KR20180040192A

KR20180040192A - Polyvalent directed peptide polymer for Using in Detection for Amyloid beta 42

Info

Publication number: KR20180040192A
Application number: KR1020160131636A
Authority: KR
Inventors: 윤문영; 이상춘; 고성호
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2016-10-11
Filing date: 2016-10-11
Publication date: 2018-04-20
Also published as: KR101909904B1

Abstract

The present invention relates to a polyvalent directed peptide polymer for the detection of amyloid beta 42 which can replace antibodies for Alzheimer′s disease. When the polyvalent directed peptide polymer of the present invention is used, amyloid beta 42 can be detected with high sensitivity to effectively diagnose Alzheimer′s disease.

Description

[0002] Polyvalent directed peptide polymers for amyloid beta 42 [

본 발명은 알츠하이머 진단을 위한 항체를 대체할 수 있는 아밀로이드 베타 42 검출용 다중인식 펩타이드 폴리머에 관한 것이다.The present invention relates to a multi-recognition peptide polymer for detection of amyloid beta 42 that can replace an antibody for Alzheimer's diagnosis.

본 발명은 알츠하이머 질환 바이오마커인 아밀로이드 베타 42(Aβ42) 진단 탐침으로서의 다중인식 펩타이드 폴리머(Polyvalent directed peptide polymer, PDPP)에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 기존 보고된 Aβ42 고리형 펩타이드의 아미노산 서열을 변형한 선형 펩타이드를 고분자 사슬에 연결함으로 Aβ42를 고민감도로 검출할 수 있는 프로브 개발에 관한 것이다. The present invention relates to a polyvalent directed peptide polymer (PDPP) as a diagnostic probe for amyloid beta 42 (A? 42) which is a biomarker of Alzheimer's disease. More specifically, it relates to a peptide having a modified amino acid sequence The present invention relates to the development of a probe capable of detecting A? 42 with a sensitive sensitivity by connecting a linear peptide to a polymer chain.

본 발명의 타겟으로 선택한 진단대상체 Aβ42는 치매를 일으키는 가장 흔한 퇴행성 뇌질환인 알츠하이머 질환의 대표적 바이오마커이다. 뇌세포 내 아밀로이드 전구체 단백질(APP, amyloid precursor protein)인 당단백질이 분해효소에 의하여 절단되어 42개 혹은 40개의 아미노산으로 형성된 물질이다. 알츠하이머 질환은 뇌 세포내 Aβ42의 침적에 의하여(섬유화 혹은 plaque 형성) 신경전달 기능을 떨어뜨려 치매와 같은 인지장애를 일으킨다. 알츠하이머 Aβ42는 일반인의 경우 뇌세포에서 생성되어 뇌척수액(CSF, cerebro spinal fluid)을 통해 순환되며, 최종적으로 뇌세포에서 자연적으로 분해된다. 그러나 이러한 기능이 제대로 작동되지 않아 뇌 세포 내에 침적이 되며, 결국 신경 전달을 방해함으로 질병을 유발한다. 알츠하이머는 기억력 감퇴, 언어능력 저하, 시공간파악능력의 저하, 판단력 및 일상생활수행능력 저하, 정신행동증상 등 다양한 증상을 유발함에 따라 진단과 치료가 매우 중요하다. The diagnostic target Aβ42 selected as the target of the present invention is a representative biomarker of Alzheimer's disease, the most common degenerative brain disease causing dementia. The amyloid precursor protein (APP), an intracerebral cellular glycoprotein, is a substance formed by 42 or 40 amino acids by cleavage by a lytic enzyme. Alzheimer's disease is caused by the deposition of A [beta] 42 in brain cells (fibrosis or plaque formation), which decreases neurotransmitter function and causes cognitive impairment such as dementia. Alzheimer's Aβ42 is produced in brain cells in the general population and circulates through cerebrospinal fluid (CSF), and eventually decomposes naturally in brain cells. However, these functions do not work properly, so they become immersed in brain cells and eventually cause diseases by interrupting neurotransmission. Diagnosis and treatment are very important as Alzheimer's causes various symptoms such as memory decline, poor language ability, deterioration of ability to grasp time and space, declining judgment and ability to perform daily living, and mental behavior symptoms.

현재 알츠하이머병을 진단하는 방법으로는 신체검사, 신경학적 검사, 정신상태 검사, 일상생활 기능수준 검사, 혈액 검사, 뇌영상학 검사 등 다양한 방법이 있다. 비록 다양한 진단법이 있음에도 불구하고, 이 모든 진단법은 조기 알츠하이머 질환을 진단하지 못하는 단점을 가지고 있다. 이미 환자 질병 단계가 어느 정도 진행된 상태에서 나타나는 증상을 가지고 진단하기 때문이다. 현재 알츠하이머 질환을 가장 정확하게 진단하는 방법은 CSF 내 존재하는 Aβ42 혹은 다른 바이오마커인 타우 단백질을 항체를 이용하여 농도를 비교분석하는 효소면역측정법(ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay)이 있으며, 뇌영상검사로 PET/SPECT 혹은 MRI 진단법이 있다. 먼저 ELISA 경우 환자의 CSF를 취한 후, 검사가 진행되는 침습적 방법으로 환자에게 극심한 고통을 제공하며, 단순히 항체를 이용한 진단법으로는 검출한계의 제한으로 정확한 진단을 하기에 다소 문제가 있고, 뇌영상 검사의 경우 비록 정확한 편이지만 영상이미지를 얻기 위해 방사성동위원소, 금속 혹은 다양한 화합물을 처리하여 진단이 진행됨에 따라 환자에게 부작용을 나타내는 문제가 수반된다. Currently, there are various methods to diagnose Alzheimer's disease such as physical examination, neurological examination, mental status test, daily life function test, blood test, and brain imaging test. Despite the various diagnostic methods, all of these diagnoses have the disadvantage of not diagnosing early Alzheimer's disease. This is because the patient is already diagnosed with the symptom of the disease stage progressing to some extent. Currently, there is an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for analyzing the concentration of A [beta] 42 or another tau protein in CSF, which is the most accurate diagnosis of Alzheimer's disease, using an antibody. PET / SPECT or MRI. In the case of ELISA, the patient is exposed to severe pain through the invasive method after taking the CSF of the patient. In the case of the antibody-based diagnosis method, there is a problem in correct diagnosis due to the limitation of the detection limit. Although it is accurate, it is accompanied by the problem of showing side effects to the patient as the diagnosis proceeds by treating radioisotopes, metals or various compounds in order to obtain image images.

그러므로 알츠하이머 질환의 조기 진단을 위하여 위와 같은 단점을 극복할 수 있는 새로운 진단제 개발이 시습한 실정이며, 이에 따라 다양한 생체적합 물질을 이용한 진단제 개발 연구들이 전 세계적으로 진행 중이다. Therefore, for the early diagnosis of Alzheimer's disease, a new diagnostic agent has been developed to overcome the above disadvantages. Accordingly, a variety of diagnostic agents using various biocompatible materials are being developed worldwide.

종래 Aβ42 진단 탐침으로서, 특정 서열의 고리형 펩타이드 프로브가 보고되었다(Robert N. Muller et al. Neurobiology of Aging 31 16791689 (2010)). 그러나 상술한 고리형 펩타이드의 경우, 그 민감도가 낮아 알츠하이머의 조기 진단에 이용하는데 한계가 있다. 본 발명자들은 이러한 문제점을 해결하고자, 종래 보고된 고리형 펩타이드 프로브 서열을 변형하여 고민감도 Aβ42 진단탐침을 개발하였다. As a conventional A? 42 diagnostic probe, a cyclic peptide probe of a specific sequence has been reported (Robert N. Muller et al., Neurobiology of Aging 31 16791689 (2010)). However, in the case of the above-mentioned cyclic peptide, its sensitivity is low and its application to early diagnosis of Alzheimer's is limited. The inventors of the present invention developed a hyperpolarised Aβ42 diagnostic probe by modifying a previously reported cyclic peptide probe sequence in order to solve such a problem.

따라서 본 발명은 위와 같은 알츠하이머 조기 진단제 개발을 위해 Aβ42에 특이적으로 결합하는 생체적합성 펩타이드 프로브를 발굴, 알츠하이머 질환을 조기에 진단하고자 하며, 더 나아가 조기 진단을 통한 질환 치료에 성공률을 높이는 방향성을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a biocompatible peptide probe that specifically binds to A? 42 for the early diagnosis of Alzheimer's disease. The present invention aims to diagnose Alzheimer's disease at an early stage and further improves the success rate of disease treatment through early diagnosis to provide.

본 발명에서 동정한 고리형 펩타이드는 항체를 대체할 수 있는 새로운 기술뿐 아니라, 기존에 보고된 바 있는 다른 펩타이드 진단제 보다 극미량으로도 아밀로이드 베타 42 진단에 효과적이며, 3차원적 구조로 인하여 높은 물리 화학적 안정성을 갖는 저분자 물질이다. 이 신규한 진단 탐침자를 이용하여 알츠하이머 메인 바이오마커로 알려진 아밀로이드 물질을 진단함으로써 기존 치료보다 더 효율적인 알츠하이머 질환 진단에 응용될 것이라고 여겨진다.The cyclic peptides identified in the present invention are effective for amyloid beta 42 diagnosis in a very small amount compared with other peptide diagnostic agents which have been reported in the past as well as new techniques for replacing antibodies, It is a low molecular substance with chemical stability. This new diagnostic probe will be used to diagnose Alzheimer's disease more efficiently than conventional therapy by diagnosing amyloid material known as Alzheimer's main biomarker.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.

본 발명자들은 알츠하이머병 진단을 위한 표적으로서의 아밀로이드베타 42 검출을 위한 항체를 대체할 수 있는 고민감도의 신규 펩타이드 프로브를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 폴리-D-라이신으로 이루어진 폴리펩타이드 백본에 소정의 아미노산 서열을 갖는 저분자 펩타이드 프로브를 다수 결합시킨 펩타이드 폴리머를 이용하여 고감도로 아밀로이드베타 42을 검출할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다. The present inventors sought to develop a novel peptide probe having a sensitive sensitivity that can replace an antibody for detection of amyloid beta 42 as a target for the diagnosis of Alzheimer's disease. As a result, the present inventors have completed the present invention by detecting that amyloid beta 42 can be detected with high sensitivity by using a peptide polymer in which a small molecule peptide probe having a predetermined amino acid sequence is bound to a polypeptide backbone composed of poly-D-lysine .

