KR101592888B1

KR101592888B1 - 바실러스속 고온성 균주를 이용한 발효 오징어간장농축액 제조방법

Info

Publication number: KR101592888B1
Application number: KR1020140058585A
Authority: KR
Inventors: 옥임호
Original assignee: 주식회사 에이치에스아쿠아피드
Priority date: 2014-05-15
Filing date: 2014-05-15
Publication date: 2016-02-11
Also published as: KR20150131636A

Abstract

본 발명은 오징어간장부산물에 기탁번호 제KCCM 11067P인 바실러스속 고온성 균주 Bacillus subtilis subsp. subtilis LSK 0604를 첨가하여 60~70℃에서 6시간 이상 발효하여 제조되는 발효오징어간장농축액 제조방법을 특징으로 한다.

Description

바실러스속 고온성 균주를 이용한 발효 오징어간장농축액 제조방법{Method for making fermented squid liver concentrate using Bacillus subtilis subsp. subtilis LSK 0604 in high-temperature type Bacillus}

본 발명은 고온에서 생육이 가능하고 단백질 분해가 뛰어난 바실러스속 고온성 균주 Bacillus subtilis subsp . subtilis LSK 0604를 이용한 발효오징어간장농축액의 제조방법의 개발에 관한 것이다.

국내에서는 해산양식어류의 사료로 바다에서 어획한 어류를(고등어, 메가리, 깡치, 풀치등) 냉동한후 펠렛을 만들어 공급하는 생사료를 많이 사용하고 있다. 어린 치어까지 잡아서 양어사료로 이용하다보니 연근해 어류의 생산량은 감소하고 있으며 생사료의 사용은 많은 양의 허실로 해양을 오염시키는 요인으로 작용하고 있다.

이러한 이유로 정부에서는 배합사료의 사용을 권장하고 있으며 배합사료 사용시 사료비의 최대 50%까지 지원하고 있다.

그리고 급속한 양식업의 팽창과 더불어 고밀도 사육과 같은 문제로 인해 생산성 저하 및 어병이 빈번하게 발생하고 있어 성장촉진 및 사료효율을 개선하거나 어류의 비특이적 면역 반응을 증강시켜 생산성 향상 및 양식어류의 질병을 예방하기 위해 많은 연구가 수행되고 있다.

또한, 국내에서는 양식 배합사료 주원료인 어분을 해외에서 대부분 수입에 의존하고 있고, 수산가공부산물을 이용하여 저가의 어분 특히, 참치와 오징어가공시 발생하는 부산물을 건조 또는 흡착하여 생산하고 있다.

이에 최근들어 양어 사료의 원료로 이용율이 낮은 수산가공부산물의 품질을 높이기 위한 개발의 필요성이 증대되고 있다.

본 발명은 SARC_BSL을 이용하여 양식 어류의 사료 섭취 및 사료 이용성 증대를 통한 성장 촉진과 비특이적 면역을 증대시킬수 있는 발효 오징어간장농축액 제조하는 것을 목적으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 오징어간장부산물에 기탁번호 제KCCM 11067P인 바실러스속 고온성 균주 Bacillus subtilis subsp . subtilis LSK 0604를 첨가하여 60~70℃에서 6시간 이상 발효하여 제조하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 상기 발효오징어간장농축액은 수분 40%이하, 조단백질 30%이상, 조지방 18%이상, 유리아미노산 4%이상을 함유하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 상기 발효오징어간장농축액은 사료의 총중량에 대하여 3~5중량%를 첨가하여 사용되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의해서 제조된 오징어간장농축액은 바실러스속 고온성 균주를 이용하여 제조되어, 단백질을 분해하여 유리아미노산을 증가시키고, 어류의 사료섭취 및 성장을 촉진하며, 비특이적 면역을 증대시켜 어병에 대한 저항력과 생존율을 높이는 효과가 있다.

