KR101600212B1 - 스키르푸신 a 및 스키르푸신 b를 포함하는 조성물 및 이의 항비만 가능성 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 스키르푸신 A 및 스키르푸신 B를 포함하는 조성물 및 이의 항비만 가능성을 개시한다. 또한, 스키르푸신 A 및 스키르푸신 B를 포함하는 조성물을 이용하는 지방세포 생성을 억제하는 방법을 개시한다. 또한, 본 발명은 스키르푸신 A 및 스키르푸신 B를 포함하는 조성물을 이용하는 포유류 내에서 비만을 치료법적으로 처리하는 방법을 개시한다. 더욱이, 본 발명은 또한 향부자의 근경의 생물활성유도분별을 통하여 A. 스키르푸신 A 및 스키르푸신 B; 및 B. 피세아타놀 및 이의 다이머 스키르푸신 A 및 스키르푸신 B를 포함하는 조성물을 획득하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 대체로 지방세포 생성 억제를 위한 조성물에 관련된다. 보다 구체적으로, 본 발명은, 스키르푸신 A 및 스키르푸신 B를 포함하는 조성물 및 이의 항-지방세포 생성/항비만 가능성을 개시한다.
신장 와인용 포도(Xinjiang wine grape)로부터 하이드록시스틸벤다이머(hydroxystilbene dimer)인 스키르푸신 A는 이전에 "Kong Q et al in J Sci Food Agric. 2010 Apr 15;90(5):823-8"에서 보고되었다. 스키르푸신 A는, 이의 아밀로이드-베타-펩타이드 응집 억제 활성화(Riviere C et al(2010)), 단일 산소 ?칭(singlet oxygen quenching 및 DNA 보호활성화(protective activity)(Kong Q et al(2010)); 및 베타-세크리테이즈억제활성화(beta-secretase inhibitory activity)(Jeon SY et al(2007))에 대해 언급되었다.
스키르푸신 B는 피세아타놀(piceatannol)의 잘 형성된 바사 완화 다이머(vasa-relaxing dimer)이고, 다량의 패션후르츠에서 획득되었다(Sano S et al, Identiflcation of the strong vasa - relaxing substance Scirpusin B, a dimer of piceatannol, from passion fruit(Passiflora edulis ) seeds, J Agric Food Chem. 2011 Jun 8;59(11):6209-13). 또한, 스키르푸신 B는, 이의 완만한 GSH 활성화(Maruki-Uchida H et al(2013)) 및 항-HIV 특성(Yang GX et al(2005))에 대해 알려져 있다.
이미 향부자 튜브 추출물의 헥산추출이 항비만 특성을 나타내는 것으로 보고되었다(Administration of Cyperus rotundus rhizomes extract prevents Weight Gain in Obese Zucker rats. Lemaure et al. 2007. Phytother Res. 21: 724 -730.). 헥산분획물(fraction)이, α-시페르논(Cypernone), 로튠덴(Rotundene), β-셀리넨(selinene), 카라메네(Calamenene), 사이페렌(Cyperene), d-카디넨(cadinene), 시페로턴돈(Cyperotundone), 카달렌(Cadalene), 패출로레온(Patchoulenone), 노트카텐(Nootkatene), 슈레놀(Sugeonol), g-카라코렌(calacorene), 코부손(Kobusone), 사이페롤(Cyperol), 이소코부손(Isokobusone) 및 Epi-a-셀리넨(Yadav et al. International Journal of Pharmaceutical and Clinical Research 2010; 2(1): 20-22)을 포함하는 것으로 분석되었다. 그러나, 본 발명은 향부자의 에틸아세테이트 분획물 내에 항비만 활성화를 개시한다. 이러한 에틸아세테이트 분획물은, 많은 헥산 분획물의 성분 중 어느 것도 포함하지 않는다. 본 에틸아세테이트 분획물은 스틸베노이드 유도 화합물(stilbenoid derived compounds)을 포함하고, 화합물의 종류는 지금까지 어떤 연구자에 의해 발견되어 보고되지 않았다. 그러므로, 스틸베노이드 유도 화합물 존재의 예상하지 못한 발견과 이들의 항비만화 작용의 독특한 조합이다. 향부자로부터 근경의 생물활성유도분별 이후에, 다이머 스키르푸신 A 및 스키르푸신 B과 함께 피세아타놀로 농축되는 다른 서브분획물과 비교시 우수한 항-지방세포생성(anti-adipogenic) 효과를 보여주는 두 개의 피세아타놀 다이머 스키르푸신 A 및 스키르푸신 B의 농축된 존재에 의해 특징되는 에틸아세테이트층의 서브분획물은 놀라운 발견이다. 이에, 본 발명의 발명자는 향부자 근경의 에틸 아세테이트 분획물에서 스키르푸신 A 및 스키르푸신 B의 존재 및 이의 항지방세포생성/항비만 가능성을 최초로 제시한다.
이에, 조성물 스키르푸신 A 및 스키르푸신 B; 및 이들의 항-지방세포 생성/항비만가능성을 개시하기 위한 본 발명의 주요 목적이다.
스키르푸신 A 및 스키르푸신 B를 포함하는 조성물을 사용하는 포유류의 세포 내에 지방세포 생성을 억제하는 방법을 개시하는 것이 본 발명의 다른 목적이다.
스키르푸신 A 및 스키르푸신 B를 포함하는 조성물을 이용하는 포유류 내에서 비만을 관리하는 방법을 개시하는 것이 본 발명의 또 다른 목적이다.
향부자의 근경의 생물활성유도분별을 통하여 A. 스키르푸신 A 및 스키르푸신 B; 및 B. 피세아타놀 및 이의 다이머 스키르푸신 A 및 스키르푸신 B를 포함하는 조성물을 획득하는 방법을 개시하는 것이 본 발명의 다른 목적이다(It is a further objective of the present invention to disclose a method of obtaining compositions comprising A. scirpusin A and scirpusin B and B. piceatannol and its dimers scirpusin A and scirpusin B through bioactivity guided fractionation of the rhizomes of Cyperus rotundus.)
본 발명은 상기 언급된 목적들을 실현하고, 관련된 이로움을 더 제공한다.
