KR101586221B1 - 카페인산페네틸에스테르를 유효성분으로 포함하는 색소침착의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 카페인산페네틸에스테르(Caffeic acid phenethyl ester)를 유효성분으로 포함하는 색소침착의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 카페인산페네틸에스테르는 α-MSH(alpha-menanocyte stimulating hormone)에 의하여 멜라닌 합성이 유도된 멜라노마 세포주에서 티로시나아제(tyrosinase)의 mRNA 및 단백질 발현을 효과적으로 억제함으로써 멜라닌 합성을 저해하는 우수한 효과를 가지고 있어, 기미, 주근깨와 같은 색소침착의 예방, 치료 또는 억제를 목적으로 하는 의약품 또는 화장품에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

카페인산페네틸에스테르를 유효성분으로 포함하는 색소침착의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating of hyperpigmentation containing caffeic acid phenethyl ester}

본 발명은 카페인산페네틸에스테르(Caffeic acid phenethyl ester)를 유효성분으로 포함하는 색소침착의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

천연물로부터 생리활성 물질에 관한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 질병에 대한 치료 및 예방제 또는 건강보조제로서 식물자원이 널리 이용되고 있다. 천연 항산화제로는 α-토코페롤(α-tocopherol), vitamin C, 카로테노이드(carotenoids), 플라보노이드(flavonoids) 등이 알려져 있는데, 이러한 항산화 효과가 있는 물질들은 동식물에 널리 분포되어 있으며, 많은 연구가 진행되고 있다.

현재까지 보고된 대부분의 천연 항산화제는 식물에서 유래된 것으로서 주로 폴리페놀 화합물인 것으로 알려져 있으며, 특히 플라보노이드는 지질의 산화, 활성산소의 소거 및 산화적 스트레스를 막는 역할을 함으로써 노화방지, 암 및 심장질환 등을 예방하거나 지연하는 효과가 있어서 오늘날 식품, 의약품, 화장품 등 많은 분야에서 활용되고 있다. 또한 멜라닌(Melanin)은 자외선으로부터 생체를 보호하는 중요한 방어 수단으로서 동물, 식물, 및 미생물에 널리 존재하는 페놀류의 고분자 천연 색소이다.

멜라닌은 자외선, 건조, 극한 온도 등에 대한 생존능력을 높여주고, 커피, 차, 담배 등의 품질을 향상시키나, 과도한 멜라닌 합성은 인체에 기미, 주근깨, 피부반점을 형성하고 피부노화를 촉진하며 피부암 유발에 관여하는 것으로 알려져 있다. 멜라닌 색소의 생합성은 티로시나아제(tyrosinase) 효소를 비롯하여 여러 효소들에 의하여 조절되고 있으며, 그 중 티로시나아제는 티로신을 기질로 하여 L-도파퀴논(L-dopaquinone)으로 전이되는 초기 생합성 과정이후 디히드록시인돌(dihydroxyindole)의 산화에 작용한다. 따라서 티로시나아제 활성 억제제를 찾는 연구가 미백제의 개발에 있어서 중요한 부분을 차지하고 있으며, 현재 계속 알려지고 있는 티로시나아제 저해제로 히드로퀴논(hydroquinone), 4-히드록시아니솔(4-hydroxyanisole), 아스코르브산(ascorbic acid) 유도체, 코지산(kojic acid), 아젤라산(azelaic acid), 코르티코스테로이드(corticosteroid), 레티노이드(retinoids), 알부틴(arbutin), 카테킨(catechin), 3,4,5-트리메톡시 신나메이트 티몰 에스테르(trimethoxy cinnamate thymol ester) 등이 있으나, 이들의 안전성과 경제성 등에 문제가 많아 사용에 있어서 어려움이 있다.

한편, 프로폴리스(propolis)는 꿀벌이 자신의 생존과 번식을 위해 여러 식물에서 뽑아낸 수지(樹脂)와 같은 물질에 자신의 침과 효소 등을 섞어서 만든 물질로, 함유성분으로는 유기물과 미네랄(무기염류)이 가장 많으며 이와 함께 104종정도의 성분이 들어 있다. 많은 성분 중에서 미네랄·비타민·아미노산·지방·유기산·플라보노이드 등은 세포대사에 중요한 역할을 하며, 테르펜류 등은 항암 효과가 보고되어 있으며, 특히 100 종류가 넘는 플라보노이드가 들어있어 건강 증진에 큰 도움을 준다. 또한, 항염, 항균, 항산화, 세포부활, 조직재생, 면역증강 작용 및 토코페롤의 세포재생, 노화방지, 항산화 작용효과도 나타낸다.