도1은 바실러스속 고온성 균주 Bacillus subtilis subsp. subtilis LSK 0604의 계통발생학적인 계보를 나타낸 도면이다.
도2는 바실러스속 고온성 균주 Bacillus subtilis subsp. subtilis LSK 0604의 염기서열를 나타낸 도면이다.

본 발명에서의 균주는 형태적 특성, 생화학적 특성 및 16S rDNA의 염기서열 분석 결과, 바실러스속으로 확인되었는바, 이를 바실러스중 Bacillus subtilis subsp. subtilis LSK 0604로 명명하고, 이하 SARC_BSL로 표기한다.

2010년 2월 19일자로 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁번호 제 KCCM 11067P호로 기탁하였다.

이하, 본 발명의 실시예에 의하여 보다 상세하게 설명하고자 한다.

아래 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예1: 고온성 균주의 분리

검체 5g을 생리식염수 100ml에 넣고 30℃ shaking incubator에서 1h shaking하였다. 그 상등액 10ml을 PBS 100ml에 넣고 40℃에서 1일간 진탕 배양하였다. 상기 배양액을 NA(Nutrient Agar) 배지에 도말하여 40℃ incubator에서 1일간 배양하여 생긴 colony를 SARC_BSL로 표기하고 TSA (Trypticase soy Broth agar)배지에서 순수배양하였다.

1) 배지조건 실험

NA배지, TSA배지 및 PDA 배지를 이용하여 순수 배양된 균체를 40℃에서 배양한 결과 NaCl을 5% 포함하는 TSA 배지에서 생육이 양호하였다. 이를 통해 SARC_BSL균주는 탄소원에 대한 요구와 미네랄 또는 소금에 대한 요구성이 높은 것으로 확인되었다.

2) 균주 배양시 온도조건(실험실 규모) 실험

TSA 배지에 SARC_BSL균주를 도말하여 30℃, 40℃, 50℃ 및 60℃에서 배양한 결과 균주는 40℃ 및 50℃에서 생육 양호하며 60℃, 70℃ 및 80℃에서 배양한 결과 생육하지 않았다. 그리고 SARC_BSL균주를 도말하여 45℃에서 1일간 배양하여 상온 및 4℃ 냉장 보관한 결과 상온 및 4℃ 냉장 보관에서 6개월 이상의 보관성을 보였다.

3) 균주 배양시 액체 배양조건 실험

TSB 배지에 균주를 접종하여 정치 및 진탕 배양한 결과, 진탕배양에서 생육 양호하였으며 JAR fermentor 대량 배양한 결과 TSB, 45,℃ 100rpm, 0.3vvm에서 8h 후 최대 성장함을 보였다.

4) 균주의 효소 특성 확인실험(APIzyme kit 이용)

Esterase 및 esterase lipase를 다량 분비하는 것으로 나타났으며, alkaline phosphatase, acid phospatase 및 naphtol-AS-Bl-phospaohydrolase를 소량 분비하는 것으로 나타났다. 또한 발암효소인 b-glucuronidase는 분비하지 않는 것으로 나타났다.

5) 균주 배양액의 독성 실험

상업적으로 개발된 배지에 배양된 균주를 이용하여 동물 독성 실험을 실시하였다.

실험용 쥐를 이용하여 1×10⁹cfu/ml의 균주를 경구 투여하여 3주간 공급 폐사 및 체중 저하 등의 이상증상이 없었다.

양식 넙치와 뱀장어의 사료에 1×10⁷ cfu/ml의 균주를 혼합하여 4주간 공급 폐사 및 체중 저하 등의 이상 증상이 없었다.

상기의 실험결과 실험실 규모에서 배양된 SARC_BSL균주는 약40~50℃의 온도에서 잘 생육하며, 상온 및 냉장 보존성이 높은 것으로 판단된다.

또한 급성 독성 실험 결과 생물체에 무해한 것으로 판단된다.

실시예2: 발효 오징어내장농축액 제조실험

1) 오징어내장농축액 제조시 적정 발효온도 조건 확인 실험.

