF에 현탁시키고 DIEA(124㎎, 167㎕, 0.96m㏖, d=0.74g/㎖)를 더 첨가하여 Fmoc-Leu-OH 용액을 제조하였다. 상기 팽창된 레진을 DMF로 세척한 후 상기 Fmoc-Leu-OH 용액에 첨가하고 1.5시간동안 교반하여 반응시켰다. 그 후 Fmoc 탈보호 반응을 수행하여 레진에 결합된 아미노산의 양을 추정하였다. 다음으로 Fmoc-Phe-OH (371㎎, 0.96m㏖)을 HOBt (130㎎, 0.96m㏖) 및 DIC (121㎎, 149㎕, 0.96m㏖, d=0.81g/㎖)가 포함된 DMF용액 첨가하고 1.5시간동안 혼합하여 커플링 반응을 수행하였다. Fmoc-Lys(5/6-FAM)-OH (1.04g, 1.44m㏖)을 HOBt(130㎎, 0.96m㏖) 및 DIC(121㎎, 149㎕, 0.96m㏖, d=0.81g/㎖)가 포함된 NMP용액에 첨가하고 12시간 이상 교반하여 커플링 반응을 수행하였다. 합성의 마지막 단계에서 3-maleimidopropionic acid(162㎎, 0.96m㏖)을 더 첨가하여 상기 합성된 펩타이드 조각들과 컨쥬게이션 시켰으며 반응이 끝난 레진은 DMF 및 CH2Cl2을 이용하여 세척하였다. 상기 합성이 완료된 레진은 절단칵테일(2,2,2-trifluoroethanol:aceticacid:CH2Cl2=1:1:8(v/v/v))을 이용하여 상온에서 2시간동안 반응시켜 펩타이드를 분리하였다.3-maleimidopropionic acid-Lys (5/6-FAM)-Leu-Phe-Leu-OH was synthesized using the solid-phase peptide synthesis method. First, 2-chlorotrityl chloride resin (500 mg, 0.32 mmol) was dipped in DMF for 20 minutes to expand. After that, Fmoc-Leu-OH (339 mg, 0.96 mmol, resin filled with about 1 mmol/g) was suspended in DMF and DIEA (124 mg, 167 μl, 0.96 mmol, d=0.74 g/ml) was further added to prepare a Fmoc-Leu-OH solution. After washing the expanded resin with DMF, it was added to the Fmoc-Leu-OH solution and stirred for 1.5 hours to react. Thereafter, Fmoc deprotection was performed to estimate the amount of amino acids bound to the resin. Next, Fmoc-Phe-OH (371 mg, 0.96 mmol) was added to a DMF solution containing HOBt (130 mg, 0.96 mmol) and DIC (121 mg, 149 μl, 0.96 mmol, d = 0.81 g/ml). The coupling reaction was performed by adding the mixture and mixing for 1.5 hours. Fmoc-Lys(5/6-FAM)-OH (1.04 g, 1.44 mmol) was mixed with HOBt (130 mg, 0.96 mmol) and DIC (121 mg, 149 μl, 0.96 mmol, d=0.81 g/ml) was added to the NMP solution containing and stirred for more than 12 hours to perform a coupling reaction. In the last step of the synthesis, 3-maleimidopropionic acid (162 mg, 0.96 mmol) was further added and conjugated with the synthesized peptide fragments. After the reaction, the resin was washed with DMF and CH 2 Cl 2 . The synthesized resin was reacted for 2 hours at room temperature using a cleavage cocktail (2,2,2-trifluoroethanol:aceticacid:CH 2 Cl 2 =1:1:8 (v/v/v)) to separate the peptide. did.

(7) 미토콘드리아 타겟팅 펩토이드 컨쥬게이티드 LFLV의 합성(7) Synthesis of mitochondrial targeting peptoid conjugated LFLV

3-maleimidopropionic acid-Lys (5/6-FAM)-Leu-Phe-Leu-Val(LFLV)-DPP는 상기와 동일한 방법으로 합성하였다. 먼저 cysteine이 컨쥬게이션된 미토콘드리아-타겟팅 펩토이드(mitochondria-targeting peptoid, MTP)인 Cys-PEG4-MTP를 합성하였다. Rink amide에 MTP가 부착된 MBHA 레진(0.13m㏖)을 DMF(5.0㎖)에서 팽창시켰다. 그 후 Fmoc-PEG4-OH(228㎎, 0.39m㏖)을 HATU(296㎎, 0.78m㏖) 및 DIEA(252㎎, 340㎕, 1.95m㏖, d=0.74g/㎖)이 포함된 DMF(5.0㎖)용액에 첨가하였다. 상기 혼합용액은 마이크로파 조건(75°C, 400W max power, 75%, ramp 4분, hold 56분, 교반레벨 3)에서 교반하였다. 그 후 상기 레진을 DMF, CH2Cl2, 및 MeOH으로 세척하였다. Fmoc 탈보호반응 후 DMF(5.0㎖)용액에 Fmoc-Cys(Trt)-OH(439㎎, 0.75m㏖), HATU(570㎎, 1.5m㏖), 및 DIEA(516㎎, 720㎕, 4.0m㏖, d=0.74g/㎖)을 혼합하여 펩타이드 커플링반응을 수행하였으며 상기 반응이 수행된 펩타이드는 마지막으로 절단반응을 수행하여 펩타이드와 레진을 분리하였다. 상기 절단반응은 절단칵테일(TFA:CH2Cl2=95:5(v/v))에서 수행되었으며 HPLC를 이용하여 펩타이드를 정제하고 동결건조하였다. 3-maleimidopropionic acid-Lys (5/6-FAM)-Leu-Phe-Leu-Val(LFLV)-DPP was synthesized in the same manner as above. First, a cysteine-conjugated mitochondria-targeting peptoid, Cys-PEG4-MTP, was synthesized. MBHA resin (0.13 mmol) with MTP attached to Rink amide was expanded in DMF (5.0 mL). Thereafter, Fmoc-PEG4-OH (228 mg, 0.39 mmol) was added to DMF ( 5.0 ml) solution. The mixed solution was stirred under microwave conditions (75°C, 400W max power, 75%, ramp 4 minutes, hold 56 minutes, agitation level 3). The resin was then washed with DMF, CH 2 Cl 2 , and MeOH. After Fmoc deprotection reaction, Fmoc-Cys(Trt)-OH (439mg, 0.75mmol), HATU (570mg, 1.5mmol), and DIEA (516mg, 720μl, 4.0m) in DMF (5.0ml) solution mol, d = 0.74 g/ml), a peptide coupling reaction was performed, and the peptide subjected to the reaction was finally subjected to a cleavage reaction to separate the peptide and the resin. The cleavage reaction was performed in a cleavage cocktail (TFA:CH 2 Cl 2 =95:5 (v/v)), and the peptide was purified using HPLC and lyophilized.

maleimide(0.4㎎, 0.3μ㏖)가 부착된 펩타이드에 DMSO(2.4㎖) 및 MTP(2.4㎎, 0.97μ㏖)을 추가하여 용해시켰다. 상기 펩타이드 용액에 질소가스를 퍼지(purge)하고 48시간동안 상온에서 교반하였다. 그 후 상기 펩타이드용액을 HPLC로 분리한 후 고순도 펩타이드가 포함된 fraction만을 수집하여 동결건조 후 -80℃에 보관하였다. 상기 고순도 펩타이드는 2회 이상 동결건조하는 방법으로 잔류 TFA를 제거하였다.DMSO (2.4ml) and MTP (2.4mg, 0.97μmol) were added to the maleimide (0.4mg, 0.3μmol)-attached peptide and dissolved. The peptide solution was purged with nitrogen gas and stirred at room temperature for 48 hours. After that, the peptide solution was separated by HPLC, and only fractions containing high-purity peptides were collected, lyophilized and stored at -80°C. Residual TFA was removed by freeze-drying the high-purity peptide two or more times.

(8) triphenylphosphonium 컨쥬게이티드 LFLV의 합성(8) Synthesis of triphenylphosphonium-conjugated LFLV

상기 합성방법으로 3-maleimidopropionic acid-Lys(5/6-FAM)-Leu-Phe-Leu-Va l-DPP을 합성하였다. cysteine이 컨쥬게이션된 MTP을 합성하였다. Rink amide에 MTP가 부착된 MBHA 레진(100-200mesh, 0.65m㏖/g, 770㎎, 0.50m㏖)을 DMF에서 20분간 팽창시켰다. 그 후 20% piperidine(862㎎, 1.0㎖, 10.0m㏖, d=0.86g/㎖)가 포함된 DMF(5.0㎖)에서 Fmoc 탈보호반응을 수행하였다. 상기 레진은 DMF 및 CH2Cl2로 세척하였다. 탈보호 반응 후 펩타이드 커플링 반응을 수행하였다. 상기 커플링 반응은 Fmoc-Cys(Trt)-OH(439㎎, 0.75m㏖), HATU(570㎎, 1.5m㏖), 및 DIEA(516㎎, 720㎕, 4.0m㏖, d=0.74g/㎖)이 포함된 DMF 용액 (5.0㎖)에서 수행하였다. 다음으로 상기 Fmoc-Cys(Trt)-OH(439㎎, 0.75m㏖), HATU(570㎎, 1.5m㏖), 및 DIEA(516㎎, 720㎕, 4.0m㏖, d=0.74g/㎖)이 포함된 DMF 용액이 포함된 레진에 TPP bromide(886㎎, 2.0m㏖)을 첨가하였다. 절단칵테일(TFA:TIS:CH2Cl2=95:2.5:2.5(v/v/v))을 이용하여 절단반응을 수행하였다. 절단반응이 수행된 반응액은 HPLC를 통해 펩타이드를 분리한 후 동결건조하였다. maleimide(0.8㎎, 0.7m㏖)가 부탁된 펩타이드에 DMSO용액(2.4㎖)과 TPP-Cys-NH2(6.4㎎, 14m㏖)을 추가하여 용해시켰다. 상기 펩타이드 용액은 질소가스를 퍼지한 후 상온에서 48시간동안 교반하였다. 그 후 상기 펩타이드 용액에 대하여 HPLC를 수행하여 펩타이드를 정제하였다. 고순도의 펩타이드가 포함된 fraction을 수집하여 동결건조한 후 -80°C에 보관하였다. 상기 고순도 펩타이드는 최소 2회 이상 동결건조하는 방법으로 잔류 TFA 제거하였다. 3-maleimidopropionic acid-Lys(5/6-FAM)-Leu-Phe-Leu-Val-DPP was synthesized by the above synthesis method. MTP conjugated with cysteine was synthesized. MBHA resin (100-200mesh, 0.65mmol/g, 770mg, 0.50mmol) with MTP attached to Rink amide was expanded in DMF for 20 minutes. Thereafter, Fmoc deprotection was performed in DMF (5.0 mL) containing 20% piperidine (862 mg, 1.0 mL, 10.0 mmol, d=0.86 g/mL). The resin was washed with DMF and CH 2 Cl 2 . After the deprotection reaction, a peptide coupling reaction was performed. The coupling reaction was Fmoc-Cys(Trt)-OH (439 mg, 0.75 mmol), HATU (570 mg, 1.5 mmol), and DIEA (516 mg, 720 μl, 4.0 mmol, d=0.74 g/ mL) in DMF solution (5.0 mL). Next, the Fmoc-Cys(Trt)-OH (439 mg, 0.75 mmol), HATU (570 mg, 1.5 mmol), and DIEA (516 mg, 720 μl, 4.0 mmol, d=0.74 g/ml) TPP bromide (886 mg, 2.0 mmol) was added to the resin containing the DMF solution. A cleavage reaction was performed using a cleavage cocktail (TFA:TIS:CH 2 Cl 2 =95:2.5:2.5 (v/v/v)). The reaction solution subjected to the cleavage reaction was lyophilized after separating the peptide through HPLC. DMSO solution (2.4ml) and TPP-Cys-NH 2 (6.4mg, 14mmol) were added to the maleimide (0.8mg, 0.7mmol)-treated peptide and dissolved. The peptide solution was purged with nitrogen gas and stirred at room temperature for 48 hours. Thereafter, HPLC was performed on the peptide solution to purify the peptide. Fractions containing high-purity peptides were collected, lyophilized, and stored at -80°C. Residual TFA was removed from the high-purity peptide by freeze-drying at least twice.

