KR101527861B1 - 돼지써코바이러스２ 캡시드 단백질의 이용방법 - Google Patents

돼지써코바이러스２ 캡시드 단백질의 이용방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101527861B1
KR101527861B1 KR1020110146641A KR20110146641A KR101527861B1 KR 101527861 B1 KR101527861 B1 KR 101527861B1 KR 1020110146641 A KR1020110146641 A KR 1020110146641A KR 20110146641 A KR20110146641 A KR 20110146641A KR 101527861 B1 KR101527861 B1 KR 101527861B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
porcine circovirus
pcv2
capsid
orf2
protein
Prior art date
Application number
KR1020110146641A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20130077958A (ko
Inventor
권창희
오윤이
이경기
김연희
송재영
Original Assignee
대한민국
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국 filed Critical 대한민국
Priority to KR1020110146641A priority Critical patent/KR101527861B1/ko
Publication of KR20130077958A publication Critical patent/KR20130077958A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101527861B1 publication Critical patent/KR101527861B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 돼지써코바이러스 (porcine circovirus: PCV2)의 캡시드 단백질을 이용하여 바이러스 검출을 위한 항체를 검출하는 방법 및 돼지써코바이러스2의 캡시드 단백질을 항원으로 포함하는 돼지써코바이러스 예방용 백신에 관한 것이다.

