KR101599686B1 - 돌연변이된 BKCa 채널을 이용한 이온 채널 조절인자의 스크리닝 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이중 돌연변이된 BK_Ca 채널 컨스트럭트 및 이를 이용한 세포-기반된 신규한 이온 채널 조절인자의 스크리닝 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 이중 돌연변이된 BK_Ca 채널-포함 세포-기반된 시스템은 대조군과 비교하여 별도의 [Ca^{2 +}]_i의 증가 유무와 관계 없이 막 탈분극에 의해 현저하게 증가된 형광을 나타내며, 알려진 활성인자(예컨대, CTBIC)에 의해서 보다 촉발된 활성(G/V 곡선의 음적 방향으로의 이동)을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 시스템은 종래의 방법들(예컨대, 자동화된 패치 클램핑 방법)과 비교하여 보다 효과적이고 더욱 더 정밀하게 이온 채널의 활성 분석이 가능함으로써 이온 채널 조절인자들(modulators)의 분리/동정 뿐 아니라, BK_Ca 채널의 조절과 관련된 질환, 질병 또는 상태의 치료제 스크리닝에 유용하게 적용될 수 있다.

Description

돌연변이된 BKCa 채널을 이용한 이온 채널 조절인자의 스크리닝 방법{Screening Methods of a Ion Channel Modulator Using a Mutated BKCa Channel}

본 발명은 이중 돌연변이된 BK_Ca 채널 컨스트럭트 및 이를 이용한 세포-기반된 신규한 이온 채널 조절인자의 스크리닝 시스템에 대한 것이다.

막 탈분극(membrane depolarization)과 세포내 Ca^{2 +} 농도의 증가는 BK 또는 Maxi-K 채널로 알려진 큰 전도성을 가진 칼슘-활성화된 포타슘 채널(large-conductance calcium-activated potassium(BK_Ca) channels)을 활성화시킨다(Salkoff, et al ., 2006; Cui, et al ., 2009). 상술한 채널들은 신경세포의 흥분도(neuronal excitability), 신경전달물질 분비, 평활근세포의 수축 및 유모세포의 주파수 조정(frequency tuning)에서 중요한 생리학적 기능들을 수행한다(Brenner, et al ., 2000; Nelson, et al ., 1995; Fettiplace and Fuchs, 1999). BK_Ca 채널들은 동공-형성(pore-forming) α-서브유니트와 조절성 β-서브유니트로 구성된다. BK_Ca 채널의 α-서브유니트는 7개의 막통과 도메인들로 구성되며(Catterall, 1995) C-말단은 K⁺ 전도성(K⁺ conductance domain; RCK) 도메인을 조절하는 2개의 조절인자를 포함하는 데, 이들은 세포내 Ca^{2 +} 농도에 반응하는 게이트 링(gating ring)을 형성한다(Jiang, et al ., 2001).

BK_Ca 채널은 매력적인 치료 타겟인데, 이는 이들이 고혈압, 관상 동맥 경련(coronary artery spasm), 요실금(urinary incontinence) 및 많은 신경학적 질환들 과 밀접한 관련성을 가지기 때문이다(Ghatta, et al ., 2006). BK_Ca 채널이 결핍된 마우스는 요실금(incontinence), 과민성 방광(bladder overactivity) 및 발기 부전(erectile dysfunction) 같은 증상들을 나타낸다(Meredith, et al ., 2004; Werner, et al ., 2005). 또한, BK_Ca 채널의 기능 장애는 소뇌성 운동 실조증(cerebellar ataxia) 및 발작성 이상운동질환(paroxysmal movement disorders)을 초래할 수 있다(Lee and Cui, 2010). BK_Ca 채널의 활성화는 K⁺ 유출을 증가시키고 과다분극을 야기함으로써 세포를 안정화시킨다. 따라서, BK_Ca 채널의 활성을 개방 또는 강화시키는 물질은 세포내 흥분성(excitability)를 감소시키고 평활근세포들의 긴장을 완화시키는 치료학적 이점들을 부여할 수 있다.

현재까지, 종래의 패치 클램프 분석이 이온 채널 조절인자들(modulators)의 발견을 위한 가장 신뢰할만한 기법으로 간주되고 있다. 하지만, 매뉴얼 패치 클램핑(patch clamping)은 매우 낮은-처리능력(low-throughput)을 나타내며 높은 수준의 기술적 전문 지식을 요구한다. 따라서, 플럭스 어세이(flux assays), 방사성리간드 결합 어세이(radioligand binding assays), 형광-기반된 어세이 및 자동화된 패치 클램핑 같은 더 높은 처리능력을 요구하는 많은 대체 방법들이 개발되어 왔다(Zheng, et al ., 2004). 그럼에도 불구하고, 상술한 더 높은 처리능력을 가진 방법들과 합치되는 BK_Ca 채널들의 분석을 위한 세포-기반된 어세이들을 확립하는 것이 어려운 실정이었다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 이온 채널 조절인자들(modulators)의 동정 및 연구를 위한 세포-기반된 효과적인 고속(high-throughput) 스크리닝 시스템을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 야생형 BK_Ca 채널 유전자 내 G733 및 N736 위치의 아미노산 서열이 돌연변이된 과다활성(hyperactive) BK_Ca 채널을 제조하고 상기 BK_Ca 채널이 낮은 Ca²⁺의 농도에서도 전압 펄스에 의해 활성화되며 세포-기반된 어세이 플랫폼에서 BK_Ca 채널 활성인자(예컨대, CTBIC)에 의해 활성 촉진(potentiation)된다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 이온 채널 조절인자(modulators)의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 돌연변이된 BK_Ca 채널 단백질을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 서열목록 제4서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상술한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 세포를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 BK_Ca 채널의 조절과 관련된 질환, 질병 또는 상태( diseases, disorders or conditions)의 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 이온 채널 조절인자(modulators)의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) 야생형 BK_Ca 채널 유전자 내 G733 및 N736 위치의 아미노산 서열이 돌연변이된 아미노산 서열-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및

(b) 상기 세포에서 상기 돌연변이된 BK_Ca 채널의 활성을 분석하는 단계로, 상기 시험물질이 상기 돌연변이된 BK_Ca 채널의 활성을 촉진시키면 이온 채널 활성제(activators)로 판단하고 상기 돌연변이된 BK_Ca 채널의 활성을 억제시키면 이온 채널 억제제(inhibitors)로 판단하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 서열목록 제4서열의 아미노산 서열로 이루어진 돌연변이된 BK_Ca 채널 단백질을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제4서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합된(operatively linked) 프로모터; 및 (c) 터미네이터(terminator)를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 재조합 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.

본 발명자들은 이온 채널 조절인자들의 동정 및 연구를 위한 세포-기반된 효과적인 고속 스크리닝 시스템을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 야생형 BK_Ca 채널 유전자 내 G733 및 N736 위치의 아미노산 서열이 돌연변이된 과다활성 BK_Ca 채널을 제조하고 상기 BK_Ca 채널이 Ca^{2 +}의 농도의 증가 없이 전압 펄스에 의해 활성화되며 세포-기반된 어세이 플랫폼에서 BK_Ca 채널 활성인자(예컨대, CTBIC)에 의해 활성 촉진된다는 것을 확인하였다.

세포 내 2차 전달물질인 칼슘의 농도 증가에 따라 다양한 K⁺ 이온 채널의 활성화를 통해 세포가 전기적으로 안정화된다. 세포내 칼슘 농도는 세포외로부터 의 유입(예컨대, 전압-의존성 칼슘 채널) 또는 세포내 저장소로부터의 배출(예컨대, ER)에 의해 순간적으로 증가된다. 이에 따라 K⁺ 이온 채널이 활성화된다. K⁺ 이온 채널은 단위시간 당 통과시키는 K⁺ 이온의 양에 따라 큰 전도성을 가진 채널(BK_Ca), 중간 전도성을 가진 채널(IK_Ca; intermediate conductance calcium-activated potassium channel) 및 작은 전도성을 가진 채널(SK_Ca; small conductance calcium-activated potassium channel)로 구분할 수 있다.

BK_Ca 채널은 세포막을 가로지르는 K⁺ 이온의 큰 전도성으로 특징화할 수 있는 이온 채널로, Maxi-K 또는 slo1으로도 불리운다. BK_Ca 채널은 막 전위(membrane electrical potential)의 변화 및/또는 세포내 칼슘 이온의 농도([Ca^{2 +}]_i) 증가에 의해 활성화(개방)된다. 그 결과, 세포내 K⁺ 이온은 세포 외로 방출됨에 따라 전기화학적 농도의 변화를 야기하여 세포막 과다분극(세포막을 가로지르는 전위의 증가) 및 세포 흥분성의 감소(세포가 활동 전위를 전도할 가능성의 감소)를 초래한다.

BK_Ca 채널은 다양한 생리학적 과정들(예컨대, 평활근의 수축, 신경세포의 흥분성, 달팽이관 내 유모세포의 전기적 튜닝, 등)의 조절에 핵심적인 기능을 가진다. BK_Ca 채널은 동공-형성 α-서브유니트와 조절성 β-서브유니트로 구성된다. 보다 상세하게는, BK_Ca 채널의 α-서브유니트는 독특한 막통과 도메인인 S0, 전압 센싱 도메인인 S1-S4, K⁺ 채널 동공 도메인인 S5 및 S6, 그리고 한쌍의 RCK 도메인으로 구성된 세포질 C-말단 도메인(cytoplasmic C-terminal domain, CTD; 두 번째 RCK 도메인 내에 '칼슘 볼(calcium bowls)'로 불리는 칼슘 이온 결합 부위 존재)으로 구성된다.

이온 채널 조절인자들의 동정 및 연구를 위해 패치 클램프 방법이 통상적으로 이용되어 왔지만, 매우 낮은 효율을 가진다는 커다란 단점을 가진다. 이를 극복하기 위해, 다양한 대체 방법들(예컨대, 자동화된 패치 클램핑, 플럭스 어세이, 형광-기반된 어세이, 등)이 제시되고 실행되어 왔으나 보다 효과적이고 용이한 채널 분석 방법이 시급히 요구되고 있는 실정이다.

본 발명은 세포-기반된 이온 채널 조절인자의 신규한 스크리닝 방법을 제공한다. 더욱이, 본 발명의 방법은 상업적으로 이용가능한 형광 어세이 방법을 통해 이온 채널의 활성 변화를 매우 간편하고 정교하게 검출할 수 있다는 장점을 가진다.

먼저, 본 발명의 방법은 이중 돌연변이된 BK_Ca 채널(G733D/N736K)을 제조한다(pre-(a) 단계).