따라서, 본 발명의 목적은 Aβ42 검출용 다중인식 펩타이드 폴리머(polyvalent directed peptide polymer)를 제공하는데 있다. Accordingly, an object of the present invention is to provide a polyvalent directed peptide polymer for detecting A [beta] 42.

본 발명의 또 다른 목적은 상술한 다중인식 펩타이드 폴리머를 포함하는 알츠하이머병 진단용 조성물을 제공하는데 있다. It is still another object of the present invention to provide a composition for diagnosing Alzheimer's disease comprising the above-mentioned multiple recognition peptide polymer.

본 발명의 또 다른 목적은 상술한 다중인식 펩타이드 폴리머를 포함하는 알츠하이머병 진단용 키트를 제공하는데 있다. Another object of the present invention is to provide a kit for diagnosing Alzheimer's disease comprising the above-mentioned multiple recognition peptide polymer.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 Aβ42(아밀로이드베타 42) 검출용 다중인식 펩타이드 폴리머(polyvalent directed peptide polymer)를 제공한다: According to one aspect of the present invention, the present invention provides a polyvalent directed peptide polymer for detection of A? 42 (amyloid beta 42) comprising:

(a) 폴리-D-라이신 백본; 및 (a) a poly-D-lysine backbone; And

(b) 상기 폴리-D-라이신 백본의 측쇄 아민에 결합된, 서열목록 제1서열 내지 제4서열 중 하나 이상의 아미노산 서열로 이루어진 복수의 단일 펩타이드 프로브.(b) a plurality of single peptide probes consisting of at least one amino acid sequence selected from the first to fourth sequences of the Sequence Listing bound to the side chain amines of the poly-D-lysine backbone.

본 발명자들은 알츠하이머병 진단을 위한 표적으로서의 아밀로이드베타 42 검출을 위한 항체를 대체할 수 있는 고민감도의 신규 펩타이드 프로브를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 폴리-D-라이신으로 이루어진 폴리펩타이드 백본에 소정의 아미노산 서열을 갖는 저분자 펩타이드 프로브를 다수 결합시킨 펩타이드 폴리머를 이용하여 고감도로 아밀로이드베타 42을 검출할 수 있음을 규명하였다. The present inventors sought to develop a novel peptide probe having a sensitive sensitivity that can replace an antibody for detection of amyloid beta 42 as a target for the diagnosis of Alzheimer's disease. As a result, it was found that amyloid beta 42 can be detected with high sensitivity using a peptide polymer in which a small molecule peptide probe having a predetermined amino acid sequence is bound to a polypeptide backbone composed of poly-D-lysine.

본 발명의 서열목록 제1 서열 내지 제2 서열로 이루어진 단일 펩타이드 프로브의 아미노산 서열은 종래 보고된(Robert N. Muller et al,. Neurobiology of Aging, 31, 16791689 (2010)) 아밀로이드베타 42 검출을 위한 고리형 펩타이드 서열을 변형하여 이용한 것이다. 기존 보고된 Aβ42 결합 고리형 펩타이드의 서열인 CIPLPFYNC 및 CFRHMTEQC 서열의 N 말단과 C 말단의 시스테인을 제거하여 분자 내 이황화 결합을 제거하였으며, N 말단에 KGCG 서열을 추가로 결합시키거나, C 말단에 GCGK 서열을 추가로 결합시켰다. 상기 KGCG 또는 GCGK 서열에 포함된 시스테인에 의해 폴리-D-라이신 백본과 결합을 형성할 수 있도록 하고, 라이신에 의해 종래 알래진 검출 표지를 용이하게 결합시킬 수 있도록 하였다. The amino acid sequences of the single peptide probes consisting of the first to second sequences of the present invention can be used for the detection of amyloid beta 42 in the previously reported (Robert N. Muller et al., Neurobiology of Aging, 31, 16791689 (2010) The cyclic peptide sequence was modified and used. The intracellular disulfide bonds were removed by removing the N-terminal and C-terminal cysteines of the CIPLPFYNC and CFRHMTEQC sequences of the previously reported A [beta] 42 -binding cyclic peptide, and the KGCG sequence was further bound to the N- The sequences were further combined. To form a bond with the poly-D-lysine backbone by the cysteine contained in the KGCG or GCGK sequence, and to readily bind conventional detection labels with lysine.

서열목록 제1서열 내지 제4서열은 다음과 같다: Sequence Listing The first to fourth sequences are as follows:

서열목록 제1서열: IPLPFYNGCGKSequence Listing 1st sequence: IPLPFYNGCGK

서열목록 제2서열: FRHMTEQGCGKSequence Listing 2nd sequence: FRHMTEQGCGK

서열목록 제3서열: KGCGIPLPFYNSEQ ID NO: 3 sequence: KGCGIPLPFYN

서열목록 제4서열: KGCGFRHMTEQSEQ ID NO: 4 sequence: KGCGFRHMTEQ

본 발명의 단일 펩타이드 프로브는 당업계에 공지된 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로는 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함되나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예: Biosearch 또는 Applied Biosystems사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 이 기술분야에서 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 펩타이드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 펩타이드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Edition; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif,1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990. 본 발명의 단일 펩타이드 프로브는 N-말단의 아미노 그룹 반응성 제거를 위한 공지된 변성이 가능하고, 예를 들어 아세틸화(Acetylation)가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. The single peptide probe of the present invention can be produced by chemical synthesis known in the art. Representative methods include, but are not necessarily limited to, liquid or solid phase synthesis, fractional condensation, F-MOC or T-BOC chemistry. The peptides of the present invention can also be produced by genetic engineering methods. First, a DNA sequence encoding the peptide is constructed according to a conventional method. DNA sequences can be constructed by PCR amplification using appropriate primers. Alternatively, DNA sequences may be synthesized by standard methods known in the art, for example, using automated DNA synthesizers (such as those sold by Biosearch or Applied Biosystems). The constructed DNA sequence is operatively linked to the DNA sequence and contains one or more expression control sequences (e.g., promoters, enhancers, etc.) that regulate the expression of the DNA sequence , And the host cells are transformed with the recombinant expression vector formed therefrom. The resulting transformant is cultured under appropriate medium and conditions so that the DNA sequence is expressed, and the substantially pure peptide encoded by the DNA sequence is recovered from the culture. The recovery can be performed using methods known in the art (e.g., chromatography). By "substantially pure peptide" herein is meant that the peptide according to the invention is substantially free of any other proteins derived from the host. Genetic engineering methods for peptide synthesis of the present invention can be found in the following references: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N. Y., Second (1998) and Third (2000) Edition; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif., 1991; And Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 12073-12080, 1990. The single peptide probe of the present invention is capable of known denaturation for eliminating the amino group reactivity at the N-terminus and is capable of acetylation, for example, It is not.

본 발명의 아밀로이드베타 42 표적용 단일 펩타이드 프로브 범위에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 본 발명의 단일 펩타이드 프로브와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이를 포함하는데에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다.It will be apparent to those skilled in the art that the biological functional equivalents that may be included in the single peptide probe range of the amyloid beta 42 of the present invention will be limited to include variations of the amino acid sequence exhibiting equivalent biological activity with the single peptide probe of the present invention Do.

이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.Such amino acid variations are made based on the relative similarity of the amino acid side chain substituents, such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, and the like. By analysis of the size, shape and type of amino acid side chain substituents, arginine, lysine and histidine are both positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; Phenylalanine, tryptophan and tyrosine have similar shapes. Thus, based on these considerations, arginine, lysine and histidine; Alanine, glycine and serine; And phenylalanine, tryptophan and tyrosine are biologically functional equivalents.

변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신 (+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 쓰레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).In introducing the mutation, the hydrophobic index of the amino acid can be considered. Each amino acid is assigned a hydrophobic index according to its hydrophobicity and charge: isoruicin (+4.5); Valine (+4.2); Leucine (+3.8); Phenylalanine (+2.8); Cysteine / cysteine (+2.5); Methionine (+1.9); Alanine (+1.8); Glycine (-0.4); Threonine (-0.7); Serine (-0.8); Tryptophan (-0.9); Tyrosine (-1.3); Proline (-1.6); Histidine (-3.2); Glutamate (-3.5); Glutamine (-3.5); Aspartate (-3.5); Asparagine (-3.5); Lysine (-3.9); And arginine (-4.5).

펩타이드의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.The hydrophobic amino acid index is very important in imparting the interactive biological function of peptides. It is known that substitution with an amino acid having a similar hydrophobicity index can retain similar biological activities. When a mutation is introduced with reference to a hydrophobic index, substitution is made between amino acids showing a hydrophobic index difference preferably within ± 2, more preferably within ± 1, even more preferably within ± 0.5.

한편, 유사한 친수성 값 (hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 펩타이드를 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트 (+3.0± 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4). On the other hand, it is also well known that the substitution between amino acids with similar hydrophilicity values leads to peptides with homogeneous biological activity. As disclosed in U.S. Patent No. 4,554,101, the following hydrophilicity values are assigned to each amino acid residue: arginine (+3.0); Lysine (+3.0); Aspartate (+ 3.0 ± 1); Glutamate (+ 3.0 ± 1); Serine (+0.3); Asparagine (+0.2); Glutamine (+0.2); Glycine (0); Threonine (-0.4); Proline (-0.5 ± 1); Alanine (-0.5); Histidine (-0.5); Cysteine (-1.0); Methionine (-1.3); Valine (-1.5); Leucine (-1.8); Isoru Isin (-1.8); Tyrosine (-2.3); Phenylalanine (-2.5); Tryptophan (-3.4).

친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.When a mutation is introduced with reference to the hydrophilicity value, the amino acid is substituted preferably within ± 2, more preferably within ± 1, even more preferably within ± 0.5.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.Amino acid exchange in peptides that do not globally alter the activity of the molecule is known in the art (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). The most commonly occurring exchanges involve amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Thy / Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu and Asp / Gly.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 단일 펩타이드 프로브에 포함되는 펩타이드는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 본 발명의 펩타이드 프로브 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl . Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl . BioSci . 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol . 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10(1990))은 NCBI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.Considering the mutation having the above-mentioned biological equivalent activity, the peptide included in the single peptide probe of the present invention is interpreted to include a sequence showing substantial identity with the sequence described in the sequence listing. The above-mentioned substantial identity is determined by aligning the peptide probe sequence of the present invention with any other sequence as much as possible, and analyzing the aligned sequence using an algorithm commonly used in the art. Quot; means a sequence showing homology. Alignment methods for sequence comparison are well known in the art. Various methods and algorithms for alignment are described by Smith and Waterman, Adv . Appl . Math. 2: 482 (1981) ; Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio. 48: 443 (1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol . 24: 307-31 (1988); Higgins and Sharp, Gene 73: 237-44 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-3 (1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res. 16: 10881-90 (1988); Huang et al., Comp. Appl . BioSci . 8: 155-65 (1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol . 24: 307-31 (1994). The NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol . Biol . 215: 403-10 (1990)) is accessible from NCBI (National Center for Biological Information) It can be used in conjunction with sequence analysis programs such as blastx, tblastn and tblastx. BLAST is available at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. A method for comparing sequence homology using this program can be found at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html.