본 발명의 요약
본 발명은 스키르푸신 A(scirpusin A) 및 스키르푸신 B를 포함하는 조성물 및 이의 항-지방세포 생성/항비만 가능성(anti-adipogenesis/anti-obesity potential)을 개시한다. 또한, 본 발명은 스키르푸신 A 및 스키르푸신 B를 포함하는 조성물을 이용하여 포유류 내에서 비만을 관리(managing)하는 방법을 개시한다. 본 발명은, 향부자(Cyperus rotundus)의 근경(rhizomes)의 생물활성유도분별을 통하여 A. 스키르푸신 A 및 스키르푸신 B; 및 B. 피세아타놀(piceatannol) 및 이의 다이머 스키르푸신 A 및 스키르푸신 B를 포함하는 조성물을 획득하는 방법을 더 개시한다. 본 발명의 다른 특징 및 이점은, 본 발명의 원리를 예시로서 기술하는, 첨부된 이미지와 함께 이루어지는 다음에 따른 더 구체적인 설명으로부터 명백해질 수 있다.
도 1은, 향부자의 근경으로부터 활성성분(active principles)을 추출하는 단계를 개요화한 플로우 차트를 보여준다.
도 2, 2a, 2b 및 3, 3a, 3b 및 3c는, 피세아타놀 다이머 스키르푸신 A 및 스키르푸신 B로 자연적으로 강화된 에틸아세테이트층(ethyl acetate layer naturally enriched with piceatannol dimers scirpusin A and scirpusin B)의 각각의 서브분획물 III 및 IV의 LC-MS 분석을 보여준다.
도 4 및 도 5는, 획득된 [M+H] 값이 다이머의 구조 및 이와 동일하게 보고된 보고된 데이타(Sano et al., 2011)와 매우 잘 상응하는 것을 나타내는 HRMS에 의한 데이타를 보여준다.
도 2, 2a, 2b 및 3, 3a, 3b 및 3c는, 피세아타놀 다이머 스키르푸신 A 및 스키르푸신 B로 자연적으로 강화된 에틸아세테이트층(ethyl acetate layer naturally enriched with piceatannol dimers scirpusin A and scirpusin B)의 각각의 서브분획물 III 및 IV의 LC-MS 분석을 보여준다.
도 4 및 도 5는, 획득된 [M+H] 값이 다이머의 구조 및 이와 동일하게 보고된 보고된 데이타(Sano et al., 2011)와 매우 잘 상응하는 것을 나타내는 HRMS에 의한 데이타를 보여준다.
가장 바람직한
실시예의
설명
가장 바람직한 실시예에서, 본 발명은 각각 STR#1 및 STR#2로 표시되는 스키르푸신 A 및 스키르푸신 B를 포함하는 항지방세포생성/항비만 조성물에 관련된다.
본 발명의 다른 가장 바람직한 실시예에서, 본 발명은, 포유류의 세포(mammalian cells) 내에서 지방세포 생성(adipogenesis)을 억제하는 방법에 관련되고, 상기 방법은, 각각 STR#1 및 STR#2으로 표시되는 스키르푸신 A 및 스키르푸신 B를 포함하는 조성물과 지방세포화(adipogenic) 포유류의 세포를 접촉하는 것을 유도하는 단계를 포함한다.
가장 바람직한 다른 실시예에서, 본 발명은 포유류 내에서 지방세포 생성에 의한 비만(obesity)을 치료법적으로(therapeutically) 억제하는 방법에 관련되고, 상기 방법은, 상기 치료법적 억제(therapeutic inhibition)가 필요한 포유류 내에, 각각 STR#1 및 STR#2으로 표현되는 스키르푸신 A 및 스키르푸신 B를 포함하는 조성물의 식이요법 보충(dietary supplementation) 단계를 포함한다.
가장 바람직한 다른 실시예에서, 본 발명은, 포유류의 세포 내에서 지방세포 생성을 억제하기 위한, STR#1 및 STR#2으로 표시되는 스키르푸신 A 및 스키르푸신 B를 포함하는 조성물의 용도에 관련된다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 본 발명은 또한, A. STR#1 및 STR#2로 표시되는 스키르푸신 A 및 스키르푸신 B; 및 B. 피세아타놀 및 각각 STR#1 및 STR#2로 표시되는 이의 다이머 스키르푸신 A 및 스키르푸신 B를 포함하는 항지방세포생성/항비만 조성물을 획득하기 위한 향부자의 근경의 생물활성유도분별을 위한 공정에 관련되며, 상기 공정은 다음의 단계를 포함한다:
1. 향부자의 근경을 건조하고 이를 분쇄하여 조분말(coarse powder)을 형성하는 단계 1;
2. 3 배 부피(volumes)의 헥산으로 상기 단계 1의 분말을 추출하고 다음으로, 가열하고, 3 시간 동안 환류하고, 여과하여 헥산 용해성 분획물 및 사용된 재료(spent material)를 획득하는 단계 2;
3. 3 배 부피의 메탄올로 단계 2의 사용된 재료를 추출하고 다음으로, 가열하고 3시간 동안 환류하고, 여과하여 메탄올 용해성 활성 분획물 및 사용된 재료를 획득하는 단계 3;
4. 수용성 메탄올 내에 상기 단계 3의 메탄올 용해성 활성 분획물을 가용화(Solubilizing)하고, 연속적으로 클로로폼(chloroform, CHCl3), 에틸아세테이트(Ethyl acetate, EtOAc) 및 메탄올로 파티셔닝(partitioning)하여, 각각의 상기 클로로폼 층, 에틸아세테이트 층 및 상기 수용성 메탄올 층을 획득하는 단계 4;
5. 상기 클로로폼 층, 에틸아세테이트 층 및 상기 수용성 메탄올 층의 생물활성유도분별이 더 이루어지는 단계 5, 상기 생물활성 파라미터는, 상기 클로로폼 층, 상기 에틸아세테이트 층 및 상기 수용성 메탄올 층의 3T3-L1 쥐 지방세포(adipocytes, 포유류의 지방세포(mammalian adipocytes)) 내에서 지방세포 생성을 억제하는 능력이다.
6. 상기 클로로폼 층, 에틸아세테이트 층 및 상기 수용성 메탄올 층에 의하여 예시된(exemplified) 지방세포 생성 억제에 대한 IC50(㎍/㎖)수치(각각 0, 9.39 및 66.42)를 계산하는 단계 6.