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 이중 돌연변이된 BK_Ca 채널(G733D/N736K)의 제조에 이용되는 재조합 벡터는 (a) 서열목록 제4서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합된(operatively linked) 프로모터; 및 (c) 터미네이터(terminator)를 포함하는 재조합 벡터이다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 재조합 벡터는 (i) 상술한 본 발명의 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열; (ii) 상기 (i)의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결되며 동물세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터; 및 (iii) 동물세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위를 포함하는 재조합 벡터를 포함한다. 야생형 BK_Ca 채널의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열에 기재되어 있다.

본 명세서에서 용어 "프로모터"는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 본 발명의 재조합 벡터에서 목적 뉴클레오타이드 서열은 상기 프로모터에 작동적으로 연결된다. 본 명세서에서 용어 "작동적으로 결합된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터 서열, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 트랜스레이션을 조절하게 된다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 재조합 벡터가 진핵세포(예컨대, AD-293 세포)에 적용되는 경우, 이용될 수 있는 프로모터는, 본 발명의 서열목록 제4서열의 아미노산 서열-코딩 뉴클레오타이드 서열의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터 및 효모 세포에서 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, CMV(cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, 효모(S. cerevisiae) GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 프로모터, 효모(S. cerevisiae) GAL1 내지 GAL10 프로모터 및 효모(Pichia pastoris) AOX1 또는 AOX2 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는, CMV 프로모터이다.

또한, 본 발명에 이용되는 발현 컨스트럭트는 폴리 아네닐화 서열을 포함한다(예: 소성장 호르몬 터미네이터(BGH pA) 및 SV40 유래 폴리 아데닐화 서열).

또한, 본 발명의 벡터는 선택마커를 추가적으로 포함한다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 네오마이신, 제네티신, 암피실린, 카나마이신, 하이그로마이신, 스트렙토마이신, 페니실린, 클로람페니콜, 겐타마이신, 카베니실린 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법들을 이용할 수 있으며, 예를 들어 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법(Cohen, et al ., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 69: 2110-2114(1972)), 하나한 방법(Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166: 557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, et al ., Nucleic. Acids Res., 16: 6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있으며, 진핵세포인 경우, 리포펙션(lipofection), 전기동공법(electroporation), 리포좀-매개 전이방법(Wong, et al., Gene, 10: 87-94(1980)) 및 레트로바이러스-매개 전이방법(Chen, H.Y., et al., (1990), J. Reprod. Fert. 41:173-182; Kopchick, J.J. et al., (1991) Methods for the introduction of recombinant DNA into chicken embryos. In Transgenic Animals, ed. N.L. First & F.P. Haseltine, pp.275-293, Boston; Butterworth-Heinemann; Lee, M.-R. and Shuman, R. (1990) Proc. 4th World Congr. Genet. Appl. Livestock Prod. 16, 107-110), 마이크로인젝션, 유전자총(particle bombardment), YAC에서 이용되는 효모 구형질체/세포 융합, 식물세포에서 이용되는 아그로박테리움-매개된 형질전환 등을 이용하여 실시할 수 있으며, 보다 구체적으로는 리포펙션 방법으로 실시한다.

이후, 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 세포에 시험물질을 접촉시킨다. 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포는 특별하게 제한되지 않으며, 구체적으로는 AD-293 세포를 포함한다. 본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "시험물질"은 이중 돌연변이된 BK_Ca 채널 단백질의 활성도에 영향을 미치는 지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 화학물질, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA(small interference RNA), shRNA(small hairpin RNA 또는 short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 펩타이드 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 스크리닝 방법에 의해 분석되는 시험물질이 화학물질인 경우, 단일 화합물 또는 화합물들의 혼합물(예컨대, 세포 또는 조직 배양물)일 수 있다. 시험물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 상업적으로 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 상업적으로 구입 가능하다. 시험물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, '1-비드 1-화합물' 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt, et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb, et al ., Proc . Natl . Acad. Sci . U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann, et al ., J. Med . Chem . 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell, et al ., Angew . Chem . Int . Ed . Engl . 33, 2059, 1994; Carell, et al., Angew . Chem . Int . Ed . Engl . 33, 2061; Gallop, et al ., J. Med . Chem . 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.

본 발명에서 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 명세서에서 용어 "상보적(complementary)"은 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건, 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 타겟(예컨대, BK_Ca 채널 단백질의 활성에 영향을 미치는 유전자)에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하는 것으로 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있으며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 보다 구체적으로는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 길이는 6 내지 100 염기이고, 보다 구체적으로는 8 내지 60 염기이고, 가장 구체적으로는 10 내지 40 염기이다.

본 발명에서 용어 "siRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(참조: WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자 치료 방법으로 제공된다. siRNA는 식물, 벌레, 초파리 및 기생충에서 처음으로 발견되었으나, 최근에 siRNA를 개발/이용하여 포유류 세포 연구에 응용되었다(Degot S, et al ., 2002; Degot S, et al ., 2004; Ballut L, et al ., 2005).

본 발명에서 이용될 수 있는 siRNA 분자는, 센스 가닥(예를 들어, BK_Ca 채널 단백질의 활성에 영향을 미치는 유전자 mRNA 서열에 상응하는(corresponding) 서열)과 안티센스 가닥(예를 들어, BK_Ca 채널 단백질의 활성에 영향을 미치는 유전자 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다. 또한, 본 발명에서 이용될 수 있는 siRNA 분자는, 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다.

siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 구체적으로는, 전체 길이는 10 내지 100 염기, 보다 구체적으로는 15 내지 80 염기, 그리고 보다 더 구체적으로는 20 내지 70 염기이다.

본 발명에서 용어 "shRNA(small hairpin RNA 또는 short hairpin RNA)"는 견고한 헤어핀 턴을 만드는 RNA의 서열을 나타내며, 이는 RNA 간섭을 통해 유전자 발현을 사일런스시키는 데 이용될 수 있다. shRNA는 세포 도입용 벡터를 이용하며 shRNA를 발현할 수 있는 U6 프로모터를 주로 이용한다. 이러한 벡터는 항상 딸세포로 전달되어 유전자 사일런싱이 유전될 수 있도록 한다. shRNA 헤어핀 구조는 세포 내 기작(machinery)인 siRNA로 분해되어 RNA-유도 사일런싱 복합체(RNA-induced silencing complex)에 결합된다. 상술한 복합체는 이에 결합된 siRNA에 상응하는(matched) mRNA에 결합하여 분해시킨다. shRNA는 RNA 폴리머라제 III에 의해 전사되며, 포유동물 세포에서 shRNA 생산은 세포가 shRNA를 바이러스 공격으로 인식하여 방어 수단을 찾는 것처럼 인터페론 반응을 야기시킬 수도 있다. 또한, shRNA는 식물 및 다른 시스템에서도 이용될 수 있으며 U6 프로모터가 반드시 필요한 것은 아니다. 식물의 경우에는 매우 강력한 연속적인 발현 능력을 보유한 전통적인 프로모터인 CaMV(cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터가 이용될 수 있다.

본 명세서의 용어 "마이크로RNA(microRNA, miRNA)"는 21-25개의 뉴클레오타이드의 단일가닥 RNA 분자로서 mRNA(messengerRNA)의 3'-UTR에 결합하여 진핵생물의 유전자 발현을 제어하는 물질을 나타낸다(Bartel DP, et al ., Cell, 23;116(2): 281-297(2004)). miRNA의 생성은 Drosha(RNaseIII type 효소)에 의해 스템-루프 구조의 전구체 miRNA(pre-miRNA)로 만들어지고, 세포질로 이동하여 다이서(Dicer)에 의해 절단되어 성숙한 miRNA로 만들어진다[Kim VN, et al ., Nat Rev Mol Cell Biol., 6(5): 376-385(2005)]. 상술한 바와 같이 제조된 miRNA는 표적단백질의 발현을 조절함으로써 발생, 세포증식 및 사멸, 지방대사, 종양형성 등에 관여한다[Wienholds E, et al ., Science, 309(5732): 310-311(2005); Nelson P, et al ., Trends Biochem Sci., 28: 534-540(2003); Lee RC, et al ., Cell, 75: 843-854(1993); 및 Esquela-Kerscher A, et al., Nat Rev Cancer, 6: 259-269(2006)].

본 명세서에서 용어 "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer . Chem . Soc . 85: 2149-54(1963); Stewart, et al ., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).

마지막으로, 시험물질이 처리된 세포에서 BK_Ca 채널 단백질의 활성도를 분석한다. 활성의 측정은 하기 기재한 바와 같이 형광 측정을 통해 용이하게 실시할 수 있으며, 측정 결과, 상기 시험물질이 상기 돌연변이된 BK_Ca 채널의 활성화를 촉진시키면 이온 채널 활성제(activators)로 판단하고 상기 돌연변이된 BK_Ca 채널의 활성화를 억제시키면 이온 채널 억제제(blockers)로 판정될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "이온 채널 활성제(activators)"는 돌연변이된 BK_Ca 채널의 활성화를(개방을) 촉진하는 물질을 의미하고, 본 명세서에서 사용되는 용어 "이온 채널 억제제(inhibitors)"는 돌연변이된 BK_Ca 채널의 활성화를(개방을) 억제하는 물질을 의미한다.