본 발명의 “폴리-D-라이신 백본”은 생체 내의 L-라이신과 구분될 수 있는 D-라이신들 간의 아마이드 결합에 의해 형성된 폴리펩타이드 체인을 의미한다. 본 발명의 폴리-D-라이신 백본은 아밀로이드베타 42 검출을 위한 복수의 단일 펩타이드 프로브들이 결합될 수 있는 플랫폼을 제공한다. &Quot; Poly-D-lysine backbone " of the present invention means a polypeptide chain formed by amide bond between D-lysines which can be distinguished from L-lysine in vivo. The poly-D-lysine backbone of the present invention provides a platform on which a plurality of single peptide probes for amyloid beta 42 detection can be coupled.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 폴리-D-라이신은 분자량이 50 내지 1000 kDa인 것이다. 일 구체예에서 상기 폴리-D-라이신의 분자량은 50 내지 500 kDa 인 것을 이용할 수 있고, 다른 일 구체예에서 분자량이 100 내지 500 kDa인 것을 이용할 수 있으며, 다른 일 구체예에서 150 내지 500 kDa인 것을 이용할 수 있고, 다른 일 구체예에서 분자량이 50 내지 300 kDa 인 것을 이용할 수 있으며, 다른 일 구체예에서 분자량이 100 내지 300 kDa인 것을 이용할 수 있고, 다른 일 구체예에서 분자량이 150 내지 300 kDa인 것을 이용할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the poly-D-lysine of the present invention has a molecular weight of 50 to 1000 kDa. In one embodiment, the molecular weight of the poly-D-lysine may be from 50 to 500 kDa, in another embodiment from 100 to 500 kDa, and in another embodiment from 150 to 500 kDa And in another embodiment, a molecular weight of 50 to 300 kDa may be used, in another embodiment, a molecular weight of 100 to 300 kDa may be used, and in another embodiment, a molecular weight of 150 to 300 kDa Can be used.

본 발명의 “다중인식 펩타이드 폴리머(polyvalent directed peptide polymer)”는 복수의 단일 펩타이드 프로브가 폴리-D-라이신 백본에 결합되어 있는 복합체를 나타내기 위하여 정의된 용어로서, 본 발명의 다중인식 펩타이드 폴리머는 대량 생산이 항체에 비해 상대적으로 간단하고, 독성이 거의 없다. 이외에도 본 발명에 따른 다중인식 펩타이드 폴리머는 종래 알려진 고리형 펩타이드 프로브 또는 이를 변형시킨 선형 펩타이드 프로브에 비해 표적 물질에 대한 결합력이 수천 배 내지 수백만 배 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 거의 일어나지 않는다. The term " polyvalent directed peptide polymer " of the present invention is a term defined to represent a complex in which a plurality of single peptide probes are bound to a poly-D-lysine backbone, Mass production is relatively simple and less toxic than antibodies. In addition, the multi-recognition peptide polymer according to the present invention is advantageous in that the binding strength to a target substance is several thousands to several millions of times higher than that of a known peptide-type probe or a linear peptide probe in which the probe is modified, It does not happen.

구체적인 일 실시예에 따르면, 본 발명의 단일 펩타이드 프로브는 이를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 이용하여 제공될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. According to one specific embodiment, the single peptide probe of the present invention may be provided using a recombinant expression vector comprising a nucleic acid molecule encoding it, but is not limited thereto.

본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).As used herein, the term " nucleic acid molecule " is intended to encompass DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules in a comprehensive sense. Nucleotides which are basic constituent units in nucleic acid molecules include not only natural nucleotides but also analogs (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews , 90: 543-584 (1990)).

뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. Variations in nucleotides do not cause changes in the protein. Such nucleic acids include functionally equivalent codons or codons that encode the same amino acid (e.g., by codon degeneration, six codons for arginine or serine), or codons that encode biologically equivalent amino acids &Lt; / RTI >

또한, 뉴클레오타이드에서의 변이가 본 발명의 단일 펩타이드 프로브의 아미노산 서열에 변화를 가져올 수도 있다. 본 발명인 펩타이드 프로브의 아미노산에 변화를 가져오는 변이인 경우에도 본 발명의 단일 펩타이드 프로브와 거의 동일한 활성을 나타내는 생물학적 기능 균등물이 얻어질 수 있다.Also, variations in the nucleotides may result in changes in the amino acid sequence of the single peptide probe of the present invention. Even when the amino acid of the peptide probe of the present invention is a mutation that causes a change in the amino acid, a biological function equivalent showing almost the same activity as the single peptide probe of the present invention can be obtained.

본 발명의 Aβ42 검출용 펩타이드 프로브 범위에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 본 발명의 펩타이드와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하고, 이러한 아미노산의 변이에 대해서는 상술하였다. It is obvious to those skilled in the art that the biological functional equivalent that can be included in the probe range for A [beta] 42 detection of the present invention will be limited to the variation of the amino acid sequence exhibiting equivalent biological activity with the peptide of the present invention. Described above.

상술한 재조합 발현 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있고, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. The above recombinant expression vector can be constructed through various methods known in the art, and specific methods for this are disclosed in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) This document is incorporated herein by reference.

상술한 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자가 원핵 세포 유래이고, 배양의 편의성 등을 고려하여, 원핵 세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다.The above-described vector may typically be constructed as a vector for cloning or as a vector for expression. In addition, the vector of the present invention can be constructed by using prokaryotic cells or eukaryotic cells as hosts. It is preferable that the nucleic acid molecule of the present invention is derived from a prokaryotic cell and that the prokaryotic cell is used as a host in consideration of the convenience of cultivation.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, p_L ^λ프로모터, p_R ^λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J. Bacteriol ., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (p_L ^λ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.For example, when the vector of the present invention is an expression vector and a prokaryotic cell is used as a host, a strong promoter capable of promoting transcription (for example, a tac promoter, lac Promoter, lac UV5 promoter, lpp promoter, p _L ^λ promoter, p _R ^λ promoter, rac 5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 Pro meoteo, trp promoter and T7 promoter, etc.), lie bojom for the start of the decrypted binding site And a transcription / translation termination sequence. When E. coli is used as a host cell, E. coli The promoter and operator site of the tryptophan biosynthetic pathway (Yanofsky, C., J. Bacteriol . , 158: 1018-1024 (1984)) and the left promoter of phage λ (p _L ^λ promoter, Herskowitz, I. and Hagen, Ann. Rev. Genet. , 14: 399-445 (1980)) can be used as a regulatory region.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19 및 pET 등), 파지(예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다. On the other hand, vectors that can be used in the present invention include plasmids such as pSC101, ColE1, pBR322, pUC8 / 9, pHC79, pUC19 and pET which are frequently used in the art, phages such as λgt4λB, λ- And M13) or a virus (e.g., SV40 or the like).

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.On the other hand, when the vector of the present invention is an expression vector and a eukaryotic cell is used as a host, a promoter derived from a genome of a mammalian cell (for example, a metallothionein promoter) or a mammalian virus Virus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus promoter, and tk promoter of HSV) can be used, and generally have a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence.

본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 단일 펩타이드 프로브의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있고, 가장 바람직하게는 6x His이다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다.The vector of the present invention may be fused with other sequences to facilitate the purification of a single peptide probe expressed therefrom. Fusion sequences include, for example, glutathione S-transferase (Pharmacia, USA), maltose binding protein (NEB, USA), FLAG (IBI, USA), and 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) Is 6x His. Because of the additional sequence for such purification, proteins expressed in the host are rapidly and easily purified through affinity chromatography.

한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.On the other hand, the expression vector of the present invention includes, as a selection marker, an antibiotic resistance gene commonly used in the art and includes, for example, ampicillin, gentamycin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, There is a resistance gene for mitine and tetracycline.

구체적인 일 실시예에 따르면, 상술한 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 이용하여 최종적으로 원하는 단일 펩타이드 프로브를 얻을 수 있다. According to a specific embodiment, a desired single peptide probe can be finally obtained by using the transformant transformed with the expression vector described above.

상술한 발현 벡터를 안정하게 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어있는 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli Origami2, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110와 같은 E. coli 균주, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.As the host cell capable of stably and continuously cloning and expressing the above-described expression vector, any host cell known in the art may be used, for example, E. coli Origami2, E. coli JM109, E. coli BL21 (DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, Bacillus strains such as E. coli, Bacillus subtilis, Bacillus Chuo ringen systems such as E. coli W3110 , And enterobacteria and strains such as Salmonella typhimurium, Serratia marcesensus and various Pseudomonas species.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포 및 사람 세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.In addition, Saccharomyce cerevisiae , insect cells and human cells (e.g., CHO cell line (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293 , HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines) and the like can be used.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc . Natl. Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol . Biol ., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol . Cell Biol ., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc . Natl . Acad . Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.The method of delivering the vector of the present invention into a host cell may be carried out by the CaCl ₂ method (Cohen, SN et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA , 9: 2110-2114 (1973) , Hanahan, D., J. MoI . Biol . , 166: 557-580 (1997)), one method (Cohen, SN et al., Proc . Natl. Acac . Sci . USA , 9: 2110-2114 (1983)) and electroporation (Dower, WJ et al., Nucleic Acids Res. , 16: 6127-6145 (1988)). In addition, when the host cell is a eukaryotic cell, microinjection (Capecchi, MR, Cell , 22: 479 (1980)), calcium phosphate precipitation (Graham, FL et al., Virology , 52: 456 electroporation (Neumann, E. et al, EMBO J., 1:. 841 (1982)), liposome-mediated transfection method (Wong, TK et al, Gene , 10:87 (1980).), DEAE- (Yang et al., Proc . Natl . Acad . Sci. , 87: 9568-9572 (1990)) and dextran treatment (Gopal, Mol . Cell Biol . , 5: 1188-1190 ) Or the like into the host cell.

숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 단일 펩타이드 프로브를 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.The vector injected into the host cell can be expressed in host cells, in which case a large amount of a single peptide probe is obtained. For example, when the expression vector comprises a lac promoter, the host cell may be treated with IPTG to induce gene expression.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 폴리-D-라이신 백본의 측쇄 아민과 본 발명의 단일 펩타이드 프로브 사이의 결합은 추가적으로 포함되는 링커에 의해 형성되며, 상기 링커는 (i) 상기 폴리-D-라이신 백본의 측쇄 아민과 아마이드 결합을 형성하는 제1 기능기 및 (ii) 상기 단일 펩타이드 프로브와 결합을 형성하는 제2 기능기를 포함한다. 본 명세서 상의 용어 “제1 기능기”는 상술한 바와 같이 아민기와 아마이드 결합을 형성할 수 있는 기능기를 의미하고, 종래 공지된 기능기라면 특별히 제한되지 않는다. 본 명세서 상의 용어 “제2 기능기”는 본 발명의 단일 펩타이드 프로브와 결합을 형성할 수 있는 기능기로서 단일 펩타이드 프로브 서열에 따라 이황화 결합 또는 아마이드 결합을 형성할 수 있는 기능기를 의미한다. 본 발명에서 이용되는 링커는 당업계에서 단백질 또는 펩타이드 사이의 결합을 위한 링커로 이용되는 어떠한 화합물도 가능하며, 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로 예를 들면, 본 발명의 링커는 N-숙시니미딜 요오도아세테이드(N-succinimidyl iodoacetate), N-히드록시숙시니미딜 브로모아세테이트(N-Hydroxysuccinimidyl Bromoacetate), m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르(m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester), m-말레이미도벤조일-N-히드록시설포숙신이미드 에스테르(m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester), N-말레이미도부티릴옥시숙신아미드 에스테르(N-Maleimidobutyryloxysuccinamide ester), N-말레이미도부티릴옥시설포숙신아미드 에스테르(N-Maleimidobutyryloxysulfosuccinamide ester), E-말레이미도카프로산 히드라지드ㆍHCl (E-Maleimidocaproic acid hydrazideㆍHCl), [N-말레이디도카프로일옥시-숙신아미드] ([N-(E-maleimidocaproyloxy)-succinamide]), [N-말레이미도카프로일옥시)-설포숙신아미드]([N-(E-maleimidocaproyloxy)-sulfosuccinamide]), 말레이미도프로피온산 N-히드록시숙신이미드 에스테르(Maleimidopropionic Acid N-Hydroxysuccinimide Ester), 말레이미도프로피온산 N-히드록시설포숙신이미드 에스테르 (Maleimidopropionic Acid N-Hydroxysulfosuccinimide Ester), 말레이미도프로피온산 히드라지드ㆍHCl (Maleimidopropionic Acid HydrazideㆍHCl), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate), N-숙시니미딜-4-(요오도아세틸)아미노벤조에이트 (N-Succinimidyl-(4-iodoacetyl) aminobenzoate), 숙시니미딜-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (Succinimidyl-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-l-carboxylate), 숙시니미딜-4-(말레이미도페닐)부틸레이트(Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrate), 설포숙시니미딜-(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트 (Sulfosuccinimidyl-(4-iodoacetyl)aminobenzoate), 설포숙시니미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate), 설포숙시니미딜-4-(p-말레이미도페닐)부틸레이트 (Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrate), m-말레이미도벤조산 히드라지드ㆍHCl (m-Maleimidobenzoic acid hydrazide HCl), 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실산 히드라지드ㆍHCl (4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexane-l-carboxylic acid hydrazideㆍHCl), 4-(4-N-말레이미도페닐)부티르산 히드라지드ㆍHCl (4-(4-N-maleimidophenyl)butyric acid hydrazideㆍHCl), N-숙시니미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate), 비스(설포숙시니미딜)수베레이트(Bis(sulfosuccinimidyl)suberate), 1,2-디[3’-(2’-피리딜디티오)프로피온아미도] 부탄(1,2-Di[3’-(2’pyridyldithio)propionamido] Butane), 디숙시니디밀 수베레이트(Dissuccinimidyl Suberate), 디숙시니미딜 타르타레이트(Dissuccinimidyl Tartarate), 디설포숙시니미딜 타르타레이트 (Disulfosuccinimdiyl Tartarate), 디티오-비스-(숙시니미딜 프로피오네이트) (Dithio-bis-(succinimidyl propionate)), 3,3‘-디티오-비스-(설포숙시니미딜-프로피오네이트)(3,3'-Dithio-bis-(sulfosuccinimidyl-propionate)), 에틸렌 글리콜 비스(숙시니미딜숙시네이트 (Ethylene Glycol bis(Succinimidylsuccinate)) 및 에틸렌 글리콜 비스(설포숙시니미딜숙시네이트)(Ethylene Glycol bis(Sulfosuccinimidylsuccinate))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the linkage between the side chain amine of the poly-D-lysine backbone of the present invention and the single peptide probe of the present invention is formed by a further included linker, wherein the linker comprises (i) A first functional group forming an amide bond with the side chain amine of the D-lysine backbone, and (ii) a second functional group forming a bond with the single peptide probe. As used herein, the term " first functional group " means a functional group capable of forming an amide bond with an amine group as described above, and is not particularly limited as long as it is a conventionally known functional group. As used herein, the term " second functional group " means a functional group capable of forming a bond with a single peptide probe of the present invention and capable of forming a disulfide bond or an amide bond according to a single peptide probe sequence. The linker used in the present invention may be any compound used in the art as a linker for binding between proteins or peptides, and is not particularly limited. Specifically, for example, the linker of the present invention may be selected from the group consisting of N-succinimidyl iodoacetate, N-Hydroxysuccinimidyl Bromoacetate, m-maleimidobenzoyl Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester, m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester, m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester, N-maleimidobutyryloxysuccinamide ester, N-maleimidobutyryloxysulfosuccinamide ester, E-maleimidocaproic acid hydrazide 占 H HCl, , [N- (E-maleimidocaproyloxy) -succinamide]), [N-maleimidocaproyloxy) -sulfosuccinamide] ([N- maleimidocaproyloxy) -sulfosuccinamide]), maleimidop Maleimidopropionic acid N-hydroxysuccinimide ester, maleimidopropionic acid N-hydroxysulfosuccinimide ester, maleimidopropionic acid, maleimidopropionic acid, maleimidopropionic acid, maleimidopropionic acid, maleimidopropionic acid, N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate, N-succinimidyl-4- (iodo) Succinimidyl- (4-iodoacetyl) aminobenzoate, succinimidyl- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate, carboxylate, succinimidyl-4- (p-maleimidophenyl) butyrate, sulfosuccinimidyl- (4-iodoacetyl) aminobenzoate -iodoacetyl) aminobenzoate, sulfosuccinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-car (P-maleimidophenyl) butyrate, sulfosuccinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate, sulfosuccinimidyl- m-maleimidobenzoic acid hydrazide HCl, 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylic acid hydrazide.HCl (4- (N-Maleimidomethyl) cyclohexane-1 -carboxylic acid hydrazide.HCl), 4- (4-N-maleimidophenyl) butyrate hydrazide.HCl (4- (4-N-maleimidophenyl) butyric acid hydrazide.HCl), N- succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate, bis (sulfosuccinimidyl) suberate, 1,2-di [3'- (2'-pyridyldithio) propionamido] butane, 1,2-di [3 '- (2'pyridyldithio) propionamido] butane, Dissuccinimidyl Suberate, Dissuccinimidyl Tar ditio-bis- (succinimidyl propionate), 3,3'-dithio-bis-tartarate, disulfosuccinimdiyl tartarate, dithio-bis- (succinimidyl propionate) (3,3'-dithio-bis- (sulfosuccinimidyl-propionate)), ethylene glycol bis (succinimidyl succinate) and ethylene glycol bis But are not limited to, Ethylene Glycol bis (Sulfosuccinimidylsuccinate).

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 단일 펩타이드 프로브와 본 발명의 링커의 제2 기능기 사이의 결합은 이황화 결합 또는 아마이드 결합이다. 본 발명의 단일 펩타이드 프로브와 본 발명의 링커의 제2 기능기 사이의 결합이 이황화 결합인 경우, 본 발명의 단일 펩타이드 프로브의 일 말단에 포함된, KGCG 또는 GCGK 서열의 시스테인(Cys)과 상술한 제2 기능기 사이에 이황화 결합이 형성된다. In one embodiment of the present invention, the bond between the single peptide probe of the present invention and the second functional group of the linker of the present invention is a disulfide bond or an amide bond. When the bond between the single peptide probe of the present invention and the second functional group of the linker of the present invention is a disulfide bond, the cysteine (Cys) of the KGCG or GCGK sequence contained at one end of the single peptide probe of the present invention, Disulfide bonds are formed between the second functional groups.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 펩타이드는 발색효소, 방사선 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나로 표지된다.In one embodiment of the present invention, the peptide of the present invention is labeled with at least one selected from the group consisting of a chromogenic enzyme, a radioactive isotope, a chromopore, a luminescent material, and a fluorescent material.

상기 발색효소는 예를 들어, 퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)일 수 있고, 상기 방사성 동위원소는 예를 들어, 124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P,35S일 수 있으며, 상기 발광물질 또는 형광물질은 예를 들어, FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots) 등 일 수 있다.The coloring enzyme may be, for example, peroxidase or alkaline phosphatase, and the radioisotope may be, for example, 124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P, 35S, The luminescent material or fluorescent material can be, for example, FITC, RITC, rhodamine, Texas Red, fluorescein, phycoerythrin, quantum dots, and the like .

유사하게, 상기 검출 가능한 표지는 항체 에피토프(epitope), 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다. 이러한 표지는 본 발명의 펩타이드를 합성하는 과정 중에 수행할 수도 있고, 이미 합성된 펩타이드에 추가로 수행될 수도 있다.Similarly, the detectable label may be an antibody epitope, a substrate, a cofactor, an inhibitor or an affinity ligand. Such labeling may be performed during the synthesis of the peptide of the present invention, or may be performed in addition to the peptide already synthesized.

상술한 검출 가능 표지에 의해 본 발명의 다중인식 펩타이드 폴리머와 아밀로이드베타 42 간의 결합을 용이하게 실시간으로 관찰 가능하다. The binding between the multiple recognition peptide polymer of the present invention and the amyloid beta 42 can be easily observed in real time by the above-described detectable label.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 다중인식 펩타이드 폴리머를 포함하는 알츠하이머병 진단용 조성물을 제공한다. According to another aspect of the present invention, there is provided a composition for diagnosing Alzheimer's disease comprising the above-mentioned multiple recognition peptide polymer.