Description

돼지써코바이러스２ 캡시드 단백질의 이용방법{Utilization method of porcine circovirus ２ capsid protein}
본 발명은 돼지써코바이러스2 (porcine circovirus: PCV2)의 캡시드 단백질을 항원으로 이용하는 것을 특징으로 하는 돼지써코바이러스2 항체 검출 방법에 관한 것으로 보다 구체적으로는 상기 단백질을 항원으로 간접형광항체법 또는 효소면역검사법을 통해 돼지써코바이러스2 항체를 검출하는 방법에 관한 것이다.
돼지 써코바이러스(PCV2)는 약 1.76kb의 단일가닥 원형 DNA 게놈을 함유하는 작은 20면체의 외피 비보유(nonenveloped)바이러스이다. 이는 원래 돼지 신장 세포주 PK-15의 세포 배양 오염물로서 단리되었다([I. Tischer et al., Nature 295:64-66 (1982)]; [I. Tischer et al., Zentralbl. Bakteriol. Hyg. Otg. A. 226(2):153-167 (1974)]). PCV는 3개의 다른 동물 써코바이러스(닭 빈혈 바이러(CAV), 앵무새 부리와 깃털병 바이러스(psittacine beak and feather disease virus: PBFDV) 및 최근에 발견된 비둘기에서 나온 콜럼비스 써코바이러스(CoCV)) 및 3가지 식물 써코바이러스(바나나 송이 상부 바이러스, 코코넛 잎 붕괴 바이러스 및 지하 클로버스턴트 바이러스)로 구성된 써코바이러스 과로 분류된다([M. R. Bassami et al., Virology 249:453-459(1998)]; [J. Mankertz et al., Virus Genes 16:267-276 (1998)]; [A. Mankertz et al., Arch. Virol. 145:2469-2479 (2000)]; [B. M. Meehan et al., J. Gen. Virol. 78:221-227 (1997)]; [B. M. Meehan et al.,J. Gen. Virol. 79:2171-2179 (1998)]; [D. Todd et al., Arch. Virol. 117:129-135 (1991)]). 3개의 이전에 인식되는 동물 써코바이러스(PCV, CAV 및 PBFDV)의 종은 서로 뉴클레오타이드 서열 상동성 또는 항원 결정자를 공유하지 않는다(상기 문헌[M. R. Bassami et al., 1998]; 상기 문헌[D. Todd et al., 1991]). PK-15 세포-유래된 PCV로 돼지를 실험적으로 감염시켰는데 임상적 질병을 생성하지 않았고, 따라서, 이 바이러스는 돼지에게는 병원성이 아닌 것으로 간주되었다([G. M. Allan et al., Vet. Microbiol. 44:49-64 (1995)]; [I. Tischer et al., Arch. Virol. 91:271-276 (1986)]). 오염된 PK-15 세포주에서 유래된 이 비병원성 PCV는 돼지 써코바이러스 1형 또는 PCV1으로 명명되었다.
1971년에 처음 개시된 이후 전신 소모성 증후군(PMWS)([J. C. Harding and E. G. Clark, Swine Health and Production 5:201-203 (1997)])은 젖을 뗀 새끼돼지의 복합 질병으로 점점 더 널리 퍼지고 있다. PMWS는 주로 5 내지 18주된 돼지에게 침범한다. 임상적 PMWS 증후는 진행성 체중 손실, 호흡곤란, 빈호흡, 빈혈, 설사 및 황달을 포함한다. 사망율은 1% 내지 2%로 다양할 수 있고, 영국에서의 일부 복잡한 사례의 경우 40%에 이른다 ([M. Muirhead, Vet. Rec. 150:456 (2002)]). PMWS의 미시적인 병변 특징은 육아종 간질성 폐렴, 림프종, 간염 및 신장염을 포함한다([G. M. Allan and J. A. Ellis, J. Vet. Diagn. Invest. 12:3-14 (2000)]; [J. C. Harding and E. G. Clark, Swine Health and Production 5:201-203 (1997)]).
PCV1이 돼지에서 편재하는 반면, 이는 돼지에게 병원성이지 않다. PMWS의 주 원인은 일반적으로 돼지 써코바이러스 2형 또는 PCV2로 명명된 PCV의 병원성 균주이다([G. M. Allan et al., Vet. Rec. 142:467-468 (1998)]; [G. M. Allan et al., J. Vet. Diagn. Invest. 10:3-10 (1998)]; [G. M. Allan et al., Vet. Microbiol. 66:115-23 (1999)]; [G. M. Allan and J. A. Ellis, J. Vet. Diagn. Invest. 12:3-14 (2000)]; [J. Ellis et al. Can. Vet. J. 39:44-51 (1998)]; [A. L. Hamel et al., J. Virol. 72:5262-5267 (1998)]; [B. M. Meehan et al., 1998, supra]; [I. Morozov et al., J. Clin. Microbiol. 36:2535-2541 (1998)]). PMWS-관련된 PCV2의 완전한 게놈 서열이 결정되었다([M. Fenaux et al., J. Clin. Microbiol. 38:2494-503 (2000)]; [A. L.Hamel et al., 1998, supra]; [J. Mankertz et al., 1998, supra]; [B. M. Meehan et al., 1997, supra]; [B.M. Meehan et al., 1998, supra]; [I. Morozov et al., 1998, supra]).
서열 분석은 PMWS-관련된 PCV2가 비병원성 PCV1과는 단지 약 75%의 뉴클레오타이드 서열 동일성을 공유한다는 것을 밝혀냈다. 비병원성 PCV1 및 병원성 PCV2 둘 모두의 ORF2 유전자는 주 면역 바이러스 캡시드 단백질을 인코딩한다([P. Nawagitgul et al., Immunol. Clin. Diagn. Lab Immunol. 1:33-40 (2002)]; [P. Nawagitgul et al., J. Gen. Virol. 81:2281-2287 (2000)]).
