KR101591361B1 - Saccharomyces cerevisiae B-8 strain producing alcohol and gamma-aminobutyric acid and nonproducing biogenic amine isolated from fermented liquid of raspberry and uses thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 복분자 발효액으로부터 분리된 알코올 및 감마-아미노뷰티르산(γ-aminobutyric acid, GABA)을 생산하고 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) B-8 균주(기탁번호 KCCM11415P), 상기 균주를 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 알코올 또는 감마-아미노뷰티르산을 생산하는 방법 및 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 알코올 또는 감마-아미노뷰티르산 생산용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 균주는 소비자의 다양한 기호에 맞춘 각종 발효식품, 천연조미료 및 건강 기능성 제품의 개발 및 생산에 활용가능한 소재로 제공될 수 있을 것이다.The present invention has been separated from the alcohol and the gamma bokbunja broth-aminobutyric acid (γ-aminobutyric acid, GABA) producing and biogenic three Mai to saccharide that does not produce the amine process Levy jiae (Saccharomyces cerevisiae) B-8 strain (Accession No. KCCM11415P), alcohol, or gamma, including the step of culturing the strain in a culture medium-containing method of producing aminobutyric acid, and the strain or its culture as an active ingredient, an alcohol or The present invention relates to a composition for producing gamma-aminobutyric acid. The strain of the present invention can be provided as a material that can be used for the development and production of various fermented foods, natural seasonings, and health functional products adapted to various tastes of consumers.
Description
본 발명은 복분자 발효액으로부터 분리된 알코올 및 감마-아미노뷰티르산을 생산하고 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 사카로마이세스 세레비지애 B-8 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 복분자 발효액으로부터 분리된 알코올 및 감마-아미노뷰티르산(γ-aminobutyric acid, GABA)을 생산하고 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) B-8 균주(기탁번호 KCCM11415P), 상기 균주를 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 알코올 또는 감마-아미노뷰티르산을 생산하는 방법 및 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 알코올 또는 감마-아미노뷰티르산 생산용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to Saccharomyces cerevisiae B-8, which produces alcohols and gamma-aminobutyric acid separated from a bokromatic fermentation broth and does not produce a biogenic amine, and to its use, and more particularly to a bacterium isolated from a bacterium fermentation broth (GABA), which does not produce biogenic amines, and Saccharomyces cerevisiae, which produces < RTI ID = 0.0 > gamma -aminobutyric & cerevisiae) B-8 strain (Accession No. KCCM11415P), alcohol, or gamma, including the step of culturing the strain in a culture medium-containing method of producing aminobutyric acid, and the strain or its culture as an active ingredient, an alcohol or To a composition for producing gamma-amino butyric acid.
발효는 오래전부터 자연발생적으로 나타난 미생물 작용의 현상으로서, 인류는 미생물의 존재가 밝혀지기 훨씬 이전부터 발효현상을 이용해왔다. 최근, 대부분의 발효는 자연계에서 분리된 미생물 균주들을 배양하여 스타터의 형태로 개발된 미생물을 접종하여 행해지고 있는데, 스타터로 첨가하는 균주에 따라서 발효물의 맛과 향에 중대한 영향을 미치게 된다. 일반적으로 발효에 사용되는 균주로는 아스퍼질러스(Aspergillus) 속, 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속 등이 있다.Fermentation is a phenomenon of microbial action that has appeared naturally from a long time ago, and mankind has used the fermentation phenomenon long before the existence of microorganisms was revealed. Recently, most of the fermentation has been carried out by inoculating the microorganisms isolated in the natural environment and cultivating the microorganisms developed in the form of starter. However, depending on the strains added as the starter, the taste and flavor of the fermented product are greatly influenced. A strain commonly used in fermentation processes and the like MY (Saccharomyces) genus Bacillus (Bacillus) genus Lactobacillus bacteria (Lactobacillus) as in Aspergillus (Aspergillus), A saccharide.
전통 발효주는 발효 식품의 대표적인 예로, 최근에는 단순 발효과정을 거친 민속주보다 향미와 색상 등의 기호적인 특성과 독특한 기능성을 부여한 발효주가 생산되고 있다. 발효 재료와 발효과정 중에 생산되는 부산물의 효능을 입증하면서 건강 기능성을 강조한 발효주는 주류 시장에서 외국의 술과 견주어 볼만큼 경쟁력을 갖춰나가고 있다.Traditional fermented soybean is a representative example of fermented food. In recent years, fermented soybean has been produced which has more favorable characteristics such as flavor and color and unique functionality than traditional fermented soy sauce. While proving the efficacy of fermented materials and byproducts produced during the fermentation process, the fermented beverages emphasizing health functionalities are becoming more competitive than those of foreign countries in the mainstream market.
감마-아미노뷰티르산은 자연계에 분포하는 비단백질성 아미노산의 일종으로 뇌나 척수와 같은 중추신경계의 주된 억제성 신경전달물질(inhibitory neurotransmitter)로 알려져 있다. 뇌의 혈류를 활발하게 하고 뇌에 산소 공급량을 증가시켜 뇌세포의 대사기능을 촉진시키며, 혈액 내의 중성지방을 줄이고 간기능을 개선시키는 등의 여러 약리 활성으로 인해, 뇌동맥 휴유증에 의한 두통, 귀 울림, 의욕저하 등의 치료제에 응용되어 왔다. 또한, 고혈압과 같은 성인병 등의 예방 및 개선에 효과적인 것으로 밝혀져, 기능성 식품소재로서의 관심이 고조되고 있고 최근에는 감마-아미노뷰티르산을 다량 함유하는 음료가 출시되기도 했다.Gamma-aminobutyric acid is a naturally occurring non-proteinaceous amino acid known as an inhibitory neurotransmitter in the central nervous system such as the brain or spinal cord. Because of the various pharmacological activities such as activating the blood flow of the brain, increasing the oxygen supply amount to the brain to promote the metabolic function of the brain cells, reducing the triglyceride in the blood and improving the liver function, headache due to cerebral artery heritability, , Decreased sensitivity, and the like. In addition, it has been found effective for prevention and improvement of adult diseases such as hypertension. Thus, interest as a functional food material has been increasing and recently, a drink containing a large amount of gamma-amino butyric acid has been introduced.
바이오제닉 아민(biogenic amin, BA)은 발효과정에서 발효 미생물들에 의해 생산되는 것으로서 성장조절 및 염증조절, 신경전달 등의 생리적 기능을 담당하지만, 이들 중 인체의 분해 한도를 넘어서는 바이오제닉 아민을 식품을 통해서 섭취하는 경우에는 인체에 유해한 증상이 나타난다. 따라서 발효에 있어서, 발효과정 동안 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 발효 균주의 선발이 매우 중요하다. Biogenic amines (BA) are produced by fermentation microorganisms in the fermentation process. They are responsible for growth regulation, inflammation regulation, and neurotransmission. However, biogenic amines exceeding the degradation limit of human body If you ingest it through the body, harmful symptoms appear. Therefore, in fermentation, selection of fermentation strains that do not produce biogenic amines during the fermentation process is very important.
따라서 본 발명을 통해 복분자 발효액으로부터 분리한 사카로마이세스 세레비지애 B-8 균주는 기존의 균주보다 알코올 생성능과 감마-아미노뷰티르산의 생산량이 많고, 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 균주로서 전통발효식품, 기능성 식품, 조미료 및 효소제품을 비롯한 산업적 응용이 가능할 것이다.Therefore, the Saccharomyces cerevisiae B-8 strain isolated from the bacterium fermentation broth through the present invention has a higher yield of alcohol-producing ability and gamma-aminobutyric acid than conventional strains, and does not produce a biogenic amine, Industrial applications including food, functional foods, seasonings and enzyme products will be possible.