(실험방법)

1L 삼각플라스크에 오징어내장부산물 200g을 넣고 0.2ml SARC_BSL 배양액을 접종하였다.

실험온도는 다음과 같다.

실험구1 : 40℃ 실험구2 : 50℃

실험구3 : 60℃ 실험구4 : 70℃

실험구5 : 80℃

12시간동안 각온도별로 진탕배양한후 생균수와 유리아미노산을 측정하였다

(실험결과)

12시간 발효후 SARC_BSL 생균수는 표1에 나타내었다.

80℃에서는 균의 숫자가 낮게 나타난 반면 나머지 실험구에서는 발효가 양호가세 이루어진 것으로 판단된다.

SARC_BSL균주가 균주 배양(실험실 규모)시 50℃이상의 경우 거의 사멸하는 것과 달리 오징어간장부산물 발효시 60-70℃에서도 잘생육하는 이유는, 수분이 직접 닿는 액체 배지에서는 직접적인 온도 전달이 이루어져 사멸하게 되지만 단백질과 지방이 약 30%정도인 오징어간장부산물내에서는 간접적인 열에 의해 더 높은 온도에서도 생육이 가능하기 때문인 것으로 판단된다.

상기의 결과를 통해 균주는 40~50℃의 온도에서 잘 생육하고 오징어간장부산물에서는 60-70℃에서 발효가 가능하며 6h에서 최대생장을 보이는 고온성 균주임을 확인할 수 있다.

	12h 후 생균수(cfu/g)
	6h	12h
40℃	10^5	10^7
50℃	10^5	10^7
60℃	10^7	10^8
70℃	10^8	10^8
80℃	10^4	10^3

오징어간장부산물내 유리아미노산 함량은 표 2(6h이후 유리아미노산 함량)와 표3(12h이후 유리아미노산 함량)에 나타내었다.

유리아미노산의 함량은 표1의 SARC_BSL의 생장 결과와 유사한 결과를 보여주고 있다.

발효 6h후의 결과에서 유리아미노산함량은 70℃에서 4.36%로 가장 높은 결과를 보여주고 있다.

발효 12h후의 결과에서 유리아미노산함량은 40-70℃에서 3.54-4.64%의 결과를 보여주었다. 80℃에서는 낮은 유리아미노산 함량을 보여주었다.

생균수와 유리아미노산함량의 결과를 종합할 때 70℃에서 6시간 이상의 발효가 가장 좋은 결과를 보여주었다.

Amino acid	온도
Amino acid	40℃	50℃	60℃	70℃	80℃
Aspartic acid	0.19	0.19	0.31	0.35	0.17
Threonine	0.15	0.18	0.35	0.41	0.11
Serine	0.18	0.19	0.40	0.45	0.15
Glutamate	0.20	0.25	0.65	0.83	0.20
Glycine	0.05	0.13	0.09	0.12	0.08
Alanine	0.08	0.10	0.18	0.21	0.06
Histidine	0.06	0.07	0.07	0.11	0.02
Arginine	0.07	0.10	0.33	0.41	0.05
soleucine	0.08	0.07	0.11	0.12	0.04
Leucine	0.10	0.15	0.18	0.25	0.06
Tyrosine	0.02	0.03	0.05	0.05	0.01
Phenylalanine	0.08	0.12	0.08	0.12	0.05
Lysine	0.10	0.12	0.11	0.15	0.04
Valine	0.24	0.19	0.25	0.34	0.17
Methionine	0.02	0.03	0.03	0.03	0.01
Proline	0.10	0.12	0.34	0.41	0.07
합계	1.72	1.92	3.53	4.36	1.29