양돈 산업계에 미치는 강력한 영향으로 인해, PCV2에 대한 백신 개발이 점차 중요해지고 있다. 예를 들면 미국 특허 제6,287,856호(포엣(Poet) 등) 및 제WO 99/45956호는 조류 종을 감염시키는 써코바이러스인 앵무 부리 및 깃털 질병 바이러스(BFDV) 및 돼지 써코바이러스(PCV)에서 나온 핵산을 개시하고 있다.
그러나 현재 이러한 돼지써코바이러스는 실험상 배양이 어려우며 진단 역시 매우 번거롭기 때문에 다량의 항원을 손쉽게 생산 할 수 있는 방법의 필요성이 대두되고 있다.
본 발명의 목적은 다량의 항원으로써 돼지써코바이러스2 캡시드 단백질을 제공하여 돼지써코바이러스2 항체 진단법을 용이하게 사용할 수 있도록 할 뿐 아니라, 이를 항원으로 이용한 백신 조성물을 제공하는데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해서 본 발명은 돼지써코바이러스2(porcine circovirus: PCV2)의 캡시드 단백질을 항원으로 이용하는 것을 특징으로 하는 돼지써코바이러스2 항체 검출 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 돼지써코바이러스2의 캡시드 단백질을 항원으로 포함하는 돼지써코바이러스2 예방용 백신을 제공한다.
본 발명에 따르면, 돼지써코바이러스 2 캡시드 단백질을 항원으로 대량 생산 가능하므로 돼지써코바이러스2 항체 진단 및 백신 생산에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 돼지써코바이러스2(PCV2)의 캡시드(ORF2)유전자의 염기 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 2는 돼지써코바이러스2(PCV2)의 캡시드(ORF2)유전자를 발현하는 렌티바이러스 발현 벡터를 이용한 발현 세포주 작성 모식도이다.
도 3은 돼지써코바이러스2(PCV2)의 캡시드(ORF2) 유전자를 발현하는 세포주에서 삽입유전자를 유전자 증폭방법(PCR)으로 확인한 결과를 도시한다.
도 4는 돼지써코바이러스2(PCV2)의 캡시드(ORF2)에 대한 특이 단크론항체와 야외 가검혈청을 이용하여 간접형광항체법(IFA: Indirect immuno fluoresence assay)으로 바이러스 감염세포 및 돼지 PCV2 캡시드(ORF2)발현 세포주를 검사한 사진이다(A: 기존의 돼지써코바이러스2(PCV2) 진단용 세포(PK-15) B: 새로 개발된 돼지써코바이러스2(PCV2) 캡시드(ORF2)발현 Vero세포주 (L-Vero 1) C: 양성 돼지혈청을 이용한 돼지써코바이러스2(PCV2) 캡시드(ORF2)발현 Vero 세포주(L-Vero 1)의 형광항체법 결과)
도 5는 웨스턴 블럿팅을 이용하여 돼지써코바이러스2(PCV2) 캡시드(ORF2)발현 세포주에서 발현 캡시드(ORF2)단백질을 확인한 사진이다.
도 6은 본 발명 IFA를 이용한 돼지써코바이러스(PCV2)의 캡시드(ORF2)항체 검사 방법의 항체 검출 효율을 도시한다.
본 발명은 돼지써코바이러스2(porcine circovirus: PCV2)의 캡시드 단백질을 항원으로 이용하는 것을 특징으로 하는 돼지써코바이러스2 항체 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명의 돼지써코바이러스2(porcine circovirus: PCV2)의 캡시드 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이와 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 사용할 수도 있다.
또한, 본 발명의 캡시드 단백질을 코딩하는 염기서열은 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열일 수 있다.
본 발명은 항체 검출 방법으로써 형광항체검사법 또는 효소면역검사법을 이용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 본 발명은 돼지써코바이러스2(porcine circovirus: PCV2)의 캡시드 단백질을 항원으로 포함하는 돼지써코바이러스2 예방용 백신을 제공한다.
실시양태에서, 돼지써코바이러스2(porcine circovirus: PCV2)의 캡시드 단백질을 항원으로 포함하는 백신 또는 면역 조성물은 돼지 2A형, 2C형 또는 2D형 균주, 또는 임의의 다른 변이체를 이용한 감염으로부터 교차 보호할 수 있다. 이런 백신 또는 면역 조성물의 투여는 낮은 유독성/낮은 사망율의 2A형 균주에 대해 돼지를 보호하고, 또한 병원성 돼지 써코바이러스의 높은 유독성/높은 사망율의 2B 균주에 대한 교차보호도 제공한다. 이용되는 백신 또는 면역 조성물은 단일 투여 또는 다중 투여로서 투여될 수 있다. 투여는 이유후 전신 소모성 증후군(PMWS)과 관련된 임의의 하나 이상의 증후 또는 후유증으로부터 돼지를 보호한다. 더욱이, 임의의 상기 언급된 실시양태를 포함하는 백신 또는 면역 조성물을 투여하면, 높은 유독성/높은 사망율의 2B형 돼지 써코바이러스 균주와 관련된 평균 사망율에 비해 사망율을 더 많이 감소시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 개시된 면역 또는 백신 조성물은 돼지 써코바이러스2에대한 면역 반응을 이끌어내기 위해, 또는 병원성 PCV2 감염에 대해 돼지를 보호하기 위해, 또는 질병과 관련된 하나 이상의 증후군을 개선시키기 위해 이용될 수 있다.
한 실시양태에서, 면역 또는 백신 조성물은 아쥬반트와 함께 또는 아쥬반트없이 투여될 수 있다.
한 실시양태에서, 면역 또는 백신 조성물은 피하, 근육내, 비강내, 경피, 간내, 또는 림프 내 경로를 통해 단일 또는 다중 투여량으로 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 바이러스 및 세포의 준비