카페인산페네틸에스테르(Caffeic acid phenethyl ester, CAPE)는 수종의 식물 및 벌집에서 추출되는 프로폴리스의 주성분으로, 주로 벌의 프로폴리스(Grunberger, D.등,Experientia. 44: 230-232, 1988)에서 추출되며 CA(Nagaoka, T.등, Bioorg Med Chem. 10: 3351-3359, 2002)를 에스테르화하여 합성된다. 또한, 카페인산페네틸에스테르는 NF-kB의 억제를 통한 항염증작용 (Natarajan et al. PNAS 1996) 및 VEGF 수용체의 억제를 통한 혈관신생억제(Chung et al. J Mol Med (Berl) 2012) 등 다양한 생리활성을 가지는 것으로 알려져 있다. 특히 티로시나아제(tyrosinase)에 의해 대사됨으로써 멜라노마(melanoma) 세포주에 특이적으로 강한 항암활성을 가지는 것으로 알려져 있다(Kudugunti et al. Chem Biol Interact 2011). 그러나, 현재까지 카페인산페네틸에스테르가 멜라닌 합성에 관여한다는 연구 결과가 공지된 바 없을 뿐만아니라, 카페인산페네틸에스테르의 색소침착 질환의 예방 또는 치료ㆍ개선에 대한 기술내용이 교시되거나 기재된 바 없다.

이에 본 발명자들은 카페인산페네틸에스테르의 멜라닌 합성 억제 효과를 이용한 색소침착의 예방 또는 치료에 효과적인 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 카페인산페네틸에스테르가 멜라노마 세포주에서 티로시나아제의 mRNA 및 단백질 발현을 효과적으로 억제함으로써 멜라닌 합성을 저해하는 우수한 효과를 가지고 있어, 기미, 주근깨와 같은 색소침착의 예방, 치료 또는 억제를 목적으로 하는 의약품 또는 화장품에 유용하게 이용될 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 카페인산페네틸에스테르(Caffeic acid phenethyl ester)를 유효성분으로 포함하는 색소침착의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 카페인산페네틸에스테르를 유효성분으로 포함하는 색소침착의 예방 또는 억제용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해서, 본 발명은 카페인산페네틸에스테르를 유효성분으로 포함하는 색소침착의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 카페인산페네틸에스테르를 유효성분으로 포함하는 색소침착의 예방 또는 억제용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 카페인산페네틸에스테르는 α-MSH(alpha-menanocyte stimulating hormone)에 의하여 멜라닌 합성이 유도된 멜라노마 세포주에서 티로시나아제(tyrosinase)의 mRNA 및 단백질 발현을 효과적으로 억제함으로써 멜라닌 합성을 저해하는 우수한 효과를 가지고 있어, 기미, 주근깨와 같은 색소침착의 예방, 치료 또는 억제를 목적으로 하는 의약품 또는 화장품에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 카페인산페네틸에스테르의 세포 생존률에 미치는 영향을 확인하기 위해서 MTT assay를 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 카페인산페네틸에스테르에 의한 B16-F10 세포주에서의 멜라닌 생성 저해 활성을 측정하기 위해서 멜라닌 생성량을 측정하고 대조군에 대한 배수(fold)로 나타낸 도이다.
도 3은 카페인산페네틸에스테르의 티로시나아제(tyrosinase) 효소 저해 활성을 측정하기 위해서 L-DOPA의 산화반응율을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 카페인산페네틸에스테르의 멜라닌 합성 억제 기전을 확인하기 위해서 티로시나아제의 mRNA 발현 분석(A), 티로시나아제의 단백질 발현 분석(B)의 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 카페인산페네틸에스테르의 의한 티로시나아제의 전사 활성 측정을 위해 사용된 티로시나아제의 전사영역(promoter) 및 특징적인 전사조절 영역(A), 티로시나아제의 전사 활성 측정(B)의 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 카페인산페테틸에스테르에 의한 MITF의 타이로시나제 전사영역에 대한 결합 저해능을 나타낸 도이다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 카페인산페네틸에스테르(Caffeic acid phenethyl ester)를 유효성분으로 포함하는 색소침착의 예방, 치료 또는 억제용 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

상기 조성물은 약학적 조성물 또는 화장료 조성물을 포함한다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 화학식 1로 표시되는 카페인산페네틸에스테르(Caffeic acid phenethyl ester)는 멜라노마 세포주에서 티로시나아제의 mRNA 및 단백질 발현을 효과적으로 억제함으로써 멜라닌 합성을 저해하는 우수한 효과를 가지고 있어, 색소침착의 예방, 치료 또는 억제를 목적으로 하는 의약품 또는 화장품에 유용하게 이용될 수 있다.