(9) 테트라 펩타이드 프로브의 질량측정결과(9) Mass measurement result of tetrapeptide probe

상기 (3) 내지 (8)의 방법으로 합성한 테트라 펩타이드 프로브는 하기 표 2와 같다. 하기 표 2는 상기 합성한 테트라 펩타이드 프로브를 화학적 계산을 통해 산출한 질량값 및 전자 분사 이온화 질량분석기(electrospray ionization mass spectrometry)을 통해 측정한 질량값을 보여준다. 하기 표 2에서 질량분석기로 측정한 값 중 위첨자“a”가 표시되지 않은 것은 [M+H]+의 질량을 의미하며 위첨자“a”가 표시된 것은 [M+3H]3+의 질량을 의미한다. 미토콘드리아 타겟팅 테트라 펩타이드 프로브의 합성을 위해 제조한 Maleimide-CF-LFLV-DPP 및 Cys-PEG4-MTP 또한 화학적 계산 및 전자 분사 이온화 질량분석기를 통해 질량값을 산출한 결과, 계산값은 각각 1316.5(Maleimide-CF-LFLV-DPP) 및 743.9a(Cys-PEG4-MTP)이었으며 측정값은 각각 1316.4(Maleimide-CF-LFLV-DPP) 및 743.9a(Cys-PEG4-MTP)인 것으로 확인 되었다.The tetrapeptide probes synthesized by the methods (3) to (8) are shown in Table 2 below. Table 2 below shows the mass values calculated through chemical calculation of the synthesized tetrapeptide probe and the mass values measured through electrospray ionization mass spectrometry. In Table 2 below, among the values measured with a mass spectrometer, those not marked with a superscript “a” mean the mass of [M+H] + , and those marked with a superscript “a” mean the mass of [M+3H] 3+ . Maleimide-CF-LFLV-DPP and Cys-PEG4-MTP prepared for the synthesis of the mitochondrial targeting tetrapeptide probe were also calculated by chemical calculation and electron spray ionization mass spectrometry. As a result, the calculated value was 1316.5 (Maleimide- CF-LFLV-DPP) and 743.9 a (Cys-PEG4-MTP), and the measured values were 1316.4 (Maleimide-CF-LFLV-DPP) and 743.9 a (Cys-PEG4-MTP), respectively.

시리즈series 명칭designation 구조structure calculated mass [M+H]+ calculated mass [M+H] + observed mass [M+H]+/[M+3H]3+ observed mass [M+H] + /[M+3H] 3+ P1-VP 1 -V IRRV-프로브IRRV-probe CF-Ahx-IRRV-DPPCF-Ahx-IRRV-DPP 1202.51202.5 1202.11202.1 FIMV-프로브FIMV-Probe CF-Ahx-FIMV-DPPCF-Ahx-FIMV-DPP 1168.51168.5 1168.11168.1 FKLV-프로브FKLV-Probe CF-Ahx-FKLV-DPPCF-Ahx-FKLV-DPP 1165.51165.5 1165.11165.1 FKGV-프로브FKGV-Probe CF-Ahx-FKGV-DPPCF-Ahx-FKGV-DPP 1109.41109.4 1109.11109.1 ASPV-프로브ASPV-probe CF-Ahx-ASPV-DPPCF-Ahx-ASPV-DPP 1032.41032.4 1032.01032.0 LFLV-프로브LFLV-Probe CF-Ahx-LFLV-DPPCF-Ahx-LFLV-DPP 1150.51150.5 1150.31150.3 MTP-LFLV-프로브MTP-LFLV-Probe MTP-PEG-K(CF)-LFLV-DPPMTP-PEG-K(CF)-LFLV-DPP 1182.4a 1182.4 a 1182.5a 1182.5 a TPP-LFLV-프로브TPP-LFLV-Probe TPP-K(CF)-LFLV-DPPTPP-K(CF)-LFLV-DPP 1781.71781.7 1781.51781.5 P1-LP 1 -L FIML-프로브FIML-Probe CF-Ahx-FIML-DPPCF-Ahx-FIML-DPP 1182.51182.5 1182.31182.3 FKLL-프로브FKLL-Probe CF-Ahx-FKLL-DPPCF-Ahx-FKLL-DPP 1179.51179.5 1179.41179.4 FKGL-프로브FKGL-probe CF-Ahx-FKGL-DPPCF-Ahx-FKGL-DPP 1123.51123.5 1123.31123.3 ASPL-프로브ASPL-Probe CF-Ahx-ASPL-DPPCF-Ahx-ASPL-DPP 1046.61046.6 1046.21046.2 LFLL-프로브LFLL-Probe CF-Ahx-LFLL-DPPCF-Ahx-LFLL-DPP 1164.51164.5 1164.31164.3

(8) 재조합 세린 프로테아제 단백질의 표지(8) Labeling of recombinant serine protease protein

인간 HTRA1/PRSS11, 인간 HTRA2/Omi, E. coli/HTRA protease Do (DegP), 인간 neutrophil elastase, 인간 trypsin 1, 및 인간 chymotrypsin C와 같은 재조합 세린 프로테아제 단백질은 R&D systems (Minneapolis, MN, USA)으로부터 구입하였다. Recombinant serine protease proteins such as human HTRA1/PRSS11, human HTRA2/Omi, E. coli /HTRA protease Do (DegP), human neutrophil elastase, human trypsin 1, and human chymotrypsin C were obtained from R&D systems (Minneapolis, MN, USA). Purchased.

재조합 세린 프로테아제 단백질의 표지는 상기 세린 프로테아제 희석용액과 1μM의 테트라 펩타이드 프로브를 혼합하고 30분간 반응시킨 후 SDS-PAGE 샘플버퍼를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 표지된 단백질은 12.5% SDS-PAGE에서 분리하였으며 ChemiDoc MP Imaging (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)을 이용하여 분석하였다. The label of the recombinant serine protease protein is The serine protease dilution solution and 1 μM tetrapeptide probe were mixed and reacted for 30 minutes, and then the reaction was stopped by adding an SDS-PAGE sample buffer. Labeled proteins were separated on 12.5% SDS-PAGE and analyzed using ChemiDoc MP Imaging (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

각 펩타이드 프로브의 용량의존성을 확인하기 위하여 각기 다른 용량의 테트라 펩타이드 프로브와 200ng의 인간 HTRA1/PRSS11(이하 HTRA1), 인간 HTRA2/Omi(이하 HTRA2), 또는 E. coli/HTRA protease Do (DegP)(이하 DegP)을 상기 활성완충용액(50 mM Tris buffer, pH=8.0)에 첨가한 후 45°C에서 한 시간 동안 활성화시켰다. HTRA1, HTRA2, 및 DegP가 각기 다른 농도의 테트라 펩타이드 프로브(1, 10, 100, and 1000nM)에서 표지되는 것이 확인 되었다. 상기 반응은 SDS-PAGE 샘플버퍼를 첨가하는 방법으로 정지시켰으며 12.5% SDS-PAGE에서 분리 및 분석하였다. 추가적으로 50, 100, 250, 또는 500 ng의 HTRA1, HTRA2, 또는 DegP을 45°C의 상기 활성완충용액에서 1시간동안 활성화 한 후 각각 5μM의 테트라 펩타이드 프로브를 첨가한 후 1시간동안 반응시켰으며 SDS-PAGE 샘플버퍼를 첨가하여 정지시켰다. 표지된 단백질은 12.5% SDS-PAGE를 이용하여 분리하고 분석하였다. To confirm the dose dependence of each peptide probe, 200 ng of human HTRA1/PRSS11 (hereafter HTRA1), human HTRA2/Omi (hereafter HTRA2), or E. coli /HTRA protease Do (DegP) ( Hereinafter, DegP) was added to the activation buffer (50 mM Tris buffer, pH=8.0) and activated at 45 °C for one hour. It was confirmed that HTRA1, HTRA2, and DegP were labeled at different concentrations of tetrapeptide probes (1, 10, 100, and 1000 nM). The reaction was stopped by adding an SDS-PAGE sample buffer, and separated and analyzed in 12.5% SDS-PAGE. Additionally, 50, 100, 250, or 500 ng of HTRA1, HTRA2, or DegP was activated for 1 hour in the above activation buffer at 45 °C, and 5 μM of each tetrapeptide probe was added and reacted for 1 hour. -PAGE was stopped by adding sample buffer. Labeled proteins were isolated and analyzed using 12.5% SDS-PAGE.