본 발명의 돌연변이된 BK_Ca 채널은 과다활성화되어 있는 상태이기 때문에 야생형 BK_Ca 채널과 비교하여 낮은 농도의 [Ca^{2 +}]_i 하에서도 충분한 활성을 가지므로, 실험의 결과를 보다 명확하게 판단할 수 있다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 돌연변이된 BK_Ca 채널 활성의 분석은 Tl⁺ 이온 농도에 대한 형광 측정을 통해 이루어진다. 상기 Tl⁺ 이온 농도에 대한 형광 측정은 당업계에 잘 알려진 상업적으로 이용가능한 어세이 방법(예컨대, FluxOR^TM)을 이용한 표준 형광측정기(standard fluorometer)로 간단하고 용이하게 실시할 수 있다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 돌연변이된 BK_Ca 채널은 [Ca^{2 +}]_i에 관계없이 막 탈분극(membrane depolarization)에 의해 활성화된다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 상술한 막 탈분극은 -80 mV 내지 200 mV 범위의 전압 펄스(voltage pulses)에서 10 mV 전압 증가로 단계적으로 유도된다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 돌연변이된 BK_Ca 채널의 전도성-전압 관계(conductance-voltage relationship, G-V)는 음적 전압(negative voltage) 방향으로 이동된다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 BK_Ca 채널의 활성은 10 μM의 CTBIC 자극에 의해 약 2.3배 정도 형광 시그널의 증가를 나타냈다(참고: 도 5c).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 BK_Ca 채널 활성-관련 질환, 질병 또는 상태(diseases, disorders or conditions)의 치료제 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) 야생형 BK_Ca 채널 유전자 내 G733 및 N736 위치의 아미노산 서열이 돌연변이된 아미노산 서열-인코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및

(b) 상기 세포에서 돌연변이된 BK_Ca 채널의 활성을 분석하는 단계로서, 상기 시험물질이 상기 돌연변이된 BK_Ca 채널의 활성을 촉진시키면 BK_Ca 채널 활성-관련 질환, 질병 또는 상태 치료제로 판단되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

본 발명의 방법은 상술한 본 발명의 돌연변이된 BK_Ca 채널로 형질전환된 세포를 유효성분으로 포함하기 때문에, 둘 사이에 중복된 내용은 중복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 BK_Ca 채널의 조절과 관련된 질환, 질병 또는 상태는 심혈관질환(cardiovascular diseases), 폐쇄 또는 염증 기도 질환(obstructive or inflammatory airway diseases), 하부 요로 질환(lower urinary tract disorders), 발기부전, 불안 및 불안-관련 상태, 간질 및 동통을 포함한다.

본 명세서의 용어 "심혈관질환(cardiovascular disease)"은 심장, 심장 판막, 혈액 및 몸의 혈관구조(vasculature)에 영향을 미치는 수많은 상태를 분류하는데 이용되는 일반적인 용어로, 심장 또는 혈관에 영향을 미치는 질병들을 포함한다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 심혈관질환은 죽상경화증, 죽상혈전증, 아테롬성 동맥경화증, 관상동맥질환, 허혈, 재관류 손상, 고혈압, 재협착증, 동맥 염증, 심근 허혈 또는 허혈성 심장 질환, 안정 및 불안정 협심증, 뇌졸중, 울혈성 심부전, 대동맥 협착증 또는 대동맥류 같은 대동맥 질환 및 말초혈관질환을 포함한다. 본 명세서의 용어 "말초혈관질환(peripheral vascular disease, PVD)"은 종종 사지 혈관의 협착시에 직면하는 심장 및 중추신경계 외측 혈관의 질환을 의미하며, 예를 들어 혈관에는 결함이 없지만 감기, 스트레스 또는 흡연과 같은 자극으로부터 발생하는 기능적 질환, 및 죽상경화증 병변, 국소 염증 또는 외상성 손상과 같은 혈관계의 구조적 결함으로부터 발생되는 기질적 질환으로 구분될 수 있다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 폐쇄 또는 염증 기도 질환은 기도 과다반응, 진폐증, 알루미늄증, 탄분증, 석면증, 석폐증, 첩모탈락증(ptilosis), 철침착증(siderosis), 규폐증, 연초 중독증, 면폐증(byssinosis), 사르코이드증(sarcoidosis), 베릴륨증, 폐기종, 급성 호흡 곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome; ARDS), 급성 폐 손상(acute lung injury; ALI), 급성 또는 만성 감염성 폐질환, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease; COPD), 기관지염, 만성 기관지염, 색색거리는(wheezy) 기관지염, 기도 과다반응 또는 낭섬유증 악화, 또는 만성 기침을 포함하는 기침, 기도 과다반응의 악화, 폐 섬유증, 폐 고혈압, 염증성 폐질환, 및 급성 또는 만성 호흡 감염 질환을 포함한다.

본 명세서의 용어 "하부 요로 질환"은 실뇨, 빈뇨, 급뇨, 및 야간뇨를 갖거나 또는 갖지 않는 과민성 방광에 의해서 특징되는 모든 하부 요로 질환을 포함한다. 따라서, 본 발명의 하부 요로 질환은 과민성 방광(overactive bladder), 과민성 배뇨근, 불안정성 방광(unstable bladder), 배뇨근과반사(detrusor hyperreflexia), 감각성 급뇨(sensory urgency) 및 배뇨근 과활동성의 증상 같은 과민성 방광(urinary bladder), 요실금 또는 긴박성 요실금(urge urinary incontinence), 스트레스성 요실금(urinary stress incontinence), 느린 배뇨, 배뇨 말기 적하(dribbling), 무뇨증 및/또는 허용 가능한 비율로 배뇨를 위한 압력을 가해야하는 필요와 같은 폐쇄성 배뇨 현상을 포함하는 하부 요로 질환 증상, 그리고 빈뇨 및/또는 급뇨와 같은 짜증나는 증상을 포함한다. 또한, 하부 요로 질환은 뇌졸증, 파킨슨 병(Parkinson's disease), 당뇨병, 다발성 경화증, 말초 신경병증, 또는 척수 손상을 포함하나, 이에 한정되지 않는 신경학적 손상의 결과로 발생되는 신경인성 방광을 포함할 수 있다. 또한, 하부 요로 질환은 전립선염, 간질성 방광염, 전립선 비대증, 및 척수 손상 환자의 경련성 방광(spastic bladder)을 포함할 수 있다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 하부 요로 질환은 과민성 방광, 불안정성 방광, 과민성 배뇨근, 배뇨근불안정(detrusor instability), 배뇨근과반사, 감각성 급뇨, 요실금, 긴박성 요실금, 스트레스성 요실금, 신경인성 요실금(relfex urinary incontinence), 느린 배뇨, 배뇨 말기 적하, 배뇨 장애(dysuria) 및 경련성 방광(spastic bladder)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서의 용어 "발기 부전(erectile dysfunction)"은 성 수행에 충분한 발기를 획득하거나 유지하는데 있어서 지속적인 불능 상태로, 이는 내피세포의 기능 이상(endothelial cell dysfunctions)과 밀접하게 연관되어 있다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 BK_Ca 채널의 조절과 관련된 질환, 장애 또는 상태는 통증 장애(pain disorders); 범불안장애, 불안공황, 강박장애, 사회 공포증, 수행 불안(performance anxiety), 외상 후 스트레스 장애(posttraumatic stress disorder), 급성 스트레스 반응, 적응 장애(adjustment disorder), 건강염려성 장애(hypochondriacal disorder), 분리 불안 장애, 광장공포증 및 특정 공포증(phobia) 같은 불안 및 불안-관련 상태; 및 단순 부분 발작, 복합체 부분 발작, 이차 전신 발작(secondary generalised seizure), 결신 발작(absence seizure), 근간대 발작(myoclonic seizure), 간대 발작(clonic seizure), 강직 발작(tonic seizure), 강직 간대 발작(tonic clonicseizure) 및 무동성 발작(atonic seizure)을 포함하는 전신 발작(generalised seizure) 같은 간질을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 특정 공포증과 관련된 불안은 동물, 곤충, 폭풍우, 운전, 비행, 높이 또는 다리 건너기, 폐쇄 또는 좁은 공간, 물, 혈액 또는 상처뿐만 아니라, 주사 또는 외과적인 의료 및 치과 과정을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 통증장애는 고통을 동반하는 장애로, 예를 들어 골격통증(musculoskeletal pain), 수술 후 통증(post operative pain) 및 수술 통증(surgical pain)과 같은 급성 통증; 만성 염증성 통증(예컨대, 류마티스 관절염 및 골관절염), 신경병증성 통증(예컨대, 대상포진 후 신경통(post herpetic neuralgia), 삼차신경병증(trigeminal neuralgia) 및 교감신경 유지 통증(sympathetically maintained pain)) 및 암과 연관된 통증 및 섬유근육통증(fibromyalgia)과 같은 만성 통증; 편두통과 연관된 통증; (만성 및 급성 모두) 통증, 및/또는 류머트즘열(rheumatic fever)과 같은 상태의 열 및/또는 감염; 인플루엔자(influenza) 또는 일반적인 감기와 같은 다른 바이러스 감염과 연관된 증상; 하부요통 및 경부통; 두통; 치통; 염좌(sprains) 및 좌성(strains); 근염(myositis); 신경통(neuralgia); 건막염(synovitis); 류마티스 관절염을 포함하는 관절염 ; 골관절염을 포함하는 퇴행성 관절증 (degenerative joint diseases) ; 통풍(gout) 및 강직성 척추염(ankylosing spondylitis); 건염(tendinitis); 윤활낭염(bursitis); 건선(psoriasis), 습진(eczema), 화상 및 피부염(dermatitis)과 같은 피부 관련 상태; 운동 손상(sports injuries); 및 수술 및 치과 과정으로 야기되는 손상과 같은 손상들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 이중 돌연변이된 BK_Ca 채널 컨스트럭트 및 이를 이용한 세포-기반된 신규한 이온 채널 조절인자의 스크리닝 시스템에 관한 것이다.

(b) 본 발명의 이중 돌연변이된 BK_Ca 채널-포함 세포-기반된 시스템은 대조군과 비교하여 별도의 [Ca²⁺]_i의 증가 유무와 관계 없이 막 탈분극에 의해 현저하게 증가된 형광을 나타낸다.

(c) 또한, 본 발명의 이중 돌연변이된 BK_Ca 채널-포함 세포-기반된 시스템은 알려진 활성인자(예컨대, CTBIC)에 의해서 보다 촉발된 활성(G/V 곡선의 음적 방향으로의 이동)을 나타낸다.

(d) 따라서, 본 발명의 시스템은 종래의 방법들(예컨대, 자동화된 패치 클램핑 방법)과 비교하여 보다 효과적이고 더욱 더 정밀하게 이온 채널의 활성 분석이 가능함으로써 이온 채널 조절인자들(modulators)의 분리/동정 뿐 아니라, BK_Ca 채널의 조절과 관련된 질환, 질병 또는 상태하부 요로 질환(예컨대, 과민성 방광, 요실금, 등)의 치료제 스크리닝에 유용하게 적용될 수 있다.