돼지써코바이러스(PCV2)의 캡시드(ORF2)유전자을 삽입하기 위해서 렌티바이러스벡터(LentiORF pLEX-MCS, Thermo Scientific Open Biosystems, USA) 를 사용하였고 바이러스는 베로(Vero) 세포주에서 배양하였다. 베로 세포주는 배지(DMEM)에 5% 태아 송아지 혈청 (fetal calf serum)과 푸로마이신(Puromycin, InvivoGen, USA), 안티바이오틱-안티마이코틱(Antibioctic-antimycotic)을 첨가한 배지를 사용하여 36℃-37℃의 항온기에서 배양하였다.
실시예 2. 돼지써코바이러스(PCV2)의 캡시드(ORF2)의 유전자 클로닝 , DNA 염기서열 분석발현 벡터 작성
국내분리 바이러스 주를 배양하여 상층액에서 DNA를 추출하여 Tag 폴리머라아제 (Takara)를 사용하여 Gene Amp PCR system 9600(Perkin Elmer)으로 증폭하였다. PCR을 이용하여 증폭된 DNA 단편은 제한효소 처리 없이 바로 pGEM-T Easy 벡터 (Promega)에 클로닝 하였고, 염기서열 분석법은 디디옥시 체인 dye terminator cycle sequencing kit(PE-Biosystem)를 이용하였으며, 반응 후 유전자 자동염기서열분석기 (ABI)를 사용하였다(도 1, 표1).
분석된 돼지써코바이러스(PCV2)의 캡시드(ORF2)단백질의 염기 및 아미노산 서열을 표1과 같다.
염기서열
(서열번호1)		 GGATCCATGA CGTATCCAAG GAGGCGTTAC CGCAGAAGAA GACACCGCCC CCGCAGCCAT 60
CTTGGCCAGA TCCTCCGCCG CCGCCCCTGG CTCGTCCACC CCCGCCACCG CTACCGTTGG 120
AGAAGGAAAA ATGGCATCTT CAACACCCGC CTCTCCCGCA CCTTCGGATA TACTGTCAAG 180
CGTACCACAG TCACAACGCC CTCCTGGGCG GTGGACATGA TGAGATTTAA GCTTGACGAC 240
TTTGTTCCCC CGGGAGGGGG GACCAACAAA ATCTCTATAC CCTTTGAATA CTACAGAATA 300
AGAAAAGTTA AGGTTGAACT CTGGCCCTGC TCCCCCATCA CCCAGGGTGA TAGGGGAGTG 360
GGCTCCACTG CTGTCATTCT AGATGATAAC TTTGTACCAA AGGCCAATGC CCTAACCTAT 420
GACTCATATG TAAACTACTC CTCCCGCCAT ACAATCCCCC AACCCTTCTC CTACCACTCC 480
CGTTACTTCA CACCCAAACC TGTTCTGGAC TCCACTATTG ATTACTTCCA ACCAAATAAC 540
AAAAGGAATC AGCTTTGGCT GAGGCTACAA ACCTCTAGAA ATGTGGACCA CGTAGGCCTC 600
GGCACTGCGT TCGAAAACAG TAAATACGAC CAGGACTACA ATATCCGTGT AACCATGTAT 660
GTACAATTCA GAGAATTTAA TCTTAAAGAC CCCCCCACTT AACCCCCTCG AG
아미노산서열
(서열번호2)		 GSMTYPRRRYRRRRHRPRSHLGQILRRRPWLVHPRHRYRWRRKNGIFNTRLSRTFGYTVK 60
RTTVTTPSWAVDMMRFKLDDFVPPGGGTNKISIPFEYYRIRKVKVELWPCSPITQGDRGV 120
GSTAVILDDNFVPKANALTYDSYVNYSSRHTIPQPFSYHSRYFTPKPVLDSTIDYFQPNN 180
KRNQLWLRLQTSRNVDHVGLGTAFENSKYDQDYNIRVTMYVQFREFNLKDPPT 233
돼지써코바이러스(PCV2)의 캡시드(ORF2)단백질을 발현하기 위하여 발현 개시 코돈인 ATG를 함유하도록하고 Bam HⅠ 제한효소 작용 부위와 말단부위에 Xho I제한효소부위를 삽입하였다. 또한 Xbo I 작용부위의 바로 앞에 위치한 정지코돈 TAG에서 단백질의 발현이 종료하도록 작성하였다. 이렇게 조작된 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하였고, 증폭된 DNA를 pGEMT-Easy vector (Promega) 에 크로닝하였다.
단백질을 발현시키기 위해서 크로닝한 벡터를 Bam HⅠ와 XboⅠ제한효소로 차례로 처리한 후 PCV2 의 유전자 부위에서 캡시드(ORF2)에 해당하는 부위만을 정제하였다. 한편 발현 벡터인 렌티 pLEX-MCS 벡터 역시 동일한 제한효소를 처리하여 정제하였다. 이렇게 만들어진 상기의 두 유전자를 접합하여 재조합 발현 벡터인 Lenti pLEX PCV2-ORF2벡터를 작성하였다(도 2).
실시예 3. 돼지써코바이러스(PCV2)의 캡시드(ORF2)발현 및 발현 세포주 작성
돼지써코바이러스(PCV2)의 캡시드(ORF2)발현 세포주 작성을 위한 과정은 다음과 같다. 재조합 렌티바이러스는 렌티 pLEX PCV2-ORF2 벡터, 외부단백질 발현 벡터와 바이러스 합성벡터유전자를 1:1:1의 비율로 293T세포에 Lipofectamine Plus (Invitrogen, USA)를 이용하여 삽입시킨 후 배양하고48시간 후에 세포배양 상층액을 0.45㎛ membrane filter (Nalgene, USA)로 여과하였다(Follensi et al., (2000) Nat. Genet. 25, 217-222, Dull et al., (1998) J. Virol. 72, 8463-8471).
발현 세포주의 작성을 위하여 재조합 렌티바이러스를 베로 세포주에 감염시킨 다음 배지(DMEM)에 5% 태아 송아지 혈청 (fetal calf serum)과 푸로마이신(Puromycin, InvivoGen, USA), 안티바이오틱-안티마이코틱 (Antibioctic-antimycotic)을 첨가한 배지를 사용하여 36℃의 항온기에서 2주간 배양하였다. 배양세포는 다시 96 Well 배양용기를 이용하여 배양액으로 100,000까지 한계희석을 실시한 다음 단일 세포를 크로닝하여 배양하였으며, 캡시드(ORF2)유전자의 크로마좀 내 삽입 후 단백질의 발현을 확인하여 돼지써코바이러스(PCV2)의 캡시드(ORF2)발현 Vero 세포주(L-Vero 1)를 작성하였다.