(9) 살아있는 세포 및 세포용해물의 표지 (9) Labeling of live cells and cell lysates

모든 세포주는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, Seoul, South Korea)에서 제공받았다. HeLa 세포, U-87MG 세포, 및 SH-SY5Y 세포는 24-well plate에 2×105 cells/well로 분주되었고 37°C, 5% CO2 분위기로 18 내지 20시간동안 배양한 후 표지실험을 수행하였다. 상기 배양된 세포는 신선한 배양액으로 교체 후 5μM의 테트라펩타이드 프로브를 첨가하였으며 1.5시간 동안 더 배양한 후 PBS로 3회 세척하였다. 그 후 RIPA 완충용액을 첨가하여 세포를 용해시켰다. 필요한 경우 상기 세포를 새로운 배양액으로 교체하고 카이닉산(kainic acid), 오카다산(okadaic acid) 또는 아밀로이드베타 펩타이드1-42(amyloid β peptide1-42, Aβ1-42)을 첨가하여 전처리한 후 펩타이드 프로브를 첨가하였다. 테트라 펩타이드 프로브 표지실험을 진행하기 전에 새로운 배양액으로 교체하였으며 DMSO의 농도가 <0.2%가 되도록 유지하였다. RIPA 완충용액을 첨가하여 세포용해물을 제조하고 BCA에세이 방법을 이용하여 단백질의 양을 측정하였다. 상기 세포용해물은 12.5% SDS-PAGE에 40㎍을 로딩하여 분리하였다. 표지된 단백질은 SDS-PAGE 겔상에서 형광스캐너로 스캐닝하였다. 전세포용해물(whole cell lysate)을 제조하기 위하여 SH-SY5Y 세포(6×108cells)를 수득한 후 RIPA 완충용액을 첨가하여 세포를 용해시켰다. 미토콘드리아 분획물은 미토콘드리아 분리키트(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하였다. 미토콘드리아 분획물은 Tris-buffered saline에 2% CHAPS가 포함된 완충용액으로 용해시켰으며 미토콘드리아 마커인 TOMM 20 항체(Abcam, Cambridge, MA, USA)와 웨스턴 블러팅을 이용하여 확인하였다. 전세포용해물(whole cell lysate)에 포함된 단백질의 농도와 미토콘드리아 용해물에 포함된 단백질의 농도는 BCA에세이를 통하여 측정하였다. 그 후 40㎍ 미토콘드리아 분획물과 전세포용해물에 LFLV-프로브(5μM)를 첨가한 후 1시간동안 반응시켰다. 상기 반응을 통해 표지된 단백질은 12.5% SDS-PAGE을 이용하여 분리하였고 SDS-PAGE 겔상에서 ChemiDoc MP Imaging System을 이용하여 형광을 스캔하였다.All cell lines were provided by the Korean Cell Line Bank (Seoul, South Korea). HeLa cells, U-87MG cells, and SH-SY5Y cells were seeded at 2×10 5 cells/well in a 24-well plate and incubated for 18 to 20 hours at 37°C, 5% CO 2 atmosphere, followed by labeling experiments. carried out. The cultured cells were replaced with a fresh culture medium, and then 5 μM of a tetrapeptide probe was added, and then incubated for 1.5 hours, washed 3 times with PBS. Thereafter, RIPA buffer was added to lyse the cells. If necessary, the cells are replaced with a fresh culture medium and pretreated with kainic acid, okadaic acid, or amyloid beta peptide 1-42 (amyloid β peptide 1-42, Aβ 1-42 ) A probe was added. Before proceeding with the tetrapeptide probe labeling experiment, it was replaced with a new culture medium and the concentration of DMSO was maintained to be <0.2%. A cell lysate was prepared by adding RIPA buffer, and the amount of protein was measured using the BCA assay method. The cell lysate was separated by loading 40 μg on 12.5% SDS-PAGE. The labeled protein was scanned with a fluorescence scanner on an SDS-PAGE gel. To prepare a whole cell lysate, SH-SY5Y cells (6×10 8 cells) were obtained, and then RIPA buffer was added to lysate the cells. For the mitochondrial fraction, a mitochondrial isolation kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) was used. The mitochondrial fraction was dissolved in a buffer solution containing 2% CHAPS in Tris-buffered saline and confirmed by using a mitochondrial marker TOMM 20 antibody (Abcam, Cambridge, MA, USA) and Western blotting. The protein concentration in the whole cell lysate and the protein concentration in the mitochondrial lysate were measured by BCA assay. After that, LFLV-probe (5 μM) was added to 40 μg mitochondrial fraction and whole cell lysate, followed by reaction for 1 hour. Proteins labeled through the reaction were separated using 12.5% SDS-PAGE, and fluorescence was scanned on the SDS-PAGE gel using ChemiDoc MP Imaging System.

(10) 면역침강법(10) Immunoprecipitation method

면역침강법은 Pierce Classic IP kit (Thermo Fisher Scientific)을 시용하였다. 먼저 HeLa 세포(5×106cells)를 FKLV-프로브(10μM)로 1.5시간동안 표지하였다. 그 후 PBS로 3회 세척하였으며 용해완충용액(50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.5% NP-40, pH=8.0)에서 수확하였다. 수확된 세포 현탁액은 얼음에 15분간 둔 후 4°C, 13,000×g로 원심분리하였고 상층액만을 수득하여 면역침강법에 사용하였다. 200㎍ 세포용해물과 2㎍ 인간 HTRA1/PRSS11 항체(R&D systems)를 IP 용해/세척 완충용액에서 혼합하였고 상기 혼합물은 얼음에서 1시간동안 반응시켰다. 아가로즈 비드(agarose bead)를 상기 혼합물에 첨가하여 슬러리를 제조한 후 이를 4℃에서 12-14시간동안 반응시켰다. 상기 아가로즈 비드는 원심분리하여 상층액만을 수득하였으며 상기 상층액은 SDS-PAGE를 통해 분석하였다. For the immunoprecipitation method, Pierce Classic IP kit (Thermo Fisher Scientific) was used. First, HeLa cells (5×10 6 cells) were labeled with FKLV-probe (10 μM) for 1.5 hours. Then, it was washed three times with PBS and harvested in a lysis buffer solution (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.5% NP-40, pH=8.0). The harvested cell suspension was placed on ice for 15 minutes and then centrifuged at 4°C and 13,000×g, and only the supernatant was obtained and used for immunoprecipitation. 200 μg cell lysate and 2 μg human HTRA1/PRSS11 antibody (R&D systems) were mixed in IP lysis/wash buffer and the mixture was incubated on ice for 1 hour. Agarose beads were added to the mixture to prepare a slurry, and then reacted at 4° C. for 12-14 hours. The agarose beads were centrifuged to obtain only a supernatant, and the supernatant was analyzed through SDS-PAGE.

(11) 현미경 이미징 분석(11) Microscopic imaging analysis

이미징 분석을 위하여 24시간 전에 8-웰-챔버 커버글래스에 5×104cells의 세포를 분주하였으며 이미징 당일에 배양액을 교체하였다. 전처리 후 상기 배양액을 교체하여 주고 LFLV-프로브, MTP-LFLV-프로브, TPP-LFLV-프로브, 및 Mitotracker Red (50nM)을 첨가한 후 15분간 배양시켰다. 배양이 끝난 세포는 PBS로 3회 세척한 후 라이브-세포 이미징 용액을 첨가하였다. 세포에 대한 형광현미경 분석은 EVOS FL cell imaging system(Thermo Fisher Scientific)을 이용하였으며 공초점 현미경 분석은 녹색 및 붉은색 채널에 oil immersion objective (63×)가 장착된 LSM 700 confocal microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany)을 이용하였다. 또한 형광이미지의 분석은 ZEN software(Carl Zeiss)를 이용하였다. For imaging analysis, 5×10 4 cells were aliquoted into an 8-well-chamber cover glass 24 hours before, and the culture medium was replaced on the day of imaging. After pretreatment, the culture medium was replaced, and LFLV-probe, MTP-LFLV-probe, TPP-LFLV-probe, and Mitotracker Red (50 nM) were added and incubated for 15 minutes. After culturing, the cells were washed 3 times with PBS, and then a live-cell imaging solution was added. Fluorescence microscopic analysis of cells was performed using the EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific), and confocal microscopy was performed with an LSM 700 confocal microscope (Carl Zeiss, Jena) equipped with an oil immersion objective (63×) in green and red channels. , Germany) were used. In addition, analysis of the fluorescence image was performed using ZEN software (Carl Zeiss).

2. 실험결과2. Experimental results

1) 테트라 펩타이드 프로브의 제조, 반응성 및 선택성 평가1) Preparation of tetrapeptide probes, evaluation of reactivity and selectivity

본 발명에서는 HTRA을 타겟으로 하는 활성 기반 프로브(active-based probe)를 디자인하고 이를 합성하였다. 또한 상기 활성 기반 프로브를 이용하여 다양한 조건에서 HTRA의 활성을 측정하였다. 상기 활성 기반 프로브는 타겟 효소 단백질의 활성부위와 공유결합을 하는 화학 프로브(chemical probe)의 일종으로 살아있는 세포 또는 동물에서 타겟 효소 단백질을 동정하고 모니터하는 용도로 사용이 가능하다.In the present invention, an active-based probe targeting HTRA was designed and synthesized. In addition, the activity of HTRA was measured under various conditions using the activity-based probe. The activity-based probe is a kind of chemical probe that covalently bonds with the active site of the target enzyme protein, and can be used to identify and monitor the target enzyme protein in living cells or animals.

본 발명에서는 10 내지 16가지 아미노산으로 구성되며 HTRA의 기질로 알려진 여러 종류의 펩타이드 서열을 테트라 펩타이드(tetra-peptide)로 분류하고 이를 합성하였다. 상기 테트라 펩타이드는 크기가 작아 합성이 용이한 장점이 있으며 세포막 통과에 유리한 장점이 있다. In the present invention, several types of peptide sequences composed of 10 to 16 amino acids and known as substrates of HTRA were classified as tetra-peptides and synthesized. The tetrapeptide has the advantage of being easy to synthesize due to its small size and advantageous in passing through the cell membrane.

HTRA의 기질(substrate)결합 도메인(또는 active domain)은 HTRA 단백질들 사이에서 잘 보존되어 있는 특징이 있다. 특히 도 1에서 같이 P1 위치에는 Val, Leu, 및 Ile과 같은 소수성 작용기를 가지는 아미노산이 공통적으로 위치하게 된다. 따라서 본 발명에서는 P1에 위치하는 아미노산 작용기로서 Val 및 Leu의 소수성 작용기를 선택하였으며 이를 P1-V 테트라 펩타이드 프로브 시리즈(IRRV-프로브, FIMV-프로브, FKLV-프로브, FKGV-프로브, ASPV-프로브, LFLV-프로브, MTP-LFLV-프로브, 및 TPP-LFLV-프로브) 및 P1-L 테트라 펩타이드 프로브 시리즈(FIML-프로브, FKLL-프로브, FKGL-프로브, ASPL-프로브, 및 LFLL-프로브)로 명명하였다. 또한 서브 패밀리 선택성을 확인하기 위하여 P1-V 테트라 펩타이드 프로브 시리즈 및 P1-L 테트라 펩타이드 프로브 시리즈의 P2 위치, P3 위치 및 P4 위치에는 다양한 종류의 아미노산 작용기로 변화시키는 방법으로 각 시리즈를 디자인 하였다. 선행연구결과를 통해 보고된 HTRA 기질 아미노산 서열에 기반하여 13 종류의 테트라 펩타이드 프로브를 합성하였으며 상기 표 2에 나타내었다.The substrate binding domain (or active domain) of HTRA is well conserved among HTRA proteins. In particular, as shown in FIG. 1 , amino acids having hydrophobic functional groups such as Val, Leu, and Ile are commonly located at the P 1 position. Therefore, in the present invention, hydrophobic functional groups of Val and Leu were selected as amino acid functional groups located at P 1 , and the P 1 -V tetrapeptide probe series (IRRV-probe, FIMV-probe, FKLV-probe, FKGV-probe, ASPV-probe) , LFLV-probe, MTP-LFLV-probe, and TPP-LFLV-probe) and P 1 -L tetrapeptide probe series (FIML-probe, FKLL-probe, FKGL-probe, ASPL-probe, and LFLL-probe). named. In addition, in order to confirm subfamily selectivity, the P 2 position, P 3 position, and P 4 position of the P 1 -V tetrapeptide probe series and the P 1 -L tetrapeptide probe series were changed to various types of amino acid functional groups in each series. was designed. Thirteen types of tetrapeptide probes were synthesized based on the HTRA substrate amino acid sequence reported through the results of previous studies and are shown in Table 2 above.