도 1은 과다활성 돌연변이 BK_Ca 채널의 제조 및 특성을 보여주는 결과이다. 도 1a는 본 연구에서 이용된 인간 BK_Ca 채널의 α-서브유니트를 도식적으로 보여주는 도면이다. RCK2 도메인 내 G733D 및 N736K 돌연변이 위치들이 파란색으로 지시되어 있다. 도 1b는 RCK1(노란색) 도메인과 RCK2(보라색) 도메인 간의 인터페이스의 결정 구조(Protein Data Bank ID: 3NAF)에서 돌연변이 위치들의 위치를 보여주는 도면이다. 도 1c는 WT 또는 G733D/N736K BK_Ca 채널 컨스트럭트로 일과성으로 트랜스펙션된 세포의 대표적인 거시적 전류 레코딩 결과이다.
도 2는 WT 또는 G733D/N736K BK_Ca 채널을 발현하는 안정적인 세포주의 규명을 보여주는 결과이다. 도 2a는 WT 또는 G733D/N736K BK_Ca 채널을 발현하는 안정적인 세포주의 면역블랏 분석 결과이다. 대조군 세포(Mock)는 pcDNA3.1 공벡터 컨스트럭트로 트랜스펙션되었다. 총 30 μg의 세포용해물이 각 레인에 로딩되었으며, 막은 항-BK_Ca 채널 항체 또는 대조군인 항-GAPDH 항체와 반응시켰다. 도 2b는 100 nM [Ca^{2 +}]_i의 존재 하에서 안정적으로 발현된 WT 및 G733D/N736K BK_Ca 채널의 거시적 전류 레코딩에 대한 대표적인 결과를 나타낸다. 이온전류는 10 mV씩 증가시켜 -80 mV부터 100 mV까지의 범위에서 전압(potentials)을 테스트하기 위한 100 ms의 전압 단계들에 의해 촉발되었다. 고정전압은 -100 mV였다. 도 2c는 안정-상태(steady-state) WT(하얀색 원) 및 G733D/N736K(검은색 원) BK_Ca 채널 전류들의 표준화된 G-V 관계(G-V relationships)를 보여주는 결과이다. 막은 -100 mV에서 시작하였으며, 이후 -80 mV부터 200 mV까지의 범위에서 10 mV의 증가로 단계적으로 증가되었다. 채널 전류는 100 nM [Ca^{2 +}]_i의 존재 하에서 레코딩되었다. 전도성 값들은 정점 꼬리전류들(peak tail currents)로부터 얻어졌으며 CTBIC의 부존재 하에서 관찰된 최대 전도성에 대해 표준화되었다. 데이터 점들은 볼츠만 함수를 이용하여 최적화되었다.
도 3은 WT 및 돌연변이 BK_Ca 채널의 전기생리학적 특성을 나타내는 도면이다. 도 3a는 WT 및 G733D/N736K BK_Ca 채널의 G-V 관계에 있어서 [Ca^{2 +}]_i의 변화에 따른 효과를 보여주는 결과이다. [Ca^{2 +}]_i의 농도는 0 μM(사각형), 0.1 μM(원), 1 μM (삼각형) 또는 10 μM(역삼각형)이었다. 막은 -100 mV에서 시작하였으며, 이후 -80 mV부터 200 mV까지의 범위에서 10 mV의 증가로 단계적으로 증가되었다. 전도성 값들은 정점 꼬리전류들로부터 얻어졌으며 최대 전도성에 대해 표준화되었다. 데이터 점들은 볼츠만 함수를 이용하여 최적화되었다. 도 3b는 다른 농도의 세포내 Ca^{2 +}에서 WT 및 G733D/N736K BK_Ca 채널의 반-활성화 전압(V _{1 /2})을 보여주는 결과이다. 각 데이터 점은 다섯 개의 실험들에서 얻어진 평균값 ± 표준오차를 나타낸다. 도 3c는 WT(빈 사각형) 또는 G733D/N736K(채워진 사각형) BK_Ca 채널을 발현하는 안정적인 세포주들의 안정 막전압(resting membrane potential, RMP)을 의미하는 결과이다. 각 데이터 점은 33개의 실험들에서 얻어진 평균값 ± 표준오차로서 제시된다. 표시: **, 쌍 Student's t-test에 의한 p < 0.001.
도 4는 BK_Ca 채널 활성인자에 의한 WT 및 G733D/N736K 채널의 활성 촉발을 보여주는 결과이다. 도 4a 및 도 4b는 10 μM CTBIC의 부존재 및 존재 하에서 WT(4a) 및 G733D/N736K(4b) BK_Ca 채널의 거시적 전류 레코딩을 보여주는 대표적인 도면이다. [Ca^{2 +}]_i는 100 nM에서 고정되었으며, CTBIC는 막의 세포내 부위(side)에 적용되었다. 이온전류는 10 mV씩 증가시켜 -80 mV부터 140 mV까지의 범위에서 전압(potentials)을 테스트하기 위한 100 ms의 전압 단계들에 의해 촉발되었다. 고정전압은 -100 mV였다. 도 4c는 WT 및 G733D/N736K BK_Ca 채널의 안정-상태 전류들의 표준화된 G-V 관계를 보여주는 결과이다. 레코딩 전에 대조군인 운반체(vehicle; 사각형) 또는 10 μM CTBIC(원)이 막 패치에 적용되었다. 막은 -100 mV에서 시작하였으며, 이후 -80 mV부터 200 mV까지의 범위에서 10 mV의 증가로 단계적으로 증가되었다. 도 4d는 10 μM CTBIC에 의해 야기된 WT 및 G733D/N736K BK_Ca 채널의 반-활성화 전압(V _{1 /2}) 상의 변화를 보여주는 결과이다. 각 데이터 점은 다섯 개의 실험들에서 얻어진 평균값 ± 표준오차를 나타낸다. 표시: *, 쌍 Student's t-test에 의한 p < 0.001.
도 5a-5c는 형광-기반된 플랫폼을 이용한 고속 스크리닝에 있어서 G733D/N736K BK_Ca 채널을 발현하는 안정적인 세포주들의 적합성에 대한 분석을 실시한 결과이다. 모 AD-239 세포주(도 5a)로부터 얻어진 형광 시그널, 그리고 WT(도 5b) 또는 G733D/N736K(도 5c) BK_Ca 채널을 안정적으로 발현하는 세포주로부터 얻어진 형광 시그널이 측정되었다. BK_Ca 채널 활성을 모니터링하기 위해, FluxOR^TM 다이가 모 AD-239 세포주, WT 세포주 및 G733D/N736K 세포주에 로딩되었다. 형광 시그널을 판독하기 전에, 세포는 BK_Ca 채널 활성인자(10 μM CTBIC; 채워진 심볼) 또는 운반체(DMSO; 빈 심볼)로 30분 동안 전-처리되었다. 기본 형광을 2분 동안 측정한 후, 세포에 10 mM 프리 K⁺을 포함하는 자극 완충액을 처리하여 세포막을 탈분극시켰다. Synergy TM H1 하이브리드 멀티-모드 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 형광 시그널을 측정하였다. 심볼(symbols): 0 μM CTBIC, 빈 심볼; 및 10 μM CTBIC, 채워진 심볼.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

컨스트럭트, 돌연변이유발 및 안정적 세포주들의 구축

야생형(wild-type, WT) 인간 BK_Ca 채널-코딩 부위(GenBank accession number, NM002247 및 NP 002238.2)가 pcDNA3.1(+) 포유동물 발현 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 서브클로닝되었다. BK_Ca 채널의 돌연변이(G733D/N736K)는 QuikChange 위치-지정된 돌연변이유발 키트(Stratagene, Santa Clara, CA)를 이용하여 WT 플라스미드의 위치-지정된 돌연변이유발에 의해 획득되었다.

HEK293 세포주의 파생물인 AD-293 세포(Stratagene)는 10% FBS(fetal bovine serum; Thermo) 및 항생제가 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagles Medium; Thermo, Waltham, MA)에서 유지되었다. 세포들은 습도-유지된 5% CO₂ 환경 하에서 37로 배양되었다. 안정적인 세포-주들을 얻기 위해, WT BKCa 채널 또는 G733D/N736K 돌연변이 컨스트럭트를 가지는 pcDNA3.1 벡터들이 Polyfect reagent(Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 AD-293 세포에 트랜스펙션되었다. 세포들은 1 mg/ml 제네티신(geneticin; Gibco-RRL, Carlsbad, CA)을 포함하는 배지에서 배양되었으며, 2일 마다 신선한 배지로 교체되었다.

면역블랏 분석(Immunoblot analysis)

세포는 20 mM HEPES(pH 7.5; Sigma), 120 mM NaCl(Sigma), 5 mM EDTA(Sigma), 1% Triton X-100(Sigma), 0.5 mM DTT(dithiothreitol; Sigma), 1 mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride; Sigma) 및 프로테아제 억제제 칵테일(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)를 포함하는 완충액에서 용해되었다. 시료들이 30분 동안 얼음에서 유지된 후, 불용성 물질(insoluble material)을 침전시키기 위해 용해물은 12,500 rpm으로 25분 동안 원심분리시켰다. 5X SDS 젤 로딩 완충액(250 mM Tris-Cl(pH 6.8), 500 mM DTT, 10% SDS(Biorad), 0.5% bromophenol blue(Sigma) 및 50% glycerol(USB product)을 첨가한 후, 혼합물은 37℃에서 15분 동안 반응시켰다. 단백질은 전기영동되어 PVDF 막(GE Healthcare Life Sciences)으로 블랏팅되었다. 상기 막은 3% BSA를 포함하는 1X TBS-T(1X Tris-buffered saline with Tween-20)를 이용하여 상온에서 1시간 동안 교반하여 블락킹시키고 1X TBS-T로 세 번에 걸쳐서 세척한 후, 일차 항체(항-BK_Ca 항체, 1:250 희석; BD Biosciences, San Jose, CA); 또는 항-GAPDH 항체, 1:5000 희석; Young In Frontier, Seoul, Korea))를 포함하는 10 ml 1X TBS-T에서 하룻밤 동안 상온에서 반응시켰다. 이후, 상기 막은 1X TBS-T로 세 번에 걸쳐서 세척하고 이차 항체(1:10,000 희석; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)를 포함하는 5 ml 1X TBS-T와 45분 동안 반응시켰다. 최종적으로, 상기 막은 1X TBS-T로 세 번에 걸쳐서 세척하고 ECL 웨스턴 블랏팅 검출 시약(Amersham Biosciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)에 담겨졌다. 상기 블랏들은 플라스틱 랩으로 감싸서 X-선 필름(Konica, Tokyo, Japan)에 노출시켰다.