7. 생물활성(지방세포생성 억제) 생물지표(biomarker)를 확인하기 위해 컬럼분별(column fractionation)을 사용하는 상기 에틸아세테이트 층을 분별(Fractionation)하는 단계 7, 상기 분별은, 분획물이 메탄올: 클로로폼의 극성 증가로 용리(eluted)되어 상기 에틸 아세테이트 층(분획물)의 서브-분획물을 획득하는 단계를 포함한다.
8. 상기 단계 7의 서브-분획물으로 생물활성(항-지방세포 생성) 분석을 실시하는 단계 8.
9. 상기 단계 8의 최상의 생물활성 서브 분획물을 확인하고 이의 LC-MS 분석을 실시하여 생물활성 성분 스키르푸신 A 및 스키르푸신 B를 확인하는 단계 9;
10. 상기 단계 7의 서브 분획물을 분취 HPLC에 통과시켜 정제된 다이머를 획득하고, 이의 고분해능질량분석법(High Resolution Mass Spectroscopy, HRMS), 액체색층분석매스분석법(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS/MS) 및 핵자기공명분광법(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR)을 실시하여 생물활성 성분 스키르푸신의 구조 및 질량(mass)을 확인하는 단계 10.
본 발명의 발명자는, 단계 2 이전에 제시된 헥산 추출물을 연구하였고, 스키르푸신 A & 스키르푸신 B이 존재하지 않는 것을 발견하였다. 이에, 단계 1의 헥산 추출물은 단계 7에서 구체화된 에틸아세테이트 분획물과 구조적으로 다르다. 그러므로, 상기 향부자의 에틸아세테이트 추출물은 "Lemaure et al. 2007. Phytother Res. 21: 724-730"의 연구에 관련된 헥산 추출물과 상당히 다르다.
상세한 설명의 다음 섹션은 본 발명의 가장 바람직한 실시예의 실례가 되는 예시로 구성된다.
실시예 1: 향부자 근경의 생물활성유도분별(도.1)
방법
건조된 향부자 근경이 조분말을 형성하도록 분쇄되었다. 다음으로, 상기 분쇄된 분말은 3 배 부피의 헥산으로 추출되고 다음으로 가열하고, 3 시간 동안 환류하여 여과되어 헥산 용해성 분획물 및 사용된 재료를 획득하였다. 상기 사용된 재료는 3 배 부피의 메탄올로 더 추출되고 다음으로, 가열하고 3 시간 동안 환류하고 여과하여 메탄올 용해성 활성 분획물 및 사용된 재료를 획득하였다. 상기 메탄올 용해성 분획물은 수용성 메탄올 내에 가용화되고 클로로폼(CHCl3), 에틸아세테이트(EtOAc) 및 메탄올로 연속적으로 파티션화되어, 각각 상기 클로로폼 층, 에틸 아세테이트 층 및 상기 수용성 메탄올 층을 획득하였다. 상기 클로로폼 층, 에틸 아세테이트 층 및 상기 수용성 메탄올층은 생물활성유도분별이 더 이루어지고, 상기 생물활성 파라미터는 3T3-L1 쥐 지방세포(mammalian adipocytes) 내에서 지방세포 생성을 억제하는 상기 클로로폼 층, 에틸아세테이트 층 및 수용성 메탄올 층의 능력이었다. 지방세포 생성억제 정도를 연구하기 위한 "Salazar Olivo et al(1995), Wu Z et al(1998), Fu M et al(2005)"로부터 승인된 "Oil Red 0" 염색기술의 단계들이 하기의 실시예 1A에서 설명된다. 그 결과는 표 A에 제시하였다.
실시예 1A
지방세포의 최종분화(Terminal differentiation)는 큰 세포질 소낭(cytoplasmic vesicles) 내에 많은 함량의 지질 축적에 의해 동반된다. 세포 배양(cell culture)에서 지방세포 분화(adipocyte differentiation)를 측정하는 일반적 에세이(assay)는 염료 "Oil Red-O(ORO)"로 이루어진다. ORO는 지방세포 분화의 신뢰 지표(reliable indicator)인 지질-용해성 브라이트 레드 염료이다.
원리
"Oil Red 0"(Solvent Red 27, Sudan Red 5B, C.I. 26125, 및 C26H24N40)은, 냉동 섹션 상에 천연 트리글리세리드(triglycerides) 및 지질 및 파라핀 섹션 상에 일부 지질단백질(lipoproteins)을 염색하기 위해 사용되는 용성색소(lysochrome, 지용성 염료) 디아조 염료(diazo dye)이다. 518(359) nm에서 최대 흡광도를 갖는 레드 파우더 외관이다. "Oil Red 0"은 "Sudan"염색에 사용되는 염료 중 하나이다. 유사한 염료는 "Sudan III, Sudan IV, 및 Sudan Black B"를 포함한다. 상기 염색은 알콜고정(alcohol fixation)이 상기 지질을 제거하는 것과 같이, 신선한 샘플 상에 수행되어진다. "Oil Red 0"는 매우 진한 레드색을 제공하고, 이에 따라 염색이 더 쉽게 보이도록 주로 "Sudan III" 및 "Sudan IV"를 대신한다. "Oil red 0"은 유용성 염료이다. 유용성 염료는 일반적인 알콜성 염료 용액보다, 조직/세포 내에서 유지질 기질(substances) 내에서 염료의 큰 용해성을 보여준다. 따라서, 세포를 깊게 염색할 수 있다.
대략 60 X 104 세포인 3T3-L1 세포는 70-80 % 군체를 얻도록 48-72 hrs 동안 배양된다. 48 hrs 이후, 신선하게(freshly) 준비된 200 ㎕의 AIM(지방세포생성 유도 매체(induction medium))이 첨가된다. 72 hrs 이후에 상이한 농도 내에서 테스트 화합물과 함께 200 ㎕ APM(지방세포생성 증식 매체(progression medium))이 웰(wells)에 첨가된다. 상기 세포는 5 % C02 및 95 % 공기의 가습된 분위기(370 C)에서 48 hrs 동안 배양된다. 상층액(supernatant)은 렙틴(leptin), 아디포넥틴(adiponectin), IL-6 및 TNF-알파의 측정을 위해 수집되고 저장된다. 세포는 10 % 프로말린의 100 ㎕를 첨가하여 고정되고, ORO 염색이 이루어진다. OD는 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 492 nm에서 확인된다.