한국등록특허 제1198746호에는 '천연 GABA를 함유하는 기능성 발효주의 제조방법 및 이에 의해 제조된 기능성 발효주'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1158448호에는 '효모 엑기스를 이용한 고농도의 천연 GABA를 함유하는 기능성 발효소재 및 그의 제조방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 복분자 발효액으로부터 분리된 알코올 및 감마-아미노뷰티르산을 생산하고 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 사카로마이세스 세레비지애 B-8 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.Korean Patent No. 1198746 discloses a process for producing a functional fermented soybean containing natural GABA and a functional fermented soybean produced thereby. Korean Patent No. 1158448 discloses a method for producing a functional fermented soybean containing a high concentration of natural GABA using yeast extract Functional fermentation material and a method for producing the fermentation material of the present invention are disclosed, but it is also possible to produce saccharomyces cerevisiae B-8 which produces alcohols and gamma-amino butyrate isolated from the bacterium fermentation broth of the present invention and does not produce biogenic amines, There is no description about use.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 복분자 발효액으로부터 분리된 알코올 및 감마-아미노뷰티르산을 생산하고 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 사카로마이세스 세레비지애 B-8 균주를 분리함으로써, 베리류 발효에 적합한 발효 균주를 제공하는데 그 목적이 있다.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made in view of the above-mentioned needs, and an object of the present invention is to provide a method for producing alcohol and gamma-aminobutyric acid separated from a bokromatic fermentation broth and producing a bacterium strain Saccharomyces cerevisiae B- And a fermentation strain suitable for berries fermentation.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 복분자 발효액으로부터 분리된 알코올 및 감마-아미노뷰티르산(γ-aminobutyric acid, GABA)을 생산하고 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) B-8 균주(KCCM11415P)를 제공한다.In order to solve the above-mentioned problems, the present invention relates to a method for producing alcohol and gamma-aminobutyric acid (GABA) separated from a bokromatic fermentation broth and producing Saccharomyces cerevisiae cerevisiae strain B-8 (KCCM 11415P).
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 알코올 또는 감마-아미노뷰티르산을 생산하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing an alcohol or gamma-amino butyric acid, comprising culturing the strain in a culture medium.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 알코올 또는 감마-아미노뷰티르산 생산용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for producing alcohol or gamma-amino butyric acid containing the strain or the culture thereof as an active ingredient.
본 발명에 따른 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) B-8 균주는 알코올 및 감마-아미노뷰티르산의 고생산이 가능하고 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 발효 특성을 가짐으로써 소비자의 다양한 기호에 맞춘 각종 발효식품, 천연조미료 및 건강 기능성 제품의 개발 및 생산에 활용가능한 소재로 제공될 수 있을 것이다.My process three to Saccharomyces according to the present invention Levy jiae (Saccharomyces cerevisiae strain B-8 is capable of high production of alcohol and gamma-aminobutyric acid, and has fermentation characteristics that do not produce biorenic amines, thereby developing various fermented foods, natural seasonings and health functional products And can be provided as materials that can be used for production.
도 1은 스타터를 배양하여 알코올 발효하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 복분자 발효액으로부터 분리한 B-8 균주의 전세포 반응의 감마-아미노뷰티르산 생산 정도를 박층 크로마토그래피(TLC)를 이용하여 분석한 결과이다.
도 3은 복분자 발효액에서 분리한 B-8 균주를 20%과 30%의 글루코스를 첨가한 YM 액체배지에 배양하고 증식도를 측정하여, 글루코스 내성을 분석한 결과이다. (A); 접종 12시간 후, (B); 접종 24시간 후, (C); 접종 48시간 후.
도 4는 복분자 발효액에서 분리한 B-8 균주를 200ppm과 300ppm의 황산을 첨가한 YM 액체배지에 배양하고 증식도를 측정하여, 아황산 내성을 분석한 결과이다. (A); 접종 12시간 후, (B); 접종 24시간 후, (C); 접종 48시간 후.
도 5는 복분자 발효액에서 분리한 B-8 균주를 알코올 농도별로 첨가한 YM 액체배지에 배양하고 증식도를 측정하여, 알코올 내성을 분석한 결과이다. (A); 접종 12시간 후, (B); 접종 24시간 후, (C); 접종 48시간 후.
도 6은 복분자 발효액에서 분리한 B-8 균주의 온도에 따른 생육곡선을 나타낸 그래프이다.
도 7은 복분자 발효액에서 분리한 B-8 균주의 제한효소 CfoⅠ, HaeⅢ, HinfⅠ 처리에 의한 패턴을 분석한 것이다. M; 1kb DNA 마커, SC; 사카로마이세스 세레비지애 KACC30008 균주, B-8; 복분자 발효액에서 분리된 사카로마이세스 세레비지애 B-8 균주.
도 8은 복분자 발효액에서 분리한 B-8 균주의 분자생물학적 계통분류도이다.
도 9는 복분자 발효액에서 분리한 B-8 균주의 주사전자현미경 사진이다.FIG. 1 is a schematic diagram showing a process of alcohol fermentation by cultivating a starter.
FIG. 2 shows the results of analysis of the degree of gamma-aminobutyric acid production of the whole-cell reaction of B-8 strain isolated from the bokbunja fermentation broth using thin layer chromatography (TLC).
FIG. 3 shows the results of analysis of glucose tolerance by culturing the strain B-8 isolated from the bokbunja fermentation broth in a YM liquid medium supplemented with 20% and 30% glucose and measuring the degree of proliferation. (A); After 12 hours of inoculation, (B); After 24 hours of inoculation, (C); 48 hours after vaccination.
FIG. 4 shows the results of analysis of sulfurous acid tolerance by culturing the B-8 strain isolated from the bokbunja fermentation broth in a YM liquid medium supplemented with 200 ppm and 300 ppm of sulfuric acid and measuring the degree of proliferation. (A); After 12 hours of inoculation, (B); After 24 hours of inoculation, (C); 48 hours after vaccination.
FIG. 5 is a result of analysis of alcohol tolerance by culturing the B-8 strain isolated from the bokbunja fermentation broth in a YM liquid medium supplemented with alcohol concentration and measuring the degree of proliferation. (A); After 12 hours of inoculation, (B); After 24 hours of inoculation, (C); 48 hours after vaccination.
6 is a graph showing growth curves of B-8 strains isolated from the bokbunja fermentation broth according to temperature.
FIG. 7 is a pattern analysis of the restriction enzymes Cfo I, Hae III, and Hinf I of the B-8 strain isolated from the bokbunja fermentation broth. M; 1 kb DNA marker, SC; Saccharomyces cerevisiae KACC30008 strain, B-8; Saccharomyces cerevisiae B-8 strain isolated from bokbunja fermentation broth.
FIG. 8 is a molecular biological systematic diagram of the strain B-8 isolated from the berry fruit fermentation broth.
FIG. 9 is a scanning electron micrograph of the strain B-8 isolated from the berry fruit fermentation broth.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 복분자 발효액으로부터 분리된 알코올 및 감마-아미노뷰티르산(γ-aminobutyric acid, GABA)을 생산하고 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) B-8 균주(KCCM11415P)를 제공한다.In order to accomplish the object of the present invention, the present invention provides a method for producing alcohol and gamma-aminobutyric acid (GABA) separated from a bokromatic fermentation broth and producing baculovirus Saccharomyces cerevisiae strain B-8 (KCCM 11415P).
본 발명에 따른 사카로마이세스 세레비지애 B-8 균주는 유기농 복분자 발효액으로부터 분리된 균주들 중에서 특히 알코올 생산능과 감마-아미노뷰티르산 생산능이 좋고 바이오제닉 아민을 생산하지 않아 발효 균주로서 활성이 가장 좋은 균주를 선발한 것이다.The strain Saccharomyces cerevisiae B-8 according to the present invention is excellent in the ability to produce alcohol and gamma-aminobutyric acid and does not produce biorenic amines, and thus is active as a fermentation strain, among strains isolated from an organic bacterium fermentation broth. The best strain was selected.
상기 선발된 사카로마이세스 세레비지애 B-8 균주는 가스크로마토그래피/수소염이온화검출(GC/FID) 방법으로 알코올 생산능을 분석한 결과 22.61%의 생산능을 보여 알코올 고생산 균주라 판별하였다.The selected Saccharomyces cerevisiae strain B-8 was found to have an ability to produce 22.61% of alcohols by the gas chromatography / hydrogen ionization detection (GC / FID) method, Respectively.