전기생리학적 레코딩(electrophysiological recordings) 및 데이터 분석

거시적 전류 레코딩은 기가옴 씰 패치 클램프 방법(gigaohm seal patch clamp method)을 이용하여 실시하였다. 패치 파이펫은 붕규산 유리(WPI, Sarasota, FL)를 이용하여 제조된 후, 3-5 MΩ의 저항으로 파이어폴리쉬되었다. 채널 전류는 Axopatch 200B amplifier(Axon Instruments, Foster City, CA)를 이용하여 증폭되고 4극(four-pole) 저역(low-pass) 베셀 필터(bessel filter)를 이용하여 1 또는 2 kHz에서 여과시킨 후, Digidata 1200A digitizer(Axon Instruments)를 이용하여 10 또는 20 포인트/ms의 속도로 디지털화시켰다. BK_Ca 채널의 이온전류(ionic current)는 -100 mV의 고정전압(holding potential)으로부터 -80에서 200 mV의 범위의 막전압(membrane potentials)으로 10 mV의 증가율(increments)로 운반된 전압-클램프 펄스(voltage-clamp pulses)에 의해 활성화되었다. 특별하게 언급되지 않는 한, 세포내 및 세포외 용액들은 116 mM KOH(Sigma), 4 mM KCl(Sigma), 10 mM HEPES 및 5 mM EGTA(Sigma)를 포함하였으며, MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid)를 이용하여 pH 7.2로 적정되었다. 정확한 프리 [Ca²⁺]_i 양을 발생시키기 위해, 세포내 용액에 첨가될 적절한 양의 총 Ca^{2 +}이 MaxChelator software(Patton, et al ., 2004; http://maxchelator.stanford.edu/)을 이용하여 계산되었다.

안정 막전위(resting membrane potential; RMP)를 측정하기 위해, 세포내 용액은 pH 7.2로 맞추어졌고 5 mM NaCl, 140 mM KCl(Sigma), 3 mM Mg-ATP(Sigma), 0.5 mM MgCl₂(Sigma), 0.33 mM CaCl₂(Sigma)및 1 mM EGTA를 포함하였다. 세포외 용액은 pH 7.4로 맞추어졌고 145 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 5 mM 글루코오스(Sigma), 1.8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂ 및 5 mM HEPES를 포함하였다. 세포내 및 세포외 용액의 요구된 pH 값은 각각 NMDG 및 NaOH를 이용하여 조정되었다. 막전압은 통상적인 전체-세포 형상(whole-cell configuration)을 획득한 후 1분 동안 측정하였다. Clampex 8.0 또는 8.1(Axon Instruments) 및 Origin 6.1(OriginLab Corp., Northampton, MA) 소프트웨어 패키지들이 레코딩 데이터의 측정 및 분석을 위해 이용되었다.

형광 측정

상업적으로 이용가능한 FluxOR^TM 포타슘 이온 채널 어세이(Invitrogen)가 BK_Ca 채널의 형광-기반된 분석을 위해 사용되었다. WT 및 G733D/N736K BK_Ca 채널을 안정적으로 발현하는 AD-293 세포들이 폴리-D-라이신(Sigma)-코팅된 96-웰 마이크로플레이트(Corning)(웰 당 5X10⁴ 세포)에 플레이팅되었다. 레코딩 전에, 세포들은 시험 화합물인 CTBIC(4-chloro-7-(trifluoromethyl)-10H-benzofuro[3,2-b]indole-1-carboxylic acid)로 30분 동안 전-배양되었다. 형광 시그널은 Gen5 소프트웨어를 이용하는 Synergy TM H1 하이브리드 멀티-모드 마이크로플레이트 판독기(BioTek Instrument, Inc., Winnoski, VT)로 측정하였다. pcDNA3.1 공벡터 컨스트럭트로 트랜스펙션된 AD-293 세포도 대조군으로서 레코딩되었다. FluxOR^TM 다이로부터 유래된 시그널은 각각 488 nm 및 525 nm의 여기 파장 및 방출 파장에서 획득하였다. BK_Ca 채널의 자극은 배양 배지에 10 mM 프리 K⁺를 첨가하여 실시하였다. 본원발명의 시스템이 표준 형광측정기(standard fluorometer)를 이용한 고속 스크리닝에 적합한 지 여부를 확인하기 위해, 상술한 마이크로플레이트는 15초 마다 판독되었다.

실험결과

과다활성(hyperactive) 돌연변이 BK _Ca 채널의 제조 및 특성 규명

본 발명자들은 BK_Ca 채널의 활성이 채널 내 2개의 RCK 도메인들 간의 유연성 인터페이스(flexible interface)에서 발생한 돌연변이들에 의해 강하게 영향받는다는 사실을 이전에 보고하였다(Kim, et al., 2008). RCK2 내 돌연변이들은 음적 방향으로 전압 활성화 곡선(voltage activation curve)을 이동시켜 채널의 개방 형태(open conformation)를 안정화시킴으로써 BKCa 채널을 활성화시킨다(Kim, et al., 2008). 이에, RCK2 도메인 내 2개의 아미노산 치환을 포함하는 BK_Ca 채널의 이중 돌연변이(G733D/N736K; 도 1a 및 도 1b)가 제조되어 이의 기능적 특성이 조사되었다. 본 발명자들은 AD-293 세포에 WT 인간 BK_Ca 채널 또는 인간 G733D/N736K 돌연변이 BK_Ca 채널을 포함하는 발현 플라스미드를 일과성으로 트랜스펙션시켰다. 세포내 Ca²⁺의 부존재 하에서, 상기 돌연변이 채널은 WT BK_Ca 채널보다 더욱 더 낮은 막 전압(membrane voltages)에 의해 활성화되었다(도 1c).

이후, 제네티신을 포함하는 배지에서 트랜스펙션된 세포를 3주 동안 선택함으로써 안정적인 세포주들을 확립하였다. 마우스 항-BK_Ca 채널 항체를 이용한 면역블랏 분석을 통해 BK_Ca 채널 단백질들의 안정적인 발현을 확인하였다(도 2a). 모 세포주에서는 어떠한 단백질 밴드들이 관찰되지 않았지만, 트랜스펙션된 세포에서 130 kDa 면역활성 밴드들이 관찰되었는데(도 2a), 이는 BK_Ca 채널의 예상된 크기와 일치한다. WT 및 G733D/N736K BK_Ca 채널의 발현 레벨이 비교될 만 하였다. 안정적으로 발현된 WT 및 돌연변이 BK_Ca 채널은 전기생리학적 방법들을 이용하여 더욱 조사되었다. 세포외(bath, 용액) 및 세포내(파이펫) 용액들은 동일한 농도의 K⁺(120 mM)을 포함하였지만, [Ca^{2 +}]_i는 각 용액에서 다양하였다. -80 mV에서부터 200 mV까지의 범위의 전압 펄스가 -100 mV의 고정전압에 10 mV의 증가로 적용되었다. 막 탈분극 및 100 nM [Ca^{2 +}]_i 모두에 의해서 활성화되는 경우, WT 및 G733D/N736K 채널들은 K⁺ 전류를 촉발시켰다(도 2b). G733D/N736K 돌연변이는 음적 전압의 방향으로 전도성-전압(conductance-voltage, G-V) 관계를 현저하게 이동시켰다(도 2c). G733D/N736K 돌연변이 채널의 반-활성화 전압(half-activation voltage, V_1/2)은 100 nM [Ca^{2 +}]_i에서 약 110 mV의 음적 변화를 나타냈다. 더욱이, 상기 돌연변이 채널의 이온전류는 Ca^{2 +}의 부존재 하에서조차 전압 펄스에 의해 완벽하게 활성화되었다(도 3a 및 도 3b). V_{1 /2} 쉬프트가 넓은 범위의 [Ca^{2 +}]_i에서 발생하였는데, 이는 상기 이중 돌연변이에 의해 BK_Ca 채널의 밀폐 상태(closed states)와 개방 상태(open states; 활성화 상태) 간의 내인성 평형이 변화하였음을 시사한다(Kim, et al ., 2008). 상술한 결과들은 AD-239 세포주에서 안정적으로 발현된 G733D/N736K 돌연변이 채널이 안정 [Ca²⁺]_i에서 막 전압의 적당한 탈분극에 의해 활성화될 수 있다는 것을 의미한다.

알려진 BK _Ca 채널 활성인자에 의한 G733D / N736K 채널의 활성 촉진

BK_Ca 채널의 조절인자들을 동정하기 위한 플랫폼으로서 G733D/N736K 채널을 안정적으로 발현하는 세포주의 적합성을 평가하기 위해, 돌연변이 채널의 활성을 촉발시키는 강력한 BK_Ca 채널 활성인자인 CTBIC의 능력을 조사하였다(Gormemis, et al., 2005; Lee, et al ., 2012). 막 패치에 10 μM CTBIC의 첨가는 WT BK_Ca 채널(도 4a) 및 G733D/N736K 돌연변이 BK_Ca 채널(도 4b) 모두에서 이온전류를 강하게 촉발시켰다. 각 채널의 상대적인 전도성(G/ G _max )은 -100 mV로의 과다분극 단계에 의해 발생된 꼬리전류를 최대꼬리전류로 표준화시킴으로써 획득하였다. 0 M 및 10 M CTBIC에서의 G/ G _max 값은 볼츠만 함수를 이용하여 최적화되었다. CTBIC의 첨가는 WT 및 G733D/N736K 채널의 G/V 곡선 모두에서 음적 방향으로의 이동을 야기시켰다(도 4c). G733D/N736K 채널의 V _{1 /2} 쉬프트(V _1/2 ^free 대 V _1/2 ^{10 μM})는 WT 채널의 쉬프트보다 현격하게 더 컸다(도 4d).

세포-기반된 어세이 플랫폼에서 G733D / N736K BK _Ca 채널의 강력한 활성화

최종적으로, 본 발명자들은 과다활성 BK_Ca 채널을 안정적으로 발현하는 세포들이 채널 활성인자들의 고속(high-throughput) 스크리닝에 적합한 지 여부를 결정하기 위한 실험들을 실시하였다. 상업적으로 이용가능한 FluxOR^TM 다이(dye)는 K⁺ 채널을 위한 보편적인 세포-기반된 어세이로서 이용하였다. WT 또는 G733D/N736K BK_Ca 채널을 안정적으로 발현하는 세포주가 폴리-D-라이신-코팅된 96-웰 플레이트에 분주되어 배양시킨 후 80% 내지 90% 컨플루언스(confluence)에 도달한 세포에서 FluxOR^TM 시그널을 측정하였다. 또한, 모 AD-293 세포주로부터 얻어진 형광 시그널이 대조군으로서 측정되었다. 형광 판독 전에, 세포들에 10 μM CTBIC 또는 DMSO(대조군)을 전-처리하였다. 기본 형광을 2분 동안 측정한 후, 세포막을 탈분극화시키기 위한 10 mM 프리 K⁺를 포함하는 자극 완충액을 세포에 처리하였다. 10 μM CTBIC의 첨가는 모 세포주에서 자극된 형광 증가 상에 최소한의 효과만을 나타냈다(도 5a). WT 채널을 발현하는 안정적인 세포주들을 테스트하였을 경우, 본 발명자들은 10 μM CTBIC의 첨가에 의해 약 1.3배의 형광 증가를 관찰할 수 있었다(도 5b). 하지만, G733D/N736K 돌연변이를 발현하는 안정적인 세포주는 WT 채널을 발현하는 세포주보다 채널 활성인자에 대해 더욱 더 큰 반응을 보였다(도 5c). 상대적인 형광 유니트(relative fluorescence unit, RFU) 값은 기본 반응과 비교하여 2.3배까지 증가하였다. 상술한 결과들은 G733D/N736K BK_Ca 채널을 안정적으로 발현하는 세포를 이용한 플랫폼이 BK_Ca 채널 조절인자들에 대한 고속 스크리닝에 이용될 수 있다는 것을 지시한다.