상기 결과는 "Graphpad prism software"를 사용한 IC50수치로 표현된다. 지방세포 생성 억제의 백분율은 다음으로 계산된다:
% 억제(Inhibition) = C-T/T*100
여기서,
C - 분화(differentiating)/비분화세포 내에서 "Oil red 0"의 흡광도(absorbance)
T - 샘플 처리된 분화/비분화 세포 내에서 "Oil red 0"의 흡광도
표 A
상기 에틸아세테이트층은, 9.39의 IC50(㎍/㎖) 수치를 갖는 지방세포 생성억제에 관련해서 최상 생물활성을 예시되었다. 다음으로, 이러한 분획물은, 상기 생물활성(지방세포 생성억제) 생체지표를 확인하기 위해 컬럼분별이 이루어졌다. 컬럼분별은 메탄올:클로로폼 혼합물의 극성 증가에 따라 에틸아세테이트 층의 서브 분획물을 용리하는 단계를 포함하였다. 상기 에틸아세테이트 층의 서브 분획물은 I, II, III 및 IV로 라벨화되고, 생물활성(항-지방세포 생성) 평가(evaluation)가 실시된다. 지방세포형성억제 활성도 평가의 필수 단계는 상기 실시예 1A에서 개요된 절차를 포함한다. 그 결과는 표 B에 요약되었다.
표 B
서브 분획물 III 및 IV은 다음으로, 피세아타놀 다이머스키르푸신 A 및 스키르푸신 B(도 2 및 3)로 강화된 양 분획물으로 LC-MS가 실시되었다. 상기 LC-MS/MS 분석은 RP C18 컬럼(250 x 4.6 mm, 5 μ입자크기)을 사용하는 "Thermo Electronics Finnigan LCQ Advantage MAX spectrometer"를 사용하여 수행되었다. 시스템은 "써모 핀니감 서베이어 PDA 감지기(Thermo Finnigan surveyor PDA detector), LC 펌프 및 자동 견본기(autosampler)로 구성된다. 이동상(Mobile Phase)은, 용매(B) 아세토나이트릴(Acetonitrile) 및 용매(A) 물 내에 0.1% 아세트산(Acetic acid)으로 35 분 동안 진행된 그라디언트(Gradient)를 포함하였다. 용매 B 농도는 0-5 분 동안 5 %, 5-20 분 동안 5-60 %, 20-25분 동안 60-100 %, 25-27 분 동안 100-5 %에서 증가되고, 27-35 분 동안 5 %에서 일정하게 정지되었다. 고정상(Stationary phase)은 "Thermo BDS hypersil", C18 컬럼(치수 - 250mm x 4.6mm); 유속(Flow rate): 1 ml/min; 탐지거리(Detection Range): 260 nm로 이루어진다.
이온화 파라미터(Ionization parameters): APCI 포지티브모드(positive mode), 전원전압(Source voltage)-4.50 kV, 모세관온도(Capillary temperature)-225 degrees, 모세관 전압(Capillary voltage)-43.00 V.
데이타 해석
스키르푸신 A의 질량(Mass)은 470.13인 것으로 보고된다. 상기 프로토콜을 사용하는 포지티브 이온화 모드 내에서 18.77 min에 측정된 질량 [M+H]은 471.08이다. 스키르푸신 B의 질량은 486으로 보고된다. 포지티브 이온화 모드에서 17.94 min에 측정된 상기 질량 [M+H]은 487.05이다.
향부자 추출물에서 피세아타놀 다이머의 존재 확인의 1차 수준은 질량 상의 이러한 사전 정보에 기초를 둔다. 스키르푸신 A은, 스키르푸신 A의 기준 시료(authentic sample)와 직접비교에 의해서 바로 확인되었다.
다음으로, 서브분획물은, 이후에 스키르푸신 B를 확인하기 위해, 다음으로 분석기술 고분해능 질량분석법(HRMS), 액체 색층분석매스분석법(LC-MS/MS) 및 핵자기공명법(NMR)을 이용하여 연구되는 정제된 다이머 스키르푸신 B를 획득하기 위해서 예비 HPLC(preparative HPLC)를 거쳤다. HRMS에 의한 데이타는, 상기 다이머의 구조 및 이와 동일하게 보고된 데이타(Sano et al., 2011)와 매우 잘 매치되는 [M+H]=487.138를 나타내었고(도 4 및 5), 또한, 스키르푸신 B의 구조는 극저온탐침(cryogenic probe) NMR를 사용하여 확인되었다(도 6). 상기 화합물은 논문(Sano et al., 2011)에서 획득가능한 데이타와 비교한 이후 증명되었다. NMR data(CD30D):δ: 56.73, 93.50, 95.39, 100.79, 102.93, 105.87 x 2, 112.21, 112.63, 114.83, 114.91, 117.03, 118.42, 118.61, 122.17, 129.46, 129.53, 133.53, 135.60, 144.90, 145.01, 145.09, 145.21, 146.27, 158.36, 158.56 x 2, 161.46. 500 MHz에서 획득된 APT (첨부된 양성자 테스트) NMR 스펙트럼은 스키르푸신 B의 구조를 더 확인하였다. 또한, 스키르푸신 B의 기준 시료는 "Sano et al., 2011"에 의해서 분리된 패션후르츠에서 분리되고, 상기 기술된 향부자에서 분리된 스키르푸신 B와 직접적으로 비교되었고, 향부자 내에서 스키르푸신 B의 존재를 확증하는 HPLC 유지시간, 질량 스펙트라 데이타 및 NMR 데이타의 분석은 가장 확실한 방법이다.
실시예
2
쥐 내에 CYPRO-AF(활성 에틸아세테이트 분획물) 및 CYPRO-D1 추출물(피세아타놀 다이머스키르푸신 A 및 스키르푸신 B 내에서 자연적으로 강화된 에틸아세테이트 서브분획물, ethyl acetate subfraction naturally enriched in piceatannol dimers scirpusin A and scirpusin B)의 항비만 효과에 대한 효험 평가
실험의 목적
연구의 목적은 C57 쥐들 내에서 항비만 효과에 대한 Cypro-AF 및 Cypro-D1 추출물의 효험을 측정하기 위한 것이다.
테스트 시스템 세부사항
테스트 수행 세부사항
사육(HUSBANDRY)
그룹화
그룹화는 동물의 그룹화는 체중 무작위배정(body weight randomization) 및 계층화 방법(stratification method)으로 환경순응의 마지막 날에 이루어졌다. 동물의 그룹화는, 사용된 동물의 다양한 체중이 각 그룹의 평균 체중의 ± 20 %를 초과하지 않도록 이루어졌다.