상기 선발된 사카로마이세스 세레비지애 B-8 균주는 전세포 반응 후 박층 크로마토그래피(TLC)로 분석한 결과, 감마-아미노뷰티르산을 47.86±0.42㎎/100㎖ 생산하여 감마-아미노뷰티르산 고생산 균주라 판별하였다.The selected Saccharomyces cerevisiae strain B-8 was analyzed by thin-layer chromatography (TLC) after the whole-cell reaction to find that 47.86 ± 0.42 mg / 100 ml of gamma-aminobutyric acid was produced, High production strain.
상기 선발된 B-8 균주의 동정을 위하여 28s rDNA 영역을 증폭하여 염기서열 분석을 실시한 결과, 본 발명의 B-8 균주는 도 8에 나타낸 바와 같이 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주들과 가장 높은 유사도를 나타내었다. 따라서 상기 B-8 균주를 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) B-8 균주라 명명하였다.For the identification of the selected strain B-8, the 28s rDNA region was amplified and the nucleotide sequence As a result of the analysis, the strain B-8 of the present invention was identified as Saccharomyces cerevisiae S. cerevisiae strains. Therefore, the strain B-8 was named Saccharomyces cerevisiae strain B-8.
본 발명의 균주 사카로마이세스 세레비지애 B-8 균주를 한국미생물보존센터에 2013년 5월 2일자로 기탁하였다(기탁번호: KCCM11415P).The strain Saccharomyces cerevisiae B-8 of the present invention was deposited at the Korean Microorganism Conservation Center on May 2, 2013 (Accession No .: KCCM 11415P).
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 바이오제닉 아민은 퓨트레신(putrescine), 카다베린(cadaverine), 스퍼미딘(spermidine), 스퍼민(spermine), 트립타민(tryptamine), 히세아민(hiseamine), 2-페닐에틸아민(2-phenylethylamine), 티라민(tyramine), 세로토닌(serotonin), L-노르에피네프린(L-norepinephrine) 또는 도파민(dopamine)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In a strain according to an embodiment of the present invention, the biogenic amine is selected from the group consisting of putrescine, cadaverine, spermidine, spermine, tryptamine, hiseamine But are not limited to, 2-phenylethylamine, tyramine, serotonin, L-norepinephrine, or dopamine.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 알코올 또는 감마-아미노뷰티르산(γ-aminobutyric acid, GABA)을 생산하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing an alcohol or gamma-aminobutyric acid (GABA) comprising culturing the strain in a culture medium.
본 발명의 알코올 또는 감마-아미노뷰티르산을 생산하는 방법에서, 알코올을 생산하기 위해 균주를 배양하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 균주 배양시, 글루코스 농도는 10~20%, 바람직하게는 글루코스를 20% 농도로 첨가한 것일 수 있으며, 배양온도는 28~32℃, 바람직하게는 30℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the method for producing the alcohol or gamma-amino butyric acid of the present invention, the method of culturing the strain for producing alcohol may be any method known in the art, but is not limited thereto. In the culture of the strain, the glucose concentration may be 10 to 20%, preferably
본 발명의 알코올 또는 감마-아미노뷰티르산을 생산하는 방법에서, 감마-아미노뷰티르산을 생산하기 위해 균주를 배양하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 균주 배양시, 글루코스 농도는 1~10%, 바람직하게는 글루코스를 5% 농도로 첨가한 것일 수 있고, 모노소듐글루타메이트(monosodium glutamate, MSG) 첨가 농도는 0.2~2%일 수 있으며, 전세포 배양 온도는 29~37℃, 바람직하게는 37℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the method of producing the alcohol or gamma-amino butyric acid of the present invention, the method of culturing the strain to produce gamma-amino butyric acid may be any method known in the art, but is not limited thereto. In the culture of the strain, the concentration of glucose may be 1 to 10%, preferably 5% of glucose, the concentration of monosodium glutamate (MSG) added may be 0.2 to 2% The temperature may be 29 to 37 占 폚, preferably 37 占 폚, but is not limited thereto.
본 발명에 따른 방법에 의해서 생산된 감마-아미노뷰티르산은 다양한 식품 조성물로 쓰일 수 있다. 이러한 조성물로 제공되는 식품은 스트레스에 시달리는 현대인이나 수험생, 알코올 과다 섭취자 등 감마-아미노뷰티르산의 농도가 낮아 이의 보충을 요하는 사람에게 매우 유용하게 제공될 수 있다.The gamma-aminobutyric acid produced by the process according to the invention can be used in a variety of food compositions. Foods provided with such a composition can be very usefully provided to a person who needs supplementation due to low concentrations of gamma-amino butyric acid such as modern people who are suffering from stress, examinees, and an excessive alcohol consumption.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 알코올 또는 감마-아미노뷰티르산(γ-aminobutyric acid, GABA) 생산용 조성물을 제공한다.
The present invention also provides a composition for the production of alcohol or gamma-aminobutyric acid (GABA) containing the strain or a culture thereof as an active ingredient.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.
재료 및 방법Materials and methods
1. 유기농 복분자 발효액으로부터 효모 분리1. Yeast isolation from organic bacterium fermentation broth
국내 무주 유기농 복분자 발효액에서 전통 발효주에 활용 가능한 토종 발효 효모를 분리하기 위하여 효모를 선발하였다. 선발에 사용된 유기농 복분자 착즙액은 약 700ℓ를 18~23℃로 유지되는 발효실에서 자연 발효한 천연 발효액으로 1년 6개월 정도 숙성된 것을 사용하였다. 발효 원액을 멸균증류수에 십진 희석하여 세균의 증식을 억제하기 위한 항생제인 페니실린-스트렙토마이신을 2,500ppm으로 첨가한 YM 배지에 도말하여 30℃에서 24~48시간 배양 후 얻어진 균주 중 단일 콜로니 약 200개를 선택하여 YM 액체배지에 계대 배양한 후 -80℃에 보관하여 연구에 사용하였다.
Yeasts were selected to isolate the native fermented yeast from the fermented organic rice bran. The organic bacterium juice used in the selection was about 700 L, which was naturally fermented in fermentation room maintained at 18 ~ 23 ℃ and aged about 1 year and 6 months. The fermentation broth was plated on YM medium supplemented with 2,500 ppm penicillin-streptomycin, which is an antibiotic for inhibiting the growth of bacteria by decidual dilution in sterilized distilled water, and cultured at 30 ° C for 24 to 48 hours. About 200 single colonies Were selected for subculture in YM liquid medium and stored at -80 ℃ for the study.
2. 알코올 함량 가스크로마토그래피(2. Alcohol Content Gas Chromatography ( GCGC ) 분석) analysis
분리 효모의 알코올 발효능은 20%의 글루코스를 첨가한 10㎖의 YM 액체배지에 전배양액 1%를 접종하여 30℃에서 48시간 동안 정치시켜 알코올 발효를 수행한 발효액을 이용하였다. 얻어진 배양액에서 균체를 원심분리하고 상등액만을 멸균한 팔콘 튜브에 분리하여 상등액 5㎖에 증류수 2㎖을 혼합하여 증류한 다음, 증류된 액은 알코올 농도를 측정하기 위한 가스크로마토그래피(GC) 분석용 샘플로 사용하였으며, 농도별로 분석한 알코올의 표준곡선과 비교하여 증류액의 알코올함량을 산출하였다(R2=0.999). 가스크로마토그래피 분석 조건은 표 1과 같다.The alcohol fermentation efficiency of the isolated yeast was obtained by inoculating 1% of the preculture medium in 10 ml of YM liquid medium supplemented with 20% of glucose and allowing the fermentation to proceed by standing at 30 ° C for 48 hours. The cells were centrifuged in the obtained culture broth and the supernatant was separated into sterilized falcon tubes. The supernatant was mixed with 2 ml of distilled water and distilled. The distilled solution was analyzed by gas chromatography (GC) analysis , And the alcohol content of the distillate was calculated by comparing with the standard curve of alcohol analyzed by concentration (R 2 = 0.999). The gas chromatographic analysis conditions are shown in Table 1.
3. 3. 바이오제닉Biogenic 아민( Amine ( BiogenicBiogenic aminamine , , BABA ) 분석) analysis
11종의 바이오제닉 아민 표준물질인 퓨트레신(putrescine), 카다베린(cadaverine), 스퍼미딘(spermidine), 스퍼민(spermine), 트립타민(tryptamine), 히세아민(hiseamine), 2-페닐에틸아민(2-phenylethylamine), 티라민(tyramine), 세로토닌(serotonin), L-노르에피네프린(L-norepinephrine), 도파민(dopamine)과 유도물질인 단실 클로라이드(dansyl chloride) 및 내부표준물질인 1.7-디아미노헵테인(1.7-diaminoheptane)은 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)에서, 프롤린(proline)과 0.1N HCl은 삼천에서, 아세토니트릴(acetonitrile)은 몰린크로트 베이커(Mallinckrodt Baker)에서 구입하였다. 표준용액은 각 표준물질을 0.1N HCl에 녹여 약 1,000 ㎎/ℓ가 되도록 한 것을 십진법으로 희석하여 표준용액으로 하였다. 복분자주 바이오제닉 아민의 검출은 국세청 주류면허지원센터의 주류분석규정에 의한 HPLC 분석법을 이용하여 측정하였다. 구체적으로, 복분자주 5㎖를 취하여 0.1N HCl 5㎖를 가한 후 이 용액 1㎖와 혼합표준용액 1㎖를 각각 취하여 내부표준물질(1,7-diaminoheptane, 100 ㎎/ℓ) 0.5㎖와 포화 Na2CO3 0.5㎖, 1% 단실 클로라이트 아세톤 용액 1㎖을 가하여 45℃에서 1시간 동안 유도체화 하였다. 유도체화 후 10% 프롤린용액 1㎖을 첨가하여 과량의 유도체화 시약을 제거한 후 에테르 5㎖을 가하여 3분간 진탕하고 상층액을 취하여 질소농축 하였다. 여기에 아세토니트릴 2㎖를 가하여 0.45㎜로 여과하여 자외선/가시광선 검출기(UV/Vis detector)가 부착된 HPLC(Agilent Technologies) 기기와 캡셀팩 C18 컬럼(4.6250㎜, 5㎜, Shiseido Co.)을 사용하였다. HPLC 측정은 이동상의 유속을 1 ㎖/분, 농도구배는 55% 아세토니트릴을 최소 10분간 유지, 15분까지 65%, 20분까지 80%로 하여 5분간 유지, 30분까지 90%로 하여 5분간 유지되도록 프로그램하여 총 40분간 시행하였다. 컬럼 온도는 40℃, UV검출기의 파장은 254㎚에서 시행하였다. 11종의 바이오제닉 아민 표준물질을 이용한 표준곡선을 이용하여 복분자주 시료에서의 바이오제닉 아민을 검출하였다.
A total of 11 bioenzymic amine standards, putrescine, cadaverine, spermidine, spermine, tryptamine, hiseamine, 2-phenylethylamine (2-phenylethylamine), tyramine, serotonin, L-norepinephrine, dopamine and dansyl chloride as an inducer and 1.7-diaminohept The 1.7-diaminoheptane was purchased from Sigma Aldrich, proline and 0.1 N HCl in 3,000 and acetonitrile from Mullercroft Baker. The standard solution was prepared by dissolving each standard substance in 0.1 N HCl to make about 1,000 mg / l, which was diluted by the decanter method to prepare a standard solution. Detection of bupivornaxis biogenic amines was measured by HPLC analysis according to the mainstream analysis regulations of the Liquor License Support Center of the National Tax Service. Specifically, the internal standard is then added to 0.1
4. 분리된 효모 균주 스타터를 이용한 복분자주의 제조4. Preparation of Bokbunjae Using Isolated Yeast Strains
선발된 20종 효모를 YM 액체배지(yeast extract 3%, malt extract 3%, peptone 5%, dextrose 10%, pH 6.2±0.2)에 접종하여 25℃ 진탕배양기(VS-8480, Vision Scientific Co., LTD.) 160rpm에서 64시간 배양한 후 복분자 발효액 제조를 위한 스타터를 제조하였다. 복분자 발효액은 순창군 쌍치면 농가에서 재배한 복분자 추출 원액을 12°Brix가 되도록 설탕으로 보당하고 121℃에서 15분간 멸균하여 제조한 복분자 추출액에 각각의 스타터 약 2%를 접종하여 25℃, 160rpm에서 48시간 동안 진탕배양시켜 주모로 사용하였다. 복분자주 제조를 위한 방법으로는 복분자 원액이 24°Brix가 되도록 설탕으로 보당하고 121℃, 15분간 멸균한 후 주모를 각각 2%(v/v) 접종하였으며, 진탕배양기에서 25℃, 160rpm으로 1일 발효시켰고, 4일 동안 25℃ 배양기(VS-1203P3V, Vision Scientific Co., LTD., Korea)에서 정치발효 하였다.
The 20 selected yeasts were inoculated into a YM liquid medium (
5. 분리된 B-8 균주의 감마-5. The gamma- 아미노뷰티르산Amino butyrate (γ-(? aminobutyricaminobutyric acidacid , , GABAGABA ) 생산량 분석) Production Analysis
분리된 효모의 감마-아미노뷰티르산(GABA) 생산량 확인을 위하여 B-8(40B) 균주는 YM 액체배지에서 29℃, 180rpm으로 48시간 동안 배양한 전배양액을 30㎖의 본배양 배지에 2% 접종하여 29℃, 180rpm으로 48시간 동안 배양하여 10,000rpm, 4℃, 10분 동안 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 멸균된 증류수로 2회 세척하여 감마-아미노뷰티르산 합성 활성 스크리닝을 위한 균체로 사용하였다. 1% 모노소듐글루타메이트(MSG)와 5% 글루코스가 함유된 기질 반응액은 0.2㎛의 필터(Minisart RC4, Sartorius stedim)를 이용하여 여과 멸균하였다. 기질 반응액은 균체 중량의 80%(w/v)로 계산하여 균체에 첨가하였다. 균질화된 혼합액은 37℃의 항온수조에서 72시간 동안 전세포 반응을 실시하였고, 80℃에서 15분 동안 가열하여 반응을 정지시킨 후 10,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액은 0.45㎛ 필터(Minisart NY 25, Sartorius stedim)로 여과 후 분석 전까지 -20℃에 보관하였다.To determine the yield of gamma-aminobutyric acid (GABA) of the isolated yeast, the B-8 (40B) strain was cultured in YM liquid medium at 29 DEG C and 180 rpm for 48 hours, The cells were inoculated and cultured at 29 DEG C and 180 rpm for 48 hours. The cells were recovered by centrifugation at 10,000 rpm and 4 DEG C for 10 minutes. The recovered cells were washed twice with sterilized distilled water and used as cells for gamma-aminobutyric acid synthesis activity screening. The substrate reaction solution containing 1% monosodium glutamate (MSG) and 5% glucose was filtered and sterilized using a 0.2 μm filter (Minisart RC4, Sartorius stedim). The substrate reaction solution was added to the cells in an amount of 80% (w / v) of the weight of the cells. The homogenized mixture was subjected to a whole-cell reaction in a constant temperature water bath at 37 ° C for 72 hours, and the reaction was stopped by heating at 80 ° C for 15 minutes, followed by centrifugation at 10,000 rpm for 10 minutes to recover the supernatant. The recovered supernatant was filtered through a 0.45 μm filter (
감마-아미노뷰티르산의 정성분석방법을 확립하기 위하여 박층 크로마토그래피(thin-layer chromatography, TLC)를 이용하여 분석하였다. 표준물질로는 감마-아미노뷰티르산(GABA)와 모노소듐글루타메이트(monosodium glutamate, MSG)를 사용하였으며, 분석에 사용된 전개용매 조성은 N-부탄올:아세트산:물을 5:3:2(v/v)의 비율로 혼합하여 사용하였다. 전개 용매의 경우, 닌히드린(ninhydrin) 0.4%(w/v)를 전개용매에 첨가함으로써 별도의 발색반응 없이 건조만으로 발색을 유도하였다. 사용된 표준물질은 감마-아미노뷰티르산과 모노소듐글루타메이트를 3차 증류수에 녹여 2mM의 농도로 제조하여 사용하였으며, 박층 크로마토그래피 실리카 겔 플레이트(20×20㎝, Merck KGaA, Germany)에 7㎖씩 점적하여 전개하였다. 전개가 완료된 박층 크로마토그래피 플레이트는 핫플레이트 위에서 5~10분간 가열하여 전개용매에 함유된 닌히드린의 아미노산과 결합하여 발생되는 붉은 점을 분석하였다.Was analyzed using thin-layer chromatography (TLC) to establish the method of qualitative analysis of gamma-amino butyric acid. (GABA) and monosodium glutamate (MSG) were used as reference materials. The developing solvent composition used was 5: 3: 2 (v / v) of N-butanol: acetic acid: v). In the case of developing solvents, ninhydrin 0.4% (w / v) was added to the developing solvent to induce color development only by drying without any color development reaction. The standard materials used were prepared by dissolving gamma-amino butyric acid and monosodium glutamate in tertiary distilled water at a concentration of 2 mM and using a thin layer chromatography silica gel plate (20 x 20 cm, Merck KGaA, Germany) . The developed thin layer chromatography plate was heated on a hot plate for 5 to 10 minutes to analyze red dots generated by bonding with the amino acid of ninhydrin contained in the developing solvent.