추가논의사항

BK_Ca 채널의 생리학적 중요성 및 치료학적 강력함에도 불구하고, BK_Ca 채널의 화학적 조절인자들은 아직까지 심도있게 탐구되지 않았다. BK_Ca 채널 조절인자들을 스크리닝하는 것과 관련된 주요 난점은 고속 스크리닝에 적합한 세포-기반된 어세이 방법의 부재이다. 다른 전압-게이트된 K⁺ 채널들과 달리, 안정 [Ca^{2 +}]_i에서 BK_Ca 채널의 활성화는 정상적인 생리학적 조건들에서 발생하지 않는 큰 탈분극을 필요로 하는 반면에, [Ca^{2 +}]_i가 마이크로몰 범위에 이르는 경우 활성화는 크지 않은 탈분극에 의해 이루어진다. [Ca²⁺]_i는 세포막 내 Ca^{2 +}-투과성 채널들의 개방 또는 세포내 저장소(intracellular stores)로부터 Ca^{2 +} 방출을 유도하는 세포 시그널링 경로들의 활성화에 의해 증가될 수 있다. [Ca^{2 +}]_i에 대한 BK_Ca 채널의 매우 정교한 민감도는 서브-막(sub-membrane) Ca^{2 +} 농도의 정밀한 조절을 필요로 한다. 이러한 이유로, BK_Ca 채널 조절인자들의 평가를 위해 [Ca^{2 +}]_i을 조절하고자 하는 많은 노력들이 있었다: 예를 들어, [Ca^{2 +}]_i을 조절하기 위한 화합물의 이용을 포함하는 자동화된 패치 클램핑의 개선된 방법이 최근에 보고되었다(Ido, et al ., 2012).

본 연구에서, 본 발명자들은 증가된 [Ca^{2 +}]_i의 필요 없이 형광-기반된 어세이에서 이용될 수 있는 BK_Ca 채널 조절인자들의 고속 스크리닝을 위한 새로운 세포-기반된 시스템을 개발하였다. 이전 연구가 BK_Ca 채널 내 2개의 RCK 도메인들의 잠재적인 유연성 인터페이스 간의 중요한 상호작용(Kim, et al ., 2008)을 제시했었기 때문에, 본 발명자들은 RCK2 도메인의 G733D 및 N736K 돌연변이를 포함하는 과다활성 돌연변이를 제조하여 이의 특성을 규명하였다. G733D/N736K BK_Ca 채널을 안정적으로 발현하는 세포주들의 패치 클램프 분석은 돌연변이 채널들이 세포내 Ca^{2 +}의 부존재 하에서 전압을 인가함으로써 완전히 활성화되는 반면에 WT 채널들은 그렇지 않다는 것을 확증하였다. 또한, K⁺ 채널을 위한 상업적으로 이용가능한 어세이를 이용하여 본 발명자들은 G733D/N736K 채널로부터 유래된 형광 시그널이 WT 채널의 형광 시그널보다 훨씬 더 높다는 것을 확인하였다. 예측한 대로, G733D/N736K BK_Ca 채널을 안정적으로 발현하는 세포주들의 RMP는 WT BK_Ca 채널을 발현하는 세포들의 RMP보다 현저하게 더 음적 전압을 나타냈다(도 3c). 보다 상세하게는, WT 및 G733D/N736K 채널을 발현하는 세포들의 RMP는 각각 -36.3 ± 2.2 V 및 -70.0 ± 2.1 V였다. 돌연변이 채널을 발현하는 세포들이 더 낮은 음적 RMP를 가진다는 것은 돌연변이 채널이 안정 [Ca²⁺]_i 및 막 전압에서 K⁺의 방출을 개방하고 매개할 수 있다는 것을 의미하는데, 이는 안정 상태에서 돌연변이 BK_Ca 채널의 과다활성화를 더욱 더 지지한다.