Amino acid	온도
Amino acid	40℃	50℃	60℃	70℃	80℃
Aspartic acid	0.33	0.35	0.35	0.38	0.20
Threonine	0.38	0.41	0.39	0.40	0.13
Serine	0.37	0.35	0.43	0.47	0.14
Glutamate	0.71	0.69	0.75	0.91	0.22
Glycine	0.08	0.11	0.13	0.13	0.12
Alanine	0.10	0.13	0.22	0.22	0.09
Histidine	0.06	0.08	0.10	0.12	0.04
Arginine	0.34	0.37	0.39	0.43	0.07
Isoleucine	0.10	0.08	0.13	0.13	0.05
Leucine	0.18	0.15	0.22	0.24	0.08
Tyrosine	0.02	0.04	0.07	0.06	0.03
Phenylalanine	0.09	0.07	0.10	0.14	0.07
Lysine	0.12	0.13	0.13	0.16	0.08
Valine	0.29	0.24	0.37	0.38	0.22
Methionine	0.02	0.02	0.04	0.04	0.01
Proline	0.35	0.37	0.39	0.43	0.10
합계	3.54	3.59	4.21	4.64	1.65

2) 발효 오징어간장농축액 현장 제조 확인 실험

발효 오징어간장농축액 제조시 오징어간장부산물의 온도를 일정하게 설정하여 유지 및 변화를 확인하고 생균수 및 유리아미노산 농도 변화에 미치는 영향을 평가하였다.

(실험방법)

6톤 용량의 오징어간장 발효농축기에 오징어간장부산물 3톤을 투입하였고 10^9으로 제조된 SARC_BSL 배양액을 3L를 접종하였다.

오징어간장 발효농축기의 스팀온도를 110-120℃로 설정하여 6시간 가열하고, 5시간 냉각한 뒤 상층부 oil을 뽑아내고, 스팀온도를 110-120℃로 설정하여 5시간 가열 농축하였고 시간별 오징어간장부산물의 온도와 생균수를 확인하였다

(실험결과)

SARC_BSL이 접종된 오징어간장부산물의 시간대별 온도, 수분 및 SARC_BSL 생균수는 하기 표4에 나타내었다.

오징어간장부산물의 온도는 6h동안 65-75℃를 유지하였으며 생균수 측정 결과 6h후에 최대치를 나타내었고 수분은 50%까지 감소하였다.

초기 6h 동안 미생물의 증식과 발효가 거의 다 이루어진 것으로 보인다. 그리고 냉각후 재가열시 온도는 80℃이상으로 올랐으며 수분은 38%까지 감소하였고 균수도 급격히 감소한 결과를 보였다.

유리아미노산의 함량은 6h에 약 4.5%정도의 양을 나타내어 실험실 실험과 유사한 결과를 보여주었다.

시간(h)	내부온도(℃)	수분(%)	생균수(cfu/g)	비고
0	31	68	3.0×10^4
1	65	63	8.2×10^5
2	69	60	2.3×10^6
3	72	56	4.1×10^6
4	71	53	1.4×10^7
5	73	52	2.7×10^7
6	74	50	4.1×10^8
1	60	47	2.9×10^7	냉각후 재가열
2	75	45	3.1×10^5
3	77	43	1.7×10^5
4	81	40	6.2×10^4
5	82	38	5.7×10^3

3) 본 발명의 발효오징어간장농축액과 일반오징어간장농축액 성분분석 비교

발효오징어간장농축액은 일반오징어간장농축액과 일반성분 수치는 비슷하며 펩신소화율은 높게 나타났다.

산가는 매우 낮은값을 나타내어 신선도가 매우 우수한 제품이 생산될 것으로 판단된다.

실시예3: 넙치 배합사료내 발효오징어내장농축액 첨가효과 실험

본 실험에서는 넙치 치어를 대상으로 배합사료내 국내시판용 오징어간장농축액(Squid Liver Concentrate, SLC)과 본 발명인 SARC_BSL을 이용한 발효오징어간장 농축액(Fermented Squid Liver Concentrate, FSLC)을 사료에 첨가하여 사료섭취 및 성장촉진효과와 비특이적 면역반응을 확인하고자 8주간 실시하였다.