상기 색소침착은 기미, 주근깨, 흑자, 검버섯, 점, 밀크커피반점, 오타모반, 청색모반, 몽고반점, 과다 색소침착 반(macule), 잡티 등으로부터 선택될 수 있으나, 이제 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 카페인산페네틸에스테르(Caffeic acid phenethyl ester)와 함께 색소침착 질환의 예방 또는 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충전제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 또한, 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 카페인산페네틸에스테르의 일일 투여량은 1mg/kg 내지 1000 mg/kg의 양으로 투여할 수 있다. 상기 조성물의 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 색소침착의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 카페인산페네틸에스테르는 색소침착의 예방 또는 억제를 목적으로 하는 화장료 조성물에 첨가될 수 있다.

본 발명에 따른 카페인산페네틸에스테르는 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 20 중량% 함유되는 것이 바람직하지만, 색소침착 억제 효과가 있고 독성이 나타나지 않는 범위에서 사용 용도에 따라서 상기 범위 이상 또는 이하로도 사용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 카페인산페네틸에스테르(Caffeic acid phenethyl ester) 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물은 그 효과를 증진시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 화장료 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수있다.

본 발명의 화장료 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예, 실험예 및 제조예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 세포배양

흑색종 세포주인 B16-F10는 American Type Culture Collection(ATCC)에서 분양 받았다. 이 세포주는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, WelGene Inc.)와 10% Fetal bovine serum (FBS, WelGene Inc.)에 L-글루타민 (200 mg/L) 및 우태아혈청 (FBS; 10%), 페니실린 (100 U/mL), 스트렙토마이신 (100 μg/mL)을 첨가하여 CO₂ 배양기(37℃, 5%)에서 배양하였다. 약 48시간 주기로 배양액을 교체하여 세포를 배양하였다.

실험예 1. MTT assay를 이용한 세포독성 측정

카페인산페네틸에스테르의 세포 생존률에 미치는 영향을 확인하기 위해서 MTT assay를 수행하였다.

구체적으로는, B16-F10 세포주를 24 웰 플레이트에 배양한 다음, α-MSH(1μM)과 0.5μM, 1.0μM, 2.0μM 및 5.0μM 농도의 카페인산페네틸에스테르를 각각 72시간 동안 처리하였다. Griess 반응 후에 MTT 용액(2.0mg/mL)을 각각의 웰에 투여하였다. 4시간 동안 37°C의 세포배양기에서 반응시킨 후, 상등액을 제거하고 생존 세포에서 생성된 포르마잔(formazan)을 microplate reader에서 540nm의 흡광도로 측정하였다. 세포의 생존율은 카페인산페네틸에스테르를 처리하지 않은 대조군에 대한 %로 계산하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 나타낸 바와 같이, 카페인산페네틸에스테르가 B16-F10 세포주의 생존률에 미치는 영향을 확인한 결과, 0.5μM, 1.0μM 및 2.0μM 농도의 카페인산페네틸에스테르를 처리한 경우, 세포독성이 거의 나타나지 않으나, 5.0 μM 농도로 카페인산페네틸에스테르를 처리한 경우, 유의한 세포독성이 나타남을 확인할 수 있었다.

따라서, 0.5μM, 1.0μM 및 2.0μM 농도의 카페인산페네틸에스테르 처리 군에서는 대조군에 비해 유의할만한 변화를 나타내지 않았으므로 세포독성이 낮아야 하는 미백제로서의 기준에 부합하는 것을 확인 할 수 있었다.

실험예 2. 멜라닌 생성 저해 활성 측정

카페인산페네틸에스테르에 의한 B16-F10 세포주에서의 멜라닌 생성 저해 활성을 측정하였다.