돼지써코바이러스(PCV2)의 캡시드(ORF2)발현을 비교하기 위하여 크로닝된 캡시드(ORF2) 유전자를 Invitrogen (USA)사의 pFastBac HTA벡터를 이용하여 재조합 벡터로 바이러스를 작성하였다. 보다 구체적으로 pFastBac HTA벡터의 6X His-tag 하단 부위의 Bam HⅠ와 XboⅠ제한효소부위를 이용하여 캡시드(ORF2)에 해당하는 부위만을 삽입하여 pFastBac HTA PCV2 캡시드(ORF2)를 작성하였으며, 이를 통해 재조합 베큘로 바이러스를 곤충세포에서 작성하였다.
재조합 베큘로바이러스를 Sf-9 세포(1.5x105 cells)에 접종하여 25 내지 27℃에서 4-5일한 배양 후 상층액을 제거하고 감염세포만을 수확하여 lysis buffer (10mM Tris pH 7.5, 130mM NaCl, 1% Triton X-100, 10mM NaF, 10mM NaPi, 10mM NaPPi(sodium prytophosphate))로 처리하고 초음파로 분쇄한 다음 His-tag colume으로 정제하여 -20℃에 보관하였다. 재조합곤충세포발현PCV2 캡시드(ORF2)단백질은 특이 항체생산과 기타 면역학적 비교시험에 비교단백질 항원으로 사용하였다.
실시예 4. 돼지써코바이러스(PCV2)의 캡시드(ORF2)유전자와 캡시드 발현
캡시드(ORF2)발현 베로 세포주(L-Vero 1)의 캡시드(ORF2)유전자는 712bp 내부의 캡시드 유전자 서열을 참고로하여 내부의 494bp가 증폭되는 프라이머 부위를 선정하였다. 선정된 서열은 다음과 같다.
Foward: 5‘ CAC GGA TAT TGT ATT CCT GGT 3’
Reverse: 5‘ CGC ACC TTC GGA TAT ACT GTC 3‘
캡시드(ORF2)발현 Vero 세포주(L-Vero 1)를 36℃의 항온기에서 5-6일 배양한 다음 수확하여 유전자를 추출한 다음 프라이머와 Tag polymerase (Takara)를 사용하여 Gene Amp PCR system 9600 (Perkin Elmer)에서 94℃에서 3분간 변성(denature)시키고 94℃, 20초, 55℃ 20초, 72℃초에서 35회 순환 반응시켰다. 그 후, 72℃에서 5분간 반응하여 증폭하였다. 삽입유전자를 유전 자증폭하여 확인한 결과가 도 3에 도시되었다.
발현 단백질의 면역학적 동정은 돼지써코바이러스(PCV2)의 캡시드(ORF2)발현 Vero 세포주(L-Vero 1)를 선택배지에서 배양시킨 후 7일째에 발현 세포를 100% 냉 아세톤으로 10분간 고정하고 돼지써코바이러스(PCV2)에 의해 야외 감염된 돼지의 양성 혈청과 특이 단크론항체를 반응시켜FITC conjugated anti-swine IgG (KPL) 나 FITC conjugated anti-mouse Ig M(KPL, USA)를 이용하였으며, 특이반응을 나타내는 재조합 돼지써코바이러스(PCV2)의 캡시드(ORF2)단백질의 발현을 간접형광항체법(IFA: Indirect immuno fluoresence assay)으로 확인하였다(도 4).
실시예 5. 웨스턴 블롯팅을 이용한 돼지써코바이러스(PCV2)의 캡시드(ORF2)확인
돼지써코바이러스2(PCV2)의 캡시드(ORF2) 발현 베로 세포주(L-Vero 1)를 9일간 배양하여 세포를 수확하였으며, 세포 파쇄액인 SDS버퍼 (1% SDS, 10mM Tris (pH7.5), 300mM NaCl, 0.5% NP-40)를 넣고 1분간 열처리한 다음 12000rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액만을 수확하였다. 이를 샘플로 하여 전기영동을 실시하였다. 전기영동을 실시한 후에 겔을 니트로셀룰로오스 필터에 전이 시키고 10%의 skimmed milk를 함유한 블로킹 용액으로 처리한 후 양성 토끼 혈청을 반응시켰다. 세척한 뒤 토끼 항체에 대한 HRP 콘주게이트(anti-rabbit HRP, Thermo, USA)를 반응시키고 세척 후 발색제로서 4 CN를 처리하여 재조합 PCV2 캡시드(ORF2)단백질의 존재 여부를 확인하였다. 이때 캡시드(ORF2)단백질의 분자량은 약 28-29 KDa 으로 확인하였다. 웨스턴 블랏을 이용하여 발현되는 캡시드(ORF2) 단백질을 확인한 결과를 도5에 나타냈다.
실시예6 . 돼지써코바이러스2 ( PCV2 )의 캡시드(ORF2)에 대한 잡종 세포( Hybridoma ) 생산
6.1 면역
돼지써코바이러스(PCV2)의 캡시드(ORF-2)에 대한 특이 항원의 생산을 위하여 시판되는 PCV에 대한 예방약을 면역원으로 7주령 발브시 마우스(Balb/c mouse)의 복강에 0.02ml씩 3주 간격으로 2회 접종하였다. 2차 접종 한 다음 2주 후 3차 면역은 재조합 PCV2 캡시드(ORF2) 베큘로바이러스를 곤충세포에서 발현시킨 후 His-tag colume으로 정제한 항원을 두당 0.2mg/ml 의 농도로 접종하였다.
6.2 융합
3차 면역 후 14일 째에 마우스로부터 양쪽 슬와 림프절을 무균적으로 채취하여 파쇄한 후 무혈청 배지(SFM, Serum Free DMEM)로 세척하여 림프구만을 회수하였다. 세포융합을 위해 종양세포 (SP2/O-Ag14 mouse myeloma cell line)를 사용하였으며 림프구와 종양세포를 5: 1의 비율로 섞은 후 PEG 1500 (50%)를 사용하여 융합을 실시하였다. 융합 후 HAT(hypoxanthine aminopterin thymidine) 증식배지(SFM에 10% FBS 함유)에 부유시켜 피더(feeder) 세포가 들어 있는 96공 마이크로플레이트(96well microplate)에 100㎕씩 분주하였으며, 37℃, 5% 이산화탄소 배양기 내에서 배양하였다. 피더 세포는 동종 마우스의 복강에서 대식세포(macrophage)을 HAT 증식배지로 수거하여 융합 하루 전날 배양한 후 사용하였다.
6.3 잡종 세포 선택