본 발명의 P1-V 테트라 펩타이드 프로브 시리즈는 IRRV-프로브(CF-Ahx-IRRV-DPP), HTRA2 특이적인 것으로 알려진 FIMV-프로브(CF-Ahx-FIMV-DPP), HTRA1 특이적인 것으로 알려진 FKLV-프로브(CF-Ahx-FKLV-DPP), FKGV-프로브(CF-Ahx-FKGV-DPP), 세포막 주위 세린 엔도프로테아제(periplasmic serine endoprotease)에 특이적인 ASPV-프로브(CF-Ahx-ASPV-DPP) 및 HTRA2 기질의 절단위치로 가장 잘 알려진 LFLV-프로브(CF-Ahx-LFLV-DPP)를 합성하고 이에 대한 실험을 수행하였다. The P 1 -V tetrapeptide probe series of the present invention is an IRRV-probe (CF-Ahx-IRRV-DPP), a FIMV-probe known to be HTRA2-specific (CF-Ahx-FIMV-DPP), and a FKLV-probe known to be HTRA1-specific. probe (CF-Ahx-FKLV-DPP), FKGV-probe (CF-Ahx-FKGV-DPP), ASPV-probe specific for periplasmic serine endoprotease (CF-Ahx-ASPV-DPP) and The most well-known LFLV-probe (CF-Ahx-LFLV-DPP) as the cleavage site of HTRA2 substrate was synthesized and an experiment was performed on it.

본 발명의 P1-V 테트라 펩타이드 프로브의 Val(P1 위치)을 Leu으로 치환하여 P1-L 테트라 펩타이드 프로브를 합성하였다. P1-L 테트라 펩타이드 프로브 시리즈는 LFLL-프로브(CF-Ahx-LFLL-DPP), FIML-프로브(CF-Ahx-FIML-DPP), FKLL-프로브(CF-Ahx-FKLL-DPP), FKGL-프로브(CF-Ahx-FKGL-DPP), 및 ASPL-프로브(CF-Ahx-ASPL-DPP)이다. Val (P 1 position) of the P 1 -V tetrapeptide probe of the present invention was substituted with Leu to synthesize a P 1 -L tetrapeptide probe. P 1 -L tetrapeptide probe series are LFLL-Probe (CF-Ahx-LFLL-DPP), FIML-Probe (CF-Ahx-FIML-DPP), FKLL-Probe (CF-Ahx-FKLL-DPP), FKGL- probe (CF-Ahx-FKGL-DPP), and ASPL-probe (CF-Ahx-ASPL-DPP).

상기 P1-V 테트라 펩타이드 프로브 시리즈 및 P1-L 테트라 펩타이드 프로브 시리즈의 C-말단(C-terminal end)에 디페닐포스포네이트(diphenyl phosphonate, DPP) 작용기를 중합시키는 방법으로 HTRA 활성부위의 세린 친핵체(nucleophile)와 선택적으로 작용할 수 있도록 하였으며 N-말단(N-terminus)에는 리포터로서 6-아미노헥사노일(6-aminohexanoyl, Ahx)을 매개로 5(6)-카르복시플루오레신(5(6)-carboxyfluorescein, CF)을 중합시키는 방법으로 형광측정이 가능하도록 하였다. HTRA active site by polymerizing a diphenyl phosphonate (DPP) functional group at the C-terminal end of the P 1 -V tetrapeptide probe series and the P 1 -L tetrapeptide probe series It was made to act selectively with a serine nucleophile, and at the N-terminus, as a reporter, 5(6)-carboxyfluorescein (5() 6)-carboxyfluorescein (CF) was polymerized to enable fluorescence measurement.

2) 세린 프로테아제에 대한 테트라 펩타이드 프로브의 반응성, 선택성 및 용량의존성2) Reactivity, selectivity and dose dependence of tetrapeptide probes for serine proteases

본 발명을 통해 디자인된 상기 P1-V 테트라 펩타이드 프로브 시리즈 및 P1-L 테트라 펩타이드 프로브 시리즈의 반응성 및 선택성은 재조합 HTRA, 세포용해물(lysate) 및 살아있는 세포에서 형광을 측정하는 방법으로 평가하였다. The reactivity and selectivity of the P 1 -V tetrapeptide probe series and the P 1 -L tetrapeptide probe series designed through the present invention were evaluated by measuring fluorescence in recombinant HTRA, cell lysate, and living cells. .

상기 표 2에 합성한 P1-V 테트라 펩타이드 프로브 시리즈 및 P1-L 테트라 펩타이드 프로브 시리즈 선택성을 평가하기 위하여, 인간트립신 1(human trypsin 1), 인간키모트립신 C(human chymotrypsin C, CMT), 호중구 엘라스타제(human neutrophil elastase, NE), HTRA1, HTRA2 및 E.coli 유래 HTRA DegP을 포함하는 재조합 세린 프로테아제(50ng)와 1μM 농도의 상기 프로브를 혼합하고 반응시켰다. 표지된 단백질들은 SDS-PAGE를 이용하여 분리하고 상기 SDS-PAGE상에서 형광을 측정하는 방법으로 확인하였다. In order to evaluate the selectivity of the P 1 -V tetrapeptide probe series and the P 1 -L tetrapeptide probe series synthesized in Table 2, human trypsin 1, human chymotrypsin C (CMT), Neutrophil elastase (human neutrophil elastase, NE), HTRA1, HTRA2, and recombinant serine protease (50ng) containing E. coli- derived HTRA DegP and 1 μM concentration of the probe were mixed and reacted. The labeled proteins were separated using SDS-PAGE and confirmed by measuring fluorescence on the SDS-PAGE.

도 1a에서 보는 바와 같이 HTRA1 및 HTRA2는 유사한 반응프로파일을 보이는 반면, E.coli에서 유래한 DegP의 경우 다른 인간 세린 프로테아제에 대비하여 차별되는 선택성을 보이는 것으로 확인되었다. 특히, P1-V 테트라 펩타이드 프로브 시리즈 중 FIMV-프로브, FKLV-프로브, ASPV-프로브, 및 LFLV-프로브는 HTRA1과 HTRA2 모두에 상대적으로 높은 반응성을 보이는 것으로 확인된 반면, IRRV-프로브 및 FKGV-프로브는 반응성이 확인되지 않았다. P1-L 테트라 펩타이드 프로브 중 LFLL-프로브 및 FIML-프로브은 서로 상응하는 P1-V 테트라 펩타이드 프로브인 LFLV-프로브 및 FIMV-프로브의 반응성과 유사한 것으로 확인된 반면 FKLL-프로브는 서로 상응하는 P1-V 테트라 펩타이드 프로브인 FKLV-프로브보다 낮은 반응성을 보이는 것이 확인되었다. As shown in FIG. 1a , HTRA1 and HTRA2 showed similar response profiles, whereas DegP derived from E. coli was confirmed to show differential selectivity compared to other human serine proteases. In particular, among the P 1 -V tetrapeptide probe series, FIMV-probe, FKLV-probe, ASPV-probe, and LFLV-probe were confirmed to show relatively high reactivity to both HTRA1 and HTRA2, whereas IRRV-probe and FKGV- The probe was not confirmed to be reactive. Among the P 1 -L tetrapeptide probes, the LFLL-probe and the FIML-probe were confirmed to have similar reactivity with the corresponding P 1 -V tetrapeptide probes, the LFLV-probe and the FIMV-probe, whereas the FKLL-probe had the corresponding P 1 It was confirmed that the -V tetrapeptide probe showed a lower reactivity than the FKLV-probe.

흥미롭게도, E.coli에서 유래한 DegP는 HTRA1 및 HTRA2와 달리 FKLV-프로브와 유일하게 반응하는 것이 확인 되었다. P1-L 테트라 펩타이드 프로브 시리즈는 일반적으로 DegP와 반응하지 않는 것으로 알려졌는데 본 발명의 경우 P1 위치의 Leu이 Val으로 치환되면서 반응성이 급격히 증가된 것으로 판단된다. Interestingly, it was confirmed that DegP derived from E. coli reacted uniquely with the FKLV-probe, unlike HTRA1 and HTRA2. It is known that the P 1 -L tetrapeptide probe series does not generally react with DegP. In the present invention, it is determined that the reactivity of the P 1 position is rapidly increased as Leu is substituted with Val.

FKGV-프로브와 FKGL-프로브는 모두 DegP와 반응성이 없는 것이 확인되었다. 상기 결과는 P2 위치에 Gly이 위치하는 기질을 선호한다는 DegP의 기질 특이성에 대한 종래의 결과와 상반되는 것이다. Both the FKGV-probe and the FKGL-probe were confirmed to be non-reactive with DegP. This result is contrary to the previous results for the substrate specificity of DegP, which favored the substrate in which Gly is located at the P 2 position.

본 발명의 P1-V 테트라 펩타이드 프로브 시리즈 및 P1-L 테트라 펩타이드 프로브 시리즈 모두 CMT 및 NE와 어느 정도 교차반응성(cross-reactivity)을 보이는 것을 확인되었으나 P1-V 테트라 펩타이드 프로브 시리즈가 P1-L 테트라 펩타이드 프로브 시리즈에 대비하여 약간 더 높은 선택성을 보이는 것으로 확인되었다. 상기에서 사용한 세린 프로테아제들은 모두 P1 위치에 작은 크기의 소수성 작용기가 위치하는 것을 선호하는 특성이 있다. 따라서 상기 측정된 교차반응성은 어느 정도 예측가능한 수준인 것으로 판단된다. It was confirmed that both the P 1 -V tetrapeptide probe series and the P 1 -L tetrapeptide probe series of the present invention showed some degree of cross-reactivity with CMT and NE, but the P 1 -V tetrapeptide probe series was P 1 It was confirmed to show slightly higher selectivity compared to the -L tetrapeptide probe series. All of the serine proteases used above have a property of favoring that a small hydrophobic functional group is located at the P 1 position. Therefore, it is determined that the measured cross-reactivity is at a predictable level to some extent.

상기 프로브에 대한 용량의존성(dose dependency)을 확인하기 위하여 HTRA 단백질들에 가장 높은 선택성을 가지고 있으며 다른 세린 프로테아제에 대해 가장 작은 반응성을 보이는 두 가지의 테트라 펩타이드 프로브를 선택하였다. 상기 두 가지의 테트라 펩타이드 프로브는 LFKV-프로브와 FKLV-프로브이다. 상기 LFKV-프로브는 HTRA1 및 HTRA에 사용하였으며 상기 FKLV-프로브는 DegP에 사용하였다. In order to confirm the dose dependency on the probe, two tetrapeptide probes having the highest selectivity for HTRA proteins and the least reactivity with other serine proteases were selected. The two tetrapeptide probes are LFKV-probe and FKLV-probe. The LFKV-probe was used for HTRA1 and HTRA, and the FKLV-probe was used for DegP.