결론적으로, 본 연구에서 제시된 결과들은 과다활성 BK_Ca 채널을 발현하는 안정적인 세포주들은 BK_Ca 채널 활성의 조사를 위한 새로운 세포-기반된 어세이 시스템이라는 것을 의미한다. 상술한 세포주들은 형광-기반된 플랫폼들 및 자동화된 전기생리학적 방법들 모두를 이용하여 BK_Ca 채널들의 신규한 활성인자들을 스크리닝하는 데 매우 유용할 것으로 예상된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술 하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 일 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Val Asn Val Glu Ile Val Phe Leu His Asn Ile Ser Pro Asn 370 375 380 Leu Glu Leu Glu Ala Leu Phe Lys Arg His Phe Thr Gln Val Glu Phe 385 390 395 400 Tyr Gln Gly Ser Val Leu Asn Pro His Asp Leu Ala Arg Val Lys Ile 405 410 415 Glu Ser Ala Asp Ala Cys Leu Ile Leu Ala Asn Lys Tyr Cys Ala Asp 420 425 430 Pro Asp Ala Glu Asp Ala Ser Asn Ile Met Arg Val Ile Ser Ile Lys 435 440 445 Asn Tyr His Pro Lys Ile Arg Ile Ile Thr Gln Met Leu Gln Tyr His 450 455 460 Asn Lys Ala His Leu Leu Asn Ile Pro Ser Trp Asn Trp Lys Glu Gly 465 470 475 480 Asp Asp Ala Ile Cys Leu Ala Glu Leu Lys Leu Gly Phe Ile Ala Gln 485 490 495 Ser Cys Leu Ala Gln Gly Leu Ser Thr Met Leu Ala Asn Leu Phe Ser 500 505 510 Met Arg Ser Phe Ile Lys Ile Glu Glu Asp Thr Trp Gln Lys Tyr Tyr 515 520 525 Leu Glu Gly Val Ser Asn Glu Met Tyr Thr Glu Tyr Leu Ser Ser Ala 530 535 540 Phe Val Gly Leu Ser Phe Pro Thr Val Cys Glu Leu Cys Phe Val Lys 545 550 555 560 Leu Lys Leu Leu Met Ile Ala Ile Glu Tyr Lys Ser Ala Asn Arg Glu 565 570 575 Ser Arg Ile Leu Ile Asn Pro Gly Asn His Leu Lys Ile Gln Glu Gly 580 585 590 Thr Leu Gly Phe Phe Ile Ala Ser Asp Ala Lys Glu Val Lys Arg Ala 595 600 605 Phe Phe Tyr Cys Lys Ala Cys His Asp Asp Ile Thr Asp Pro Lys Arg 610 615 620 Ile Lys Lys Cys Gly Cys Lys Arg Leu Glu Asp Glu Gln Pro Ser Thr 625 630 635 640 Leu Ser Pro Lys Lys Lys Gln Arg Asn Gly Gly Met Arg Asn Ser Pro 645 650 655 Asn Thr Ser Pro Lys Leu Met Arg His Asp Pro Leu Leu Ile Pro Gly 660 665 670 Asn Asp Gln Ile Asp Asn Met Asp Ser Asn Val Lys Lys Tyr Asp Ser 675 680 685 Thr Gly Met Phe His Trp Cys Ala Pro Lys Glu Ile Glu Lys Val Ile 690 695 700 Leu Thr Arg Ser Glu Ala Ala Met Thr Val Leu Ser Gly His Val Val 705 710 715 720 Val Cys Ile Phe Gly Asp Val Ser Ser Ala Leu Ile Gly Leu Arg Asn 725 730 735 Leu Val Met Pro Leu Arg Ala Ser Asn Phe His Tyr His Glu Leu Lys 740 745 750 His Ile Val Phe Val Gly Ser Ile Glu Tyr Leu Lys Arg Glu Trp Glu 755 760 765 Thr Leu His Asn Phe Pro Lys Val Ser Ile Leu Pro Gly Thr Pro Leu 770 775 780 Ser Arg Ala Asp Leu Arg Ala Val Asn Ile Asn Leu Cys Asp Met Cys 785 790 795 800 Val Ile Leu Ser Ala Asn Gln Asn Asn Ile Asp Asp Thr Ser Leu Gln 805 810 815 Asp Lys Glu Cys Ile Leu Ala Ser Leu Asn Ile Lys Ser Met Gln Phe 820 825 830 Asp Asp Ser Ile Gly Val Leu Gln Ala Asn Ser Gln Gly Phe Thr Pro 835 840 845 Pro Gly Met Asp Arg Ser Ser Pro Asp Asn Ser Pro Val His Gly Met 850 855 860 Leu Arg Gln Pro Ser Ile Thr Thr Gly Val Asn Ile Pro Ile Ile Thr 865 870 875 880 Glu Leu Val Asn Asp Thr Asn Val Gln Phe Leu Asp Gln Asp Asp Asp 885 890 895 Asp Asp Pro Asp Thr Glu Leu Tyr Leu Thr Gln Pro Phe Ala Cys Gly 900 905 910 Thr Ala Phe Ala Val Ser Val Leu Asp Ser Leu Met Ser Ala Thr Tyr 915 920 925 Phe Asn Asp Asn Ile Leu Thr Leu Ile Arg Thr Leu Val Thr Gly Gly 930 935 940 Ala Thr Pro Glu Leu Glu Ala Leu Ile Ala Glu Glu Asn Ala Leu Arg 945 950 955 960 Gly Gly Tyr Ser Thr Pro Gln Thr Leu Ala Asn Arg Asp Arg Cys Arg 965 970 975 Val Ala Gln Leu Ala Leu Leu Asp Gly Pro Phe Ala Asp Leu Gly Asp 980 985 990 Gly Gly Cys Tyr Gly Asp Leu Phe Cys Lys Ala Leu Lys Thr Tyr Asn 995 1000 1005 Met Leu Cys Phe Gly Ile Tyr Arg Leu Arg Asp Ala His Leu Ser Thr 1010 1015 1020 Pro Ser Gln Cys Thr Lys Arg Tyr Val Ile Thr Asn Pro Pro Tyr Glu 1025 1030 1035 1040 Phe Glu Leu Val Pro Thr Asp Leu Ile Phe Cys Leu Met Gln Phe Asp 1045 1050 1055 His Asn Ala Gly Gln Ser Arg Ala Ser Leu Ser His Ser Ser His Ser 1060 1065 1070 Ser Gln Ser Ser Ser Lys Lys Ser Ser Ser Val His Ser Ile Pro Ser 1075 1080 1085 Thr Ala Asn Arg Gln Asn Arg Pro Lys Ser Arg Glu Ser Arg Asp Lys 1090 1095 1100 Gln Lys Tyr Val Gln Glu Glu Arg Leu 1105 1110 <210> 3 <211> 3339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of mutated BKCa channel <400> 3 atggatgcgc tcatcatccc ggtgaccatg gaggtgccgt gcgacagccg gggccaacgc 60 atgtggtggg ctttcctggc ctcctccatg gtgactttct tcgggggcct cttcatcatc 120 ttgctctggc ggacgctcaa gtacctgtgg accgtgtgct gccactgcgg gggcaagacg 180 aaggaggccc agaagattaa caatggctca agccaggcgg atggcactct caaaccagtg 240 gatgaaaaag aggaggcagt ggccgccgag gtcggctgga tgacctccgt gaaggactgg 300 gcgggggtga tgatatccgc ccagacactg actggcagag tcctggttgt cttagtcttt 360 gctctcagca tcggtgcact tgtaatatac ttcatagatt catcaaaccc aatagaatcc 420 tgccagaatt tctacaaaga tttcacatta cagatcgaca tggctttcaa cgtgttcttc 480 cttctctact tcggcttgcg gtttattgca gccaacgata aattgtggtt ctggctggaa 540 gtgaactctg tagtggattt cttcacggtg ccccccgtgt ttgtgtctgt gtacttaaac 600 agaagttggc ttggtttgag atttttaaga gctctgagac tgatacagtt ttcagaaatt 660 ttgcagtttc tgaatattct taaaacaagt aattccatca agctggtgaa tctgctctcc 720 atatttatca gcacgtggct gactgcagcc gggttcatcc atttggtgga gaattcaggg 780 gacccatggg aaaatttcca aaacaaccag gctctcacct actgggaatg tgtctattta 840 ctcatggtca caatgtccac cgttggttat ggggatgttt atgcaaaaac cacacttggg 900 cgcctcttca tggtcttctt catcctcggg ggactggcca tgtttgccag ctacgtccct 960 gaaatcatag agttaatagg aaaccgcaag aaatacgggg gctcctatag tgcggttagt 1020 ggaagaaagc acattgtggt ctgcggacac atcactctgg agagtgtttc caacttcctg 1080 aaggactttc tgcacaagga ccgggatgac gtcaatgtgg agatcgtttt tcttcacaac 1140 atctccccca acctggagct tgaagctctg ttcaaacgac attttactca ggtggaattt 1200 tatcagggtt ccgtcctcaa tccacatgat cttgcaagag tcaagataga gtcagcagat 1260 gcatgcctga tccttgccaa caagtactgc gctgacccgg atgcggagga tgcctcgaat 1320 atcatgagag taatctccat aaagaactac catccgaaga taagaatcat cactcaaatg 1380 ctgcagtatc acaacaaggc ccatctgcta aacatcccga gctggaattg gaaagaaggt 1440 gatgacgcaa tctgcctcgc agagttgaag ttgggcttca tagcccagag ctgcctggct 1500 caaggcctct ccaccatgct tgccaacctc ttctccatga ggtcattcat aaagattgag 1560 gaagacacat ggcagaaata ctacttggaa ggagtctcaa atgaaatgta cacagaatat 1620 ctctccagtg ccttcgtggg tctgtccttc cctactgttt gtgagctgtg ttttgtgaag 1680 ctcaagctcc taatgatagc cattgagtac aagtctgcca accgagagag ccgtatatta 1740 attaatcctg gaaaccatct taagatccaa gaaggtactt taggattttt catcgcaagt 1800 gatgccaaag aagttaaaag ggcatttttt tactgcaagg cctgtcatga tgacatcaca 1860 gatcccaaaa gaataaaaaa atgtggctgc aaacggcttg aagatgagca gccgtcaaca 1920 ctatcaccaa aaaaaaagca acggaatgga ggcatgcgga actcacccaa cacctcgcct 1980 aagctgatga ggcatgaccc cttgttaatt cctggcaatg atcagattga caacatggac 2040 tccaatgtga agaagtacga ctctactggg atgtttcact ggtgtgcacc caaggagata 2100 gagaaagtca tcctgactcg aagtgaagct gccatgaccg tcctgagtgg ccatgtcgtg 2160 gtctgcatct ttggcgacgt cagctcagcc ctgatcgacc tccggaaact ggtgatgccg 2220 ctccgtgcca gcaactttca ttaccatgag ctcaagcaca ttgtgtttgt gggctctatt 2280 gagtacctca agcgggaatg ggagacgctt cataacttcc ccaaagtgtc catattgcct 2340 ggtacgccat taagtcgggc tgatttaagg gctgtcaaca tcaacctctg tgacatgtgc 2400 gttatcctgt cagccaatca gaataatatt gatgatactt cgctgcagga caaggaatgc 2460 atcttggcgt cactcaacat caaatctatg cagtttgatg acagcatcgg agtcttgcag 2520 gctaattccc aagggttcac acctccagga atggatagat cctctccaga taacagccca 2580 gtgcacggga tgttacgtca accatccatc acaactgggg tcaacatccc catcatcact 2640 gaactagtga acgatactaa tgttcagttt ttggaccaag acgatgatga tgaccctgat 2700 acagaactgt acctcacgca gccctttgcc tgtgggacag catttgccgt cagtgtcctg 2760 gactcactca tgagcgcgac gtacttcaat gacaatatcc tcaccctgat acggaccctg 2820 gtgaccggag gagccacgcc ggagctggag gctctgattg ctgaggaaaa cgcccttaga 2880 ggtggctaca gcaccccgca gacactggcc aatagggacc gctgccgcgt ggcccagtta 2940 gctctgctcg atgggccatt tgcggactta ggggatggtg gttgttatgg tgatctgttc 3000 tgcaaagctc tgaaaacata taatatgctt tgttttggaa tttaccggct gagagatgct 3060 cacctcagca cccccagtca gtgcacaaag aggtatgtca tcaccaaccc gccctatgag 3120 tttgagctcg tgccgacgga cctgatcttc tgcttaatgc agtttgacca caatgccggc 3180 cagtcccggg ccagcctgtc ccattcctcc cactcgtcgc agtcctccag caagaagagc 3240 tcctctgttc actccatccc atccacagca aaccgacaga accggcccaa gtccagggag 3300 tcccgggaca aacagaagta cgtgcaggaa gagcggctt 3339 <210> 4 <211> 1113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of mutated BKCa channel <400> 4 Met Asp Ala Leu Ile Ile Pro Val Thr Met Glu Val Pro Cys Asp Ser 1 5 10 15 Arg Gly Gln Arg Met Trp Trp Ala Phe Leu Ala Ser Ser Met Val Thr 20 25 30 Phe Phe Gly Gly Leu Phe Ile Ile Leu Leu Trp Arg Thr Leu Lys Tyr 35 40 45 Leu Trp Thr Val Cys Cys His Cys Gly Gly Lys Thr Lys Glu Ala Gln 50 55 60 Lys Ile Asn Asn Gly Ser Ser Gln Ala Asp Gly Thr Leu Lys Pro Val 65 70 75 80 Asp Glu Lys Glu Glu Ala Val Ala Ala Glu Val Gly Trp Met Thr Ser 85 90 95 Val Lys Asp Trp Ala Gly Val Met Ile Ser Ala Gln Thr Leu Thr Gly 100 105 110 Arg Val Leu Val Val Leu Val Phe Ala Leu Ser Ile Gly Ala Leu Val 115 120 125 Ile Tyr Phe Ile Asp Ser Ser Asn Pro Ile Glu Ser Cys Gln Asn Phe 130 135 140 Tyr Lys Asp Phe Thr Leu Gln Ile Asp Met Ala Phe Asn Val Phe Phe 145 150 155 160 Leu Leu Tyr Phe Gly Leu Arg Phe Ile Ala Ala Asn Asp Lys Leu Trp 165 170 175 Phe Trp Leu Glu Val Asn Ser Val Val Asp Phe Phe Thr Val Pro Pro 180 185 190 Val Phe Val Ser Val Tyr Leu Asn Arg Ser Trp Leu Gly Leu Arg Phe 195 200 205 Leu Arg Ala Leu Arg Leu Ile Gln Phe Ser Glu Ile Leu Gln Phe Leu 210 215 220 Asn Ile Leu Lys Thr Ser Asn Ser Ile Lys Leu Val Asn Leu Leu Ser 225 230 235 240 Ile Phe Ile Ser Thr Trp Leu Thr Ala Ala Gly Phe Ile His Leu Val 245 250 255 Glu Asn Ser Gly Asp Pro Trp Glu Asn Phe Gln Asn Asn Gln Ala Leu 260 265 270 Thr Tyr Trp Glu Cys Val Tyr Leu Leu Met Val Thr Met Ser Thr Val 275 280 285 Gly Tyr Gly Asp Val Tyr Ala Lys Thr Thr Leu Gly Arg Leu Phe Met 290 295 300 Val Phe Phe Ile Leu Gly Gly Leu Ala Met Phe Ala Ser Tyr Val Pro 305 310 315 320 Glu Ile Ile Glu Leu Ile Gly Asn Arg Lys Lys Tyr Gly Gly Ser Tyr 325 330 335 Ser Ala Val Ser Gly Arg Lys His Ile Val Val Cys Gly His Ile Thr 340 345 350 Leu Glu Ser Val Ser Asn Phe Leu Lys Asp Phe Leu His Lys Asp Arg 355 360 365 Asp Asp Val Asn Val Glu Ile Val Phe Leu His Asn Ile Ser Pro Asn 370 375 380 Leu Glu Leu Glu Ala Leu Phe Lys Arg His Phe Thr Gln Val Glu Phe 385 390 395 400 Tyr Gln Gly Ser Val Leu Asn Pro His Asp Leu Ala Arg Val Lys Ile 405 410 415 Glu Ser Ala Asp Ala Cys Leu Ile Leu Ala Asn Lys Tyr Cys Ala Asp 420 425 430 Pro Asp Ala Glu Asp Ala Ser Asn Ile Met Arg Val Ile Ser Ile Lys 435 440 445 Asn Tyr His Pro Lys Ile Arg Ile Ile Thr Gln Met Leu Gln Tyr His 450 455 460 Asn Lys Ala His Leu Leu Asn Ile Pro Ser Trp Asn Trp Lys Glu Gly 465 470 475 480 Asp Asp Ala Ile Cys Leu Ala Glu Leu Lys Leu Gly Phe Ile Ala Gln 485 490 495 Ser Cys Leu Ala Gln Gly Leu Ser Thr Met Leu Ala Asn Leu Phe Ser 500 505 510 Met Arg Ser Phe Ile Lys Ile Glu Glu Asp Thr Trp Gln Lys Tyr Tyr 515 520 525 Leu Glu Gly Val Ser Asn Glu Met Tyr Thr Glu Tyr Leu Ser Ser Ala 530 535 540 Phe Val Gly Leu Ser Phe Pro Thr Val Cys Glu Leu Cys Phe Val Lys 545 550 555 560 Leu Lys Leu Leu Met Ile Ala Ile Glu Tyr Lys Ser Ala Asn Arg Glu 565 570 575 Ser Arg Ile Leu Ile Asn Pro Gly Asn His Leu Lys Ile Gln Glu Gly 580 585 590 Thr Leu Gly Phe Phe Ile Ala Ser Asp Ala Lys Glu Val Lys Arg Ala 595 600 605 Phe Phe Tyr Cys Lys Ala Cys His Asp Asp Ile Thr Asp Pro Lys Arg 610 615 620 Ile Lys Lys Cys Gly Cys Lys Arg Leu Glu Asp Glu Gln Pro Ser Thr 625 630 635 640 Leu Ser Pro Lys Lys Lys Gln Arg Asn Gly Gly Met Arg Asn Ser Pro 645 650 655 Asn Thr Ser Pro Lys Leu Met Arg His Asp Pro Leu Leu Ile Pro Gly 660 665 670 Asn Asp Gln Ile Asp Asn Met Asp Ser Asn Val Lys Lys Tyr Asp Ser 675 680 685 Thr Gly Met Phe His Trp Cys Ala Pro Lys Glu Ile Glu Lys Val Ile 690 695 700 Leu Thr Arg Ser Glu Ala Ala Met Thr Val Leu Ser Gly His Val Val 705 710 715 720 Val Cys Ile Phe Gly Asp Val Ser Ser Ala Leu Ile Asp Leu Arg Lys 725 730 735 Leu Val Met Pro Leu Arg Ala Ser Asn Phe His Tyr His Glu Leu Lys 740 745 750 His Ile Val Phe Val Gly Ser Ile Glu Tyr Leu Lys Arg Glu Trp Glu 755 760 765 Thr Leu His Asn Phe Pro Lys Val Ser Ile Leu Pro Gly Thr Pro Leu 770 775 780 Ser Arg Ala Asp Leu Arg Ala Val Asn Ile Asn Leu Cys Asp Met Cys 785 790 795 800 Val Ile Leu Ser Ala Asn Gln Asn Asn Ile Asp Asp Thr Ser Leu Gln 805 810 815 Asp Lys Glu Cys Ile Leu Ala Ser Leu Asn Ile Lys Ser Met Gln Phe 820 825 830 Asp Asp Ser Ile Gly Val Leu Gln Ala Asn Ser Gln Gly Phe Thr Pro 835 840 845 Pro Gly Met Asp Arg Ser Ser Pro Asp Asn Ser Pro Val His Gly Met 850 855 860 Leu Arg Gln Pro Ser Ile Thr Thr Gly Val Asn Ile Pro Ile Ile Thr 865 870 875 880 Glu Leu Val Asn Asp Thr Asn Val Gln Phe Leu Asp Gln Asp Asp Asp 885 890 895 Asp Asp Pro Asp Thr Glu Leu Tyr Leu Thr Gln Pro Phe Ala Cys Gly 900 905 910 Thr Ala Phe Ala Val Ser Val Leu Asp Ser Leu Met Ser Ala Thr Tyr 915 920 925 Phe Asn Asp Asn Ile Leu Thr Leu Ile Arg Thr Leu Val Thr Gly Gly 930 935 940 Ala Thr Pro Glu Leu Glu Ala Leu Ile Ala Glu Glu Asn Ala Leu Arg 945 950 955 960 Gly Gly Tyr Ser Thr Pro Gln Thr Leu Ala Asn Arg Asp Arg Cys Arg 965 970 975 Val Ala Gln Leu Ala Leu Leu Asp Gly Pro Phe Ala Asp Leu Gly Asp 980 985 990 Gly Gly Cys Tyr Gly Asp Leu Phe Cys Lys Ala Leu Lys Thr Tyr Asn 995 1000 1005 Met Leu Cys Phe Gly Ile Tyr Arg Leu Arg Asp Ala His Leu Ser Thr 1010 1015 1020 Pro Ser Gln Cys Thr Lys Arg Tyr Val Ile Thr Asn Pro Pro Tyr Glu 1025 1030 1035 1040 Phe Glu Leu Val Pro Thr Asp Leu Ile Phe Cys Leu Met Gln Phe Asp 1045 1050 1055 His Asn Ala Gly Gln Ser Arg Ala Ser Leu Ser His Ser Ser His Ser 1060 1065 1070 Ser Gln Ser Ser Ser Lys Lys Ser Ser Ser Val His Ser Ile Pro Ser 1075 1080 1085 Thr Ala Asn Arg Gln Asn Arg Pro Lys Ser Arg Glu Ser Arg Asp Lys 1090 1095 1100 Gln Lys Tyr Val Gln Glu Glu Arg Leu 1105 1110