1) 성장실험

(실험방법)

- 실험사료

실험사료의 조성표는 하기 표5에 나타내었다.

대조구와 오징어간장농축액(Squid Liver Concentrate, SLC)와 SARC_BSL을 이용한 발효오징어간장 농축액(Fermented Squid Liver Concentrate, FSLC)를 각각 1%, 3%과 5%를 혼합하여 총 7개의 실험사료를 제조하였다.

모든 실험사료는 조단백질 함량은 50%, 가용에너지는 17.6KJ/g (protein, carbohydrate and lipid: 16.7, 16.7 and 37.7J/g)으로 맞추어 사료원을 혼합한 후 펠렛제조기로 압출 성형하여 밀봉상태로 -20℃에 냉동 보관하여 사용하였다.

실험사료는 다음과 같다.

실험구 1 : 대조구 실험구 2 : SLC 1%

실험구 3 : SLC 3% 실험구 4 : SLC 5%

실험구 5 : FSLC 1% 실험구 6 : FSLC 3%

실험구 7 : FSLC 5%

항목	발효오징어간장농축액	일반오징어간장농축액
수분(%)	38	40이하
조단백질(%)	30	30이상
조지방(%)	18	18이상
펩신소화율(%)	95	90
산가(mgKOH/g)	25	60이하

- 실험어 및 실험디자인

실험사료 및 환경에 적응시키기 위해 1주일간 기초를 공급하면서 예비사육을 하였다.

실험어는 넙치 치어 (9.2 ±0.1g)를 사용하였으며 60ℓ사각 수조에 15마리씩 각 실험구당 3반복으로 무작위 배치하였다.

사육수 유수식으로 유수량은 2-4ℓ/min로 조절하였다.

수온은 전 실험기간동안 16 ±1.1℃였다.

각 수조에 충분한 산소공급을 위해 에어스톤을 설치하였다.

일일 사료공급량은 어체중의 3-5%(건물량 기준)로 1일 2회(10:00, 16:00h)공급 하였다.

2주마다 각 수조의 전체 실험어 무게를 측정하고 사료공급량을 조절하였다.

- 샘플 수집 및 분석

8주간의 실험종료 후, 전체 무게 및 마리수를 측정하고 증체율, 사료효율, 일간성장율, 단백질 전환효율, 비만도와 생존율을 계산하였다. 그리고 전어체의 수분, 단백질, 지방과 회분을 분석하였다.

- 통계분석

모든 자료는 Computer Progrem Statistix 3.1(Analytical Software, St. Paul, Mn. USA)로 분산분석(ANOVA)을 실시하여 최소유의차검정(LSD : Least Significant Difference)으로 평균간의 유의성(P = 0.05)을 검정하였다.

대조구 사료의 조성표는 하기 표6과 같다.

사료원료	%
어분	57.0
대두박	10.0
콘글루텐밀	5.0
밀가루	16.0
어유	10.0
비타민	1.0
미네랄	1.0
일반성분 분석치 (% 건물기준)
수분	19.4
조단백	51.0
조지방	18.2

(실험결과)

8주간의 실험결과는 표7와 표8에 나타내었다.

사료섭취량은 대조구가 일일 평균 어체중의 2.8%였고 일반 오징어간장농축액 5%첨가구인 실험구 4가 일일 평균 어체중의 2.3%로 가장 낮았다.

발효오징어간장농축액을 첨가한 실험구 5, 6 및 7은 다른 실험구에 비해 높은 사료섭취량을 보였으며 일일 평균 어체중의 3.0-3.2% 이상 섭취하여 사료섭취 촉진효과가 뛰어난 것으로 나타났다.