용량의존성(dose dependency)의 확인을 위하여 서로 다른 농도의 상기 세린 프로테아제와 테트라 펩타이드 프로브를 조합하여 혼합하는 방법으로 단백질-표지 실험(Protein-labeling experiment)을 수행하였다. In order to confirm the dose dependency, a protein-labeling experiment was performed by combining and mixing different concentrations of the serine protease and the tetrapeptide probe.

테트라 펩타이드 프로브의 농도를 고정시키고 세린 프로테아제의 농도를 증가시키거나 세린 프로테아제의 농도를 고정시키고 테트라 펩타이드 프로브의 농도를 증가시켜 실험한 결과, 상기 테트라 펩타이드 프로브는 세린프로테아제와 용량의존적으로 반응하는 것으로 확인되었다(도 2b 참조).As a result of the experiment by fixing the concentration of the tetrapeptide probe and increasing the concentration of the serine protease, or by fixing the concentration of the serine protease and increasing the concentration of the tetrapeptide probe, it was confirmed that the tetrapeptide probe reacts with the serine protease in a dose-dependent manner. (see Figure 2b).

3) 살아있는 세포에서의 테트라 펩타이드 프로브의 반응성, 선택성 및 용량의존성3) Reactivity, selectivity and dose dependence of tetrapeptide probes in living cells

HeLa 세포를 이용하여 상기 합성한 프로브의 HTRA에 대한 선택성 및 반응성을 확인하였으며 실험을 통해 표지된 HTRA 단백질들은 겔상에서 형광을 측정하는 방법으로 분석하였다. The selectivity and reactivity of the synthesized probe to HTRA were confirmed using HeLa cells, and the HTRA proteins labeled through the experiment were analyzed by measuring fluorescence on a gel.

실험결과, HTRA1이 50kDa에서 강한 밴드로 확인되었다(도 2a 참조). 이 결과는 P1-V 테트라 펩타이드 프로브 시리즈, 특히 FKLV-프로브, ASPV-프로브, 및 LFLV-프로브가 살아있는 세포에서 HTRA1과 선택적으로 상호작용하는 것을 의미한다. 살아있는 세포내에서 프로브의 반응성은 재조합 단백질에 대한 반응성에 대비하여 차이가 있는 것이 확인되는데 이는 살아있는 세포에서 실험할 경우, 세포내 환경 및 프로브의 세포막 투과도에 의해 프로브의 반응성이 영향을 받기 때문으로 판단된다. 표지된 HTRA1 단백질에 대한 검증은 HTRA1 항체를 이용한 면역침강방법으로 확인하였다. As a result of the experiment, it was confirmed that HTRA1 was a strong band at 50 kDa (see FIG. 2a ). This result indicates that the P 1 -V tetrapeptide probe series, especially the FKLV-probe, ASPV-probe, and LFLV-probe, selectively interacts with HTRA1 in living cells. It is confirmed that there is a difference in the reactivity of the probe in living cells compared to the reactivity to the recombinant protein. do. Validation of the labeled HTRA1 protein was confirmed by the immunoprecipitation method using the HTRA1 antibody.

실험결과, P1-L 테트라 펩타이드 프로브 시리즈는 다중 밴드를 보이는 성향이 확인된다(도 3a 참조). 이 결과는 프로브가 높은 소수성 성질로 인해 낮은 용해도를 가지므로 단백질과 지질이 비특이적으로 결합되었기 때문으로 판단된다. 상기 비특이적 결합은 반복적인 세척(washing)으로 인해 밴드의 강도가 희미해지는 결과에 의해 지지된다. As a result of the experiment, the P 1 -L tetrapeptide probe series has a tendency to show multiple bands (see FIG. 3a ). This result is considered to be due to the non-specific binding of proteins and lipids because the probe has low solubility due to its high hydrophobicity. The non-specific binding is supported by the result that the band's intensity fades due to repeated washing.

HeLa 세포에서는 미토콘드리아 HTRA2(36KDa)에 대한 밴드가 확인되지 않았다. 본 발명의 프로브로 미토콘드리아 HTRA2를 확인하지 못한 이유는 두 가지로 설명 가능하다. 첫 번째는 본 발명의 프로브가 미토콘드리아의 지질층을 통과하지 못하였기 때문이며, 두 번째는 HeLa 세포의 미토콘드리아 HTRA2의 활성도가 너무 낮아 측정이 불가하였기 때문이다. 본 발명에서는 상기 합성한 프로브가 복합단백질체(complex proteome)에 포함된 미토콘드리아 HTRA2를 선택적으로 표지할 수 있는지 확인하기 위하여 미토콘드리아 HTRA2가 높은 수준으로 발현되는 것으로 알려진 인간 신경아세포증 세포주(human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y 세포)를 이용하여 실험을 수행하였다. 살아있는 SH-SY5Y 세포 및 SH-SY5Y 세포의 용해물(lysate)에 LFLV-프로브를 첨가하여 혼합하고 SDS-PAGE 상에서 분리한 후 형광을 측정하는 방법으로 상기 LFLV-프로브가 미토콘드리아 HTRA2를 선택적으로 표지하는지 확인하였다. 실험결과, 살아있는 SH-SY5Y 세포에서는 아무런 활성이 확인되지 않은 반면, SH-SY5Y 세포용해물에서는 단량체(monomeric) 활성 HTRA2(36KDa) 및 삼량체(trimeric) 활성 HTRA2(105KDa)가 모두 표지되는 것으로 확인되었다(도 2c 참조). 상기 결과는 상기 LFLV-프로브가 살아있는 세포에서는 미토콘드리아의 지질층을 통과하지 못하였기 때문에 미토콘드리아 내부의 HTRA2와 결합할 수 없었으나, 세포막과 미토콘드리아막이 모두 제거된 세포용해물에서는 미토콘드리아에서 방출된 HTRA2와 직접 반응한 것으로 판단된다.In HeLa cells, a band for mitochondrial HTRA2 (36KDa) was not identified. The reason for not confirming mitochondrial HTRA2 with the probe of the present invention can be explained in two ways. The first is that the probe of the present invention did not pass through the lipid layer of mitochondria, and the second is that the activity of mitochondrial HTRA2 in HeLa cells was too low to measure. In the present invention, in order to check whether the synthesized probe can selectively label mitochondrial HTRA2 included in the complex proteome, a human neuroblastoma cell line (SH) known to express high levels of mitochondrial HTRA2 -SY5Y cells) were used for experiments. LFLV-probe is added to the lysate of live SH-SY5Y cells and SH-SY5Y cells, mixed, separated on SDS-PAGE, and fluorescence is measured. Whether the LFLV-probe selectively labels mitochondrial HTRA2 Confirmed. As a result of the experiment, no activity was confirmed in live SH-SY5Y cells, whereas both monomeric active HTRA2 (36KDa) and trimeric active HTRA2 (105KDa) were confirmed in SH-SY5Y cell lysate. (see Figure 2c). The above result was that the LFLV-probe could not bind to HTRA2 inside the mitochondria because it did not pass through the lipid layer of mitochondria in living cells. is considered to have been

4) 테트라 펩타이드 프로브를 이용한 HTRA1 활성측정 및 이를 이용한 알츠하이머병의 초기진단 가능성4) Measurement of HTRA1 activity using tetrapeptide probe and possibility of early diagnosis of Alzheimer's disease using the same

HTRA1은 알츠하이머병의 발병에 밀접한 관련이 있다. HTRA1은 알츠하이머병에 관련된 아밀로이드 전구 단백질(amyloid precursor protein, APP), 베타 아밀로이드 응집체(amyloid β aggregate), 및 타우 섬유단백질(tau fibril)을 분해한다는 결과가 보고된 바 있다. 본 발명에서는 상기 합성한 P1-V 테트라 펩타이드 프로브 시리즈 및 P1-L 테트라 펩타이드 프로브 시리즈를 이용하여 세린 프로테아제 재조합 단백질 용액, 고정된 세포, 및 조직섹션(tissue section)에서의 HTRA1 활성을 측정하는 실험을 수행하였다. 그 결과 본 발명의 테트라 펩타이드 프로브를 이용하여 살아있는 세포의 HTRA1 활성을 측정하고 이를 분석하면, HTRA1과 알츠하이머 병의 관계를 이해하는 데 중요한 역할을 할 수 있을 것으로 판단되었다. HTRA1 is closely related to the pathogenesis of Alzheimer's disease. It has been reported that HTRA1 degrades Alzheimer's disease-associated amyloid precursor protein (APP), beta amyloid β aggregate, and tau fibril. In the present invention, HTRA1 activity is measured in a serine protease recombinant protein solution, fixed cells, and tissue section using the synthesized P 1 -V tetrapeptide probe series and P 1 -L tetrapeptide probe series. Experiments were performed. As a result, it was determined that HTRA1 activity in living cells was measured and analyzed using the tetrapeptide probe of the present invention, which could play an important role in understanding the relationship between HTRA1 and Alzheimer's disease.

본 발명에서는 신경퇴행성 질환연구에 광범위하게 사용되는 악성신경교종세포주인 U-87MG 세포를 이용하여 HTRA1 활성을 측정하였다. 또한 알츠하이머병과 유사한 병리학적 특성을 가진 세포를 제조하고 이를 이용하여 HTRA1에 대한 실험을 수행하기 위하여 강력한 신경독소인 카이닉산(kainic acid), 단백질 인산가수분해효소의 저해제로서 타우 과인산화를 유도하는 오카다산(okadaic acid), 및 알츠하이머병의 원인물질인 Aβ1-42를 사용하였다. HTRA1의 활성을 확인하기 위하여, 상기 세포에 LFLV-프로브를 처리하고 형광현미경을 이용하여 HTRA1의 활성을 확인하였다.In the present invention, HTRA1 activity was measured using U-87MG cells, a malignant glioma cell line widely used in neurodegenerative disease research. In addition, Okada induces hyperphosphorylation of tau as an inhibitor of kainic acid, a strong neurotoxin, and protein phosphatase, in order to prepare cells with pathological characteristics similar to Alzheimer's disease and use them to conduct experiments on HTRA1. Acid (okadaic acid) and Aβ 1-42 , a causative agent of Alzheimer's disease, were used. In order to confirm the activity of HTRA1, the cells were treated with an LFLV-probe and the activity of HTRA1 was confirmed using a fluorescence microscope.

U-87MG 세포에 카이닉산 또는 오카다산을 처리한 결과, U-87MG 세포의 성장 및 형태에 심각한 영향을 주는 것으로 확인되었다. 그러나 U-87MG 세포에 디메틸술폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO) 또는 Aβ1-42만을 처리한 결과, 세포의 활성에 아무런 영향도 주지 못하는 것이 확인되었다(도 4a 참조). 참도로 DMSO는 카이닉산, 오카다산, 및 Aβ1-42를 세포내로 운반하는 운반체로 사용된다. As a result of treating U-87MG cells with kainic acid or okadaic acid, it was confirmed that the growth and morphology of U-87MG cells were severely affected. However, as a result of treating U-87MG cells with dimethyl sulfoxide (DMSO) or Aβ 1-42 only, it was confirmed that there was no effect on cell activity (see FIG. 4a ). As a matter of fact, DMSO is used as a carrier for intracellular transport of chynic acid, okadaic acid, and Aβ 1-42.