구체적으로는, B16-F10 세포를 6 웰 플레이트에 배양한 다음, α-MSH(1μM)와 0.5μM, 1.0μM 및 2.0μM 농도의 카페인산페네틸에스테르를 처리한 후, 72시간 동안 페놀레드(phenol red)가 없는 DMEM 배지를 이용하여 배양하였다. 이때, 알부틴(Arbutin)은 양성 대조군(100μM)으로 사용하였다. 세포배양액을 수집한 후, 세포 파편은 원심분리를 통하여 제거하였다. 배양세포는 얼음에 넣어 차갑게 한 인산염완충액(PBS)을 이용하여 두 번 세척한 후, 60℃에서 30분간 건조하였다. 건조된 세포는 1N NaOH(500μL)를 첨가하여 80℃에서 1시간 동안 배양한 다음, 12,000g로 30분간 원심분리하였다.

상기의 방법으로 준비한 세포배양액 및 용해된 세포의 광학적 농도는 microplate reader에서 405 nm의 흡광도로 측정하였다. 합성멜라닌(Sigma chemical Co.)을 표준 검량선을 이용하여 각 웰에서 생성된 멜라닌 양을 산출하였다. 멜라닌은 단위세포에서 단위 멜라닌 생성량을 측정하였고, 대조군에 대한 배수(fold)로 나타내었다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 1μM의 카페인산페네틸에스테르를 처리하였을 때부터 유의한 멜라닌 생성의 저해가 관찰되었으며, 2μM의 카페인산페네틸에스테르를 처리하였을 때에서는 대조군으로 사용된 알부틴과 비교했을 때, 멜라닌 합성 저해능이 현저히 높음을 확인 할 수 있었다. 특이 중요한 것은 B16F10 세포주에 대한 세포 증식력이 없는 농도에서 유의한 멜라닌 합성이 관찰되었다.

따라서, 대조군인 알부틴보다 높은 멜라닌 저해 활성을 확인하였으므로, 멜라닌 생성을 줄이면서 세포독성은 낮아야 하는 미백제로서의 기준으로 볼 때, 카페인산페네틸에스테르는 미백제로서 좋은 결과를 보여주었다.

실험예 3. 티로시나아제(tyrosinase) 효소 저해 활성 측정

카페인산페네틸에스테르가 티로시나아제 효소의 활성을 직접적으로 억제하는지 확인하기 위해서, 시험관 내 효소활성 시험을 수행하였다.

구체적으로, B16-F10 세포를 α-MSH(1μM)를 처리하여 72시간 동안 배양한 다음, 150μL의 용해액(0.1 M sodium phosphate (pH 6.8)과 1% Triton X-100, 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF)를 포함)을 첨가하여 4℃에서 20분간 반응시켰다. 용해된 세포를 12,000g로 30분간 원심분리 한 후, 상등액을 수집하였다. 동일한 양의 단백질(30μg)을 가진 상등액을 L-DOPA의 산화반응율을 측정하기 위하여 사용하였다. 최종 농도가 1, 10, 50 및 100μM이 되게 카페인산페네틸에스테르를 세포용해액(100μL)에 첨가하여 5분간 상온에서 반응시켰다. 알부틴(100μM)은 양성 대조군으로 사용하였다. 그 다음 시료를 100μL의 L-DOPA 용액(3 mg/mL의 농도로 0.1 M 인산염완충액(pH 6.8)에 녹인 것)을 첨가하여 37°C에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응은 50μL의 1M HCl을 첨가하여 종료시키고, ELISA plate reader에서 490 nm의 흡광도로 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 카페인산페네틸에스테르가 멜라닌 합성에 중요한 효소인 티로시나아제의 효소 활성을 직접적으로 저해하는지를 확인한 결과, 티로시나아제 효소 활성에 대한 카페인산페네틸에스테르의 저해 효과는 관찰되지 않았다. 따라서, 카페인산페네틸에스테르는 대조군으로 사용한 알부틴과는 달리 티로시나아제의 효소활성을 직접적으로 저해하지는 않음을 확인할 수 있었다.

실험예 4. 티로시나아제(tyrosinase)의 발현 억제

상기 실험예 3에서 확인한 바와 같이, 카페인산페네틸에스테르는 티로시나아제의 효소활성을 억제하지는 않음을 확인할 수 있었다. 따라서 카페인산페네틸에스테르가 멜라닌 합성을 억제하는지를 확인하기 위하여, 티로시나아제의 발현을 확인하였다.