증체율(WG, weight gain), 사료효율(Feed Efficiency, FE), 일간성장율(Specific Growth Rate, SGR), 단백질 전환효율(Protein Efficiency Ratio, PER) 및 비만도에 있어서 대조구에 비해 SLC첨가구(실험구 2, 3 및 4)중 실험구 3은 유의적으로 높은 결과를 보였고, 실험구 2는 유의적인 차이가 없었고, 실험구 4는 유의적으로 낮은 결과를 보였다(P<0.05).

FSLC첨가구(실험구 5, 6 및 7)중 실험구 6과 7이 모든 실험구에 비해 유의적으로 가장 높은 결과를 보였다.(P>0.05)

비만도(Condition Factor, CF)는 FSLC첨가구 (실험구 5, 6 과 7)가 다른실험구에 비해 유의적으로 높은 결과를 보였고 간중량 지수(Hepatosomatic index, HSI)와 생존율(Survival)에 있어서 모든 실험구간에 유의적인 차이가 없었다.(P>0.05)

전어체 일반성분 분석치는 표9에 나타내었다.

전어체 단백질함량에 있어서 FSLC첨가구인 실험수 7과 8이 다른실험구에 비해 유의적으로 높게 나타났으며 지방함량은 다른실험구에 비해 유의적으로 낮게 나타났다.(P>0.05)

전어체 수분과 회분함량은 모든 실험구간에 유의적인 차이가 없었다.(P>0.05)

성장실험결과 일반 국내 시판 오징어간장농축액은 3% 첨가시에는 일부 효과를 보였지만 5%첨가시에는 오히려 사료의 기호성이 떨어지고 성장이 감소하는 결과를 보여주었다. 반면에 발효오징어농축액은 사료섭취 촉진을 통한 사료효율개선을 통해 성장을 촉진시키며 비만도 역시 증대 시켰다.

어류의 사료섭취 촉진물질로 알려진 유리아미노산의 함량이 발효를 통해 증대되어진 결과인 것으로 사료된다. 그리고 어체의 단백질은 증가하고 지방은 감소하는 효과를 가진 것으로 확인되었다.

이러한 결과는 넙치전어체내 단백질의 축적을 증가시키고 지방대사의 활성화를 통한 지방축적을 감소시켜 건강한 상태를 유지하고 고급육질 생산에도 기여할 것으로 사료된다.

하기의 표7은 실험사료 공급 8주후 증체율(WG), 사료효율(FE), 일간성장율(SGR) 및 단백진 전환 효율(PER) 결과를 나타낸다.

실험구	WG(%)	FE(%)	SGR(%)	PER
1	221^d	78.3^c	2.24^d	1.53^c
2	229^d	78.6^c	2.25^d	1.55^c
3	237^c	81.4^b	2.34^c	1.63^b
4	212^e	75.3^d	2.21^d	1.50^c
5	240^c	82.5^b	2.41^b	1.69^a
6	267^a	87.4^a	2.51^a	1.72^a
7	255^b	86.3^a	2.48^a	1.70^a
평균표준오차	3.11	1.23	0.03	0.03

하기의 표8은 실험사료 8주공급후, 비만도(CF), 간중량 지수(HSI) 및 생존율( survival)를 나타낸다.

실험구	CF	HSI	Survival(%)
1	1.16^b	2.52	100
2	1.17^b	2.51	100
3	1.19^b	2.47	100
4	1.13^c	2.46	100
5	1.24^a	2.41	100
6	1.26^a	2.46	100
7	1.26^a	2.51	100
평균표준오차	0.04	0.21	0.00

하기의 표9는 실험사료 8주공급후 전어체 일반성분결과(% 건물기준)를 나타낸다.