실험결과에 따르면, LFLV와 DMSO를 동시에 처리한 U-87MG 세포, LFLV와 카이닉산을 함께 처리한 U-87MG 세포, 및 LFLV와 오카다산을 함께 처리한U-87MG 세포는 중간 정도의 낮은 형광세기를 보이는 것이 확인되었다. 이에 반하여, LFLV-프로브와 Aβ1-42를 동시에 처리한 U-87MG 세포는 가장 강한 형광세기를 보이는 것이 확인되었다(도 4b 참조). 또한 Aβ1-42가 처리된 U-87MG 세포의 용해물(lysate)을 분석한 결과, 활성 HTRA1에 해당하는 밴드(50KDa)가 강하게 표지된 것이 확인되었는데, 특히 표지된 밴드의 형광신호를 정량화하여 분석한 결과, Aβ1-42에 노출된 세포들에서 약 3.8배정도 향상된 신호세기를 나타냈다(도4c 참조). 상기 결과들은 U-87MG 세포와 같은 성상세포(astrocyte)가 긴 기간 동안 높은 수준으로 Aβ1-42에 노출되면 HTRA1이 활성화된다는 것을 보여준다. 성상세포는 알츠하이머병의 발병과 관계되어 있으며 Aβ 응집체의 제거에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 Aβ1-42의 축적으로 인한 HTRA1의 활성증가는 알츠하이머병의 초기 진단용 바이오마커로서 활용 가능할 것으로 판단된다. According to the experimental results, U-87MG cells treated with LFLV and DMSO simultaneously, U-87MG cells treated with LFLV and chynic acid, and U-87MG cells treated with LFLV and okadaic acid had moderately low fluorescence intensity. was confirmed to be visible. In contrast, it was confirmed that U-87MG cells treated with the LFLV-probe and Aβ 1-42 simultaneously showed the strongest fluorescence intensity (see FIG. 4b ). In addition , as a result of analyzing the lysate of U-87MG cells treated with Aβ 1-42 , it was confirmed that the band (50KDa) corresponding to active HTRA1 was strongly labeled. In particular, the fluorescence signal of the labeled band was quantified. As a result of the analysis, the signal intensity was improved by about 3.8 times in the cells exposed to Aβ 1-42 (see Fig. 4c). The above results show that HTRA1 is activated when astrocytes such as U-87MG cells are exposed to high levels of Aβ 1-42 for a long period of time. Astrocytes are involved in the pathogenesis of Alzheimer's disease and are known to play an important role in the clearance of Aβ aggregates. Therefore, it is judged that the increase in HTRA1 activity due to the accumulation of Aβ 1-42 can be utilized as a biomarker for early diagnosis of Alzheimer's disease.

추가적으로 활성 HTRA1의 세포내 위치를 확인하기 위하여 다양한 세포주에서 공초점현미경을 이용한 라이브-세포 이미징 실험을 수행하였다. 도 5a는 LFLV-프로브와 미토콘드리아 형광 마커인 Miotraccker를 HeLa 세포에 처리한 후 수득한 형광이미지를 보여준다. 실험결과, 활성 HTRA1에 해당하는 녹색형광신호가 강하게 확인되었다. 상기 형광신호는 세포질에서 고르게 확인된 반면, 미토콘드리아와 그 신호가 겹쳐지지 않는 특징을 보였다. U-87MG 세포의 경우, 동일한 실험조건으로 수행하였음에도 HeLa 세포와 달리, 형광세기가 더 약한 것으로 확인되었다(도 5a 및 b 참조). Additionally, in order to confirm the intracellular localization of active HTRA1, live-cell imaging experiments using confocal microscopy were performed in various cell lines. Figure 5a shows a fluorescence image obtained after treating HeLa cells with the LFLV-probe and Miotraccker, a mitochondrial fluorescent marker. As a result of the experiment, a green fluorescence signal corresponding to active HTRA1 was strongly confirmed. While the fluorescence signal was uniformly identified in the cytoplasm, the signal did not overlap with the mitochondria. In the case of the U-87MG cells, it was confirmed that the fluorescence intensity was weaker, unlike the HeLa cells, even though it was performed under the same experimental conditions (see FIGS. 5a and b).

흥미롭게도 Aβ1-42가 전처리된 U-87MG 세포의 경우 세포질과 세포막에서 HTRA1의 활성이 확인되었다(도 5c 참조). 상기 결과는 활성 HTRA1이 세포외로 분비된다는 것을 의미하며 상기 처리를 통해 확인된 HTRA1의 세포외 분비 및 세포내 활성의 증가는 HTRA1이 알츠하이머병의 초기 진단용 바이오마커로서 사용 가능하다는 것을 의미한다. Interestingly, in the case of U-87MG cells pretreated with Aβ 1-42 , HTRA1 activity was confirmed in the cytoplasm and cell membrane (see Fig. 5c). The above results indicate that active HTRA1 is secreted extracellularly, and the increase in extracellular secretion and intracellular activity of HTRA1 confirmed through the above treatment means that HTRA1 can be used as a biomarker for early diagnosis of Alzheimer's disease.

5) 테트라 펩타이드 프로브를 이용한 미코콘드리아 HTRA2의 활성 측정 및 이를 이용한 5) Measurement of mycochondrial HTRA2 activity using a tetrapeptide probe and using the same

본 발명의 LFLV-프로브를 이용하는 경우 활성 HTRA2의 표지는 세포용해물 또는 미토콘드리아 분획(fraction)에서만 확인될 뿐 살아있는 HeLa 세포 또는 SH-SY5Y 세포에서는 확인되지 않았다. 상기 결과는 LFLV-프로브가 미토콘드리아막을 통과하여 그 내막 공간(mitochondrial intermembrane space)에 위치하는 활성 HTRA2에 도달하여 표지할 수 없다는 것을 의미한다. 따라서 살아있는 세포에서 미토콘드리아 HTRA2 활성을 확인하기 위해서는 LFLV-프로브를 미토콘드리아로 이동시키는 수단이 필요한 것으로 판단된다. 이에 본 발명에서는 LFLV-프로브에 미토콘드리아-표적 모이어티(mitochondria-targeting moiety)를 중합하였다. In the case of using the LFLV-probe of the present invention, active HTRA2 labeling was confirmed only in cell lysates or mitochondrial fractions, but not in live HeLa cells or SH-SY5Y cells. This result means that the LFLV-probe cannot label active HTRA2 located in the mitochondrial intermembrane space through the mitochondrial membrane. Therefore, in order to confirm the mitochondrial HTRA2 activity in living cells, it is considered that a means for moving the LFLV-probe to the mitochondria is necessary. Therefore, in the present invention, the LFLV-probe was polymerized with a mitochondria-targeting moiety.

본 발명에서 사용한 미토콘드리아-표적 모이어티는 두 가지이다. 첫 번째 모이어티는 본 발명자가 개발한 미토콘드리아 타겟팅 펩토이드(mitochondria-targeting peptoid, MTP)이며 두 번째는 이미 잘 알려진 트리페닐포스포늄(triphenylphosphonium, TPP)이다. 상기 MTP-LFLV-프로브 및 TPP-LFLV-프로브는 시스테인-말레이미드 컨쥬게이션(cysteine-maleimide conjugation)을 통하여 상기 미토콘드리아 타겟팅 모이어티(MTP 및 TPP)와 LFLV-프로브를 중합한 것이다. There are two mitochondrial-targeting moieties used in the present invention. The first moiety is a mitochondria-targeting peptoid (MTP) developed by the present inventors, and the second is a well-known triphenylphosphonium (TPP). The MTP-LFLV-probe and the TPP-LFLV-probe are obtained by polymerizing the mitochondrial targeting moieties (MTP and TPP) and the LFLV-probe through cysteine-maleimide conjugation.

상기 MTP-LFLV-프로브 및 TPP-LFLV-프로브가 미토콘드라의 활성 HTRA2를 표지하는지 확인하기 위하여 SH-SY5Y 세포에 상기 MTP-LFLV-프로브 및 TPP-LFLV-프로브를 처리한 후 공초점 현미경을 이용하여 라이브-세포 이미지를 수득하였다. In order to check whether the MTP-LFLV-probe and the TPP-LFLV-probe label mitochondrial active HTRA2, SH-SY5Y cells were treated with the MTP-LFLV-probe and the TPP-LFLV-probe, followed by confocal microscopy. was used to obtain live-cell images.

실험결과, LFLV-프로브만을 처리한 SH-SY5Y 세포에서는 형광이미지가 확인되지 않았다. 그러나 MTP-LFLV-프로브의 경우 LFLV-프로브(10μM)보나 낮은 농도인 5μM을 처리하였음에도 강한 형광신호가 확인되었다(도 6a 참조). MTP-LFLV-프로브의 녹색 형광신호는 주로 Mitotracker의 붉은 형광신호와 겹치는 것으로 확인되는데 이는 MTP-LFLV-프로브로 표지된 활성 HTRA2가 미토콘드리아에 위치한다는 것을 의미한다(도 6b 참조). As a result of the experiment, no fluorescence image was observed in SH-SY5Y cells treated with LFLV-probe only. However, in the case of the MTP-LFLV-probe, a strong fluorescence signal was confirmed even when the LFLV-probe (10 μM) was treated with a lower concentration of 5 μM (see FIG. 6a ). The green fluorescence signal of the MTP-LFLV-probe mainly overlaps the red fluorescence signal of the Mitotracker, which means that the active HTRA2 labeled with the MTP-LFLV-probe is located in the mitochondria (see Fig. 6b).

이와 반대로, TPP-LFLV-프로브는 상대적으로 약한 녹색 형광신호를 보였다. 5μM의 농도의 TPP-LFLV-프로브를 시험한 결과, 용해도가 낮았으며 세포 형태 및 생존력에 영향을 주는 것으로 확인되었다. 상기 결과는 TPP-LFLV-프로브는 펩타이드 구조를 갖는 LFLV프로브를 효율적으로 미토콘드리아로 수송하지 못하였으며, 사용한 농도에서 세포독성이 있음을 의미한다.In contrast, the TPP-LFLV-probe showed a relatively weak green fluorescence signal. As a result of testing the TPP-LFLV-probe at a concentration of 5 μM, the solubility was low and it was confirmed that the cell morphology and viability were affected. The above results indicate that the TPP-LFLV-probe did not efficiently transport the LFLV probe having a peptide structure to the mitochondria, and was cytotoxic at the concentration used.