잡종 세포가 증식한 배양 상층액을 수거하여 간접형광항체(IFA) 방법으로 스크리닝을 실시하여 양성을 보이는 잡종 세포를 well당 1 - 0.5개의 세포가 포함되도록 희석한 후 세포 집단을 형성할 때까지 (약 2주일) 배양한다. 돼지써코바이러스(PCV2) 단백질에 대한 항체를 생성하면서 단 하나의 클론(Clone) 만을 형성한 세포 집단을 선발하여 배양용 플라스크(Culture Flask)에 대량 배양 후 동종 발브시 마우스에 선발된 잡종 세포를 접종하여 복수를 생성하여 이를 실험에 사용하였다. 본 실험에서 선발된 특이 항체 생산 세포주의 특성은 표2와 같다.
Clone Isotype IFA (titer)
11A69 IgM 250-500
1B53 IgM 250-500
실시예 7. 돼지써코바이러스(PCV2)의 캡시드(ORF2)단백질을 이용한 형광항체 검사법( IFA )
돼지써코바이러스(PCV2)캡시드(ORF2)단백질을 발현시킨 엘베로세포(L-Vero 1)를 96well microplate(TPP사)에 7일간 배양한 다음 배양액을 제거한 후 0.01M Phosphate buffered saline(PBS)완충액 200ul 으로 한번 세척하였다. 세척된 플레이트는 37℃에서 10분간 건조시킨 후 80%의 차가운 아세톤을 well당 100ul 첨가하여 -20 ℃에서 10분간 고정 하였다. 고정 후 분주한 고정액을 제거한 PBS를 첨가하여 잔여고정액을 제거하였다. 고정한 세포는 실온에서 자연건조 시킨 후 -20℃ 보관하였다. 형광항체 검사법(IFA)은 고정된 세포에 블로킹 용액으로 1% BSA로 100ul첨가하여 37℃에서 60분간 반응시킨 다음 제거한 다음 100ul의 세척액(0.01M Phosphate buffered saline pH7.4 + 0.05% Tween 20)으로 세척하여 한 다음 가검혈청을 PBS에 단계별 희석하여100ul씩 분주하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 세포는 100ul의 PBS로 3회 세척하였다. 2차반응 콘주게이트(FITC conjugated anti-swine IgG)를 상기와 동일한 희석액으로 3,000-4,000배 희석하여 100ul씩 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 PBST 세척액으로 100ul씩 3회 세척하고 흡습지에 깨끗이 털어내어 잔류물이 없도록 한 다음 형광항체 현미경(Nicon)으로 형광발색여부를 확인한다(도 4).
실시예 8. 돼지써코바이러스(PCV2)의 캡시드(ORF2)단백질을 이용한 ELISA 검사법
돼지써코바이러스(PCV2) 캡시드(ORF2)단백질을 발현시킨 곤충세포에서 His-tag으로 정제한 캡시드(ORF2)단백질을 코팅완충액 (Carbonate buffer; pH9.6) 에 50배(0.240-0.230 g/㎕)로 희석하여 이뮤노플레이트(Nunc사)에 100㎕씩 분주한 다음 -4℃ 냉장고에서 하룻밤 (12시간) 동안 흡착한다. 냉장 보관된 플레이트를 세척액 (0.01M Phosphate buffered saline pH7.4 + 0.05% Tween 20)으로 200ul씩 3회 세척하고 흡습지에 깨끗이 털어내어 잔류물이 없도록 한다. 블로킹 용액 (0.01M Phosphate buffered saline + 5% skimmed milk)을 200ul씩 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 반응을 시킨다. 세척액 (0.01M Phosphate buffered saline + 0.05% Tween 20)으로 250ul씩 3회 세척하고 흡습지에 깨끗이 털어내어 잔류물이 없도록 한다.
항원 항체 반응을 위해서 시험 혈청과 표준 혈청을 희석액 (0.01M Phosphate buffered saline pH7.4 + 0.05% Tween 20 + 5% skimmed milk)에 200배 희석하여 100ul 씩 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 반응을 시킨다. 세척액 (0.01M Phosphate buffered saline + 0.05% Tween 20)으로 200ul씩 3회 세척하고 흡습지에 깨끗이 털어내어 잔류물이 없도록 한다. 콘주게이트 (Horseradish peroxidase conjugated anti-swine IgG)를 상기와 동일한 희석액으로 3,000-4,000배 희석하여 100ul씩 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 반응을 시킨다. 세척액 (0.01M Phosphate buffered saline + 0.05% Tween 20)으로 200ul씩 3회 세척하고 흡습지에 깨끗이 털어내어 잔류물이 없도록 한다. 발색제로서 TMB용액 (Thermo.사 1 component)을 100ul 씩 첨가한 후 상온에서 30분간 반응시킨다. 반응정지용액 용액을 100ul씩 첨가한 후 이뮤노플레이트 자동 판독기를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정한다.
실시예 9. ELISA 검사법 및 형광항체 검사법의 항체 검출 효율
야외 돼지에서 채혈한 혈청 134두에 대해서 돼지써코바이러스(PCV2)의 캡시드(ORF2)항체 검출에 대한 효율을 효소면역검사법 (ELISA)으로 비교한 결과는 표2 와 같다.
상대적인 민감도는 Synbiotics사의 진단키트와는 98.37 %, Ingezim사의 진단키트와는 98.6%의 민감도(sensitivity)를 나타내었다.
돼지 7두를 18주간 사육하면서 채혈한 123두의 혈청에 대해서 돼지써코바이러스(PCV2)의 캡시드(ORF2)항체 검출에 대한 효율을 간접형광항체볍(IFA)과 효소면역검사법 (ELISA)으로 조사한 결과는 도 6 및 표 3과 같다.
상대적인 민감도는 Synbiotics사의 진단키트와는 100%, 베큘로 발현 후 정제한 캡시드(ORF2)단백질을 이용한 ELISA검사방법과 비교한 민감도(sensitivity)는 99.18%,를 나타내었다.
Designated 　No . of tested
　
　　		 Synbiotics 　Ingezim
　		 Jeno
Positive Negative 　 Positive Negative
　 		Positive Negative
　
I- ELISA 		　
　
　		 123 11
　 		82 52
　 		95 39
Positive 131