실험구	Moisture	Crude Protein	Crude fat	Ash
1	73.2	67.5^d	16.4^d	12.1
2	73.6	68.8^c	15.7^c	12.3
3	73.4	69.5^b	15.1^b	12.2
4	73.1	67.1^d	16.8^d	12.1
5	74.2	70.3^b	15.1^b	11.9
6	73.6	72.8^a	14.2^a	12.2
7	74.2	72.3^a	14.5^a	11.6
평균표준오차	1.12	0.91	0.27	0.34

2) 비특이적 면역반응과 공격실험

(실험방법)

- 두신 식세포의 화학발광반응(Chemiluminescent Response)

8주간의 성장실험 종료후, 넙치로 부터 두신을 무균적으로 분리한 후 냉장한 행크스 균형염용액(Hank's Balanced Salt Solution, HBSS)에 넣어 가는 망사를 이용하여 세포들을 분리해 내었다.

분리된 두신 세포는 다시 34/51%의 퍼콜밀도기울기(Percoll (Sigma) density gradient)를 이용하여, 4℃에서 400g로 30분간 원심분리한 다음 34%와 51% 사이의 세포층을 가는 파스퇴르 피펫을 이용하여 분리하였다.

최종적으로 분리된 세포는 헤파린과 항체가 포함되어 있는 HBSS로 400g에서 5분간 2번 세척하였다.

세포의 생존유무는 트리판 청색균(trypan blue stain)을 이용하여 분석하였으며, 모든 실험구에서 분리된 세포들의 생존율은 98% 이상이었다. 실험에 사용한 식세포의 세포수는 1×106 cells/ml HBSS로 조절하였다.

치모산(Zymosan (Sigma))을 본 실험에 사용하지 않은 건강한 넙치 성어로부터 분리한 혈청과 혼합하여 30℃에서 30분간 배양하였다. 이과정을 통해 옵소닌화(opsonization)이 된 치모산(zymosan)을 원심분리하여 분리하고, HBSS를 이용하여 3회 세척하였다.

식세포에서 방출되는 반응산소중간물질들(Reactive oxygen intermediates, ROIs)은 자동 광도계(automatic photoluminometer:Bio-Orbit 1251, Finland)에 의해 정량적으로 분석하였다. 즉, 각 시험큐벳(test cuvette)은 Scott and Klesius (1981)의 방법에 따라 조제한 루미놀(luminol (Sigma)) 0.7 ml과 세포현탄액(cell suspension) 0.4 ml을 혼합하여 5분간 실온에서 incubation 한 후 측정 바로 전에 옵소닌 처리한 치모산(opsonized zymosan) 0.3 ml을 첨가하여 100분간 측정하였다. 결과는 mV로 기록하였다.

- 라이소자임 활성 (Lysozyme activity)

각각의 실험구 어류에서 분리한 혈청 0.1 ml과 0.05M sodium phosphate buffer, (pH 6.2)에 Micrococcus lysodeikticus (0.2 mg/ml)를 부유시킨 suspension 2 ml과 혼합하였다.

반응은 20℃ 조건에서 분광 흡광도계의 흡광도 530nm에서 0.5분과 4.5분에 측정하였다. lysozyme의 활성 단위는 분당 0.001의 흡광도 감소를 나타내는 효소양으로 정의하였다.

- 보체 대체 경로 (ACP 50) 활성 분석

보체 대체 경로 (ACP) 활성은 양의 적혈구(sheep red blood cells, SRBC)를 이용하여 분석하였다. SRBC를 Mg2+ 와 EGTA가 포함된 젤라틴베로날완충액(gelatin veronal buffer, GVB)에 3번 세척하고, 같은 완충액에서 2×10⁸/ml로 조절하였다. 실험 혈청을 GVB를 이용하여 연속적으로 단계 희석한 후, SRBC를 100ml 첨가하였다.

이 혼합액을 가끔씩 흔들어 주면서 20℃에서 90분간 배양한 후, 4℃에서 1600g로 원심분리하여 상층액을 분광 흡광도계의 흡광도 414nm에서 측정하였다. ACP (ACH50) 활성은 용혈의 정도에 따라 계산하였다.

- 병원균 배양 및 공격실험

독성이 있는 Edwardsiella tarda 부유액 (1 X 106 cfu/ml)을 1.5% NaCl이 첨가된 trypticase soy agar (TSA)에 27℃에서 48시간 배양하여 준비하였다. 어류당 박테리아 부유물을 0.1ml씩 복강 주사한 후 폐사를 기록하였다. 폐사어의 폐사원인을 확인하기 위해 매일 폐사된 어체로 부터 신장을 채취하여 TSA에 배양하여 E. tarda의 존재를 확인하였다.

-통계분석

Students t-test를 사용하여 유의차를 검증하였다.

(실험결과)

비특이적 면역반응과 관련한 자료는 표 10에 나타내었다.

두신 식세포의 화학발광(Chemiluminescence, CL) 반응과 혈청의 라이소자임 활성도에 있어서 FSLC 첨가구(실험구 5, 6과 7)가 다른 모든 실험구에 비해 유의적으로 높은 결과를 보여주었고(P<0.05), 대조구와 SLC첨가구(실험구 2, 3과 4) 사이에는 유의적인 차이가 없었다(P>0.05). 보체 대체 경로의 활성(ACH50)에 있어서 모든 실험구간에 유의적인 차이는 없었다(P>0.05).

Edwardsiella tarda의 복강주사에 의한 공격실험 결과는 표 11에 나타내었다. 공격실험후 4, 5, 6일째 누적폐사율에 있어 FSLC 첨가구(실험구 5, 6과 7)가 대조구와 SLC 첨가구(실험구 2, 3과 4)에 비해 유의적으로 낮게 나타났으며 실험구 6이 가장 낮은 누적폐사율을 보였다(P<0.05). 대조구와 SLC 첨가구(실험구 2, 3과 4)는 인위감염 6일째에 100% 폐사하였으나 FSLC 첨가구(실험구 5, 6과 7)는 인위감염 7일째에도 30%의 생존율을 나타내었다.

SARC_BSL을 이용한 발효오징어내장농축액이 넙치의 비특이적 면역반응을 증대시키는 결과를 보여주었고 넙치에서 질병을 일으키는 Edwardsiella tarda의 공격실험에서도 생존결과를 보여 넙치의 생산성 향상에 기여할것으로 사료된다.

하기 표10은 실험사료 8주 공급후 비특이적 면역반응을 나타낸다.

실험구	Peak value of CL (mV)	Lysozyme activity (U/ml)	ACH50 (U/ml)
1	437^c	316^c	54
2	454^c	317^c	48
3	435^c	324^c	50
4	423^c	302^c	47
5	683^b	401^b	56
6	742^a	453^a	61
7	729^a	411^b	53
평균표준오차	30	21	10

하기 표11은 실험사료 공급 8주후 Edwardsiella tarda를 이용한 공격실험후 누적폐사율을 나타낸다.

일	실험구							Pooled SEM²
일	1	2	3	4	5	6	7
	1	2	3	4	5	6	7
4	83^a	77^b	50^c	90^a	33^d	37^d	40^d	2.5
5	90^a	83^b	73^c	100^a	61^d	43^e	57^b	1.9
6	100^a	100^a	100^a	100^a	70^b	53^c	67^b	1.5
7	100^a	100^a	100^a	100^a	70^b	63^b	70^b	1.3

이처럼 본발명의 발효오징어간장농축액은 유리아미노산을 증가시키고, 사료 섭취 및 성장을 촉진하며, 비특이 면역을 증대시키는 효과가 발휘됨을 확인할 수 있다.

Claims

오징어간장부산물에 기탁번호 제KCCM 11067P인 바실러스속 고온성 균주 Bacillus subtilis subsp. subtilis LSK 0604를 첨가하여 60~70℃에서 6시간 이상 발효하여 제조되며, 수분 40%이하, 조단백질 30%이상, 조지방 18%이상, 유리아미노산 4%이상을 함유하고, 사료의 총중량에 대하여 3~5중량% 첨가되어 사용되는 것을 특징으로 하는 발효오징어간장농축액 제조방법.
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