연구 디자인
상기 동물은 각 10 마리 동물(5 수컷 및 5 암컷)로 이루어진 그룹 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로 6 그룹으로 나누어졌다. 상기 그룹의 세부사항은 그룹 당 동물의 수/성별 및 투여량은 하기의 표 내에 나타내었다:
제형 세부사항 및 투여량
테스트 대상 Cypro-AF 및 Cypro-Dl는 다른 함량으로 제형화하기 위해 증류수에 용해되었다. 신선하게 제형화된 테스트 항목은 튜브식(gavage)으로 오랄을 통하여 투여되었다. 동물 당 투여량은 연구 기간 내내 모든 동물에게 10(ml/kg body weight)로 유지되었다. 하기의 표는 테스트 제형의 세부 사항을 제공한다.
비만 유도
주 연구 기간 및 비만 유도 기간 동안에, G1 통제 그룹 동물(Control group animals)은 10 kcal %(fat)을 포함하는 표준 조절식 사료(normal control diet feed)D12450B를 먹이고, G2 내지 G6 그룹 동물은 60 kcal%(fat)를 포함하는 고지방식 사료(High fat diet feed)D12492를 먹였다.
주 연구
주 연구는 비만 유도 이후에 시작되었다. Cypro-AF의 3(doses) 및 Cypro-D1의 1(dose)이 동물에 27일 기간 동안 연속적으로 28일부터 하루씩(from Day 28 daily consecutively for a period of 27 days) 동물에서 투여되었다. 주연구 중에 지속적 규정식의 급식이 비만의 유도 중에 이루어졌다. 다른 그룹의 동물이 상기 연구 기간의 28일에서 54일까지 테스트 대상을 받는 동안, 상기 G1 통제 및 G2 고지방식 통제 그룹 동물은 증류수와 함께 투여되었다. 투여의 체적량(dose volume)은 개별 동물의 주간 체중에 따라 유지되었다. 상기 연구 전체 기간은 61일이다(7일 순응기간 +27일 비만의 유도 기간 +27일 주연구 기간).
관찰
다음의 측정은 주 연구 기간 동안 이루어졌다.
사료 소비
개별 동물 사료 소비는 기록되었다. 주간 평균 사료 소비는 계산되고 기록되었다.
체중
개별 동물 체중은 연구 기간 동안 1일 및 주간(± 1일) 이후에 받은 날에 기록되었다.
임상적 관찰
모든 동물은 연구 기간 동안에 하루 2회 임상적으로 관찰되었다.
임상 병리학(Clinical Pathology)
연구 기간의 완료시, 혈액 샘플이 임상 화학을 위해 혈액응고방지제가 없고, 혈액학을 위해 포타슘 에틸렌 디아민 테트라 아세트산(potassium ethylene di-amide tetra acetic acid, K2-EDTA)혈액응고방지제를 포함하는 투브 내에 동물로부터 수집되었다. 상기 혈액응고방지제 없이 튜브 내에 수집된 혈액 샘플은 세럼을 획득하도록 10 분동안 3000 rpm에서 원심분리되었다. 혈액 샘플은 미세 모세관(capillary tube)의 도움으로 마일드한 에테르 마취 하에서 안와정맥총주사방법(retro-orbital plexus puncture method)으로 인도적으로 수집되었다. 다음으로 혈액학 및 임상적 화학 파라미터가 분석되었다.
혈액학(Hematology)
다음의 혈액학 파라미터는 "Sysmex, KX-21(Transasia Bio-Medicals Ltd., India)"을 사용하여 추정되었다.
임상적 화학
다음의 임상적 화학 파라미터는 세럼 샘플로부터 "Erba Mannheim Chem Touch analyzer"(Transasia Bio-Medicals Ltd., India)"을 사용하여 분석되었다.
병리학
55일에, 연구 기간이 완료된 이후에, 모든 동물은, 가스 챔버 내에서 과량의 카본다이옥사이드로 노출시켜 인도적으로 죽이고, 다음으로 외부 및 내부 전체 부검(gross necropsy)이 이루어졌다.
전체 부검
상기 동물은 내부 및 외부전체 병리학 실험(external and internal gross pathological examinations)이 실시되었다.
장기 무게
모든 동물에 의한 다음의 장기는 적절하게 피착 조직들을 손질하고, 가능한 건조를 피하기 위해 바로 젖은 상태에서 무게를 측정하였다: 뇌, 흉선, 간, 부신, 신장(쌍으로 된 장기), 지라, 심장, 난소/정소(쌍으로된 장기).
지방간 무게(Fat deposits Weights)
모든 동물로부터 다음의 지방간이 수집되고 무게측정되었다.
1. 부고환 지방(Epididymal Fat)
2. 갈색지방( Brown Fat)
3. 난소지방(Ovarian Fat)
통계적 분석 및 보고 준비
본 연구에서 획득된 로우데이터(raw data)는 컴퓨터 통계처리(statistical processing)가 실시되었다. 상기 데이터의 컴퓨터 인쇄물(첨부 형태로)은 원(original)로우데이터로 검증되었다. 검증(verification) 이후에, 상기 데이타는 "GraphPad Prism version 5.01, GraphPad Software"을 이용하여 체중, 혈액학 및 임상적 화학 파라미터에 대한 데이타를 위한 "Dunnett's post test"으로 "One-way ANOVA(Analysis of Variance)"가 이루어졌다. 하기에 제시된 보고서를 통하여 모든 분석 및 비교는, G1이 G3, G4, G5, 및 G6과 비교되는 a, 및 G2가 G3, G4, G5, 및 G6과 비교되는 b의 위첨자에 의해 표시되어 나타내었으며, 신뢰도(P<0.05)의 95 % 수준에서 측정될 수 있다:*:이용 가능한 경우라면 통계적으로 중요한(P<0.05)(Statistically significant (P<0.05) wherever applicable)
데이타는 다음에 따른 비교에 의해서 "One way-ANOVA statistical analysis"방법으로 실시되었다:
하기에 나타낸 바와 같이, G1 그룹{통제 그룹(10 kcal% Fat)} 대 G3 그룹{CYPRO-AF 50 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}, G4 그룹{CYPRO-AF - 100 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}, G5 그룹{CYPRO-AF 200 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)} 및 G6 그룹{CYPRO-D1 10 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}:
하기에 나타낸 바와 같이, G2 - 고지방식 통제(60 kcal% Fat) 대 G3 그룹{CYPRO-AF 50 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}, G4 그룹{CYPRO-AF-100 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}, G5 그룹{CYPRO-AF 200 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)} 및 G6 그룹{CYPRO-D1 10 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}:
결과
사료 소비
암컷 동물 및 수컷 동물의 주간 평균 사료 소비의 정리는 각각 표 1 및 표 2에 나타내었다. 연구 기간 동안에 동물의 사료 소비에서 통계적으로 주목할 만한 차이점은 없었다.