121 (121) 10

81 (71) 50

94 (94) 37
Negative 3

2 1 (1)

1 　2 (2)

1 2 (2)
<110> REPUBLIC OF KOREA(Management : Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries. National Veterinary Research and Quarantine Service(NVRQS)) <120> Utilization method of porcine circovirus2 capsid protein <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 712 <212> DNA <213> Porcine circovirus <400> 1 ggatccatga cgtatccaag gaggcgttac cgcagaagaa gacaccgccc ccgcagccat 60 cttggccaga tcctccgccg ccgcccctgg ctcgtccacc cccgccaccg ctaccgttgg 120 agaaggaaaa atggcatctt caacacccgc ctctcccgca ccttcggata tactgtcaag 180 cgtaccacag tcacaacgcc ctcctgggcg gtggacatga tgagatttaa gcttgacgac 240 tttgttcccc cgggaggggg gaccaacaaa atctctatac cctttgaata ctacagaata 300 agaaaagtta aggttgaact ctggccctgc tcccccatca cccagggtga taggggagtg 360 ggctccactg ctgtcattct agatgataac tttgtaccaa aggccaatgc cctaacctat 420 gactcatatg taaactactc ctcccgccat acaatccccc aacccttctc ctaccactcc 480 cgttacttca cacccaaacc tgttctggac tccactattg attacttcca accaaataac 540 aaaaggaatc agctttggct gaggctacaa acctctagaa atgtggacca cgtaggcctc 600 ggcactgcgt tcgaaaacag taaatacgac caggactaca atatccgtgt aaccatgtat 660 gtacaattca gagaatttaa tcttaaagac ccccccactt aaccccctcg ag 712 <210> 2 <211> 233 <212> PRT <213> Porcine circovirus <400> 2 Gly Ser Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg 1 5 10 15 Pro Arg Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val 20 25 30 His Pro Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn 35 40 45 Thr Arg Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Arg Thr Thr Val 50 55 60 Thr Thr Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Lys Leu Asp Asp 65 70 75 80 Phe Val Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu 85 90 95 Tyr Tyr Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Leu Trp Pro Cys Ser Pro 100 105 110 Ile Thr Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp 115 120 125 Asp Asn Phe Val Pro Lys Ala Asn Ala Leu Thr Tyr Asp Ser Tyr Val 130 135 140 Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser 145 150 155 160 Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe 165 170 175 Gln Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ser 180 185 190 Arg Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Lys 195 200 205 Tyr Asp Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg 210 215 220 Glu Phe Asn Leu Lys Asp Pro Pro Thr 225 230

Claims (5)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 돼지써코바이러스2(porcine circovirus2: PCV2)의 캡시드 단백질을 항원으로 이용하여 형광항체검사법을 수행하는 단계를 포함하는, 돼지써코바이러스2 항체 검출 방법에 있어서,
    상기 돼지써코바이러스2(porcine circovirus2: PCV2)의 캡시드 단백질은 하기의 개열지도로 이루어진 pLEX-MCS PCV2 ORF2로 형질전환된 베로(Vero) 세포주로부터 생산된 것인, 돼지써코바이러스2 항체 검출 방법.
    Figure 112014122270003-pat00006
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호1의 염기서열에 의하여 코딩되는 것을 특징으로 하는 돼지써코바이러스2 항체 검출 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
KR1020110146641A 2011-12-30 2011-12-30 돼지써코바이러스２ 캡시드 단백질의 이용방법 KR101527861B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110146641A KR101527861B1 (ko) 2011-12-30 2011-12-30 돼지써코바이러스２ 캡시드 단백질의 이용방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110146641A KR101527861B1 (ko) 2011-12-30 2011-12-30 돼지써코바이러스２ 캡시드 단백질의 이용방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130077958A KR20130077958A (ko) 2013-07-10
KR101527861B1 true KR101527861B1 (ko) 2015-06-12