본 발명의 알츠하이머병 진단용 조성물의 구성 성분인 다중인식 펩타이드 폴리머는 알츠하이머병 진단을 위해 Aβ42를 특이적으로 검출하기 위한 것으로서, 상술한 Aβ42 검출용 다중인식 펩타이드 폴리머를 그대로 이용할 수 있다. 따라서, 상기 다중인식 펩타이드 폴리머에 관해서는 상술한 내용을 원용하며, 중복되는 내용에 대하여는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다. The multi-recognition peptide polymer as a constituent of the composition for diagnosing Alzheimer's disease of the present invention is specifically for detecting A? 42 for the diagnosis of Alzheimer's disease, and the above-described multiple recognition peptide polymer for A? 42 detection can be used as it is. Therefore, the above-mentioned contents are used for the multi-recognition peptide polymer, and redundant contents are omitted in order to avoid the excessive complexity described in the present specification.

본 발명의 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 알츠하이머병 진행 단계 결정 또는 알츠하이머병에 대한 치료의 효능 정도 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다. The term " diagnosing " in the context of the present invention includes determining the susceptibility of an object to a particular disease or disorder, determining whether an object currently has a particular disease or disorder, Determining the prognosis (e.g., determining the stage of Alzheimer's disease progression or determining the efficacy of treatment for Alzheimer's disease), or determining the prognosis of an object that is afflicted with the disease (e. G., Providing information about therapeutic efficacy) To monitor the state of the object in response to the request.

본 명세서 배경기술란에 설명한 바와 같이, Aβ42는 치매를 일으키는 가장 흔한 퇴행성 뇌질환인 알츠하이머 질환의 대표적 바이오마커이다. 알츠하이머 질환은 뇌 세포내 Aβ42의 침적에 의하여(섬유화 혹은 plaque 형성) 신경전달 기능을 떨어뜨려 치매와 같은 인지장애를 일으킨다. 알츠하이머 Aβ42는 일반인의 경우 뇌세포에서 생성되어 뇌척수액(CSF, cerebro spinal fluid)을 통해 순환되며, 최종적으로 뇌세포에서 자연적으로 분해된다. 그러나 이러한 기능이 제대로 작동되지 않아 뇌 세포 내에 침적이 되며, 결국 신경 전달을 방해함으로 질병을 유발하는 것으로 알려져 있다. As described in the background section of this specification, A? 42 is a representative biomarker of Alzheimer's disease, which is the most common degenerative brain disease causing dementia. Alzheimer's disease is caused by the deposition of A [beta] 42 in brain cells (fibrosis or plaque formation), which decreases neurotransmitter function and causes cognitive impairment such as dementia. Alzheimer's Aβ42 is produced in brain cells in the general population and circulates through cerebrospinal fluid (CSF), and eventually decomposes naturally in brain cells. However, it is known that these functions do not work properly, so they become immersed in brain cells, which ultimately interfere with neurotransmission and cause diseases.

따라서, 뇌 세포내 Aβ42가 침적되어 있는 것으로 검출되는 경우, 상기 세포가 유래한 개체는 알츠하이머병에 걸렸거나 걸릴 위험성이 높은 것으로 진단할 수 있다.Therefore, when Aβ42 in brain cells is detected as being immersed, the cell-derived individual can be diagnosed as having a high risk of being or suffering from Alzheimer's disease.

상기 조성물이 피검체에 투여되는 경우, 상기 조성물 내의 펩타이드는 뇌 세포 내에 침적된 Aβ42에 특이적, 선택적으로 결합하게 되고, 상기 폴리펩티드에 태깅된 검출체에서 일어나는 반응을 통해 상기와 같이 표적에 결합된 펩타이드의 위치 또는 발현량을 측정할 수 있다. When the composition is administered to a subject, the peptide in the composition specifically and selectively binds to A [beta] 42 immobilized in brain cells, and is capable of binding to the target as described above through a reaction occurring in the tagged- The position or expression level of the peptide can be measured.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 형광단층촬영(Fluorescence mediated tomography:FMT)으로 알츠하이머병을 진단할 수 있다. 예컨대, 형광물질로 표지된 본 발명의 펩타이드를 혈액 내로 투여하게되면 형광단층촬영으로 펩타이드에 의한 형광을 관찰할 수 있다. 형광이 관찰되는 패턴에 따라, 알츠하이머병을 진단할 수 있다. In one embodiment of the present invention, when a fluorescent substance is used as a detectable label, fluorescence tomography (FMT) can be used to diagnose Alzheimer's disease. For example, when a peptide of the present invention labeled with a fluorescent substance is administered into blood, fluorescence by peptide can be observed by fluorescence tomography. Depending on the pattern in which the fluorescence is observed, it is possible to diagnose Alzheimer's disease.

즉, 피검체의 조직 또는 세포 내에서 상기 검출체의 반응이 많이 일어나면, 상기 피검체의 뇌 조직에는 Aβ42가 과량으로 침적된 것이고, 상기 피검체는 알츠하이머 병에 걸려 있거나, 걸릴 확률이 높다는 것을 조기에 진단할 수 있는 것이다. 또한, 상기 조성물은 체내 투여됨으로써 상기 피검체의 알츠하이머병의 발병 위험 및 발병 여부를 비침습적으로 확인할 수 있다. That is, when a large amount of the reaction of the detector occurs in the tissues or cells of the subject, excess A [beta] 42 is deposited in the brain tissue of the subject, and the subject is caught in Alzheimer's disease, . In addition, the composition can be non-invasively confirmed by administering the composition in the body, thereby preventing the risk of developing Alzheimer's disease and the onset of the disease.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 다중인식 펩타이드 폴리머를 포함하는 알츠하이머병 진단용 키트를 제공한다. According to another aspect of the present invention, there is provided a kit for diagnosing Alzheimer's disease comprising the above-mentioned multiple recognition peptide polymer.

본 발명의 알츠하이머병 진단용 키트에는 Aβ42 검출을 위한 펩타이드의 분석 방법에 적합한 하나 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물 또는 장치가 포함될 수 있고, 펩타이드의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 안정성을 유지하기 위해, 4℃ 유지된 상태로 제공될 수 있다. 본 발명인 알츠하이머병 진단용 키트는 상술한 본 발명의 다른 일 양태인 ‘다중인식 펩타이드 폴리머’를 포함하는 알츠하이머병 진단용 키트에 관한 것인바, 중복되는 내용에 대하여는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다. The kit for diagnosing Alzheimer's disease of the present invention may contain one or more other component compositions or devices suitable for the method of assaying for A [beta] 42, and a buffer or reaction solution which stably maintains the structure or physiological activity of the peptide is added &Lt; / RTI > Further, in order to maintain the stability, it may be provided at a temperature of 4 占 폚. The kit for diagnosing Alzheimer's disease according to the present invention relates to a kit for diagnosing Alzheimer's disease including 'multi-recognition peptide polymer' which is another embodiment of the present invention described above, and duplicated contents are omitted in order to avoid excessive complexity described in the present specification do.

Aβ42에 결합한 본 발명의 다중인식 펩타이드 폴리머의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 본 발명의 키트에 포함되는 다중인식 펩타이드 폴리머는 상술한 바와 같이 표지된 상태로 제공될 수 있다. 한편, 본 발명의 펩타이드가 표지되지 않은 채로 제공되는 경우에는, 본 발명의 알츠하이머병 진단용 키트는 본 발명의 펩타이드의 시험관 내 또는 생체 내에서 Aβ42와의 결합 정도 또는 그 위치를 탐색하기 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분은 본 발명의 펩타이드의 표지를 위한 공지의 화합물이거나, 항원-항체반응을 통한 탐색을 위하여 본 발명의 펩타이드 또는 본 발명의 펩타이드와 결합하는 특정 수용체에 대한 항체 또는 이들에 대한 2차 항체 및 이의 검출을 위한 시약일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 진단은 종래의 면역분석(immunoassay) 방식 또는 프로토콜을 변형하여 실시될 수 있다. 예컨대, 종래 면역분석에서 항체 대신에, 본 발명의 펩타이드를 사용하고, 프로세스는 동일하게 하여 본 발명의 진단을 실시할 수 있다. 예를 들어, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)는 펩타이드 기반 ELISA(Peptide based ELISA)로 조금 변형하여 실시된다. In order to facilitate the identification, detection and quantification of the multi-recognition peptide polymer of the present invention bound to A? 42, the multi-recognition peptide polymer contained in the kit of the present invention may be provided in a labeled state as described above. When the peptide of the present invention is provided without labeling, the kit for diagnosing Alzheimer's disease of the present invention further comprises a component for searching the binding degree or position of the peptide of the present invention in vitro or in vivo with A? 42 . The components may be known compounds for the labeling of the peptides of the invention or may be conjugated to a peptide of the invention or an antibody against a particular receptor that binds to the peptide of the invention or a secondary antibody thereto, And may be a reagent for detection thereof. Specifically, the diagnosis of the present invention can be carried out by modifying a conventional immunoassay method or protocol. For example, the diagnosis of the present invention can be carried out by using the peptide of the present invention instead of the antibody in the conventional immunoassay, and the process is the same. For example, an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) is performed with a slight modification to a peptide-based ELISA (Peptide based ELISA).

또한 본 발명인 진단용 키트의 펩타이드는 플레이트의 표면에 코팅된 형태로 제공될 수도 있다. 이 경우에는 상기 플레이트에 직접 대상(subject)의 뇌척수액 또는 혈장 시료를 적당한 조건에서 반응시킨 후, 플레이트의 표면상에서의 뇌척수액 또는 혈장 시료 내에 포함된 Aβ42를 캡쳐링(Captureing)하고, Aβ42 진단용 펩타이드를 처리하여 샌드위치 방식의 ELISA 방식으로 펩타이드와 Aβ42 결합을 정량적으로 분석함으로써 알츠하이머병을 진단할 수 있다.In addition, the peptide of the diagnostic kit of the present invention may be provided in a form coated on the surface of the plate. In this case, after subjecting the subject's cerebrospinal fluid or blood plasma sample directly to the plate under appropriate conditions, capturing the Aβ42 contained in the cerebrospinal fluid or plasma sample on the surface of the plate, treating the Aβ42 diagnostic peptide By quantitatively analyzing peptide and A [beta] 42 binding by sandwich ELISA method, it is possible to diagnose Alzheimer's disease.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(a) 본 발명은 Aβ42 검출용 다중인식 펩타이드 폴리머(polyvalent directed peptide polymer)를 제공한다. (a) The present invention provides a polyvalent directed peptide polymer for detection of A? 42.

(b) 본 발명은 상술한 다중인식 펩타이드 폴리머를 포함하는 알츠하이머병 진단용 조성물을 제공한다. (b) The present invention provides a composition for diagnosing Alzheimer's disease comprising the above-mentioned multiple recognition peptide polymer.

(c) 본 발명은 상술한 다중인식 펩타이드 폴리머를 포함하는 알츠하이머병 진단용 키트를 제공한다. (c) The present invention provides a kit for diagnosing Alzheimer's disease comprising the above-mentioned multiple recognition peptide polymer.

(d) 본 발명의 다중인식 펩타이드 폴리머를 이용하는 경우, 기존의 고리형 단일 펩타이드 프로브에 비해 민감도 및 결합력이 극적으로 증대된 아밀로이드베타 42 검출용 프로브를 제공할 수 있다. (d) When the multi-recognition peptide polymer of the present invention is used, it is possible to provide a probe for detecting amyloid beta 42 which has a dramatically increased sensitivity and binding force as compared with a conventional single-type peptide probe.

(e) 본 발명의 다중인식 펩타이드 폴리머, 알츠하이머병 진단용 조성물 또는 진단용 키트를 이용하는 경우, 높은 민감도로 아밀로이드베타 42를 검출하여 알츠하이머병을 효과적으로 진단할 수 있다. (e) When the multiple recognition peptide polymer, the composition for diagnosing Alzheimer's disease, or the diagnostic kit of the present invention is used, the amyloid beta 42 can be detected with high sensitivity to effectively diagnose Alzheimer's disease.

도 1은 종래 알려진 고리형 펩타이드 프로브와 본 발명의 단일 펩타이드 프로브의 아밀로이드 42에 대한 결합력 측정 결과를 나타낸다. Pho-ABP 또는 Pho-펩타이드는 서열목록 제1서열의 단일 펩타이드를 의미하고, Phi-ABP 또는 Phi-펩타이드는 서열목록 제2서열의 단일 펩타이드를 의미한다. 도 1의 (a)는 아미노산 변형을 통해 합성된 서열목록 제1서열 및 제2서열의 펩타이드 서열 및 해리상수를 나타내고, 도 1의 (b)는 각 펩타이드와 Aβ42 사이의 결합력을 분석한 그래프를 나타내며, 도 1의 (c)는 기존 고리형 펩타이드와 변형된 펩타이드에 대한 Aβ42 결합 능력 비교 결과를 나타낸다. 해리상수가 작을 수록 타겟에 더욱 쉽게 결합하는 것을 의미한다.
도 2는 아밀로이드베타 42와 결합하는 다중인식 펩타이드 고분자(Polyvalent-directed peptide polymer; PDPP) 합성 일 실시예의 모식도를 나타낸다. PDL(150-300 kDa)과 SPDP 링커의 반응을 통하여 PDL-SPDP 백본 형성 후, 각각의 단일 펩타이드(Pho-ABP, Phi-ABP)를 처리하여 Pho-PDPP와 Phi-PDPP를 형성시킬 수 있다. 이후 겔 여과(gel filtration) 컬럼을 이용하여 반응하지 않은 ABPs를 분리하고 최종적으로 Aβ42 결합 PDPPs를 합성할 수 있다.
도 3은 아밀로이드베타42에 대한 PDPPs의 결합력 분석 결과를 나타낸다. Aβ42에 결합하는 각 PDPP를 농도에 따라 처리한 후, 결합력을 측정하였다. PDPPs 경우 각각 기존 고리형 펩타이드 프로브와 본 발명의 단일 펩타이드 프로브에 비해 약 10⁶배와 10³배 이상 결합력이 증가되는 것을 확인하였다. 또한 두 가지 펩타이드 조합을 통한 PDPP 경우 기존 단일 펩타이드와 PDPPs에 비해 약 10⁴배와 10배 이상의 결합력이 증가되는 것을 확인하였다.
도 4는 알츠하이머 환자 뇌척수액(Cerebro spinal fluid; CSF) 내 아밀로이드베타42 분포 표를 나타낸다. 전반적으로 알츠하이머병(AD)의 경우 CSF 내 Aβ42 농도가 상대적으로 preAD 환자보다 낮은 농도를 함유한다. MMSE; mini-mental status examination(미니정신기능검사), CDR; clinical dementia rating (임상치매척도), WMS; wechsler memory scale(웩슬러기억척도).
도 5는 알츠하이머 환자의 CSF 내 Aβ42에 대한 PDPP의 결합력 분석 결과를 나타낸다. CSF 샘플을 96 웰 플레이트에 고정시키고, Aβ42 결합 PDPP를 처리하여 결합력을 측정하였다. 도 5의 (a)는 AD 환자 CSF 샘플 농도(N6, N20, N26의 평균 Aβ42 농도)를 다양하게 처리하고, Aβ42에 결합하는 다양한 프로브들을 이용하여 결합력을 측정한 결과를 나타낸다. Pho-Phi-PDPP가 가장 좋은 민감도를 나타내었다. 도 5의 (b)는 preAD와 AD 그룹 내 CSF 샘플의 농도를 다양하게 처리하고, Aβ42에 결합하는 PDPP를 결합시킨 후 결합력을 측정한 결과를 나타낸다. CSF 내 많은 양의 Aβ42가 존재하는 preAD 샘플에서 가장 높은 신호가 검출되었다.
도 6은 CSF 내 Aβ42 검출을 위한 샌드위치 측정법을 실시하기 위한 모식도를 나타낸다. 기존 항체 기반 측정법과 동일한 시스템을 적용할 수 있으며, Pho-ABP를 고정물질로, Phi-PDPP를 진단 물질로 사용한 실시예를 나타내었다.
도 7a 및 7b는 Aβ42 결합 PDPP 프로브의 CSF 내 Aβ42에 대한 검출한계 분석 결과를 나타낸다. Aβ42 농도 차이가 많이 나타나는 N17(AD CSF)과 O16(preAD CSF)을 대상으로 PDPP를 이용하여 CSF 내 Aβ42에 대한 검출한계를 측정하였다. 또한 CSF내 Aβ42 농도가 정확히 측정되는지 비교하기 위하여 상업적인 Aβ42와 재조합 Aβ42 단백질을 사용하였다. 검출한계 측정에서는 기존 병원에서 사용하는 진단법인 Aβ42를 고정시킬 수 있는 물질과 진단하는 물질을 이용한 샌드위치 방법으로 측정을 하였으며, Pho-ABP를 고정(capture) 프로브로 Phi-PDPP를 진단 프로브로 사용하였다. 도 7a는 각 샘플 농도에 따른 PDPP에 대한 Aβ42 검출 신호 측정 결과를 나타낸다. 각 샘플 내 존재하는 Aβ42 농도가 증가할수록 이에 따른 신호가 비례적으로 증가되었다. 도 7b는 각 샘플 내 Aβ42의 농도를 동일하게 하여 PDPP를 이용하여 Aβ42를 측정한 결과를 나타낸다. 그 결과 각 샘플의 Aβ42 농도에 따라 신호가 유사하게 측정되었으며, 약 3 fg/ml의 검출한계가 측정되었다. FIG. 1 shows the results of measurement of binding force against amyloid 42 of a conventional peptide-type probe and a single peptide probe of the present invention. Pho-ABP or Pho-peptide refers to a single peptide of Sequence Listing 1 sequence, and Phi-ABP or Phi- peptide refers to a single peptide of Sequence Listing 2 sequence. 1 (a) shows the peptide sequence and dissociation constant of the first and second sequences of the sequence listing synthesized through amino acid modification, and FIG. 1 (b) shows a graph showing the binding strength between each peptide and A? 42 1 (c) shows the results of comparing the binding ability of A [beta] 42 to the existing cyclic peptide and the modified peptide. The smaller the dissociation constant, the easier it is to bind to the target.
2 shows a schematic diagram of one embodiment of synthesis of a polyvalent-directed peptide polymer (PDPP) that binds to amyloid beta 42. Fig. PhP-PDPP and Phi-PDPP can be formed by treating each single peptide (Pho-ABP, Phi-ABP) after PDL-SPDP backbone formation through reaction of PDL (150-300 kDa) and SPDP linker. Thereafter, unreacted ABPs can be separated using a gel filtration column, and ultimately, A [beta] 42 -bonded PDPPs can be synthesized.
FIG. 3 shows the binding force analysis results of PDPPs against amyloid beta 42. FIG. Each PDPP bound to A? 42 was treated according to the concentration and the binding force was measured. PDPPs were found to have increased binding strengths of about 10 ^6- fold and 10 ^3- fold, respectively, compared to the conventional peptide-type probe and the single peptide probe of the present invention. In addition, the binding affinity of PDPP over two peptide combinations was increased about 10 ⁴ times and 10 times higher than that of the existing single peptide and PDPPs.
Figure 4 shows the distribution of amyloid beta 42 in Alzheimer's patients cerebrospinal fluid (CSF). Overall, in patients with Alzheimer's disease (AD), Aβ42 levels in CSF are relatively lower than those in preAD patients. MMSE; mini-mental status examination, CDR; clinical dementia rating, WMS; wechsler memory scale.
FIG. 5 shows the results of analysis of the binding force of PDPP against A? 42 in CSF of Alzheimer patients. CSF samples were fixed in 96-well plates and the binding force was measured by treating the A [beta] 42 -bonded PDPP. Fig. 5 (a) shows the result of measuring binding force using various probes binding to A [beta] 42 by variously treating the AD CSF sample concentration (the average A [beta] 42 concentration of N6, N20 and N26). Pho-Phi-PDPP showed the best sensitivity. FIG. 5 (b) shows the result of measuring the binding force after variously treating the concentration of the CSAD sample in preAD and AD groups and binding PDPP bound to A? 42. The highest signal was detected in preAD samples with large amounts of A [beta] 42 in CSF.
6 shows a schematic diagram for carrying out the sandwich assay for detection of A? 42 in CSF. The same system as the conventional antibody-based assay can be applied, and examples using Pho-ABP as a fixing substance and Phi-PDPP as a diagnostic substance are shown.
7A and 7B show the results of detection limit analysis for A? 42 in CSF of A? 42-binding PDPP probes. The detection limit of Aβ42 in CSF was measured using PDPP for N17 (AD CSF) and O16 (preAD CSF), which showed a large difference in Aβ42 concentration. Commercial A [beta] 42 and recombinant A [beta] 42 proteins were also used to compare whether the A [beta] 42 concentration in CSF was accurately measured. In the detection limit measurement, Phi-ABP was used as a capture probe and Phi-PDPP was used as a diagnostic probe in a sandwich method using a substance capable of fixing Aβ42 and a diagnostic substance used in a conventional hospital . 7A shows the result of Aβ42 detection signal measurement for PDPP according to each sample concentration. As the concentration of Aβ42 present in each sample increased, the corresponding signal was increased proportionally. Fig. 7B shows the results of measuring A [beta] 42 using PDPP with the same concentration of A [beta] 42 in each sample. As a result, signals were similarly measured according to the A? 42 concentration of each sample, and a detection limit of about 3 fg / ml was measured.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예Example

실시예 1: Aβ42 결합 펩타이드 변형 및 결합력 분석Example 1 Modification of A [beta] 42 Binding Peptide and Binding Assay

고민감도 Aβ42 검출 프로브 개발을 위하여 기존 보고된 Aβ42 결합 고리형 펩타이드의 서열(CIPLPFYNC와 CFRHMTEQC, N말단과 C말단의 시스테인 잔기에 의한 S-S 결합으로 인한 고리형 구조의 펩타이드)을 다음과 같이 선형 펩타이드 형태로 변형하였다(참조: 도 1의 a). (CIPLPFYNC and CFRHMTEQC, N-terminal and C-terminal cysteine residues of SS-linked peptides) of the previously reported A [beta] 42 -binding cyclic peptides for the development of hyperpigmented A [beta] 42 detection probes are shown in the following linear peptide form (See Fig. 1 (a)).

Pho-ABP : Ac-IPLPFYNGCGK(FITC)-NH₂ Pho-ABP: Ac-IPLPFYNGCGK ( FITC) -NH 2

Phi-ABP : Ac-FRHMTEQGCGK(FITC)-NH₂ Phi-ABP: Ac-FRHMTEQGCGK ( FITC) -NH 2

표기된 아미노산 서열은 아미노 말단(N-말단)부터 나타낸다. N-말단에는 아미노 말단의 반응성 제거를 위해 아세틸화(Acetylation)를 시켰고 C-말단에는 카르복시말단에 FITC를 부착하기 위해 아미노산 K(Lysine)를 첨가하였다. 각각의 아미노산 서열의 카르복시말단 부근에는 GCGK가 첨가되는데, 이는 형광 펩타이드 탐침자 ABPs-GCGK(FITC)의 민감도를 극대화시키기 위한 과정에 응용하기 위해서 첨가한 것이다. 펩타이드의 Aβ42에 대한 결합력 분석을 위하여 각각의 펩타이드를 Aβ42가 고정된 96 웰 플레이트에 농도별로 희석하여 결합시켰다. 플레이트 각 웰의 Aβ42에 결합한 펩타이드는 형광광도계(Fluorometer)를 이용하여 펩타이드에 연결되어진 FITC의 최대 파장(Excitation : 495 nm, Emission : 520 nm)에서 각 펩타이드 농도에 대한 형광세기를 측정하였다. 펩타이드의 농도에 따른 형광 신호를 표지하여 포화곡선에 맞추어 K _d 값을 결정하였다 (Pho-ABP: 0.949±0.35 μM, Phi-ABP: 0.796±0.69 μM)(참조: 도 1의 b).The indicated amino acid sequence represents from the amino terminal (N-terminal). The amino acid K (Lysine) was added to the C-terminus to attach the FITC to the carboxy terminal, while the N-terminal was acetylated to remove the reactivity of the amino terminal. GCGK is added near the carboxy terminus of each amino acid sequence, which is added for application in the process to maximize the sensitivity of the fluorescent peptide probe ABPs-GCGK (FITC). To analyze the binding force of peptides to A [beta] 42, each peptide was diluted by concentration to bind to A [beta] 42-fixed 96 well plate. Peptides bound to A [beta] 42 in each well of the plate were measured for fluorescence intensity for each peptide concentration at a maximum wavelength (excitation: 495 nm, emission: 520 nm) of FITC connected to the peptide using a fluorescence spectrometer. The fluorescence signal according to the concentration of the peptide was labeled and adjusted to the saturation curve to obtain K _d (Pho-ABP: 0.949 + 0.35 [mu] M, Phi-ABP: 0.796 + 0.69 [mu] M) (see Fig.

실시예 2: Aβ42 결합 다중인식 펩타이드 고분자(PDPP) 합성 Example 2: Synthesis of A? 42 -bonded multi-recognition peptide polymer (PDPP)

펩타이드의 경우 항체에 비해 크기도 작고 합성의 용이하다는 장점이 있지만, 목표 단백질과의 결합 후 항체와 마찬가지로 진단 프로브로서는 신호가 낮은 제한이 있다. 이러한 단점을 보완하기 위해 본 발명에서는 생체적합성 고분자인 폴리펩타이드 체인을 기본으로 한 다중인식 펩타이드 고분자(Polyvalent-directed Peptide Polymer, PDPP) 프로브를 제작하였다. 고분자 사슬을 만들기 위해 체내 L-입체이성질체와 차이를 둔 폴리-D-라이신(PDL)을 사용하였으며, 이에 단일 펩타이드와 결합을 시키기 위하여 링커로써 이형 이중 기능성(heterobifunctional)의 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP)를 사용하였다. SPDP의 한 쪽에 위치한 N-히드록시숙신이미드 에스터는 좋은 이탈기(leaving group)로서 작용하여 PDL의 곁가지(side chain)에 존재하는 아민기(amine group)와의 치환반응으로 인해 PDL-SPDP를 연결시켰다. 이 후 PDL-SPDP 백본에 다른 한 쪽에 위치한 2-피리딜 디설파이드(pyridyl disulfide)와 단일 펩타이드의 카르복시말단 부근에 첨가된 시스테인의 설프히드릴기의 치환 반응에 의해 가교(cross-linking) 반응이 일어나면서 PDL-SPDP 고분자 백본에 각각의 펩타이드가 연결되며, 즉 PDL-SPDP-Pho-ABP(FITC)와 PDL-SPDP-Phi-ABP(FITC) (이하 Pho-PDPP와 Phi-PDPP) 형태의 프로브를 합성하였다. 이렇게 합성된 각각의 PDPPs는 겔 여과(gel filtration) 컬럼을 이용하여 반응하지 않은 단일 펩타이드와 PDL-SPDP 백본을 분리하여 최종적으로 PDPPs를 합성하였다. 합성된 PDPPs는 형광광도계(Fluorometer)를 이용하여 Aβ42 결합 펩타이드에 연결되어진 FITC의 최대 파장(Excitation: 495 nm, Emission : 520 nm)에서 각 펩타이드 농도에 대한 형광세기를 측정하여 농도를 결정하였다(참조: 도 2). Peptides are smaller in size and easier to synthesize than antibodies, but there is a lower signal limit for diagnostic probes as well as antibodies after binding to target proteins. In order to overcome such disadvantages, a polyvalent-directed peptide polymer (PDPP) probe based on a polypeptide chain of a biocompatible polymer was prepared. Poly-D-lysine (PDL), which differs from the body L-stereoisomer, was used to make the polymer chain. To this end, a heterobifunctional N-succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP) was used. The N-hydroxysuccinimide ester located on one side of the SPDP acts as a good leaving group and causes PDL-SPDP to be connected due to the substitution reaction with the amine group present in the side chain of PDL . The cross-linking reaction was then induced by the substitution of 2-pyridyl disulfide on the other side of the PDL-SPDP backbone with the sulfhydryl group of the cysteine added near the carboxy terminus of the single peptide The PDL-SPDP-Phi-ABP (FITC) (hereinafter referred to as Pho-PDPP and Phi-PDPP) probes are connected to the PDL-SPDP polymer backbone Were synthesized. Each of the synthesized PDPPs was separated from unreacted single peptide and PDL-SPDP backbone using a gel filtration column to finally synthesize PDPPs. The concentration of the synthesized PDPPs was determined by measuring the fluorescence intensity for each peptide concentration at the maximum wavelength (excitation: 495 nm, emission: 520 nm) of the FITC connected to the A? 42 binding peptide using a fluorescence spectrophotometer : Fig. 2).

실시 예 3: Aβ42 결합 다중인식 펩타이드 고분자(PDPP)에 대한 결합력 분석Example 3: Analysis of binding force to A? 42 binding multiple recognition peptide polymer (PDPP)

합성된 PDPPs의 Aβ42에 대한 결합력 분석을 진행하기 위하여 먼저 Aβ42를 96 웰 플레이트에 고정시켰다. 이 후 결합하지 않은 Aβ42를 세척 과정으로 제거하고, Aβ42가 결합된 플레이트에 PDPPs를 각각 농도별로 처리하였다. 결합한 각각의 PDPPs의 양을 형광광도계(Fluorometer)를 이용하여 각 PDPPs 내 연결되어진 단일 펩타이드의 FITC 최대 파장(Excitation : 495 nm, Emission : 520 nm)에서 PDPPs 농도에 대한 형광세기를 측정하였다. 각 PDPPs의 농도에 따른 형광 신호를 표지하여 포화곡선에 맞추어 K _d 값을 결정하였다(참조: 도 3).In order to analyze the binding force of the synthesized PDPPs to A? 42, A? 42 was first fixed on a 96-well plate. Subsequently, the unbound A [beta] 42 was removed by washing, and PDPPs were treated on the A [beta] 42 -containing plate by concentration. The fluorescence intensities of the combined PDPPs were measured by using a fluorometer to determine the PDPPs concentration at a maximum excitation wavelength (excitation: 495 nm, emission: 520 nm) of the single peptides connected to each PDPPs. The fluorescence signal according to the concentration of each PDPPs was labeled and the K _d value was determined according to the saturation curve (see FIG. 3).

PDPPs의 경우 각각 기존 고리형 펩타이드와 변형된 펩타이드에 비해 약 10^-2배와 10^-7배 이상 K _d 가 감소되는 것을 확인하였다. 또한 두가지 펩타이드 조합을 통한 PDPP의 경우 기존 단일 펩타이드와 PDPPs에 비해 약 10⁵배와 10배 이상으로 결합력이 증가되는 것을 확인하였다. PDPPs showed a decrease of about 10 ^-2 times and 10 ^-7 times more K _d than the conventional cyclic and modified peptides, respectively. In addition, it was confirmed that the binding force of PDPP through the combination of two peptides was about 10 ⁵ times and 10 times higher than that of the existing single peptide and PDPPs.