4-1. mRNA 발현 분석

카페인산페네틸에스테르가 티로시나아제의 mRNA의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해서, RT-PCR을 수행하였다.

동일한 양의 총 RNA를 올리고-dT 프라이머와 AccuPower RT-PreMix를 이용한 역전사 반응에 사용하였다. 합성된 cDNA는 표 1에 나타낸 염기서열의 프라이머와 AccuPower PCR-PreMix를 이용한 티로시나아제, TRP-1 및 TRP-2, MITF 및 GAPDH의 PCR 반응에 사용하였다.

유전자	프라이머	염기서열	서열번호	증폭크기
				(bp)
Tyrosinase	mTyr-F	5′-CCTCCTGGCAGATCATTTGT-3′	서열번호1	236
	mTyr-R	5′-GGCAAATCCTTCCAGTGTGT-3′	서열번호2
TRP-1	mTRP1-F	5′-AGACTCCCGACCCCACAGCC-3′	서열번호3	260
	mTRP1-R	5′-GGTGAGTTGTGCGCTTCGCC-3′	서열번호4
TRP-2	mTRP2-F	5′-AGGAAGACTGGCGAGAAGCTCCC-3′	서열번호5	311
	mTRP2-R	5′-CGGCGTCCCACCTGGTTTCTG-3′	서열번호6
MITF	mMITF-F	5′-CTGGAGCATGCGAACCGGCA-3′	서열번호7	255
	mMITF-R	5′-CGGCATGGTGCCGAGGTTGT-3′	서열번호8
GAPDH	mGAPDH-F	5′-GGAGCCAAAAGGGTCATCAT-3′	서열번호9	203
	mGAPDH-R	5′-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3′	서열번호10

증폭된 DNA는 1.5%의 아가로오스 젤에서 전기영동 한 후 UV를 이용하여 확인하였다. 그 결과를 도 4A에 나타내었다.

도 4A에 나타낸 바와 같이, 카페인산페네틸에스테르가 티로시나아제의 mRNA의 발현을 효과적으로 억제함을 확인하였다.

4-2. 단백질 발현 분석

세포의 전체 단백질은 1mM PMSF를 포함하고 있는 RIPA 완충액을 이용하여 준비하였다. 단백질은 Bradford 방법으로 정량하였으며, 동일한 양의 단백질을 SDS-PAGE를 이용하여 크기별로 분리한 후, 니트로셀룰로오스 막에 전기영동을 통하여 전이시켰다. 그 막은 5%의 탈지유 용액(skim milk)에 최소 1시간 이상 차단(blocking)한 다음, 표적 단백질에 특이적인 1차 항체를 4°C에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 1차 항체 반응 후, 그 막을 2회 세척하여 HRP가 중합된 2차 항체에 반응시킨 후, 표적으로 하는 특이적 단백질의 밴드를 ECL법으로 검출하였다. 그 결과를 도 4 B에 나타내었다.

도 4 B에 나타낸 바와 같이, 카페인산페네틸에스테르가 티로시나아제의 단백질 발현을 효과적으로 억제함을 확인하였다.

4-3. 티로시나아제의 전사 활성 측정

티로시나아제의 전사 활성을 측정하기 위해서, 마우스 티로시나아제 리포터 세포주를 구축하여 루시퍼라아제 검사법(Luciferase assay)을 수행하였다.

구체적으로, 마우스의 게놈 DNA는 C57/BL6 생쥐의 혈액을 이용에서 QIAmp DNA Mini Kit(Quiagen)를 이용하여 제조자의 설명서에 따라서 추출하였다. 대략 0.5 kb 길이의 마우스 타이로시나제 유전자의 근거리 프로모터를 표 2에 표시된 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 통하여 도 5A에 표시된 영역의 유전자 서열을 증폭하였다. PCR 산물을 염기서열 분석을 통하여 확인한 다음 pGL4.17-luc2/Neo 벡터에 클로닝하였다. 그 결과 생성된 mTyr-pGL4.17 벡터를 B16-F10 세포에 주입한 다음, 1000μg/mL의 G418을 이용하여 티로시나아제 리포터 세포주 후보군을 선별하였다. 항생제 저항성을 통하여 선별된 티로시나아제 리포터 세포주는 α-MSH에 대한 반응성을 최종적으로 확인한 후 실험에 사용하였다. α-MSH(1μM)와 표시된 농도의 CAPE를 24시간 처리한 후, 세포를 채취한 후 용해액(25 mM의 Tris-phosphate(pH 7.8)과 2 mM의 EDTA, 1%의 Triton X-100, 10%의 glycerol을 포함)을 첨가하고 초음파 처리에 의하여 파쇄하였다. 루시퍼라아제 활성은 루시퍼라아제 시험 키트(Promega)를 이용하여 제조자의 설명에 따라 측정하였으며, 세포 추출물의 총 단백질의 양으로 비교하여 표준화하였다. 그 결과를 도 5B에 나타내었다.

유전자	프라이머	염기서열	서열번호	증폭크기
				(bp)
Tyrosinase promoter	mTyrPro-F	5′-GCGGTACCATGCATTGAAGCAGTTCACC-3′	서열번호11	522
	mTyrPro-R	5′-ATGAGCTCCACAGACTTCTTTTCCAGCA-3′	서열번호12
MITF ChIP assay	ChIP-MITF-F	5′-CCTCACTATGGGCTATGTACAAACT-3′	서열번호13	172
	ChIP-MITF-R	5′-GACTTCTTTTCCAGCAACCCC-3′	서열번호14

도 5B에 나타낸 바와 같이, 마우스 티로시나아제 리포터 세포주의 구축을 이용한 루시퍼라아제 검사법으로 티로시나아제의 전사조절을 확인한 결과, 카페인산페네틸에스테르는 티로시나아제의 발현을 전사과정에서부터 효과적으로 저해하는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 카페인산페네틸에스테르에 의한 멜라닌 생성 감소는 티로시나아제 저해 활성에 의한 것이 주요한 원인 중의 하나로 판단되었다.

실험예 5. 크로마틴 면역침강(ChIP)시험

MITF(microphthalmia-associated transcription factor)는 멜라닌 발현의 전사인자로서 매우 중요한 역할을 한다. 멜라닌 합성과 관련된 인자인 티로시나아제와 MITF의 높은 발현은 멜라닌 합성의 증가를 의미한다. 따라서 카페인산페네틸에스테르가 MITF의 티로시나아제의 프로모터 영역에 대한 결합을 저해하는지 확인하기 위해서, 크로마틴 면역침강 시험을 ChIP assay kit(Upstate)를 이용하여 수행하였다.

DNA와 결합된 단백질을 DNA에 교차결합시킨 후, 1X 단백분해효소 저해제(PI)를 포함한 SDS 용해액에 용해시켰다. VC100 sonicator(Sonics & Materials Inc.)를 이용하여 DNA를 30초간 초음파 펄스를 주어 200-500 bp의 크기로 잘랐다. 크로마틴 용액은 50% 연어 DNA/protein A 아가로오스 현탁액과 섞어서 4℃에서 30분간 전처리하였다. 전처리된 상등액은 MITF 특이적 항체 또는 동형의(isotypic) IgG와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 침전된 DNA와 침전되지 않은 input 게놈 DNA를 상기 표 2에 나타낸 프라이머를 이용하여 도 5A에 표시된 영역의 유전자 서열을 PCR 반응으로 증폭시켰다.

증폭된 PCR 산물을 2% 아가로오스 겔에서 전기영동으로 분리한 후 UV를 통하여 확인하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 카페인산페네틸에스테르가 MITF의 티로시나아제의 프로모터 영역에 대한 결합을 저해하는 것을 확인하였다.

본 실험예에서의 통계적 분석은, 세포생존율 및 멜라닌 함량, 티로시나아제 효소활성, 프로모터 시험 등에서 모두 정상대조군에 대한 백분율(%) 또는 배수(fold)로 계산하였으며, 평균값 ± 표준편차의 형태로 나타내었다. 군 간의 차이는 GraphPad Prism 소프트웨어를 이용하여 Dunnet의 후향적 비교를 이용한 ANOVA 검증을 통하여 확인하였다. 모든 분석에서 유의성이 있는 최저 수치는 P 값이 0.05 이상인 것으로 설정하였다. 모든 실험은 최소한 3회 이상, 독립적으로 시행하였다.