표 1-수컷 동물의 주간 평균 사료 소비(g)의 정리
표 2: 암컷 동물의 주간 평균 사료 소비(G)의 정리
체중
수컷 및 암컷 동물의 주간 체중의 정리는 표 3 및 표 4에 각각 나타내었다.
표 3: 수컷 동물의 체중(g)의 정리
표 4: 암컷 동물의 체중(g)의 정리
수컷 동물에서, G1 그룹{통제 그룹(10 kcal% Fat)}과 비교해서, G3 그룹{CYPRO-AF - 50 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}, G4 그룹{CYPRO-AF - 100 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}, G5 그룹{CYPRO-AF - 200 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)} 및 G6 그룹{CYPRO-D1 - 10 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}에서 21일에 평균주간 체중수치의 통계적으로 중요한 증가가 있었다. 이러한 변화는 상기 사료의 지방 함량의 차이에 의한 것으로 고려된다.
수컷 동물에서, G1 그룹{통제 그룹(10 kcal% Fat)}과 비교해서, G4 그룹{CYPRO-AF - 100 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}, G5 그룹{CYPRO-AF - 200 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)} 및 G6 그룹{CYPRO-D1 - 10 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}에서 28일에 평균주간 체중수치의 통계적으로 중요한 증가가 있었다. 이러한 변화는 상기 사료의 지방 함량의 차이에 의한 것으로 고려된다.
수컷 동물에서, G1 그룹{통제 그룹(10 kcal% Fat)}과 비교해서, G3 그룹{CYPRO-AF - 50 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}, G4 그룹{CYPRO-AF - 100 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}, G5 그룹{CYPRO-AF - 200 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)} 및 G6 그룹{CYPRO-D1 - 10 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}에서 35, 42, 49 및 55일의 평균주간 체중수치에서 감소가 있었다. 이러한 변화는 테스트 항목의 투여에 의한 것으로 고려된다.
암컷 동물에서, G1 그룹{통제 그룹(10 kcal% Fat)}과 비교해서, G4 그룹{CYPRO-AF - 100 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}, G5 그룹{CYPRO-AF - 200 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)} 및 G6 그룹{CYPRO-D1 - 10 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}에서 21에 평균주간 체중수치(weekly body weight values)의 통계적으로 중요한 증가가 있었다. 이러한 변화는 상기 사료의 지방 함량의 차이에 의한 것으로 고려된다.
암컷 동물에서, G1 그룹{통제 그룹(10 kcal% Fat)}과 비교해서, G3 그룹{CYPRO-AF - 50 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}, G4 그룹{CYPRO-AF - 100 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}, G5 그룹{CYPRO-AF - 200 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)} 및 G6 그룹{CYPRO-D1 - 10 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}에서 28 일에 주간 체중수치의 통계적으로 중요한 증가가 있었다. 이러한 변화는 상기 사료의 지방 함량의 차이에 의한 것으로 고려된다.
암컷 동물에서, G1 그룹{통제 그룹(10 kcal% Fat)}과 비교해서, G3 그룹{CYPRO-AF - 50 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}, G4 그룹{CYPRO-AF - 100 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}, G5 그룹{CYPRO-AF - 200 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)} 및 G6 그룹{CYPRO-D1 - 10 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}의 35, 42, 49 및 55일에 평균 주간 체중수치에서 감소가 있었다. 이러한 변화는 테스트 대상의 투여에 의한 것으로 고려된다.
임상적 관찰
수컷 및 암컷 동물의 임상적 징후의 정리는 각각 표 5 및 표 6에 나타내었다. 상기 동물은 연구기간 동안에 임상적 관찰 중에 건강 상태 내에서 정상 및 건강한 것으로 확인되었다.
표 5: 수컷 동물에서 임상적 징후 관찰의 정리
표 6: 암컷 동물에서 임상적 징후 관찰의 정리
혈액학
수컷 및 암컷 동물의 혈액학 파라미터 측정의 요약은 각각 표 7 및 표 8에 나타내었다.
표 7: 수컷 동물의 혈액학 정리
표 7: 수컷 동물의 혈액학 정리
표 8: 암컷 동물의 혈액학 정리
[
PARA
0100]
표 8: 암컷 동물의 혈액학 정리
G1 대 G3, G4, G5, 및 G6 간의 혈액학 파라미터 통계적 분석 비교
평균 적혈구 헤모글로빈 농도(Mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC)
수컷 동물에서, G1 그룹{통제 그룹(10 kcal% Fat)}과 비교해서, G4 그룹{CYPRO-AF - 100 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}의 평균 MCHC 수치에서 통계적으로 중요한 증가가 있었다. 이러한 변화는 용량 의존성 반응이 없는 것과 같이 부수적인 것으로 고려될 수 있다(These changes can be considered as incidental as there was no dose dependent response.)
평균 적혈구용적 및 평균 적혈구 헤모글로빈
암컷 동물에서, G1 그룹{통제 그룹(10 kcal% Fat)}과 비교해서, G3 그룹{CYPRO-AF - 50 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}에서 평균 MCV 및 MCH 수치에서 통계적으로 중요한 증가가 있었다. 이러한 변화는 용량 의존성 반응이 없는 것과 같이 부수적인 것으로 고려될 수 있다.
평균적혈구색소량(Corpuscular Hemoglobin) 및 평균적혈구색소량 농도
암컷 동물에서, G2 그룹{고지방식 통제 그룹(60 kcal% Fat)}과 비교해서, G5 그룹{CYPRO-AF -200 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}의 평균 MCH 및 MCHC 수치에서 통계적으로 중요한 증가가 있었다. 이러한 변화는 용량 의존성 반응이 없는 것과 같이 부수적인 것으로 고려될 수 있다.
임상적 화학
수컷 및 암컷 동물의 임상적 화학 파라미터 측정의 요약이 각각 표 9 및 표 10에 나타내었다.