Family

ID=48991027

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020110146641A KR101527861B1 (ko) 2011-12-30 2011-12-30 돼지써코바이러스２ 캡시드 단백질의 이용방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101527861B1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103472225B (zh) * 2013-09-06 2015-02-25 青岛易邦生物工程有限公司 一种用于检测猪圆环病毒2型的荧光免疫试剂盒
CN109125719B (zh) * 2017-06-19 2022-06-14 普莱柯生物工程股份有限公司 一种含猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型抗原的免疫原性组合物及其应用
CN109799351A (zh) * 2018-09-19 2019-05-24 天津瑞普生物技术股份有限公司 猪圆环病毒2型双抗体夹心elisa试剂盒及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004250385A (ja) * 2003-02-20 2004-09-09 Nippon Inst For Biological Science ２型豚サーコウイルス特異的抗体検出用ｅｌｉｓａ抗原
KR20080087317A (ko) * 2007-03-26 2008-10-01 전남대학교산학협력단 돼지 써코 바이러스 진단용 단백질 칩 및 이를 이용한 돼지써코 바이러스 진단 방법
WO2009000459A1 (en) * 2007-06-22 2008-12-31 Ghent University Methods and compositions in the treatment of porcine circoviral infection

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004250385A (ja) * 2003-02-20 2004-09-09 Nippon Inst For Biological Science ２型豚サーコウイルス特異的抗体検出用ｅｌｉｓａ抗原
KR20080087317A (ko) * 2007-03-26 2008-10-01 전남대학교산학협력단 돼지 써코 바이러스 진단용 단백질 칩 및 이를 이용한 돼지써코 바이러스 진단 방법
WO2009000459A1 (en) * 2007-06-22 2008-12-31 Ghent University Methods and compositions in the treatment of porcine circoviral infection

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NCBI GenBank AB462383.1 (2008) *
NCBI GenBank AB462383.1 (2008)*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20130077958A (ko) 2013-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220251144A1 (en) Porcine circovirus type 3 immunogenic compositions and methods of making and using the same
Shang et al. Fine mapping of antigenic epitopes on capsid proteins of porcine circovirus, and antigenic phenotype of porcine circovirus type 2
AU2016219738B2 (en) Designer peptide-based PCV2 vaccine
Zhou et al. In vitro expression, monoclonal antibody and bioactivity for capsid protein of porcine circovirus type II without nuclear localization signal
Niagro et al. Beak and feather disease virus and porcine circovirus genomes: intermediates between the geminiviruses and plant circoviruses
US9897605B2 (en) Porcine torque teno virus vaccines and diagnosis
KR101320192B1 (ko) 토크 테노 바이러스(ｔｔｖ) 분리물 및 조성물
TW201225975A (en) Porcine circovirus type 2, immunogenic composition containing the same, test kit, and application thereof
US20100184016A1 (en) Methods and compositions in the treatment of porcine circoviral infection
Huang et al. Development of a blocking ELISA for detection of serum neutralizing antibodies against porcine circovirus type 2
JPH03504963A (ja) 仮性狂犬病感染に対する組換えサブユニットワクチンの調製
Guo et al. Production and immunogenicity of VP2 protein of porcine parvovirus expressed in Pichia pastoris
KR101527861B1 (ko) 돼지써코바이러스２ 캡시드 단백질의 이용방법
Sun et al. Identification of three PPV1 VP2 protein-specific B cell linear epitopes using monoclonal antibodies against baculovirus-expressed recombinant VP2 protein
US20150202282A1 (en) Pcv2 orf2 virus like particle with foreign amino acid insertion
JPH05292976A (ja) マレック病ウイルスワクチン
JP7213507B2 (ja) 組換え豚パルボウイルス抗原タンパク質及びその用途
CN105296507B (zh) 拉沙热病毒样颗粒、其制备方法与应用
CN109999191B (zh) 一种鸡毒支原体新型基因工程亚单位疫苗
US10067130B2 (en) Infectious genomic DNA clone and serological profile of torque teno sus virus 1 and 2
EP1723168B1 (en) Beak and feather disease virus sequences, compositions and vaccines and the use thereof in therapy, diagnosis and assays
RU2803427C1 (ru) Иммуногенные композиции для иммунизации свиней против цирковируса типа 3 и способы их получения и применения
WO2017120168A1 (en) Porcine parainfluenza virus compositions and related methods
Trible Characterization of the antibody response to vaccination and or infection with porcine circovirus type 2 and identification and characterization of a decoy epitope in the capsid protein
Lee et al. Expression of porcine circovirus type 2 capsid protein fused with partial polyhedrin using baculovirus

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant