KR101588285B1 - 소포체 스트레스로 인한 세포사멸을 약화시키는 agr2 호모-다이머 - Google Patents

Abstract

본 발명은 AGR2(Anterior Gradient 2) 다이머(dimer)의 특이적 저해제를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 결장선암, 대장암, 위암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 식도암, 간암 및 폐암 등의 전이성 종양에서 과발현되는 AGR2는 암 세포주에서 이황화 결합을 통해 호모-다이머 형태로 존재하고, 상기 AGR2 다이머가 소포체 스트레스로 인한 세포 사멸을 약화시키고 BiP/GRP78과 상호 작용하므로, 상기 AGR2 다이머의 특이적 저해제 또는 항체를 암 진단 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

소포체 스트레스로 인한 세포사멸을 약화시키는 AGR2 호모-다이머{AGR2 homo-dimer attenuating ER stress induced cell death}

본 발명은 Hct8 인간 결장선암 세포주에서 과발현되는 AGR2 다이머(dimer)의 특이적 저해제를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 AGR2 다이머에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 암 진단용 키트 및 암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

전개 단백질 반응(unfolded protein response, UPR) 신호전달 기전은 단백질 생합성, 신호 전달, 및 칼슘 항상성을 포함하는 소포체 내 반응의 주요 조절자인 BiP/GRP78에 의하여 개시되는 세포 내 스트레스 반응이다(Palade, Science (1975) 189:347-358; Ma and Hendershot, Cell (2001) 107:827-830; Zhang and Kaufman, J. Biol . Chem . (2004) 279:25935-25938; Clapham, Cell (2007) 131:1047-1058; Dudek et al., Cell . Mol . Life Sci. (2009) 66:1556-1569). 휴지기의 BiP/GRP78는 IRE1a(inositol-requiring kinase 1a), PERK(protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase) 및 ATF6(activating transcription factor 6)과 같은 소포체 스트레스 변환자(transducer)와 관련이 있다.

소포체 스트레스에 따른 UPR 신호전달 기전은 IRE1a 및 PERK로부터 BiP/GRP78의 해리에 의해 촉진되고, 이는 올리고머화 및 인산화에 의하여 소포체 외막에서 활성화된다(Bertolotti et al., Nat. Cell Biol. (2000) 2:326-332). 추가적인 번역 로딩(loading) 예방 및 정상적인 소포체 기능 복구를 위하여 활성화된 UPR 신호전달 기전은 새롭게 합성된 단백질의 번역을 약화시킨다. 더욱이, UPR 신호전달의 활성은 종양 세포의 생존을 가능하도록 하며(Ma and Hendershot, Nat Rev . Cancer (2004) 4:966-977), 쥐에서 BiP/GRP78 발현감소(knockdown)는 종양 발생을 억제한다(Jamora et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA (1996) 93:7690-7694). 또한, XBP1 및 PERK는 또한 종양 발생에 필수적이고, 쥐에서 XBP1 발현감소는 전이성 종양을 야기할 수 없다(Romero-Ramirez et al., Cancer Res . (2004) 64:5943-5947). 유사하게, PERK 발현감소는 생체 내(in vivo)에서 종양의 생장 속도를 감소시킨다(Naczki et al., EMBO J. (2005) 24:3470-3481; Blais et al., Mol . Cell . Biol. (2006) 26:9517-9532).

인간 AGR2(Anterior Gradient 2)는 신경 발달 동안 필수적인 역할을 하는 제노푸스 라에비스(Xenopus laevis)의 XAG-2와 상동성이 있다(Aberger et al., Mech . Dev. (1998) 72:115-130; Sive et al., Cell (1989) 58:171-180). 인간에서, AGR2는 대부분의 전이성 선암(예를 들어, 유방암, 췌장암, 전립선암, 위암, 식도암, 간암, 폐암, 및 결장암)에서 증가하여 존재한다(Brychtova et al., Cancer Lett . (2011) 304:1-7). AGR2는 저산소증(hypoxia), 혈청 감손(serum depletion), 및 소포체 스트레스와 같은 다양한 스트레스에 의하여 생성된다(Zweitzig et al., Mol . Cell . Biochem. (2007) 306:255-260; Zhao et al., Dev . Biol . (2010) 338:270-279). 혈중 산소 감소로 인한 스트레스를 유발하는 악성 종양 환경은 소포체 스트레스를 촉진하고, 고형 암에서 상기 스트레스에 대한 반응은 상기 전개 단백질 반응 신호전달 기전과 연계되어있다(Ma and Hendershot, Nat Rev . Cancer (2004) 4:966-977; Bi et al., EMBO J. (2005) 24:3470-3481; Ron and Walter, Nat . Rev . Mol . Cell Biol. (2007) 8:519-529).

AGR2의 과발현은 생체 내 및 시험관 내(in vitro)에서 종양 성장 및 전이성 표현형을 촉진하고(Wang et al., Cancer Res . (2008) 68:492-497), 또한 AGR2 발현억제(silencing)는 UPR 신호전달 기전 및 소포체 스트레스로 인한 자식작용(autophagy)에 영향을 미친다고 알려져 있으나(Higa et al., J. Biol . Chem . (2011) 286:44855-44868), AGR2와 상기 UPR 신호전달 기전 및 소포체 스트레스로 인한 세포 사멸의 관련성에 대하여 많이 보고됐음에도 불구하고, AGR2 및 UPR 신호 기전의 연계에 대한 분자적 기전에 대한 연구는 미비한 실정이다.

이에 본 발명자들은, AGR2 및 UPR 신호 기전의 연계에 대한 분자적 기전을 확인하기 위해 노력한 결과, AGR2가 암 세포주에서 이황화 결합을 통해 다이머(dimer) 형태로 존재하며, 상기 AGR2 다이머가 BiP/GRP78과 상호 작용을 통해 소포체 스트레스로 인한 세포 사멸을 억제함을 확인함으로써, 상기 AGR2 다이머의 특이적 저해제 또는 항체를 암 진단, 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 AGR2(Anterior Gradient 2) 다이머(dimer)의 특이적 저해제를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 AGR2 다이머에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 암 진단용 키트(kit)를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은

1) 실험군으로 암 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 실험군 및 피검화합물을 처리하지 않는 대조군에서 각각 AGR2 다이머의 양 또는 활성을 측정하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 측정 결과, AGR2 다이머의 양 또는 활성을 대조군에 비해 감소시키는 피검화합물을 선별하는 단계로 구성된 암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 AGR2(Anterior Gradient 2) 다이머(dimer)의 특이적 저해제를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 AGR2 다이머에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 암 진단용 키트(kit)를 제공한다.

아울러, 본 발명은

1) 실험군으로 암 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 실험군 및 피검화합물을 처리하지 않는 대조군에서 각각 AGR2 다이머의 양 또는 활성을 측정하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 측정 결과, AGR2 다이머의 양 또는 활성을 대조군에 비해 감소시키는 피검화합물을 선별하는 단계로 구성된 암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 AGR2(Anterior Gradient 2) 다이머(dimer)의 특이적 저해제를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 결장선암, 대장암, 위암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 식도암, 간암 및 폐암 등의 전이성 종양에서 과발현되는 AGR2는 암 세포주에서 이황화 결합을 통해 호모-다이머 형태로 존재하고, 상기 AGR2 다이머가 소포체 스트레스로 인한 세포 사멸을 약화시키고 BiP/GRP78과 상호 작용하므로, 상기 AGR2 다이머의 특이적 저해제 또는 항체를 암 진단 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 AGR2(Anterior Gradient 2) 단백질의 도메인 및 모티프를 표시하는 도이다.
도 2는 세포 내(intracellular) 화학적 가교제(chemical crosslinker)인 DSS 및 세포 외(extracellular) 화학적 가교제인 BS3을 각각 농도를 달리하여 처리한 결과, AGR2의 모노머(monomer) 및 다이머(dimer) 존재 여부를 나타내는 도이다.
도 3은 FLAG로 태그된 AGR2 야생형 및 이의 CS-돌연변이형 각각을 Hct8 세포에 세포감염시킨 후, 2-메르캅토에탄올(2-mercaptoethanol)에 의해 환원된 세포와 무처리 세포의 추출물에서 FLAG로 태그된 단백질을 확인한 도이다.
도 4는 FLAG로 태그된 AGR2 단백질 양을 달리하여 HeLa 세포로 세포감염시킨 후, 추출한 세포에서 FLAG, p-PERK, PERK, p-IRE1, IRE1, 및 투블린(tubulin)의 발현량을 나타내는 도이다.
도 5는 공벡터(empty vector) 및 FLAG로 태그된 AGR2의 야생형 및 이의 돌연변이형을 각각 HeLa 세포로 세포감염시킨 후, 도 4와 같이 추출한 세포에서 FLAG, p-PERK, PERK, p-IRE1, IRE1, 및 투블린의 발현량을 비교하여 나타내는 도이다.
도 6은 도 5와 같이 세포감염된 세포에 투니카마이신(tunicamycin, TM) 및 타프시가르긴(thapsigargin, TG)을 60 시간동안 처리한 후, 세포 활성(viability)을 통계적으로 분석(*; p<0.05, **; p<0.005)한 결과를 나타내는 도이다.
도 7은 도 5와 같이 세포감염된 세포에 투니카마이신을 처리한 후, 카스파제(caspase)-3의 활성을 확인한 도이다.
도 8은 FLAG로 태그된 AGR2 공벡터로 각각 세포감염된 Hct8 세포에서, FLAG로 태그된 AGR2를 면역침강한 후, 면역침강된 복합체를 항 BiP/GRP78 항체로 웨스턴 블럿팅 분석을 하여 상호결합 여부를 확인한 도이다.
도 9는 투니카마이신을 처리한 Hct8 세포에서 내인성(endogenous) AGR2를 면역침강한 후, 면역침강된 복합체를 항 BiP/GRP78 항체로 웨스턴 블럿팅 분석을 하여 상호결합여부를 확인한 도이다.
도 10은 FLAG로 태그된 AGR2 야생형 및 HA로 태그된 BiP/GRP78의 상호작용 여부를 확인하기 위하여 HeLa 세포에 공-형질감염(co-transfected) 및 면역침강(immunoprecipitated)한 결과를 나타내는 도이다.

이하, 본 발명의 용어를 상세히 설명한다.

본 발명에 있어서, "개선"이란 조성물의 투여로 암 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 있어서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 조성물은 활성물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 AGR2(Anterior Gradient 2) 다이머(dimer)의 특이적 저해제를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 AGR2는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 AGR2 다이머는 AGR2 모노머(monomer)의 81 번째 아미노산인 시스테인 사이의 이황화 결합을 통해 이루어지는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

상기 AGR2 다이머는 BiP/GRP78과의 상호작용을 통해 세포 사멸을 억제시키는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

상기 AGR2 다이머 특이적 저해제는 이황화 결합이 이루어지는 AGR2 모노머의 81 번째 아미노산인 시스테인을 인지하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

상기 암은 결장선암, 대장암, 위암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 식도암, 간암 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서 본 발명자들은 인간 결장선암 Hct8 세포주 및 HeLa 세포주를 이용하여 형질감염시켜 AGR2 유전자(도 1 참조)를 과발현시킨 후, 화학적 가교(Chemical crosslinking)를 통하여 AGR2 다이머 형성을 확인하였다(도 2 참조).

또한, AGR2 과발현시 AGR2 다이머가 소포체 스트레스에 의해 유도된 UPR 신호전달 기전을 통한 세포 사멸을 억제함을 확인하였다(도 4 및 도 5 참조). 또한, AGR2 다이머는 소포체 스트레스에 대한 저항력을 갖아 알파-카스파제-3의 활성을 약화시킴으로써 세포 생존력이 높지만, 81번째 시스테인이 세린으로 돌연변이화된 AGR2 CS 돌연변이형이 과발현되어 AGR2 모노머가 과량 존재할 때에는 세포 생존력에 유의미한 영향을 미치지 않음을 확인하였다(도 6 및 도 7 참조).

또한, 발현량이 거의 동일한 AGR2 야생형 및 AGR2 CS 돌연변이형에 대하여 각각 BiP/GRP78과 면역침강(Immunoprecipitation)한 결과, 상기 AGR2 야생형은 다이머를 형성하여 BiP/GRP78과 직접적으로 상호작용하지만, 상기 AGR2 CS 돌연변이형의 경우에는 BiP/GRP78과의 상호작용이 약함을 확인하였다(도 10 참조).

따라서, 본 발명에 따른 조성물은 AGR2는 암 세포주에서 이황화 결합을 통해 호모-다이머 형태로 존재하고, 상기 AGR2 다이머가 소포체 스트레스로 인한 세포 사멸을 약화시키고 BiP/GRP78과 상호 작용하므로, 상기 AGR2 다이머의 특이적 저해제 또는 항체를 유효 성분으로 함유함으로써, 암 진단 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

즉, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 차파랄 추출물 또는 이의 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 비경구 투여시 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사를 통할 수 있다.

투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배를 함유하거나 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 구체적으로 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다. 본 발명의 조성물의 유효용량은 0.0001 ~ 10 g/㎏일 수 있고, 구체적으로 0.001 ~ 1 g/kg일 수 있으며, 하루 1 ~ 6회 투여될 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 AGR2 다이머에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 암 진단용 키트(kit)를 제공한다.

구체적으로, 상기 AGR2는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 AGR2 다이머는 AGR2 모노머의 81 번째 아미노산인 시스테인 사이의 이황화 결합을 통해 이루어지는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 AGR2 다이머는 BiP/GRP78과의 상호작용을 통해 세포 사멸을 억제시키는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

따라서, 본 발명에 따른 암 진단용 키트는 AGR2가 암 세포주에서 이황화 결합을 통해 호모-다이머 형태로 존재하고, 상기 AGR2 다이머가 BiP/GRP78과 상호 작용함으로서 소포체 스트레스로 인한 세포 사멸을 약화시키므로, 상기 AGR2 다이머의 이황화 결합 부분에 대한 특이적 항체를 포함함으로써, 암 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 키트는 암 환자와 정상인에서 발현에 차이가 있는 본 발명의 하나 이상의 마커를 측정하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 키트는 환자가 암인지 아닌지를 구별하여 의사 등 진료 행위자가 암을 진단하는 것을 가능하게 할 뿐 아니라, 치료에 대한 환자의 반응을 모니터하여 그 결과에 따라 치료를 변경하는 것을 가능하게 한다. 또한, 암 모델(예: 마우스, 래트 등의 동물모델)의 생체 내 또는 생체 외에서 하나 이상의 마커의 발현을 조절하는 화합물을 동정하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 암 진단용 키트는 (i) 발굴한 AGR2 모노머의 81 번째 아미노산인 시스테인 부위에 결합하는 1차 획득 시약(capture reagent) 및 (ii) 1차 획득시약에 결합하지 않는 2차 획득 시약을 포함할 수 있다.

1차 획득시약은 항체 또는 금속킬레이트, 바람직하게는 항체이고 2차 획득시약은 발색 효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드로 표지한 접합체(conjugate)로 2차 항체이다. 발색효소는 퍼록시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 또는 산성 포스파타제(acid phosphatase)(예: 양고추냉이 퍼록시다제(horseradish peroxidase))일 수 있고 형광물질인 경우, 플루오레신카복실산(FCA), 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC), 플루오레신 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸이 가능하다.

환자로부터 수득된 시료를 1차 획득시약, 바람직하게는 이황화 결합이 이루어지는 AGR2 모노머의 81 번째 아미노산인 시스테인에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키는 경우, 시료는 항체와 접촉 전에 알맞은 정도로 희석될 수 있고 항체는 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기위해 고형상에 고정될 수 있다. 고형상은 유리나 플라스틱 예를 들어 미세역가 플레이트(microtiter plate), 막대, 비드(bead) 또는 미세비드(microbead) 등이 될 수 있다. 항체는 또한 프로브 기질이나 단백질칩에 결합될 수 있다. 시료를 항체와 정온 배치한 후 세척하여 항체-마커 복합체를 측정할 수 있다. 이는 세척된 혼합물을 2차 획득시약, 바람직하게는 2차 항체와 정온배치하여 수행된다. 항체-마커 복합체의 양 측정이나 존재 검출은 형광, 발광, 화학발광(chemiluminescence), 흡광도, 반사 또는 투과를 통해 이루어질 수 있다. 상기 방법 외에도 시료 내의 마커는 간접적인 분석방법 예를 들어, 마커의 다른 에피토프에 결합하는 모노클론 항체와 경쟁 또는 억제 반응 분석을 실시하여 검출할 수 있다.

또한, 키트는 효소와 발색반응할 기질 및 결합되지 않은 단백질 등은 제거하고 결합된 바이오마커만을 보유할 수 있는 세척액 또는 용리액을 포함할 수 있다. 분석을 위해 사용되는 시료는 혈청, 뇨, 눈물 타액 등 정상적인 상태와 구별될 수 있는 질환 특이적 폴리펩타이드를 확인할 수 있는 생체 시료를 포함한다. 바람직하게는 생물학적 액체 시료, 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장 보다 바람직하게는, 혈청으로부터 측정될 수 있다. 시료는 마커의 탐지감도를 증가시키도록 준비될 수 있는데 예를 들어 환자로부터 수득한 혈청 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 액체 크로마토그래피, 연속추출(sequential extraction) 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있다.

또한, 본 발명은

1) 실험군으로 암 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 실험군 및 피검화합물을 처리하지 않는 대조군에서 각각 AGR2 다이머의 양 또는 활성을 측정하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 측정 결과, AGR2 다이머의 양 또는 활성을 대조군에 비해 감소시키는 피검화합물을 선별하는 단계로 구성된 암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 단계 2)의 AGR2 다이머의 양은 웨스턴 블럿팅(Western blotting), ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay), 면역침강(Immunoprecipitation)을 이용하여 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 암은 결장선암, 대장암, 위암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 식도암, 간암 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

본 발명에 따른 암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법은 AGR2 다이머의 형성을 억제하거나 AGR2 사이의 이황화 결합을 해리시키는 특징을 지니는 피검화합물을 선별하는 것으로, 상기 방법으로 선별된 피검화합물은 AGR2 다이머를 저해하므로 암 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 이에 한정되지 않는다.

< 실시예 1> 세포 배양 및 소포체( ER ) 스트레스 처리

5% CO₂ 및 37℃ 조건에서 인간 결장선암(human colon adenocarcinoma, Hct8) 세포주(한국세포주은행) 및 HeLa 세포주(한국세포주은행)를 10% FBS(fetal bovine serum)를 함유하는 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Media) 배지에서 배양하였다. 세포를 0.5 내지 1 x 10⁶ 세포/웰로 배치한 후, 소포체 스트레스를 유도하기 위하여 2 μg/mL 투니카마이신(tunicamycin, Sigma) 및 0.25 μM 타프시가르긴(thapsigargin, Sigma)을 처리하였다. 재현가능성을 보장하기 위하여 모든 실험은 최소 3 반복하였다.

< 실시예 2> 플라스미드( plasmid ) 준비 및 형질감염( transfection )

AGR2는 Tx-유사 도메인(Thloredoxin-like domain)으로도 불리는 CXXS 도메인으로 구성된 단백질 이황화 이성화효소(PDI)-유사 도메인을 가지고 있다(도 1). 인간 AGR2(서열번호 1) 및 BiP/GRP78를 암호화하는 전장(full-length)의 cDNA 클론은 Invitrogen 사에서 구입하였고, 이를 포유류(mammalian) 발현 벡터(vector)에 서브클로닝(subcloning)하였다.

구체적으로, AGR2 및 BiP/GRP78를 코딩하는(coding) 서열은 BamHI/XhoI 사이트를 이용하여 태그(tag)를 불포함한 pCMV-Tag 1(Agilent Technologies) 및 N-말단에 FLAG(또는 HA) 태그를 포함한 pcDNA3.1 zeo (+) 벡터에 클로닝하였다. 전체 AGR2 서열에 FLAG 태그를 추가한 FLAG-AGR2 구조체(construct)는 이전에 보고된 것을 사용하였다(Park et al., The protein disulfide isomerase AGR2 is essential for production of intestinal mucus, Proc . Natl . Acad . Sci . USA (2009) 106:6950-6955).

또한, PCR 기반의 자리-지정 돌연변이화(site-directed mutagenesis) 방법을 이용하여 pCMV-Tag 1 및 pcDNA3.1 zeo (+) AGR2(C81S) 돌연변이(81번째 아미노산인 시스테인(cysteine)을 세린(serine)으로 치환(CS)한 AGR2 돌연변이) 구조체를 각각 제작하였다. 그 다음, 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 시약(Invitrogen)을 이용하여 1 μg의 DNA 플라스미드를 <실시예 1>에서 배양한 세포에 각각 형질감염시켰다.

인간 AGR2 야생형 아미노산 서열(서열번호 1):

MEKIPVSAFLLLVALSYTLARDTTVKPGAKKDTKDSRPKLPQTLSRGWGDQLIWTQTYEEALYKSKTSNKPLMIIHHLDE C PHSQALKKVFAENKEIQKLAEQFVLLNLVYETTDKHLSPDGQYVPRIMFVDPSLTVRADITGRYSNRLYAYEPADTALLLDNMKKALKLLKTEL.

( C : 81번째 아미노산인 시스테인으로, AGR2 모노머 간 이황화 결합이 이루어지는 부위)

<실시예 3> 화학적 가교( Chemical crosslinking )를 통한 AGR2 다이머 형성 확인

본 발명자의 선행 결과(Lee do et al., Identification of proteins differentially expressed in gastric cancer cells with high metastatic potential for invasion to lymph nodes, Mol . Cells (2011) 31:563571)에 따르면, AGR2는 인간 위암 세포의 높은 전이 가능성과 관련이 있다고 알려져 있고, 박테리아에서 발현된 AGR2 단백질은 젤 여과 크로마토그래피에서 약 34 kDa로 나타나며, 이 크기는 다이머 형태를 의미한다. 또한, AGR2는 점액-생산(mucus-producing) 세포에서 시스테인81(Cys81) 잔기를 이용한 이황화 결합을 통해 MUC2와 헤테로다이머(heterodimer)를 형성한다.

상기 결과를 기반으로, 세포 내에서 AGR2가 다이머로 존재할 가능성이 있음을 가정하였다. 이를 확인하기 위하여, 화학적 가교제(chemical crosslinker)를 Hct8 세포에 처리한 후, 상기 세포 추출물을 웨스턴 블럿팅(western blotting) 방법으로 분석하였다. 세포 내(intracellular) 화학적 가교제인 디숙신이미딜 수베르산(DSS, Disuccinimidyl suberate) 및 세포 외(extracellular) 화학적 가교제인 비스설포숙신이미딜 수베르산(BS³, Bis[sulfosuccinimidyl] suberate)을 이용하였고, 이는 각각 사용 직전 DMSO 또는 물에 용해시켰다. 그런 다음, 상기 세포는 아이스-콜드(ice-cold) PBS로 3 번 세척 및 1 mL PBS로 재현탁한 후, 각 세포 현탁액(cell suspension)에 화학적 가교제를 첨가하였다. 가교된 세포를 30 내지 60 분 동안 상온에서 배양한 후, 최종 농도 15 mM가 된 후 화학반응을 멈추기 위하여 15 분 동안 상온에서 담금질(quenching) 완충용액(1 M Tris, pH 7.5)을 처리하였다. 각 세포 현탁액의 농도를 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 및 1.5 mM로 달리한 조건에서 DSS 및 BS³을 각각 처리하였다.

구체적으로 웨스턴 블럿팅을 실시하기 위하여, <실시예 2>에 따른 세포감염 후 약 48 시간 동안 배양된 세포를 수확하고 아이스 콜드 PBS를 이용하여 2 번 세척한 후, 수확한 세포를 프로테아제(protease) 억제제 및 포스파타아제(phosphatase) 억제제(Roche)가 첨가된 NP-40 용해용 완충용액(lysis buffer, 조성: 20 mM TrisCl, pH 7.5; 137 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% NP-40; 10% 글리세롤)에 용해한다. 4℃에서 13,000 rpm으로 20 분 동안 원심분리를 하여 세포 용해물(lysate)을 분리한다. 상청액의 단백질 1030 μg을 SDS-PAGE로 분리하고 PVDF 멤브레인(Millipore)로 옮긴 후, 프로브(probe)로 적합한 항체 및 ECL 키트(Pierce)를 이용하여 시각화하였다. 모든 웨스턴 블럿팅 실험의 대조군으로는 투블린(tubulin)을 사용하였다. 1차 항체는 항 AGR2(Santa Cruz 및 Abcam) 및 항 투블린 항체를 이용하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 17 및 34 kDa 밴드가 확인되었고, 이는 각각 AGR2 모노머(monomer) 및 다이머(dimer) 상태임을 확인하였다(도 2).

<실시예 4> AGR2 의 상호분자간 이황화 결합을 통한 다이머 형성 확인

AGR2의 이량체화가 상호분자간 이황화 결합임을 조사하기 위하여, 상기 <실시예 2>에서 제작한 FLAG로 태그된 AGR2 야생형 및 이의 CS 돌연변이형 단백질을 Hct8 세포에서 과발현한 후, 상기 세포 추출물을 비-환원성 SDS-PAGE에서 항 FLAG 항체(Sigma)를 이용하여 상기 <실시예 3>과 동일한 방법으로 웨스턴 블럿팅을 수행하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 비-환원성 SDSPAGE 젤에서의 경우 CS 돌연변이형 AGR2는 다이머 형태가 관찰되지 않았지만, AGR2 야생형은 상호 분자 간 이황화 결합에 의하여 호모-다이머로 존재함을 확인하였다(도 3).

<실시예 5> AGR2 이량체화의 소포체 스트레스 유도 세포 사멸 억제 효과 확인

AGR2는 종양성 및 전이성 마커(marker)로서 잘 알려져 있고(Innes et al., Br. J. Cancer (2006) 94:1057-1065; Smirnov et al., Cancer Res . (2005) 65:4993-4997; Zhang et al., Genes Chromosomes Cancer (2005) 43:249-259; Liu et al., Cancer Res. (2005) 65:3796-3805; Chen et al., Mol . Cancer (2010) 9:149), 종양 세포에서 증가한 AGR2의 발현량은 세포 증식과 상관관계에 있음이 알려져 있으며(Wang et al., Cancer Res. (2008) 68:492-497; Ramachandran et al., Cancer Res. (2008) 68:7811-7818; Hrstka et al., Oncogene (2010) 29:4838-4847), AGR2의 발현 억제(silencing)가 UPR 기전에 영향(Higa et al., J. Biol . Chem. (2011) 286:44855-44868)을 미치는 것이 보고되었다.

상기 선행문헌의 결과를 기반으로 하여 AGR2의 과발현이 UPR 신호전달 기전에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 <실시예 1>의 Hela 세포에서 AGR2가 과발현되었을 때 FLAG, p-PERK, PERK, p-IRE1, IRE1, 및 투블린(tubulin)의 발현량을 항체를 이용하여 상기 <실시예 4>와 동일한 방법으로 웨스턴 블럿팅을 수행하였다. 소포체 스트레스가 없을 경우, FLAG로 태그된 AGR2의 과발현은 선량-의존 방법(dose-dependent manner)에 따라 PERK 및 IRE1a의 인산화를 유도하였다(도 4).

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, FLAG로 태그된 AGR2 단백질 0, 0.25, 0.5, 1.0, 및 2.0 μg을 각각 HeLa 세포주로 세포감염시킨 후, 추출한 세포에서 웨스턴 블럿팅을 통해 FLAG, p-PERK, PERK, p-IRE1, IRE1, 및 투블린(tubulin)의 발현량을 확인하였다. 이 때, 항 FLAG(Sigma), 항 p-PERK(Santa Cruz), 항 p-IRE1a(Abcam), 항 BiP/GRP78, 항 HA, 항 PERK, 항 IRE1a, 항 PARP, 또는 항 카스파제(caspase)-3(Cell Signaling) 항체를 1차 항체로 사용하였다.

또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, AGR2 이량체화의 기능을 파악하기 위하여, FLAG로 태그된 AGR2 야생형 또는 이의 CS 돌연변이형 또는 공벡터를 각각 HeLa 세포로 세포감염시켜 과발현시킨 결과, 인산화된 PERK 및 인산화된 IRE1의 양이 증가하였으나, 과발현된 CS 돌연변이형은 PERK 또는 IRE1 둘 중 하나의 인산화를 유도하지 못하는 것을 확인하였다(도 5). 따라서, AGR2의 이량체화가 UPR 신호전달 기전 활성에 중요한 역할을 함을 확인하였다.

< 실시예 6> AGR2 이량체화의 세포 생존력( viability ) 확인

소포체 스트레스 조건 하에서 세포 생존력을 파악하기 위하여 세포 집계(Counting) 키트-8(CCK8, DOJINDO 라이브러리)를 이용하였다.

구체적으로, FLAG로 태그된 AGR2 야생형 및 이의 돌연변이형 또는 공벡터를 각각 <실시예 2>에서 배양한 HeLa 세포에 형질전환한 후, 96-웰 플레이트에서 배양된 HeLa 세포(5 × 10³ 세포/웰)에 투니카마이신(tunicamycin) 또는 타프시가르긴(thapsigargin)을 60 시간 동안 처리한 후, 10 μL의 CCK8 분석 용액에 추가하고, 상기 배약액을 1 시간 동안 추가적으로 배양하였다. 그 다음, ELISA 리더(reader)를 이용하여 450 nm에서 흡광도(absorbance)를 측정하였다. 공벡터를 100%로 하여 퍼센트 세포 생존력을 계산하였다. 모든 양적 데이터는 독립적인 스튜던트 t-검정(independent Student’s t-test)을 통해 분석하고, p<0.05일 때 유의성이 있다고 판단하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, siAGR2의 영향(Higa et al., J. Biol . Chem. (2011) 286:44855-44868)과 정반대로 과발현된 AGR2 야생형이 형질전환된 세포는 소포체 스트레스에 저항력을 갖는 결과를 나타내었지만, CS 돌연변이형의 과발현 세포는 세포 생존력에 영향을 주지 않는 것을 확인하였다(도 6).

< 실시예 7> AGR2 이량체화의 α- 카스파제 ( caspase )-3 활성 확인

FLAG로 태그된 AGR2 야생형 및 이의 돌연변이형 또는 공벡터를 상기 <실시예 2>의 배양한 HeLa 세포에 형질감염한 후, 2 μg/mL 투니카마이신을 처리한 후, α-카스파제-3, α-잘린 카스파제-3, Flag, 투블린에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿팅을 수행하여 α-카스파제(caspase)-3의 활성을 확인하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 장기적인 소포체 스트레스로 인하여 α-카스파제-3(염)의 활성이 존재하고 α-잘린 카스파제-3가 형성되며 세포는 사멸에 이르게 되나, 소포체 스트레스 하에서 CS 돌연변이형 과발현과 달리 AGR2 야생형의 과발현은 α-카스파제-3의 활성을 약화시켜 α-잘린 카스파제-3 생성을 억제함을 확인하였다. 따라서 상기 결과로부터 AGR2 이량체화가 소포체 스트레스로 인한 세포 사멸을 약화시킴을 확인하였다(도 7).

< 실시예 8> AGR2 이량체 및 BiP / GRP78 의 상호작용 확인

AGR2 이량체와 BiP/GRP78, IRE1a, 및 PERK과 같은 UPR 신호전달 기전 조절자와 상호작용할 수 있는 가능성을 조사하기 위하여, Hct8 세포에서 실시예 2에 따라 세포감염 후 발현된 외인성(exogenous)의 FLAG로 태그된 AGR2는 FLAG M2 비드(bead)를 이용하여 면역침강(Immunoprecipitation)하였다. FLAG로 태그된 AGR2 및 BiP/GRP78의 면역침강은 항 FLAG M2 친화성(affinity) 젤(Sigma)을 이용한다. FLAG로 태그된 단백질을 추출하기 위하여, 20 μL의 친화성 젤과 함께 500 내지 600 μg의 세포 용해물을 4℃에서 6 시간 동안 천천히 회전시킨다. 3000 rpm으로 1 분 동안 원심분리에 의해 얻은 항원-항체 복합체는 NP-40 용해 완충용액으로 3 번 세척 후, 친화성 젤로부터 단백질을 녹여서 분리하기 위하여 1× SDS 시료(sampling) 완충용액 5 분 동안 95℃에서 끓였다. 그 다음, 면역침강된 복합체는 <실시예 4>과 동일한 방법에 따라 항 BiP/GRP78, IRE1a, 또는 PERK 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 실시하였다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, UPR 기전의 개시자(initiator) 및 모든 소포체의 과정에서 중심 분자 샤페론(chaperone)으로 역할하는 BiP/GRP78이 AGR2와 공-면역침강됨을 확인하였으나, PERK 및 IRE1a는 AGR2와 공-면역침강되지 않음을 확인하였다(도 8).

또한, 소포체 스트레스 조건 하에서 ARG2 및 BiP/GRP78 사이의 물리적 상호연관성이 존재하는지를 알아보고자, 2 μg/mL 투니카마이신을 처리한 Hct8 세포에서 내인성(endogenous) AGR2를 항 AGR2 항체와 면역침강한 후, 이 면역침강된 복합체는 항 BiP/GRP78 항체를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 투니카마이신에 대한 반응으로 BiP/GRP78 및 AGR2의 상호결합이 증가하였다(도 9).

또한, AGR2의 이량체화가 BiP/GRP78와 상호작용에 얼마나 영향을 미치는지를 판단하기 위하여, FLAG로 태그된 AGR2 야생형 또는 AGR2 CS-돌연변이형 및 HA로 태그된 BiP/GRP78을 HeLa 세포주에서 상기 <실시예 2>의 형질감염 방법을 사용하여 공-형질감염(co-transfected)시켰고, HA-BiP/GRP78 복합체 및 항 HA 아가로스(agarose)를 이용하여 공-면역침강을 수행하였다.

그 결과, AGR2 야생형 및 AGR2 CS-돌연변이형의 발현 수준은 거의 동일하였음에도 불구하고, 선행문헌의 결과처럼 AGR2 야생형은 BiP/GRP78와 결합하지만, AGR2의 CS-돌연변이형 및 BiP/GRP78 사이의 상호작용은 약하였다(도 10).

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> AGR2 homo-dimer attenuating ER stress induced cell death <130> 13p-04-010 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 175 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Lys Ile Pro Val Ser Ala Phe Leu Leu Leu Val Ala Leu Ser 1 5 10 15 Tyr Thr Leu Ala Arg Asp Thr Thr Val Lys Pro Gly Ala Lys Lys Asp 20 25 30 Thr Lys Asp Ser Arg Pro Lys Leu Pro Gln Thr Leu Ser Arg Gly Trp 35 40 45 Gly Asp Gln Leu Ile Trp Thr Gln Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Tyr Lys 50 55 60 Ser Lys Thr Ser Asn Lys Pro Leu Met Ile Ile His His Leu Asp Glu 65 70 75 80 Cys Pro His Ser Gln Ala Leu Lys Lys Val Phe Ala Glu Asn Lys Glu 85 90 95 Ile Gln Lys Leu Ala Glu Gln Phe Val Leu Leu Asn Leu Val Tyr Glu 100 105 110 Thr Thr Asp Lys His Leu Ser Pro Asp Gly Gln Tyr Val Pro Arg Ile 115 120 125 Met Phe Val Asp Pro Ser Leu Thr Val Arg Ala Asp Ile Thr Gly Arg 130 135 140 Tyr Ser Asn Arg Leu Tyr Ala Tyr Glu Pro Ala Asp Thr Ala Leu Leu 145 150 155 160 Leu Asp Asn Met Lys Lys Ala Leu Lys Leu Leu Lys Thr Glu Leu 165 170 175

Claims (8)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 1) 실험군으로 암 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;
   2) 상기 단계 1)의 실험군 및 피검화합물을 처리하지 않는 대조군에서 각각 AGR2 다이머의 양 또는 활성을 측정하는 단계; 및
   3) 상기 단계 2)의 측정 결과, AGR2 다이머의 양 또는 활성을 대조군에 비해 감소시키는 피검화합물을 선별하는 단계로 구성된 암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.
   
8. 제 7항에 있어서, 상기 단계 2)의 AGR2 다이머의 양은 웨스턴 블럿팅(Western blotting), ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay), 면역침강(Immunoprecipitation)을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.

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