감마-아미노뷰티르산의 정량 분석을 위하여 HPLC(515 pump, Waters Co. US)와 ELSD 검출기(ELSD 800, All tech)로 효모가 생산한 감마-아미노뷰티르산의 함량을 분석하였다. 감마-아미노뷰티르산 정량 분석에 사용된 컬럼은 C18 역상컬럼(primesep 100, SIELC)을 사용하였으며 이동상은 10%(v/v)의 아세토니트릴에 0.1%(v/v) 트리플루오로아세트산을 첨가한 등용매를 사용하였으며, 컬럼의 온도는 37℃를 유지하면서 1 ㎖/분의 유속으로 20㎖씩 주입하여 분석하였다. 표준물질인 모노소듐글루타메이트와 감마-아미노뷰티르산의 농도별 표준곡선과 비교하여 반응액의 감마-아미노뷰티르산함량을 산출하였다(R2=0.99).
The content of gamma-aminobutyric acid produced by yeast was analyzed by HPLC (515 pump, Waters Co. US) and ELSD detector (ELSD 800, All tech) for the quantitative analysis of gamma-aminobutyric acid. The column used for quantitative analysis of gamma-aminobutyric acid was a C18 reverse phase column (
6. 분리된 B-8 균주의 6. Isolation of isolated B-8 strain 내당성My legacy 조사 Research
스크리닝 결과 선발된 B-8(40B) 균주를 글루코스의 농도가 20%, 30%가 되도록 첨가한 YPD 배지에 각 균주의 전 배양액을 10㎖의 본 배양액에 각각 5%(v/v)를 접종한 후, 30℃, 150rpm에서 12, 24, 48시간 동안 배양하여 각 균주의 내당성을 조사하였다.
After screening, the culture broth of each strain was inoculated 5% (v / v) into 10 ml of the culture broth on a YPD medium supplemented with the selected B-8 (40B) strain so that the glucose concentration was 20% and 30% After incubation at 30 ° C and 150 rpm for 12, 24, and 48 hours, the resistance of each strain was examined.
7. 분리된 B-8 균주의 아황산 내성 조사7. Investigation of sulfurous acid tolerance of isolated B-8 strain
분리 균주의 메타 아황산 칼슘에 대한 내성을 조사하기 위하여, 산성아황산나트륨(sodium metabisulfite, K2S2O5)의 농도가 200, 500ppm(w/v)이 되도록 각각 첨가하여 만든 YPD 액체배지에 1차 스크리닝에서 선발한 균주의 전 배양액을 10㎖의 본 배양액에 각각 5%(v/v)씩 접종하여 30℃, 150rpm에서 12, 24, 48시간 동안 배양한 후 600㎚에서 흡광도(UV-VIS spectrophotometer, Beckman coulter)를 측정하여 아황산의 농도에 따른 균주의 생육정도로 아황산 내성을 조사하였다.
To investigate the resistance of the isolate to calcium metabisulfite, a selection was made in a YPD liquid medium prepared by adding sodium metabisulfite (K2S2O5) at a concentration of 200 and 500 ppm (w / v), respectively, in a primary screening The culture broth was inoculated with 5% (v / v) each of 10 ml of the culture solution and cultured at 30 ° C and 150 rpm for 12, 24, and 48 hours. The absorbance was measured at 600 nm using a UV-VIS spectrophotometer (Beckman coulter) The sulfurous acid tolerance was investigated as the degree of growth of the strain according to the concentration of sulfurous acid.
8. 분리된 B-8 균주의 알코올 내성 조사8. Investigation of Alcohol Tolerance of Isolated B-8 Strain
알코올에 대한 내성은 발효 및 양조에 있어서 매우 중요한 특성 중의 하나로 발효 후기로 진행되면서 생산된 알코올의 영향으로 효모의 증식이 억제되거나 효모의 생리화학적 변화로 인하여 자가분해가 발생한다. 당과 알코올이 고농도로 존재할 경우 알코올생산용 효모 균주는 심각한 저해를 받게 되어 발효율이 급감하고 발효시간이 오래 걸릴 수 있기 때문에 발효에 있어 매우 중요한 요소의 하나이다. 따라서 1차 분리 균주의 알코올에 대한 내성을 조사하기 위하여 배양초기 알코올을 0, 5, 10, 15% 함유한 YPD 배지를 이용하여 배양액을 10㎖의 본 배양액에 각각 5%(v/v) 접종하고 30℃, 150rpm에서 12, 24, 48시간 동안 배양하여 600㎚에서 흡광도(UV-VIS spectrophotometer, Beckman coulter, USA)를 측정하여 균의 생육양상을 분석하였다.
Tolerance to alcohol is one of the most important characteristics in fermentation and brewing. As the fermentation proceeds to the later stage of fermentation, the alcohol produced inhibits the proliferation of yeast, or self-decomposition occurs due to the physiochemical change of yeast. When sugar and alcohol are present at a high concentration, yeast strains for alcohol production are seriously inhibited, so that the efficiency of the fermentation is reduced and the fermentation time may be prolonged, which is one of the important factors in fermentation. Therefore, in order to investigate the tolerance of the primary isolate to alcohol, 5% (v / v) inoculum was added to 10 ml of the culture broth using YPD medium containing 0, 5, 10 and 15% (UV-VIS spectrophotometer, Beckman coulter, USA) at 600 nm for 12, 24, and 48 hours at 30 ° C and 150 rpm.
9. 분리된 B-8 균주의 생육곡선9. Growth curve of isolated B-8 strain
종균배지는 YM broth(BD) 5㎖을 사용하여 29℃, 180rpm으로 24시간 동안 진탕배양 하였으며, 10㎖의 본배양 배지에 종균 배양액을 1.0%로 접종하여 진탕배양기에서 각각 20, 25, 29, 37℃에서 180rpm으로 배양하였다. 본 배양배지를 진탕배양하여 3, 6, 16, 24, 30시간 간격으로 600㎚에서 흡광도를 통한 생육정도를 측정하였다(n=3).
The seed culture medium was cultured with 5 ml of YM broth (BD) at 29 ° C and 180 rpm for 24 hours. 10 ml of the culture broth was inoculated with 1.0% of the culture medium and cultured at 20, 25, 29, And cultured at 37 ° C at 180 rpm. The culture medium was incubated with shaking for 3, 6, 16, 24, and 30 hours intervals, and the degree of growth was measured by absorbance at 600 nm (n = 3).
10. 분리된 B-8 균주의 10. Isolation of isolated B-8 strain ITS1ITS1 , , ITS4ITS4 영역을 포함한 5.8s 5.8s including area rRNArRNA 제한효소 처리에 따른 Restriction enzyme treatment RFLPRFLP 분석 analysis
유기농 복분자 발효액에서 분리된 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) B-8 균주의 유전자적 구별 방법으로 표준균주와 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 B-8(40B) 균주의 5.8s rRNA 영역의 증폭 및 제한효소 처리 후 패턴분석을 수행하였다. 이스티브-자르조소(Esteve-Zarzoso, 1999)에서 사용한 프라이머 ITS 1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'; 서열번호 1)과 프라이머 ITS 4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'; 서열번호 2)를 사용하여 95℃에서 15분간 변성 후 얻은 주형 DNA로 콜로니 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 표 2와 같다. PCR 후 PCR 산물을 정제하여 제한효소 cfoⅠ, HaeⅢ, HinfⅠ으로 37℃에서 1시간 반응시킨 후 2% 아가로스 겔에서 전기영동하여 에티디움 브로마이드로 염색 후, 몰레큘라 이미저(Molecular imager, Gel Doc XR+ and ChemiDoc XRS+ Systems, Bio-rad)로 밴드를 확인하였다.The 5.8s rRNA region of the B-8 (40B) strain which does not produce the standard strain and the biogenic amine by the genetic discrimination method of the S. cerevisiae strain B-8 isolated from the organic bacterium fermentation broth And pattern analysis was performed after restriction enzyme treatment. (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 '; SEQ ID NO: 1) and primer ITS 4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'; SEQ ID NO: 2) used in Esteve-Zarzoso, After denaturation at 95 ° C for 15 minutes, colony PCR was performed with the obtained template DNA. The PCR conditions are shown in Table 2. After PCR, the PCR product was purified and reacted with restriction enzymes cfoI, HaeIII, and HinfI at 37 ° C for 1 hour. After staining with ethidium bromide by electrophoresis on 2% agarose gel, a Molecular Imager (Gel Doc XR + and ChemiDoc XRS + Systems, Bio-rad).
(35 cycles)Amplification
(35 cycles)
55℃, 2min. (Annealing)
72℃, 2min. (Elongation)94 ° C, 1 min. (Denature)
55 C, 2 min. (Annealing)
72 ° C, 2 min. (Elongation)
11. 분리된 B-8 균주의 28s 11. 28s of isolated B-8 strain rDNArDNA 동정 Sympathy
현재 가장 광범위하게 자료가 축적된 진균 유전자 서열은 28s rDNA 영역의 D1/D2 영역으로 많은 진균류에 대한 유전정보가 축적되어 있어 효모와 같은 진균류의 동정에 우선적으로 시행할 수 있는 방법으로 알려져 있다. B-8(40B) 균주의 28s rDNA 유전자의 염기서열 분석을 위해 사용한 올리고뉴클레오티드 프라이머는 유니버셜 프라이머인 NL1(5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'; 서열번호 3)와 NL4(5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'; 서열번호 4) 두 가지의 프라이머가 사용되었으며, PCR은 PCR 사이클 프리머스(MWG-BIOTECH)을 사용하여 수행하였다. 염기서열분석은 ABI PRISM 3730 DNA 아날라이저로 결정하였다.
The fungal gene sequence, which is the most widely accumulated data at present, is D1 / D2 region of 28s rDNA region, and genetic information on many fungi is accumulated, and it is known as a method to be preferentially identified to yeast-like fungi. The oligonucleotide primers used for the nucleotide sequence analysis of the 28s rDNA gene of strain B-8 (40B) were NL1 (5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3 '; SEQ ID NO: 3) and NL4 (5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'; SEQ ID NO: 4). Two primers were used, and PCR was performed using PCR Cycle Primus (MWG-BIOTECH). Sequence analysis was determined with an ABI PRISM 3730 DNA analyzer.
12. 분리된 B-8 균주의 주사전자현미경 촬영12. Scanning electron microscopy of the isolated strain B-8
최종적으로 선발된 효모의 모양, 크기 및 특징을 전자주사현미경(SEM, SN-3000 Hitachi)으로 분석하였다. 시료의 전처리 과정은 배양액을 1,000rpm에서 5분 동안 원심분리 후 상등액을 제거하여 균체를 회수하고 0.9% NaCl로 3회 세척하였다. 1차로 균체를 고정하기 위한 과정으로 2.5% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 균체를 현탁하여 실온에서 30분간 반응시킨 후, 1,000rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 0.9% NaCl로 3회 세척하였다. 2차 고정은 1% 오스뮴 테트로독사이드(osmium tetrodoxide)로 실온에서 20분 반응 후 1차 고정과 같은 방법으로 원심분리와 세척과정을 거쳤다. 고정 과정을 마친 균체는 농도별 에탄올(25, 50, 70, 90, 100%)로 각 5분간 탈수하고 100% 에탄올은 2회 반복 처리하였다. 탈수가 끝난 균체는 커버 글라스에 고정 및 건조한 다음 금으로 코팅하여 주사전자현미경 분석을 실시하였다.
Finally, the shapes, sizes and characteristics of the selected yeasts were analyzed by electron microscopy (SEM, SN-3000 Hitachi). For the pretreatment of the samples, the culture broth was centrifuged at 1,000 rpm for 5 minutes, the supernatant was removed, and the cells were recovered and washed three times with 0.9% NaCl. The cells were suspended in 2.5% glutaraldehyde for 30 minutes at room temperature, centrifuged at 1,000 rpm for 5 minutes to remove the supernatant, and washed three times with 0.9% NaCl . Secondary fixation was carried out with 1% osmium tetrodoxide for 20 min at room temperature followed by centrifugation and washing in the same manner as for primary fixation. Cells that had been fixed were dehydrated with ethanol (25, 50, 70, 90, 100%) for 5 minutes each, and 100% ethanol was repeated twice. Dehydrated cells were fixed on cover glass, dried, coated with gold, and analyzed by scanning electron microscopy.
실시예Example 1. 알코올 고생산 효모 분리 1. Separation of high-yield yeast from alcohol
복분자 과실 발효액에서 전통발효주에 사용가능한 토종 발효 효모를 분리하였으며, 분리된 약 200균주의 토종 발효 효모에 대한 알코올 생산능을 가스크로마토그래피/수소염이온화검출(GC/FID)로 분석한 결과는 표 3과 같다. 분리된 균주의 알코올 생산량을 분석한 결과, 200개 균주 중 79개 균주에서 15% 이상의 알코올 생산량을 보였으며 31개의 균주는 알코올 발효 후에 20% 이상의 알코올을 생산하는 것으로 분석되었다. 그 중 1A, 11A, 28A, 42B, 109B의 5개 균주는 30% 이상의 높은 알코올 생산량을 보였다. 그 결과 최종적으로 20% 이상의 알코올을 고생산하는 20개의 균주를 선별하여 분석에 사용하였다.The results of gas chromatography / hydrogen ionization detection (GC / FID) analysis of the alcohol production ability of about 200 strains of native fermented yeast isolated from the fermented jujubes of
실시예Example 2. 알코올 고생산 효모의 2. Alcohol production yeast 바이오제닉Biogenic 아민 Amine 생산능Production capacity
히스타민, 퓨트레신, 카바베린, 페닐에틸아민(phenylethyamine)과 트립타민(tryptamine) 등 주요 바이오제닉 아민은 식중독의 원인이 되며, 히스타민은 특히 알레르기성 과민반응을 일으키는 강력한 혈관확장제로 작용한다. 따라서 약 20% 이상의 고알코올을 생산하는 균주 20종을 사용하여 제조된 복분자 발효액의 바이오제닉 아민의 생산여부를 확인하기 위해, 효모를 접종하지 않은 대조구와 효모를 접종하여 발효시킨 시험구의 바이오제닉 아민 함량을 분석 비교하였다(표 4). 측정 결과, 대조구 및 시험구에서 바이오제닉 아민 11종 중 총 7종의 아민류가 검출되었고, 효모를 접종하지 않은 대조구에서는 카다베린 5.09 ㎎/ℓ, 히스타민 2.72 ㎎/ℓ, 세로토닌 70.25 ㎎/ℓ, 스퍼미딘 1.21 ㎎/ℓ, 도파민 11.43 ㎎/ℓ등 5종의 바이오제닉 아민이 검출되었다. 대조구의 결과를 기준으로 바이오제닉 아민의 생산여부를 확인한 결과 SRCM(A21), M-5(43B), B-8(40B) 및 SRCM(197B), 이 4종의 효모가 바이오제닉 아민을 생산하지 않음을 확인할 수 있었다.Major biogenic amines, such as histamine, putrescine, carbapenel, phenylethylamine and tryptamine, cause food poisoning, and histamine acts as a powerful vasodilator that causes allergic hypersensitivity reactions. Therefore, in order to confirm the production of the biogenic amine of the bacterium fermentation broth manufactured by using 20 strains producing about 20% or more of high alcohol, a control enzyme without yeast inoculation and a biogenic amine (Table 4). As a result, seven kinds of amines among 11 kinds of bianenic amines were detected in the control and the test groups. In the control without yeast, 5.09 mg / l of cadaverine, 2.72 mg / l of histamine, 70.25 mg / Five kinds of biogenic amines such as 1.21 mg / L of demin and 11.43 mg / L of dopamine were detected. Based on the results of the control, the production of biogenic amines was confirmed. As a result, four yeast strains of SRCM (A21), M-5 (43B), B-8 (40B) and SRCM .
실시예Example 3. 선별된 알코올 고생산 스타터 균주를 사용한 복분자주 제조 및 알코올 생산량의 변화 양상 3. Production of Bokbunja using Alcohol High-Production Starter Strains and Changes in Alcohol Production
도 1은 순창군 쌍치면 농가에서 재배한 복분자를 이용한 복분자 원액의 제조 및 알코올 발효 과정을 제시하였다. 알코올을 고생산하는 분리균주를 스타터로 사용하여 주모 배양한 후 알코올 발효에 적용하였을 때 최종적으로 발효주에 함유된 알코올 함량을 분석한 결과, 206B를 제외한 모든 균주가 9% 이상의 알코올을 생산하였으며 이 결과는 표준균주인 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) KCCM 12224가 발효 후 6%의 알코올을 생산한 결과와 비교했을 때 상대적으로 높은 알코올 발효능을 가진 것으로 확인할 수 있었다(표 5).FIG. 1 shows the preparation of a crude bokbule solution and the fermentation process of alcohol using bokbunja cultivated in a farmhouse in Chuncheon, Sunchang. As a result of analysis of the alcohol content in the fermented soybeans when the fermentation broth was cultivated using alcohol as a starter, all strains except for 206B produced more than 9% of alcohol Showed that S. cerevisiae KCCM 12224, which is a standard strain, has a relatively high alcohol efficacy as compared to the result of producing 6% alcohol after fermentation (Table 5).
실시예Example 4. 분리된 4. Separated 사카로마이세스Sakaromayses 세레비지애Selivijia B-8 균주의 감마- The Gamma- 아미노뷰티르산Amino butyrate 생산량 분석 Yield analysis
유기농 복분자 발효액으로부터 분리된 B-8 균주의 감마-아미노뷰티르산 생산능을 확인하기 위하여 전세포 반응을 수행하였다. 전세포 반응 후 감마-아미노뷰티르산의 정성분석을 위한 방법으로 박층 크로마토그래피 분석을 실시한 결과 도 2에서 보이는 것처럼 표준물질인 감마-아미노뷰티르산과 동일한 Rf 값에 해당하는 위치에서 점이 확인되어 B-8 균주의 감마-아미노뷰티르산 생산 여부를 확인할 수 있었다. K. Masuda 등(2008, Biosci. Biotechnol. Biochem., 72(12), 3265-3272)은 사카로마이세스(Saccharomyces) 속 균주의 감마-아미노뷰티르산 생산량은 본 연구의 전세포 반응과 동일한 조건인 1% 모노소듐글루타메이트(MSG)와 5% 글루코스를 기질액으로 사용했을 때 2.84~6.6㎎/100㎖의 감마-아미노뷰티르산 생산량을 보인 것에 반해 본 발명에서 분리한 토종 복분자 효모의 경우는 HPLC 분석 결과(표 6), B-8 균주가 47.86±0.42㎎/100㎖의 감마-아미노뷰티르산을 생산하여 해양에서 분리한 감마-아미노뷰티르산 고생산 사카로마이세스 속 균주가 생산하는 것보다 많은 양의 감마-아미노뷰티르산을 생산하는 것을 알 수 있었다.The whole-cell reaction was performed to confirm the ability of B-8 strain isolated from the organic bacterium fermentation broth to produce gamma-amino butyrate. As a result of the thin layer chromatography analysis as a method for qualitative analysis of gamma-amino butyric acid after the whole-cell reaction, as shown in FIG. 2, points were confirmed at positions corresponding to the same Rf value as gamma- 8 production of gamma-aminobutyric acid. The amount of gamma-aminobutyric acid produced by Saccharomyces sp. Strain was determined by the same conditions as in the whole cell reaction of this study (K. Masuda et al., 2008, Biosci. Biotechnol. Biochem., 72 (12), 3265-3272) The yield of gamma-aminobutyric acid was 2.84 ~ 6.6mg / 100ml when 1% monosodium glutamate (MSG) and 5% glucose were used as a substrate solution. On the contrary, in case of native bacterium yeast isolated from the present invention, HPLC The results of the analysis (Table 6) show that the strain B-8 produces 47.86 ± 0.42 mg / 100 ml of gamma-amino butyrate, which is produced by the strain Saccharomyces in high gamma-aminobutyric acid production It was found that a large amount of gamma-amino butyrate was produced.
실시예Example 5. 분리된 5. Isolated 사카로마이세스Sakaromayses 세레비지애Selivijia B-8 균주의 Of strain B-8 내당성My legacy 분석 analysis
무주 복분자 발효액에서 분리된 고알코올, 바이오제닉 아민 비생산 효모 B-8의 내당성을 비교분석한 실험결과를 도 3에 나타냈다. 12시간까지의 배양 초기에 B-8 균주의 생육 정도는 30%의 글루코스 농도에서 생육의 저해 정도가 다소 큰 것으로 보였지만 24시간 후에는 20%와 30% 조건에서 거의 동일한 수준의 성장을 보였다. 하지만 생육도는 약 40~50% 감소되는 결과를 보였다. 반면에 48시간 이후는 흡광도가 급격하게 증가하는 경향을 보였는데 이는 배지에 함유되어 있던 당이 효모에 의해 소비됨에 따라 균주의 생육 억제 정도가 낮아진 결과로 사료된다. 일반적으로 25~30%의 당농도는 높은 삼투압과 세포 내에 알코올 농도를 증가시켜 효모의 증식에 저해를 일으킴으로 와인양조에는 효모의 생육을 위해 그 이하의 당농도가 요구된다.
FIG. 3 shows the results of a comparative analysis of the tolerance of the high alcohol and biogenic amine-free yeast B-8 isolated from the mulberry barberry fermentation broth. Growth of B-8 strain at the early stage of culture up to 12 hours seemed to be somewhat greater at 30% glucose concentration, but after 24 hours growth was almost the same at 20% and 30%. However, the growth rate was reduced by about 40 ~ 50%. On the other hand, after 48 hours, the absorbance tended to increase sharply. This suggests that the sugar contained in the medium was consumed by the yeast, resulting in a lower inhibition of the growth of the strain. In general, the sugar concentration of 25 ~ 30% increases the osmotic pressure and the alcohol concentration in the cell, which inhibits the proliferation of the yeast. Therefore, in the wine brewing, a lower sugar concentration is required for the growth of the yeast.
실시예Example 6. 분리된 B-8 균주의 아황산 내성 분석 6. Analysis of sulfurous acid tolerance of isolated B-8 strain
과실주 발효에 사용되는 아황산은 산화방지와 유해 미생물의 살균을 위하여 사용되는 첨가물로 효모에 의한 알코올 발효에 영향을 미칠 수가 있다고 알려져 있다. 본 발명에서는 선택된 균주의 알코올 발효과정 중에 아황산에 의한 영향을 살펴보고자 YM 배지에 아황산을 농도별로 첨가하여 생육저해도를 분석하였다(도 4). 그 결과 200ppm에서 보다는 낮은 성장률을 보였다. 일반적으로 와인에 첨가되는 아황산의 첨가량은 약 100ppm 정도로, 200ppm에서 모든 균주가 유사한 양상으로 생육이 진행되는 것으로 보아 아황산에 내성이 높은 것으로 사료된다. 특히 48시간 이후에는 아황산이 휘발되어 소실됨으로써 저해율이 음의 값을 나타내는 것으로 보아 생육이 저해되지 않고 오히려 더 높은 성장을 나타냈다. 500ppm이 함유된 배지조건에서도 생육도는 꾸준히 증가하였으나 200ppm이 함유된 조건보다는 낮은 생육도를 보여 아황산 200ppm에 내성이 높은 것으로 사료된다.