Claims (16)

1. 다음의 단계를 포함하는 이온 채널 조절인자(modulators)의 스크리닝 방법:
   (a) 서열목록 제4서열로 이루어진 돌연변이된 BKCa 채널 단백질의 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및
   (b) 상기 세포에서 상기 돌연변이된 BK_Ca 채널의 활성을 분석하는 단계로, 상기 시험물질이 상기 돌연변이된 BK_Ca 채널의 활성을 촉진시키면 이온 채널 활성제(activators)로 판단하고 상기 돌연변이된 BK_Ca 채널의 활성을 억제시키면 이온 채널 억제제(blockers)로 판단하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
   
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 돌연변이된 BK_Ca 채널은 [Ca^{2 +}]_i에 관계없이 막 탈분극(membrane depolarization)에 의해 활성화되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
   
4. 제 3 항에 있어서, 상기 탈분극은 -80 mV 내지 200 mV 범위의 전압 펄스(voltage pulses)에서 10 mV 전압 증가로 단계적으로 유도되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 돌연변이된 BK_Ca 채널의 전도성-전압 관계(conductance-voltage relationship, G-V)는 음적 전압(negative voltage) 방향으로 이동된 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
   
6. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 분석은 Tl⁺ 이온 농도에 대한 형광 측정을 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
   
7. 서열목록 제4서열의 아미노산 서열로 이루어진 돌연변이된 BK_Ca 채널 단백질.
   
8. (a) 서열목록 제4서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합된(operatively linked) 프로모터; 및 (c) 터미네이터(terminator)를 포함하는 재조합 벡터.
   
9. 제 8 항의 재조합 벡터로 형질전환된 세포.
   
10. 다음의 단계를 포함하는 BK_Ca 채널 활성 이상 질환(diseases)의 치료제 스크리닝 방법:
    (a) 서열목록 제4서열로 이루어진 돌연변이된 BKCa 채널 단백질의 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 세포에서 돌연변이된 BK_Ca 채널의 활성을 분석하는 단계로서, 상기 시험물질이 상기 돌연변이된 BK_Ca 채널의 활성을 촉진시키면 BK_Ca 채널 활성 이상 질환 치료제로 판단되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
    
11. 삭제
12. 제 10 항에 있어서, 상기 BK_Ca 채널 활성 이상 질환은 심혈관질환(cardiovascular disease), 기도 과다반응, 진폐증, 알루미늄증, 탄분증, 석면증, 석폐증, 첩모탈락증(ptilosis), 철침착증(siderosis), 규폐증, 연초 중독증, 면폐증(byssinosis), 사르코이드증(sarcoidosis), 베릴륨증, 폐기종, 급성 호흡 곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome; ARDS), 급성 폐 손상(acute lung injury; ALI), 급성 또는 만성 감염성 폐질환, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease; COPD), 기관지염, 만성 기관지염, 색색거리는(wheezy) 기관지염, 낭섬유증 악화, 만성 기침, 기도 과다반응의 악화, 폐 섬유증, 폐 고혈압, 염증성 폐질환, 하부 요로 질환(lower urinary tract disorders), 발기부전, 불안(anxiety) 장애, 간질 또는 동통인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
    
13. 제 12 항에 있어서, 상기 심혈관질환은 죽상경화증, 죽상혈전증, 아테롬성 동맥경화증, 관상동맥질환, 허혈, 재관류 손상, 고혈압, 재협착증, 동맥 염증, 심근 허혈 또는 허혈성 심장 질환, 안정 및 불안정 협심증, 뇌졸중, 울혈성 심부전, 대동맥 협착증, 대동맥류 또는 말초혈관질환인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
    
14. 삭제
15. 제 12 항에 있어서, 상기 하부 요로 질환은 과민성 방광(overactive bladder), 불안정성 방광(unstable bladder), 과민성 배뇨근, 배뇨근불안정(detrusor instability), 배뇨근과반사(detrusor hyperreflexia), 감각성 급뇨(sensory urgency), 요실금, 긴박성 요실금(urge urinary incontinence), 스트레스성 요실금(urinary stress incontinence), 신경인성 요실금(relfex urinary incontinence), 느린 배뇨, 배뇨 말기 적하(dribbling), 배뇨 장애(dysuria) 또는 경련성 방광(spastic bladder)인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
    
16. 제 12 항에 있어서, 상기 불안 장애는 범불안장애, 불안공황, 강박장애, 사회 공포증, 수행 불안(performance anxiety), 외상 후 스트레스 장애(posttraumatic stress disorder), 급성 스트레스 반응, 적응 장애(adjustment disorder), 건강염려성 장애(hypochondriacal disorder), 분리 불안 장애, 광장공포증 또는 특정 공포증(phobia)인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
    

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