이하 본 발명의 상기 조성물을 포함하는 약학적 조성물 및 화장료 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 약학적 조성물의 제제

1-1. 산제의 제조

카페인산페네틸에스테르 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

1-2. 정제의 제조

카페인산페네틸에스테르 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

1-3. 캡슐제의 제조

카페인산페네틸에스테르 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

1-4. 주사제의 제조

카페인산페네틸에스테르 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

1-5. 액제의 제조

카페인산페네틸에스테르 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 2. 화장료 조성물의 제제

2-1. 유연 화장수의 제조

화학식 1로 표시되는 카페인산페네틸에스테르를 유효성분으로 포함하는 유연 화장수는 하기와 같이 제조하였다.

원료 함량(중량부)

카페인산페네틸에스테르 0.0005

1,3-부틸렌글리콜 1.00

디소듐이디티에이 0.05

알란토인 0.10

디포타슘글리시리제이트 0.05

시트릭애씨드 0.01

소듐시트레이트 0.02

글리세레스-26 1.00

알부틴 2.00

하이드로제네이티드캐스터오일 1.00

에탄올 30.00

보존제 미량

착색제 미량

착향제 미량

정제수 잔량

2-1. 영양 크림의 제조

화학식 1로 표시되는 카페인산페네틸에스테르를 유효성분으로 포함하는 영양 크림은 하기와 같이 제조하였다.

원료 함량(중량부)

카페인산페네틸에스테르 0.0005

1,3-부틸렌 글리콜 7.0

글리세린 1.0

D-판테놀 0.1

식물 추출물 3.2

마그네슘알루미늄실리케이트 0.3

PEG-40 스테아레이트 1.2

스테아르산 2.0

폴리소르베이트 60 1.5

친유형글리세릴스테아레이트 2.0

소르비탄세스퀴올리에이트 1.5

세테아릴알코올 3.0

미네랄오일 4.0

스쿠알란 3.8

카르릴릭/카프릭트리글리세라이드 2.8

식물성 오일 1.8

디메치콘 0.4

디포타슘글리시리제이트 미량

알란토인 미량

소듐 히아루로네이트 미량

토코페릴아세테이트 적량

트리에탄올아민 적량

보존제 적량

착향제 적량

정제수 잔량

<110> Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation <120> Composition for preventing or treating of hyperpigmentation containing caffeic acid phenethyl ester <130> 1.28p <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of Tyrosinase <400> 1 cctcctggca gatcatttgt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of Tyrosinase <400> 2 ggcaaatcct tccagtgtgt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of TRP-1 <400> 3 agactcccga ccccacagcc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of TRP-1 <400> 4 ggtgagttgt gcgcttcgcc 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of TRP-2 <400> 5 aggaagactg gcgagaagct ccc 23 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of TRP-2 <400> 6 cggcgtccca cctggtttct g 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of MITF <400> 7 ctggagcatg cgaaccggca 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of MITF <400> 8 cggcatggtg ccgaggttgt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of mouse GAPDH <400> 9 ggagccaaaa gggtcatcat 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of mouse GAPDH <400> 10 gtgatggcat ggactgtggt 20 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of mouse Tyrosinase promoter <400> 11 gcggtaccat gcattgaagc agttcacc 28 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of mouse Tyrosinase promoter <400> 12 atgagctcca cagacttctt ttccagca 28 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of mouse ChIP-MITF <400> 13 cctcactatg ggctatgtac aaact 25 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of mouse ChIP-MITF <400> 14 gacttctttt ccagcaaccc c 21

Claims (4)

1. 0.5 내지 2μM의 하기 화학식 1로 표시되는 카페인산페네틸에스테르(Caffeic acid phenethyl ester) 를 유효성분으로 포함하는 색소침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   [화학식 1]
   

   
2. 제 1항에 있어서, 상기 카페인산페네틸에스테르(Caffeic acid phenethyl ester)는 티로시나아제의 mRNA 및 단백질 발현을 억제하여 멜라닌 합성을 저해하는 것을 특징으로 하는, 색소침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 색소침착 질환은 기미, 주근깨, 흑자, 검버섯, 점, 밀크커피반점, 오타모반, 청색모반, 몽고반점, 과다 색소침착 반(macule), 및 잡티로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 색소침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
4. 0.5 내지 2μM의 하기 화학식 1로 표시되는 카페인산페네틸에스테르(Caffeic acid phenethyl ester)를 유효성분으로 포함하는 색소침착의 예방 또는 억제용 화장료 조성물.
   [화학식 1]
   

   

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