표 9:
표 9:
표 10:
표 10:
G1 대 Q3, G4, G5, 내지 G6 간의 임상적 화학 파라미터 통계적 분석 비교
총단백질
암컷 동물에서, G1 그룹{통제 그룹(10 kcal% Fat)}과 비교해서, G3 그룹{CYPRO-AF - 50 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}및 G4 그룹{CYPRO-AF - 100 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}의 평균 총단백질 수치에서 통계학으로 중요한 감소가 있었다. 이러한 변화는 상기 사료의 지방 함량의 차이에 의한 것으로 고려될 수 있다.
트리글리세리드(Triglycerides)
암컷 동물에서, G1 그룹{통제 그룹(10 kcal% Fat)}과 비교해서, G3 그룹{CYPRO-AF - 50 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}, G4 그룹{CYPRO-AF - 100 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}, G5 그룹{CYPRO-AF - 200 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)} 및 G6 그룹{CYPRO-D1 - 10 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}의 평균 중성지방 수치에서 통계학으로 중요한 감소가 있었다. 이러한 변화는 상기 사료의 지방 함량의 차이에 의한 것으로 고려된다.
총콜레스테롤(Total Cholesterol)
수컷 동물에서, G1 그룹{통제 그룹(10 kcal% Fat)}과 비교해서, G3 그룹{CYPRO-AF - 50 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)} 및 G6 그룹{CYPRO-D1 10 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}의 평균 총콜레스테롤 수치에서 통계적으로 중요한 증가가 있었다. 이러한 변화는 상기 사료의 지방 함량의 차이에 의한 것으로 고려된다.
암컷 동물에서, G1 그룹{통제 그룹(10 kcal% Fat)}과 비교해서, G5 그룹{CYPRO-AF - 200 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}의 총콜레스테롤 수치에서 통계적으로 중요한 증가가 있었다. 이러한 변화는 상기 사료의 지방 함량의 차이에 의한 것으로 고려된다.
고밀도 지질(High density lipids)
수컷 동물에서, G1 그룹{통제 그룹(10 kcal% Fat)}과 비교해서, G5 그룹{CYPRO-AF - 200 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}의 고밀도 지질 수치에서 통계학적 중요한 감소가 있었다. 이러한 변화는 상기 사료의 지방 함량의 차이에 의한 것으로 고려된다.
저밀도 지질(Low density lipids)
수컷 동물에서, G1 그룹{통제 그룹(10 kcal% Fat)}과 비교해서, G3 그룹{CYPRO-AF - 50 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}, G4 그룹{CYPRO-AF - 100 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)} 및 G6 그룹{CYPRO-D1 - 10 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}의 평균 저밀도지방 수치에서 통계적 중요한 증가가 있었다. 이러한 변화는 상기 자료의 지방 함량(fat content)의 차이에 의한 것으로 고려된다.
초저밀도 지질(Very low density lipids)
암컷 동물에서, G1 그룹{통제 그룹(10 kcal% Fat)}과 비교해서, G5 그룹{CYPRO-AF - 200 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}의 평균 초저밀도 지질 수치에서 통계적으로 중요한 증가가 있었다. 이러한 변화는 상기 사료의 지방 함량에서 차이에 의한 것으로 고려된다.
G2 대 G3, G4, G5, 내지 G6 간에 임상적 화학 파라미터 통계적 분석비교
트리글리세리드
수컷 동물에서, G2 그룹 고지방식 통제(60 kcal% Fat)와 비교해서, G3 그룹{CYPRO-AF - 50 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}, G4 그룹{CYPRO-AF - 100 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}, G5 그룹{CYPRO-AF - 200 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}및 G6 그룹 {CYPRO-D1 - 10 mg/kg + 그룹고지방식 (60 kcal% Fat)}의 평균 트리글리세리드 수치에서 감소가 있었다. 이러한 트리글리세리드 수치 변화에서 감소는 본 테스트 대상의 효과에 의한 것이다.
암컷 동물에서, G2 그룹 고지방식 통제(60 kcal% Fat)와 비교해서 G6 그룹{CYPRO-D1 - 10 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}의 평균 트리글리세리드 수치에서 통계학적 중요한 감소가 있었다. 이러한 트리글리세리드 수치 변화에서 감소는 본 테스트 대상의 효과에 의한 것이다.
G2 그룹 고지방식 통제(60 kcal% Fat)와 비교해서 G3 그룹{CYPRO-AF - 50 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}, G4 그룹{CYPRO-AF - 100 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)} 및 G5 그룹{CYPRO-AF - 200 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}의 평균 중성지방 수치(Triglyceride values)에서 감소가 있었다. 이러한 중성지방 수치 변화에서 감소는 본 테스트 대상의 효과에 의한 것이다.
총콜레스테롤
수컷 동물에서, G2 그룹 고지방식 통제(60 kcal% Fat)와 비교해서, G3 그룹{CYPRO-AF - 50 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}, G4 그룹{CYPRO-AF - 100 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)} 및 G5 그룹{CYPRO-AF - 200 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}의 평균 총콜레스테롤 수치에서 감소가 있었다. 이러한 총콜레스테롤 수치 변화에서 감소는 본 테스트 대상의 효과에 의한 것이다.
암컷 동물에서, G2 그룹 고지방식 통제(60 kcal% Fat)와 비교해서, G3 그룹{CYPRO-AF - 50 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}, G4 그룹{CYPRO-AF - 100 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}, 및 G6 그룹{CYPRO-D1 - 10 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}의 평균 총콜레스테롤 수치에서 감소가 있었다. 이러한 총콜레스테롤 수치 변화에서 감소는 본 테스트 대상의 효과에 의한 것이다.
고밀도 지질(High density lipids)
G2 그룹 고지방식 통제(60 kcal% Fat)와 비교해서, G3 그룹{CYPRO-AF - 50 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}, G4 그룹{CYPRO-AF - 100 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}, G5 그룹{CYPRO-AF - 200 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)} 및 G6 그룹{CYPRO-D1 - 10 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}의 평균 고밀도 지질 수치에서 통계적으로 상당한 감소가 있었다.
이러한 고밀도 지질 수치에서 통계적으로 상당한 감소는 본 테스트 대상의 효과에 의한 것이다.
암컷 동물에서, G2 그룹 고지방식 조절(High fat diet Control, 60 kcal% Fat)과 비교해서, G3 그룹{CYPRO-AF - 50 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}, G4 그룹{CYPRO-AF - 100 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}, G5 그룹{CYPRO-AF - 200 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)} 및 G6 그룹{CYPRO-D1 - 10 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}의 평균 고밀도 지질 수치에서 통계적으로 상당한 감소가 있었다. 이러한 고밀도 지질 수치에서 감소는 본 테스트 대상의 효과에 의한 것이다.
저밀도 지질(Low density lipids)
수컷 동물에서, G2 그룹 고지방식 조절(60 kcal% Fat)과 비교해서, G5 그룹{CYPRO-AF - 200 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}의 평균 저밀도 지질 수치에서 감소가 있었다. 이러한 저밀도 지질 수치 변화에서 감소는 본 테스트 대상의 효과에 의한 것이다.
초저밀도 지질 수치
수컷 동물에서, G2 그룹 고지방식 조절(60 kcal% Fat)과 비교해서, G3 그룹{CYPRO-AF - 50 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}, G4 그룹{CYPRO-AF - 100 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}, G5 그룹{CYPRO-AF - 200 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)} 및 G6 그룹{CYPRO-D1 - 10 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}의 평균 초저밀도 지질 수치 면에서 감소가 있었다. 이러한 초저밀도 지질 수치 변화의 감소는 본 테스트 항목의 효과에 의한 것이다.
암컷 동물에서, G2 그룹 고지방식 조절(60 kcal% Fat)과 비교해서 G3 그룹{CYPRO-AF - 50 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}, G4 그룹{CYPRO-AF 100 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}, 및 G6 그룹{CYPRO-D1 10 mg/kg + 고지방식(60 kcal% Fat)}의 평균 초저밀도 지질 수치(Very low density lipid values)의 상당한 감소가 있었다. 이러한 초저밀도 지질 수치 변화에서 감소는 본 테스트 대상의 효과에 의한 것이다.
결론
본 연구에서, 실험대상 Cypro-AF 및 Cypro-D1가 50, 100 및 200 mg/kg Bwt의 Cypro-AF 및 10 mg/kg Bwt의 Cypro-Dl에서 고지방식 다이어트를 유도한 비만 수컷 및 암컷 C57 동물에서 HDL, 트리글리세리드, 콜레스테롤, LDL 및 VLDL 농도와 같은 파라미터는 감소하는 효과를 갖는 것으로 결론지을 수 있다. 큰 통계학적 변화는 동물의 부검에 따라 지방간(fat deposit) 및 장기 무게에서 측정되지 않았다.
본 발명은 바람직한 구현예와 관련되어 기술되었지만, 본 발명이 한정되지 않는다는 것은 당업자에 의해서 명확하게 이해된다. 더욱이, 본 발명의 범위는 단지 첨부된 청구항과 함께 해석된다.
Claims (7)
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- 향부자(Cyperus rotundus)의 근경(rhizomes)을 건조하고 이를 분쇄(pulverizing)하여 조분말(coarse powder)을 형성하는 단계 1;
3 배 부피(volumes)의 헥산으로 상기 단계 1의 분말을 추출하고 다음으로, 가열하고, 3 시간 동안 환류하고, 여과하여 헥산 용해성 분획물 및 사용된 재료(spent material)를 획득하는 단계 2;
3 배 부피의 메탄올로 상기 단계 2의 사용된 재료를 추출하고 다음으로, 가열하고, 3시간 동안 환류하고, 여과하여 메탄올 용해성 활성 분획물 및 사용된 재료를 획득하는 단계 3;
수용성 메탄올 내에 상기 단계 3의 메탄올 용해성 활성 분획물을 가용화(Solubilizing)하고, 연속적으로 클로로폼(chloroform, CHCl3), 에틸아세테이트(Ethyl acetate, EtOAc) 및 메탄올로 파티셔닝(partitioning)하여, 각각의 상기 클로로폼 층, 에틸 아세테이트 층 및 상기 수용성 메탄올 층을 획득하는 단계 4;
상기 클로로폼 층, 에틸아세테이트 층 및 상기 수용성 메탄올 층의 생물활성유도분별이 더 이루어지는 단계 5, 상기 생물활성 파라미터는, 상기 클로로폼 층, 상기 에틸아세테이트 층 및 상기 수용성 메탄올 층의 3T3-L1 쥐 지방세포(adipocytes, 포유류의 지방세포(mammalian adipocytes)) 내에서 지방세포 생성을 억제하는 능력이다;
상기 클로로폼 층, 에틸아세테이트 층 및 상기 수용성 메탄올 층에 의하여 예시된(exemplified) 지방세포 생성 억제에 대한 IC50(㎍/㎖)수치(각각 0, 9.39 및 66.42)를 계산하는 단계 6;
생물활성(지방세포생성 억제) 생물지표(biomarker)를 확인하기 위해 컬럼 분별(column fractionation)을 사용하는 상기 에틸아세테이트 층을 분별(Fractionation)하는 단계 7, 상기 분별은, 분획물이 메탄올: 클로로폼의 극성 증가로 용리(eluted)되어 상기 에틸아세테이트 층(분획물)의 서브-분획물을 획득하는 단계를 포함;
상기 단계 7의 서브-분획물으로 생물활성(항지방세포 생성) 분석을 실시하는 단계 8;
상기 단계 8의 최상의 생물활성 서브 분획물을 확인하고 이의 LC-MS 분석을 실시하여 생물활성 성분 스키르푸신 A 및 스키르푸신 B를 확인하는 단계 9;
상기 단계 7의 서브 분획물을 분취 HPLC에 통과시켜 정제된 다이머를 획득하고, 이의 고분해능질량분석법(High Resolution Mass Spectroscopy, HRMS), 액체색층분석매스분석법(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS/MS) 및 핵자기공명분광법(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR)을 실시하여 생물활성 성분 스키르푸신의 구조 및 질량(mass)을 확인하는 단계 10
을 포함하는,
A. STR#l 및 STR#2으로 표시되는 스키르푸신 A 및 스키르푸신 B; 및 B. 피세아타놀, 및 각각 STR#l 및 STR#2으로 표시되는 이의 다이머 스키르푸신 A 및 스키르푸신 B; 를 포함하는, 지방세포 생성을 억제하기 위한 항비만 조성물을 획득하기 위한 향부자 근경의 생물활성유도분별을 위한 공정:
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