Sulfuric acid, which is used for fruit fermentation, is an additive used for the prevention of oxidation and sterilization of harmful microorganisms. It is known that it can affect the fermentation of alcohol by yeast. In the present invention, the effect of sulfurous acid on alcohol fermentation of selected strains was investigated by adding sulfurous acid to the YM medium (FIG. 4). As a result, the growth rate was lower than 200ppm. Generally, the addition amount of sulfurous acid added to wine is about 100 ppm, and all the strains grow in a similar pattern at 200 ppm, which is considered to be highly resistant to sulfurous acid. Especially after 48 hours, the inhibition rate was negative due to the volatilization and disappearance of sulfurous acid. The growth rate was steadily increased even under the medium containing 500ppm, but the growth was lower than the condition containing 200ppm. Therefore, it is considered to be resistant to sulfoxide 200ppm.
실시예Example 7. 분리된 B-8 균주의 알코올 내성 분석 7. Analysis of Alcohol Tolerance of Isolated B-8 Strains
알코올에 대한 내성은 발효 및 양조에 있어서 매우 중요한 특성 중의 하나로 효모에 의해 생산된 알코올의 영향으로 발효 후기로 진행되면서 효모의 증식이 억제되거나 자가분해가 발생한다. 고농도의 당과 알코올의 함량에 의해 알코올 생산 스타터 효모 균주는 심각한 저해를 받게 되어 발효율이 급감하고 발효시간이 길어짐에 따라 최종제품의 품질에 영향을 미칠 수 있다. 도 5와 같이 B-8 균주는 12시간 배양 후보다 5% 함유된 배지에서 알코올이 첨가되어 있지 않은 배지보다 높은 생육도를 보였으며 그 이상의 농도인 10%와 15%에서는 거의 생육하지 못했다.
Tolerance to alcohol is one of the most important characteristics in fermentation and brewing. As a result of the alcohol produced by the yeast, the yeast is inhibited from proliferation or autolysis by progressing to the late stage of fermentation. Alcohol production Starter yeast strains are seriously inhibited by high concentration of sugar and alcohol, so that the efficiency of the final product may be affected as the production efficiency is decreased and the fermentation time is increased. As shown in FIG. 5, the B-8 strain showed higher growth than the medium containing no alcohol at a concentration of 5% after 12 hours of incubation, but almost no growth at 10% and 15%.
실시예Example 8. 분리된 8. Separated 사카로마이세스Sakaromayses 세레비지애Selivijia B-8 균주의 생육곡선 Growth curve of B-8 strain
분리균주 B-8을 20, 25, 29, 37℃에서 180rpm으로 진탕배양하며 30시간 동안 시간별로 생육정도를 흡광도로 측정한 결과 25℃에서 대수증식기, 정지기를 거치는 동안 가장 높은 생육도를 보였다. 일반적인 효모의 생육온도가 25~30℃인 특성과 일치하며 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae)의 최적 생육온도가 29℃인데 비해 낮은 온도에서 최적 생육조건을 가지는 것으로 나타났다(도 6).
The isolate B-8 was cultivated at 20, 25, 29, and 37 ℃ with shaking at 180 rpm. The degree of growth of the isolate was measured by absorbance at 30 ℃ for 30 hours. The highest growth rate was observed at 25 ℃ during the logarithmic growth phase and stopper. It was found that the growth temperature of the common yeast was in the range of 25 to 30 ° C. and that the optimal growth condition of S. cerevisiae was 29 ° C. compared to that of S. cerevisiae (FIG. 6) .
실시예Example 9. 분리된 9. Separated 사카로마이세스Sakaromayses 세레비지애Selivijia B-8 균주의 Of strain B-8 ITS1ITS1 , , ITS4ITS4 영역을 포함한 5.8s 5.8s including area rRNArRNA 제한효소 처리에 따른 Restriction enzyme treatment RFLPRFLP 분석 analysis
ITS1, 2영역과 5.8s rRNA 영역은 18s나 25s rRNA 영역보다 이종간의 차이가 더욱 뚜렷하게 나타나기 때문에 가까운 종간의 차이를 식별하는데 유용하게 접근가능한 방법이다. 따라서 본 발명에서는 분리된 균주들을 표준균주인 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) KACC30008과 비교하기 위하여 증폭된 서열을 제한효소 CfoⅠ, HaeⅢ, HinfⅠ으로 처리하여 패턴을 분석하였다. 그 결과 도 7과 같이 B-8균주의 패턴이 표준균주와 동일한 것으로 보아 분리된 균주가 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae)에 속한다는 것을 확인하였다.
The ITS1, 2 and 5.8s rRNA regions are more accessible than the 18s or 25s rRNA regions, which is a useful approach to identifying differences between species. Therefore, in order to compare the isolated strains with the standard strain S. cerevisiae KACC30008, the amplified sequences were treated with restriction enzymes CfoI, HaeIII and HinfI to analyze the patterns. As a result, it was confirmed that the pattern of B-8 strain was the same as that of the standard strain as shown in Fig. 7, indicating that the isolated strain belonged to S. cerevisiae .
실시예Example 10. 분리된 10. Separated 사카로마이세스Sakaromayses 세레비지애Selivijia B-8 균주의 28s 28s of B-8 strain rDNArDNA 영역을 이용한 균주의 동정 Identification of strain using region
분리 균주의 동정을 위하여 무주 복분자 발효액에서 분리한 B-8 균주의 28s rDNA 서열로 상동성을 분석한 결과 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae)와 99%의 상동성을 보였으며(표 7), 도 8의 계통분류도와 같이 지고사카로마이세스(Zygosaccharomyces)를 아웃 그룹으로 지정하였을 때 크게 두 개의 그룹으로 나눠지는데 B-8 균주는 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae)와 계통분류학적으로 가까운 그룹에 속해있으며 다른 그룹은 비사카로마이세스(non-saccharomyces)의 그룹으로 분리균들과는 계통분류학적으로 상동성이 낮았다. 따라서, 본 발명에서 분리한 균주는 세레비지애(S. cerevisiae)로 나타났다.In order to identify the isolate, the homology of the 28S rDNA sequence of the B-8 strain isolated from the non-bacterium fermentation broth was 99% homologous with S. cerevisiae (Table 7). When the Zygosaccharomyces is designated as an outgroup as shown in Fig. 8, the strain B-8 is divided into two groups, S. cerevisiae and S. cerevisiae It belongs to the phylogenetically close group and the other group is a group of non-saccharomyces, which is phylogenetically homologous to the isolates. Therefore, the strain isolated in the present invention was S. cerevisiae .
실시예Example 11. 분리된 11. Separated 사카로마이세스Sakaromayses 세레비지애Selivijia (( S. S. cerevisiaecerevisiae ) B-8 균주의 주사현미경을 이용한 형태학적 특성 분석) Morphological characterization of B-8 strain using a scanning microscope
B-8 균주의 형태학적 특성을 주사현미경으로 관찰한 결과, 크기는 평균 2~4㎛의 구형이었으며 표면에 출아 흔적이 관찰되어 전형적인 사카로마이세스(Saccharomyces) 속 균의 형태를 보였으며, 다극출아에 의해 생육하는 것을 확인할 수 있었다(도 9).The morphological characteristics of the B-8 strain were observed with a scanning electron microscope. The size of the B-8 strain was spherical with an average of 2 ~ 4 ㎛, and the appearance of seeds on the surface was observed to show a typical shape of Saccharomyces sp. (Fig. 9).
<110> Sunchang Research Center for Fermentation Microbes(SRCM) <120> Saccharomyces cerevisiae B-8 strain producing alcohol and gamma-aminobutyric acid and nonproducing biogenic amine isolated from fermented liquid of raspberry and uses thereof <130> PN14010 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tcctccgctt attgatatgc 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gcatatcaat aagcggagga aaag 24 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggtccgtgtt tcaagacgg 19 <110> Sunchang Research Center for Fermentation Microbes (SRCM) <120> Saccharomyces cerevisiae B-8 strain producing alcohol and gamma-aminobutyric acid and nonproducing biogenic amine isolated from fermented liquid of raspberry and uses <130> PN14010 <160> 4 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tcctccgctt attgatatgc 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gcatatcaat aagcggagga aaag 24 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggtccgtgtt tcaagacgg 19
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