실시 예 4: 알츠하이머 환자 시료 뇌척수액(CSF)을 통한 PDPP의 Aβ42에 대한 검출 능력 검증Example 4 Verification of Detection Ability of PDPP on A [beta] 42 Through CSF Samples CSF (Alzheimer's Disease Patient)

Aβ42 결합 PDPP에 대한 추가적인 결합 능력을 검증하기 위하여, 실제 알츠하이머 환자에서 추출한 뇌척수액(CSF)을 통해 실험을 진행하였다. 일반 사람의 경우 Aβ42가 뇌에서 CSF로 이동하여 다시 뇌로 이동하는 순환과정을 거쳐 자연적으로 분해됨에 따라 일반 사람의 CSF에는 상대적으로 높은 농도의 Aβ42가 존재한다. 이에 반하여 알츠하이머 환자의 경우 Aβ42가 뇌세포에 축적되므로 CSF에 낮은 농도로 존재한다. 이러한 원리로 알츠하이머 환자의 질환 진행정도에 따른 다양한 Aβ42를 이용하여 PDPP 프로브 검출 능력을 검증하였다. 먼저 채취된 CSF 샘플은 의료기관에서 일차적으로 CSF 내 Aβ42 농도를 측정하였으며, 이미 Aβ42가 CSF 내 얼마나 존재하는지 정량화된 시료를 이용하여 본 실험에 사용하였다(참조: 도 4). 총 11개의 CSF 샘플을 제공받았으며, 4개의 preAD 환자 시료와 7 개의 AD 환자 시료 그룹으로 나누었다. 이 중 각 그룹의 Aβ42 농도 차가 크게 형성되는 시료만을 선택하여 PDPP를 처리하였다. 시료의 농도는 일정 비율로 감소시키며 측정되었으며, 측정 방법은 위에 제시된 형광측정법을 이용하여 진행하였다(참조: 도 5). Experiments were conducted with CSF extracted from patients with Alzheimer's disease in order to verify the additional binding ability to Aβ42-binding PDPP. In general, A [beta] 42 migrates from the brain to the CSF and then travels back to the brain. As a result, the CSF of the general person has a relatively high concentration of A [beta] 42 as natural decomposition proceeds. In contrast, in Alzheimer's patients, A [beta] 42 accumulates in brain cells and thus exists in a low concentration in CSF. In this way, the ability to detect PDPP probes was verified using a variety of Aβ42 according to disease progression in Alzheimer's patients. First, the collected CSF samples were firstly measured for Aβ42 concentration in CSF in a medical institution and used for this experiment using a quantified sample of how much Aβ42 was present in the CSF (see FIG. 4). A total of 11 CSF samples were received, divided into 4 preAD patient samples and 7 AD patient sample groups. PDPP treatment was performed by selecting only samples in which the difference in A [beta] 42 concentration was large in each group. The concentration of the sample was measured at a constant rate, and the measurement was carried out using the above-described fluorescence measurement method (see FIG. 5).

도 4에서 전반적으로 AD 경우 CSF 내 Aβ42 농도가 상대적으로 preAD 환자보다 낮은 농도를 함유한다. MMSE는 미니정신기능검사(mini-mental status examination), CDR은 임상치매척도(clinical dementia rating), WMS은 웩슬러기억척도(wechsler memory scale)를 나타낸다. In Fig. 4, the A [beta] 42 concentration in the CSF in the AD case is relatively lower than that in the preAD patients. The MMSE is the mini-mental status examination, the CDR is the clinical dementia rating, and the WMS is the wechsler memory scale.

CSF 샘플을 96 웰 플레이트에 고정시키고, Aβ42 결합 PDPP를 처리하여 결합력을 측정한 결과를 도 5의 a에 나타내었다. AD 환자 CSF 샘플 농도(N6, N20, N26의 평균 Aβ42 농도)를 다양하게 처리하고, Aβ42에 결합하는 다양한 프로브들을 이용하여 결합력을 측정한 결과 Pho-Phi-PDPP가 가장 좋은 민감도를 나타내었다. 한편 preAD와 AD 그룹 내 CSF 샘플의 농도를 다양하게 처리하고, Aβ42에 결합하는 PDPP를 결합시킨 후 결합력을 측정하였다. 그 결과 CSF 내 많은 양의 Aβ42가 존재하는 preAD 샘플에서 가장 높은 신호가 검출되었다. CSF sample was immobilized on a 96-well plate and A? 42-binding PDPP was treated to measure the binding force, which is shown in FIG. Phi-Phi-PDPP showed the best sensitivity when binding force was measured using a variety of probes binding to A? 42 and various treatment of AD CSF sample concentration (average A? 42 concentration of N6, N20 and N26). On the other hand, the concentrations of CSF samples in preAD and AD groups were variously treated, and PDPP bound to A? 42 was bound and the binding force was measured. As a result, the highest signal was detected in preAD samples in which a large amount of A? 42 was present in CSF.

실시 예 5: CSF 내 Aβ42에 대한 PDPP 검출한계 측정Example 5 Measurement of PDPP detection limit on A? 42 in CSF

Aβ42 농도 차이가 많이 나타나는 N17(AD CSF)과 O16(preAD CSF)을 대상으로 PDPP를 이용하여 CSF 내 Aβ42에 대한 검출한계를 측정하였다. 또한 CSF내 Aβ42 농도가 정확히 측정되는지 비교하기 위하여 상업적인 Aβ42와 재조합 Aβ42 단백질을 사용하였다. 검출한계 측정에서는 기존 병원에서 사용하는 진단법인 Aβ42를 고정시킬 수 있는 물질과 진단하는 물질을 이용한 샌드위치 방법으로 측정을 하였으며(참조: 도 6), 사용된 물질은 Pho-ABP를 캡춰(capture) 프로브로 Phi-PDPP를 진단 프로브로 사용하였다. 모든 측정 방법은 위에 제시된 형광측정법을 이용하여 진행하였다(참조: 도 7a 및 7b). The detection limit of Aβ42 in CSF was measured using PDPP for N17 (AD CSF) and O16 (preAD CSF), which showed a large difference in Aβ42 concentration. Commercial A [beta] 42 and recombinant A [beta] 42 proteins were also used to compare whether the A [beta] 42 concentration in CSF was accurately measured. The detection limit was measured by a sandwich method using a substance capable of immobilizing Aβ42, which is a diagnostic method used in existing hospitals, and a diagnostic substance (see FIG. 6), and the substance used was Pho-ABP as a capture probe Phi-PDPP was used as a diagnostic probe. All measurement methods were carried out using the above-described fluorescence measurement method (see FIGS. 7A and 7B).

각 샘플 농도에 따른 PDPP에 대한 Aβ42 검출 신호 측정 결과를 도 7a에 나타내었다. 각 샘플 내 존재하는 Aβ42 농도가 증가할수록, 이에 따라 신호가 비례적으로 증가되었다. 각 샘플 내 Aβ42의 농도를 동일하게 한 상태에서 PDPP를 이용하여 Aβ42를 측정한 결과를 도 7b에 나타내었다. 각 샘플의 Aβ42 농도에 따라 신호가 유사하게 측정되었으며, 약 3 fg/ml의 검출한계가 측정되었다. The result of measurement of A? 42 detection signal for PDPP according to each sample concentration is shown in FIG. As the concentration of A [beta] 42 present in each sample increased, the signal was proportionally increased accordingly. Fig. 7B shows the result of measurement of A [beta] 42 using PDPP in the same concentration of A [beta] 42 in each sample. Signals were similarly measured according to the A [beta] 42 concentration of each sample, and a detection limit of about 3 fg / ml was measured.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

<110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) <120> Polyvalent directed peptide polymer for Using in Detection for Amyloid beta 42 <130> PN150646 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amyloid beta 42 targeting peptide <400> 1 Ile Pro Leu Pro Phe Tyr Asn Gly Cys Gly Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amyloid beta 42 targeting peptide <400> 2 Phe Arg His Met Thr Glu Gln Gly Cys Gly Lys 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amyloid beta 42 targeting peptide <400> 3 Lys Gly Cys Gly Ile Pro Leu Pro Phe Tyr Asn 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amyloid beta 42 targeting peptide <400> 4 Lys Gly Cys Gly Phe Arg His Met Thr Glu Gln 1 5 10 <110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) <120> Polyvalent directed peptide polymer for Use in Detection for Amyloid beta 42 <130> PN150646 <160> 4 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amyloid beta 42 targeting peptide <400> 1 Ile Pro Leu Pro Phe Tyr Asn Gly Cys Gly Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amyloid beta 42 targeting peptide <400> 2 Phe Arg His Met Thr Glu Gln Gly Cys Gly Lys 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amyloid beta 42 targeting peptide <400> 3 Lys Gly Cys Gly Ile Pro Leu Pro Phe Tyr Asn 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amyloid beta 42 targeting peptide <400> 4 Lys Gly Cys Gly Phe Arg His Met Thr Glu Gln 1 5 10

Claims

A polyvalent directed peptide polymer for detection of amyloid beta 42 comprising:
(a) a poly-D-lysine backbone; And
(b) a plurality of single peptide probes consisting of at least one amino acid sequence selected from the first to fourth sequences of the Sequence Listing bound to the side chain amines of the poly-D-lysine backbone.

The multi-recognition peptide polymer according to claim 1, wherein the poly-D-lysine has a molecular weight of 50 to 1000 kDa.

2. The method of claim 1, wherein the linkage between the side chain amine of the poly-D-lysine backbone and the single peptide probe is further formed by a linker comprising: (i) a side chain amine of the poly- And (ii) a second functional group which forms a bond with the single peptide probe. 2. The multi-recognition peptide polymer according to claim 1, wherein the first functional group is an amide bond.

4. The multiple recognition peptide polymer of claim 3, wherein the bond between the single peptide probe and the second functional group of the linker is a disulfide bond or an amide bond.

The multi-recognition peptide polymer according to claim 1, wherein the single peptide probe is labeled with at least one selected from the group consisting of a chromogenic enzyme, a radioactive isotope, a chromophor, a luminescent material and a fluorescent material. .

A composition for diagnosing Alzheimer's disease comprising the multiple recognition peptide polymer of any one of claims 1 to 5.

A kit for diagnosing Alzheimer's disease comprising the multiple recognition peptide polymer of any one of claims 1 to 5.