6) 결론 6) Conclusion

본 발명은 인간 HTRA1, 인간 HTRA2 및 E.coli HTRA/DegP에 대한 활성기반 테트라 펩타이드 프로브에 관한 것이다. 실험결과, 상기 테트라 펩타이드 프로브들은 용량의존적이며 선택적으로 HTRA과 반응을 하는 것이 확인되었으며 상기 테트라 펩타이드 프로브들의 반응성 및 특이성은 재조합 HTRA 단백질, 세포용해물 및 살아있는 세포를 통하여 검증되었다. 상기 테트라 펩타이드 프로브 중 LFLV-프로브는 살아있는 HeLa세포와 U-87MG 세포의 활성 HTRA1을 선택적으로 표지하는 것이 확인되었으며 SH-SY5Y 세포용해물에서도 활성 HTRA2를 선택적으로 표지하는 것이 확인되었다.The present invention relates to an activity-based tetrapeptide probe for human HTRA1, human HTRA2 and E. coli HTRA/DegP. As a result of the experiment, it was confirmed that the tetrapeptide probes reacted selectively with HTRA in a dose-dependent manner, and the reactivity and specificity of the tetrapeptide probes were verified through recombinant HTRA protein, cell lysate and live cells. Among the tetrapeptide probes, it was confirmed that the LFLV-probe selectively labels active HTRA1 in live HeLa cells and U-87MG cells, and it was also confirmed that the LFLV-probe selectively labels active HTRA2 in the SH-SY5Y cell lysate.

LFLV-프로브는 미토콘드리아 내막 공간으로 침투하는 것이 불가능한 것으로 확인되었다. LFLV-프로브는 미토콘드리아 타겟팅 모이어티가 컨쥬게이션된 MTP-LFLV-프로브로 제조하게 되면, 살아있는 SH-SY5Y 세포의 미토콘드리아 내부로 침투가 가능하며 이를 통하여 미토콘드리아의 활성 HTRA2를 선택적으로 표지할 수 있는 것이 확인 되었다. It was confirmed that the LFLV-probe was unable to penetrate into the mitochondrial intima space. When the LFLV-probe is prepared with MTP-LFLV-probe conjugated with a mitochondrial targeting moiety, it is possible to penetrate into the mitochondria of live SH-SY5Y cells, confirming that it is possible to selectively label mitochondrial active HTRA2 became

특히, 본 발명의 테트라 펩타이드 프로브를 이용한 광학 이미징 분석방법 및 SDS-PAGE 분석방법을 통하여 Aβ1-42에 장기간 노출된 U-87MG 성상세포의 HTRA1 활성이 고도로 상승된다는 것이 확인되었다. 상기 결과는 본 발명의 테트라 펩타이드 프로브를 이용하여 측정방법이 HTRA1의 세포외 분비에 수반되는 세포질내 효소 단백질의 폭발적인 활성증가를 측정할 수 있으므로 알츠하이머병 초기 진단에 유용한 바이오마커로서 사용될 수 있다는 것을 의미한다. In particular, it was confirmed that the HTRA1 activity of U-87MG astrocytes exposed to Aβ 1-42 for a long period of time was highly elevated through the optical imaging analysis method and the SDS-PAGE analysis method using the tetrapeptide probe of the present invention. The above results indicate that the measurement method using the tetrapeptide probe of the present invention can measure the explosive increase in the activity of the intracytoplasmic enzyme protein involved in the extracellular secretion of HTRA1, so that it can be used as a useful biomarker for early diagnosis of Alzheimer's disease. do.

HTRA1의 활성은 기질-유도 리모델링(substrate-induced remodeling)을 통하여 조절되는 것으로 알려져 있으며 세포실험 수준에서 Aβ1-42가 HTRA1의 잠재적인 기질이라는 결과가 보고된 바 있을 뿐 실제 살아있는 세포에서 증명된 바는 없었다. 본 발명은 상기 결과를 살아있는 세포 수준에서 실험적으로 증명한 최초의 결과라는 점에서 의미가 있다. 본 발명에서는 HTRA에 특이적인 테트라 펩타이드 프로브를 제공한다. 상기 HTRA 특이 테트라 펩타이드 프로브는 잠재적인 바이오마커를 발굴하는데 사용 가능하며, HTRA의 활성 변화를 모니터링하는 방법으로 알츠하이머병 초기 진단 및 이와 관련된 생화학 경로 및 기작연구에 유용하게 사용 될 수 있을 뿐 아니라 다양한 타입의 살아있는 세포 및 세포기반 질병모델에서 세포내 위치를 확인하는데 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한 본 발명의 테트라 펩타이드 프로브들은 HTRA의 효소활성을 정량적으로 분석할 수 있을 뿐 아니라 HTRA에 대한 정성적 스크린 어세이에도 활용 가능하므로 새로운 질환진단용 바이오마커를 발굴하는데 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다. The activity of HTRA1 is known to be regulated through substrate-induced remodeling, and it has been reported that Aβ 1-42 is a potential substrate for HTRA1 at the level of cellular experiments, but it has been proven in real living cells. there was no The present invention is meaningful in that it is the first result to experimentally prove the above results at the level of living cells. The present invention provides a tetrapeptide probe specific for HTRA. The HTRA-specific tetrapeptide probe can be used to discover potential biomarkers, and as a method of monitoring changes in HTRA activity, it can be usefully used for early diagnosis of Alzheimer's disease and related biochemical pathways and mechanisms, as well as various types It is expected that it will be usefully used to confirm the intracellular localization in living cells and cell-based disease models of In addition, since the tetrapeptide probes of the present invention can not only quantitatively analyze the enzymatic activity of HTRA, but also can be used in a qualitative screen assay for HTRA, it is expected that they will be usefully used to discover new biomarkers for diagnosis of diseases.

본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다. The specific examples described herein are meant to represent preferred embodiments or examples of the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereby. It will be apparent to those skilled in the art that modifications and other uses of the present invention do not depart from the scope of the invention as set forth in the claims herein.

Claims (11)

HTRA(high temperature requirement A)의 기질 결합 도메인과 공유결합하는 테트라 펩타이드(tetra peptide);
상기 테트라 펩타이드의 C-말단(terminal)에 중합된 디페닐포스포네이트(diphenyl phosphonate) 작용기; 및
상기 테트라 펩타이드의 N-말단(terminal)에 중합된 형광표지;
를 포함하는 HTRA 활성 기반 HTRA 검출용 펩타이드 프로브로서,
상기 테트라 펩타이드는 C-말단으로부터 P1, P2, P3, 및 P4 아미노산 위치를 가지며 상기 P1 위치는 Valine 또는 Leucine인 것을 특징으로 하되,
상기 P1 위치가 Valine인 테트라 펩타이드의 아미노산 시퀸스는 Phenylalanine-Isoleucine-Methionine-Valine(FIMV), Phenylalanine-Lysine-Leucine-Valine(FKLV), Alanine-Serine-Proline-Valine(ASPV), 또는 Leucine-Isoleucine-Phenylalanine-Valine(LFLV)인 것을 특징으로 하며,
상기 P1 위치가 Leucine인 테트라 펩타이드의 아미노산 시퀸스는 Leucine-Phenylalanine-Leucine-Leucine(LFLL), Phenylalanine-Isoleucine-Methionine-Leucine(FIML), 또는 Alanine-Serine-Proline-Leucine(ASPL)인 것을 특징으로 하는 HTRA 활성 기반 HTRA 검출용 펩타이드 프로브.
tetra peptide covalently bound to the substrate binding domain of HTRA (high temperature requirement A);
a diphenyl phosphonate functional group polymerized at the C-terminal of the tetrapeptide; and
a fluorescent label polymerized to the N-terminal of the tetrapeptide;
As a peptide probe for HTRA activity-based HTRA detection comprising a,
The tetrapeptide has P1, P2, P3, and P4 amino acid positions from the C-terminus, and wherein the P1 position is Valine or Leucine,
The amino acid sequence of the tetrapeptide in which the P1 position is Valine is Phenylalanine-Isoleucine-Methionine-Valine (FIMV), Phenylalanine-Lysine-Leucine-Valine (FKLV), Alanine-Serine-Proline-Valine (ASPV), or Leucine-Isoleucine- It is characterized in that it is Phenylalanine-Valine (LFLV),
The amino acid sequence of the tetrapeptide in which the P1 position is Leucine is Leucine-Phenylalanine-Leucine-Leucine (LFLL), Phenylalanine-Isoleucine-Methionine-Leucine (FIML), or Alanine-Serine-Proline-Leucine (ASPL), characterized in that A peptide probe for HTRA detection based on HTRA activity.
 삭제delete 삭제delete 제 1 항에 있어서, 상기 디페닐포스포네이트(diphenyl phosphonate) 작용기는 상기 HTRA 활성부위(active site)의 세린 친핵체(serine nucleophile)를 선택적으로 인식하여 결합하는 것을 특징으로 하는 HTRA 활성 기반 HTRA 검출용 펩타이드 프로브.
The method of claim 1, wherein the diphenyl phosphonate functional group selectively recognizes and binds to a serine nucleophile of the HTRA active site. peptide probe.
 제 1 항에 있어서, 상기 형광표지는 6-아미노헥사노일(6-aminohexanoyl)을 매개로 중합된 5(6)-카르복시플루오레신(5(6)-carboxyfluorescein)인 것을 특징으로 하는 HTRA 활성 기반 HTRA 검출용 펩타이드 프로브.
According to claim 1, wherein the fluorescent label is 6-aminohexanoyl (6-aminohexanoyl) based on 5 (6) -carboxyfluorescein (5 (6) -carboxyfluorescein) polymerized via HTRA activity, characterized in that Peptide probe for HTRA detection.
 제 1 항에 있어서, 상기 HTRA는 인간 HTRA1, 인간 HTRA2 또는 미생물 유래 HTRA인 것을 특징으로 하는 HTRA 활성 기반 HTRA 검출용 펩타이드 프로브.
The peptide probe for HTRA detection based on HTRA activity according to claim 1, wherein the HTRA is human HTRA1, human HTRA2, or microorganism-derived HTRA.
 제 1 항 및 제 4 항 내지 6항의 어느 한 항에 있어서, 상기 HTRA 활성 기반 HTRA 검출용 펩타이드 프로브는 세포막을 통과하여 인간 세포내에 존재하는 인간 HTRA1 또는 미생물 세포내에 존재하는 미생물 유래 HTRA의 활성을 측정하는 것을 특징으로 하는 HTRA 활성 기반 HTRA 검출용 펩타이드 프로브.
[Claim 7] The method of any one of claims 1 and 4 to 6, wherein the HTRA activity-based peptide probe for detecting HTRA passes through a cell membrane and measures the activity of human HTRA1 present in human cells or HTRA derived from microorganisms present in microbial cells. A peptide probe for HTRA detection based on HTRA activity, characterized in that
 제 1 항에 있어서, 상기 테트라 펩타이드의 N-말단(terminal)에 미토콘드리아 타겟팅 모이어티(moiety)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 HTRA 활성 기반 HTRA 검출용 펩타이드 프로브.
The peptide probe for HTRA activity-based HTRA detection according to claim 1, further comprising a mitochondrial targeting moiety at the N-terminal of the tetrapeptide.
 제 8 항에 있어서, 상기 미토콘드리아 타겟팅 모이어티는 미토콘드리아 타겟팅 펩토이드(mitochondria-targeting peptoid) 또는 트리페닐포스포늄(triphenylphosphonium)인 것을 특징으로 하는 HTRA 활성 기반 HTRA 검출용 펩타이드 프로브.
The peptide probe for HTRA detection based on HTRA activity according to claim 8, wherein the mitochondrial targeting moiety is a mitochondria-targeting peptoid or triphenylphosphonium.
 제 8항 내지 9항의 어느 한 항에 있어서, 상기 HTRA 활성 기반 HTRA 검출용 펩타이드 프로브는 세포막과 미토콘드리아막을 통과하여 미토콘드리아 내부에 존재하는 인간 HTRA2의 활성을 측정하는 것을 특징으로 하는 HTRA 활성 기반 HTRA 검출용 펩타이드 프로브.
The method according to any one of claims 8 to 9, wherein the peptide probe for HTRA detection based on HTRA activity passes through the cell membrane and the mitochondrial membrane and measures the activity of human HTRA2 present in the mitochondria. peptide probe.
 제 1 항의 HTRA 활성 기반 HTRA 검출용 펩타이드 프로브를 포함하는 HTRA 활성 측정용 조성물.
A composition for measuring HTRA activity comprising the peptide probe for HTRA activity-based HTRA detection of claim 1.
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004531731A (en) * 2001-05-31 2004-10-14 ザ トラスティーズ オブ プリンストン ユニバーシテイ Assays for identifying IAP binding peptides and compounds that bind to IAP
JP2015528573A (en) * 2012-09-05 2015-09-28 ジュリア リウ， Methods and compositions for detecting enterocyte barrier dysfunction
KR101609451B1 (en) * 2014-05-21 2016-04-06 한양대학교 에리카산학협력단 Simultaneous detection method of three mycoplasma species using PNA probe and FMCA
KR20180040192A (en) * 2016-10-11 2018-04-20 한양대학교 산학협력단 Polyvalent directed peptide polymer for Using in Detection for Amyloid beta 42
KR20180065747A (en) * 2016-12-08 2018-06-18 서울대학교산학협력단 Nano graphene bio-sensor comprising hyaluronic acid or cell penetrating peptide-loaded graphene oxide
KR20180065748A (en) * 2016-12-08 2018-06-18 서울대학교산학협력단 Composition for detecting nucleotide in exosome comprising nano graphene sensor
KR20190015947A (en) * 2017-08-07 2019-02-15 한양대학교 산학협력단 Peptide probe for detecting amyloid beta

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004531731A (en) * 2001-05-31 2004-10-14 ザ トラスティーズ オブ プリンストン ユニバーシテイ Assays for identifying IAP binding peptides and compounds that bind to IAP
JP2015528573A (en) * 2012-09-05 2015-09-28 ジュリア リウ， Methods and compositions for detecting enterocyte barrier dysfunction
KR101609451B1 (en) * 2014-05-21 2016-04-06 한양대학교 에리카산학협력단 Simultaneous detection method of three mycoplasma species using PNA probe and FMCA
KR20180040192A (en) * 2016-10-11 2018-04-20 한양대학교 산학협력단 Polyvalent directed peptide polymer for Using in Detection for Amyloid beta 42
KR20180065747A (en) * 2016-12-08 2018-06-18 서울대학교산학협력단 Nano graphene bio-sensor comprising hyaluronic acid or cell penetrating peptide-loaded graphene oxide
KR20180065748A (en) * 2016-12-08 2018-06-18 서울대학교산학협력단 Composition for detecting nucleotide in exosome comprising nano graphene sensor
KR20190015947A (en) * 2017-08-07 2019-02-15 한양대학교 산학협력단 Peptide probe for detecting amyloid beta

Non-Patent Citations (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. Tennstaedt, S. Popsel, L. Truebestein, P. Hauske, A. Brockmann, N. Schmidt, I. Irle, B. Sacca, C. M. Niemeyer, R. Brandt, H. Ksiezak-Reding, A. L. Tirniceriu, R. Egensperger, A. Baldi, L. Dehmelt, M. Kaiser, R. Huber, T. Clausen and M. Ehrmann, J. Biol. Chem., 2012, 287, 20931-20941.
B. Hoy, T. Geppert, M. Boehm, F. Reisen, P. Plattner, G. Gadermaier, N. Sewald, F. Ferreira, P. Briza, G. Schneider, S. Backert and S. Wessler, J. Biol. Chem., 2012, 287, 10115-10120.
C. Dlle, I. Flønes, G. S. Nido, H. Miletic, N. Osuagwu, S. Kristoffersen, P. K. Lilleng, J. P. Larsen, O.-B. Tysnes, K. Haugarvoll, L. A. Bindoff and C. Tzoulis, Nat. Comm., 2016, 7, 13548.
C. Eigenbrot, M. Ultsch, M. T. Lipari, P. Moran, S. J. Lin, R. Ganesan, C. Quan, J. Tom, W. Sandoval, M. van Lookeren Campagne and D. Kirchhofer, Structure, 2012, 20, 1040-1050.
C. M. Abfalter, M. Schubert, C. Gotz, T. P. Schmidt, G. Posselt and S. Wessler, Cell Commun. Signal., 2016, 14, 30.
D. He, M. Zhang, S. Liu, X. Xie and P. R. Chen, Cell Chem. Biol., 2019, 26, 144-150 e143.
D. J. Barbosa, J. P. Capela, M. de L. Bastosa and F. Carvalho, Toxicol. Res., 2015, 4, 801.
D. Zurawa-Janicka, T. Wenta, M. Jarzab, J. Skorko-Glonek, P. Glaza, A. Gieldon, J. Ciarkowski and B. Lipinska, Arch. Biochem. Biophys., 2017, 621, 6-23.
H. J. Olivos, P. G. Alluri, M. M. Reddy, D. Salony and T. Kodadek, Org. Lett. 2002, 4, 4057-4059.
H. Y. Nam, J. A. Hong, J. Choi, S. Shin, S. K. Cho, J. Seo and J. Lee, Bioconjugate Chem. 2018, 29, 1669-1676.
H. Y. Nam, J. A. Hong, J. Choi, S. Shin, S. K. Cho, J. Seo and J. Lee, Bioconjugate Chem., 2018, 29, 1669-1676.
J. M. Jones, P. Datta, S. M. Srinivasula, W. Ji, S. Gupta, Z. Zhang, E. Davies, G. Hajnczky, T. L. Saunders, M. L. Van Keuren, T. Fernandes-Alnemri, M. H. Meisler and E. S. Alnemri, Nature, 2003, 425, 721.
J. Skrko-Glonek, D. Zurawa-Janicka, T. Koper, M. Jarzab, D. Figaj, P. Glaza and B. Lipinska, Curr. Pharm. Des., 2013, 19, 977-1009.
J. Zielonka, J. Joseph, A. Sikora, M. Hardy, O. Ouari, J. Vasquez-Vivar, G. Cheng, M. Lopez and B. Kalyanaraman, Chem. Rev., 2017, 117, 10043-10120.
L. M. Martins, B. E. Turk, V. Cowling, A. Borg, E. T. Jarrell, L. C. Cantley and J. Downward, J. Biol. Chem., 2003, 278, 49417v49427.
L. Truebestein, A. Tennstaedt, T. Monig, T. Krojer, F. Canellas, M. Kaiser, T. Clausen and M. Ehrmann, Nat. Struct. Mol. Biol., 2011, 18, 386-388.
L. Vande Walle, P. Van Damme, M. Lamkanfi, X. Saelens, J. Vandekerckhove, K. Gevaert and P. Vandenabeele, J. Proteome Res., 2007, 6, 1006-1015.
M. Fonovic and M. Bogyo, Expert Rev. Proteomics, 2008, 5, 721-730.
M. L. Sun, L. M. Sun and Y. Q. Wang, J. Mol. Recognit., 2018, 31, e2698.
M. Uhlen, L. Fagerberg, B. M. Hallstrom, C. Lindskog, P. Oksvold, A. Mardinoglu, A. Sivertsson, C. Kampf, E. Sjostedt, A. Asplund, I. Olsson, K. Edlund, E. Lundberg, S. Navani, C. A. Szigyarto, J. Odeberg, D. Djureinovic, J. O. Takanen, S. Hober, T. Alm, P. H. Edqvist, H. Berling, H. Tegel, J. Mulder, J. Rockberg, P. Nilsson, J. M. Schwenk, M. Hamsten, K. von Feilitzen, M. Forsberg, L. Persson, F. Johansson, M. Zwahlen, G. von Heijne, J. Nielsen and F. Ponten, Science, 2015, 347, 1260419.
M. Wysocka, A. Wojtysiak, M. Okoska, N. Gruba, M. Jarzb, T. Wenta, B. Lipiska, R. Grzywa, M. Sieczyk and K. Rolka, Anal. Biochem., 2015, 475, 44-52.
Murwantoko, M. Yano, Y. Ueta, A. Murasaki, H. Kanda, C. Oka and M. Kawaichi, Biochem. J, 2004, 381, 895-904.
P. Hauske, M. Meltzer, C. Ottmann, T. Krojer, T. Clausen, M. Ehrmann and M. Kaiser, Biorg. Med. Chem., 2009, 17, 2920-2924.
P. M. Quiros, T. Langer and C. Lopez-Otin, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2015, 16, 345.
R. E. Gonzalez-Reyes, M. O. Nava-Mesa, K. Vargas-Sanchez, D. Ariza-Salamanca and L. Mora-Munoz, Front. Mol. Neurosci., 2017, 10, 427.
S. Backert, S. Bernegger, J. Skrko-Glonek and S. Wessler, Cell Microbiol., 2018, 20, e12845.
S. F. Carter, K. Herholz, P. Rosa-Neto, L. Pellerin, A. Nordberg and E. R. Zimmer, Trends Mol. Med., 2019, 25, 77-95.
S. Grau, A. Baldi, R. Bussani, X. Tian, R. Stefanescu, M. Przybylski, P. Richards, S. A. Jones, V. Shridhar, T. Clausen and M. Ehrmann, Proc. Nat. Acad.Sci., 2005, 102, 6021-6026.
S. Poepsel, A. Sprengel, B. Sacca, F. Kaschani, M. Kaiser, C. Gatsogiannis, S. Raunser, T. Clausen and M. Ehrmann, Nat. Chem. Biol., 2015, 11, 862-869.
S. Serim, S. V. Mayer and S. H. L. Verhelst, Org. Biomol. Chem. 2013, 11, 5714-5721.
S. Serim, U. Haedke and S. H. Verhelst, ChemMedChem, 2012, 7, 1146-1159.
S. T. Runyon, Y. Zhang, B. A. Appleton, S. L. Sazinsky, P. Wu, B. Pan, C. Wiesmann, N. J. Skelton and S. S. Sidhu, Protein Sci., 2007, 16, 2454-2471.
S. Wessler, G. Schneider and S. Backert, Cell Commun. Signal., 2017, 15, 4.
T. Clausen, M. Kaiser, R. Huber and M. Ehrmann, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2011, 12, 152.
Y. Zhang, B. A. Appleton, P. Wu, C. Wiesmann and S. S. Sidhu, Protein Sci., 2007, 16, 1738-1750.

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