KR101508421B1 - 생분해성 포스포아미드 링커에 의해 가교된 peg 하이드로젤 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생체 적합한 생분해성 포스포아미드 링커에 의해 가교된 PEG 하이드로젤 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 그리고 본 발명은 이러한 하이드로젤 및 상기 하이드로젤의 내부에 봉입된 약제학적 활성 성분을 포함하는 약물 전달체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
상세하게는 본 발명의 하이드로젤은, 에피클로로히드린이 PEG 말단에 도입된 프리폴리머(epichlorohydrin-modified PEG: EMP)의 글리시딜 기와 포스파닐 아미드(phosphonyl amide)의 아미드 기가 친핵성 치환반에 따라 가교됨을 특징으로 제조된다.

Description

생분해성 포스포아미드 링커에 의해 가교된 PEG 하이드로젤 및 이의 제조 방법{Crosslinked PEG Hydrogels with Degradable Phosphamide Linkers and the method for producing them}

본 발명은 생체 적합한 생분해성 포스포아미드 링커에 의해 가교된 PEG 하이드로젤 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 그리고 본 발명은 이러한 하이드로젤 및 상기 하이드로젤의 내부에 봉입된 약제학적 활성 성분을 포함하는 약물 전달체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

염증, 혈전증 및 조직 손상을 피하거나 줄이는 우수한 생체 적합성 뿐만 아니라 조직과 매우 유사한 높은 확산계수 및 탄성계수 때문에, 물-팽윤성 및 물-불용성 폴리머 물질로서 하이드로젤은 넓은 범위의 생의학 용도에서 관심을 끌고 있다. 골격으로서 이용되는 하이드로젤은 조직 및 물질 표면 사이의 접착제 또는 배리어의 유망한 대체자일 수 있고 조직 구조에 대한 적절한 구조의 온점함을 제공할 수 있고 뿐만 아니라 조직 및 배양물로의 약물 또는 단백질의 운송을 제어할 수 있다.

현재까지, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol: PEG)에 기초한 하이드로젤은 생의학 영역에서의 이의 넓은 용도와 함께, 구조 및 합성 방법에서 대부분 연구되고 있다. 불용성 네트워크의 생성을 위해, 말단 작용화된 PEG에 기초한, 많은 방법들이 개발되어 오고 있다. 이러한 예들은, "Click" 화학 및 열 에너지로부터 발생된 라디칼 개시, 레독스 반응 또는 개시자 분자의 광쪼개짐이 있다. PEG 하이드로벨의 제조를 위한 상기 이 방법들은 종종 많은 단계의 반응을 요구하고 하이드로젤의 골격 구조 및 기계적 강도의 쉬운 조절을 잠재적으로 제한하는 과정을 수행해야 해서, 만들어진 하이드로젤은 구조의 온전함이 부족하였다.

본 발명자들에 의해, 포스포에스테르 및 포스포아미드 결합으로 이뤄진 분해가능한 가교 지점을 가지는 가교된 물 팽윤성 그리고 다아민 작용화된 PEG 하이드로젤(CWMPH)의 합성이 보고되었다. [L. D. Zhang, Y. -I. Jeong, S. D. Zheng, S. I. Jang, H. S. Suh, D. H. Kang and I. Kim, Polym. Chem., DOI: 10.1039/c2py20755a]. 이 제조는 요구된 PEG의 사전 변경 없이 원-팟 공정으로 축합 가교 반응을 바로 이용하는 것이다. 얻어지 젤은 우수한 완전성을 보여주었고 높은 기계적 강도를 보여주었다. 그러나 이의 용도는 여전히 제한적이었다. 왜냐하면 사용된 가교제 시약의 독성 그리고 반응 중 생성된 염산 부산물 때문이다.

본 발명의 목적은, 용매 없이 제 자리의 가교 반응에 의해 만들어질 수 있는, 폴리머 네트워크의 발생을 위한 더욱 유망한 방법을 제공함에 있다. 한편, 본 발명의 방법은 해로운 물질 예컨대 염산 부산물은 완전히 억제할 수 있는 방법을 제공함에 있다. 본 발명의 하이드로젤은 네트워크로 분해성 프레임워크의 도입을 위한 친환경적 방법에 의해 제조된다. 본 발명은 생의학 용도에 적합한 하이드로젤을 제공함을 목적으로 한다.

본 발명은 상기 개진된 종래 기술의 문제점 및 필요성을 반영하여, 더욱 간단하고 더욱 친환경적인 방법으로, 분해성 포스포닐-아미드 프레임워크가 TAEPT(N,N',N''-tris(2-aminoethyl)phosphoric triamide)의 1차 아민기와 에피클로로하이드린-개질된 PEG의 디글리시딜 에테르와의 쉬운 가교 반응(도해 1 참조)을 통해 하이드로젤 구조 도입된 하이드로젤을 제공한다.

도해1

상기 도해1은 EMP 프리폴리머와 TAEPT로부터 가교된 PEG 포스포아미드 하이드로젤의 형성 과정을 보여준다.

본 발명에 있어서, 포스포닐-아미드 프레임워크는 디자인된 하이드로젤의 분해와 세포의 생리학에 있어서 매우 중요하고, 임의의 유기체에 필수적이다.

한편, 본 발명에 따라 제조된 하이드로젤의 기계적 강도, 물 팽윤성 및 분해성과 같은 특성은 TAEPT와 EMP의 몰비 및 분자량의 변화에 따라 제어 가능하다.

일 측면으로서, 본 발명은, 주쇄로서 하기 화학식 1의 다수의 중합체의 가교 지점(A₁)에 가교 분자로서 하기 화학식 2의 가교 지점(A₃)이 결합된 하이드로젤을 제공한다.

상기 화학식 1에서, n은 1 이상의 정수이고; A₁ 및 A₂는 다른 분자와 가교되는 가교지점이며, 상기 화학식 2에서, m은 1 내지 5의 정수, 바람직하게는 1이고, A₃는 다른 분자와 가교되는 가교지점이다. 여기서, 상기 주쇄 화합물의 가교 지점(A₂)이 다른 주쇄 화합물의 가교 지점(A₃)와 결합될 수 있다.

일 측면으로서, 상기 하이드로젤은, 말단에 글리시딜 기가 수식된 폴리에틸렌글리콜(PEG)의 글리시딜 기와, 아미드 말단을 가진 포스파닐 화합물의 아미드 기가 반응하여 공유 결합된 화합물이다.

상기 포스파닐 화합물은 하기 화학식 3로 표현되는, N,N',N''-트리스(2-아미노에틸)포스포릭 트리아미드(TAEPT)이다.

다른 측면으로서, 본 발명은, 상기 하이드로젤; 및 상기 하이드로젤의 내부에 봉입된 약제학적 활성 성분을 포함하는 약물 전달체를 제공한다.

상기 약제학적 활성 성분은 항암제, 항생제, 호르몬, 호르몬 길항제, 인터루킨, 인터페론, 성장 인자, 종양 괴사 인자, 엔도톡신, 림포톡시, 유로키나제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성제, 프로테아제 저해제, 알킬포스포콜린, 방사선 동위원소 표지 물질, 계면활성제, 심혈관계 약물, 위장관계 약물 및 신경계 약물로 이루어진 군으로부터 선택된다.

상기 항암제는 에피루비신(Epirubicin), 도세탁셀(Docetaxel), 젬시타빈(Gemcitabine), 파클리탁셀(Paclitaxel), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 택솔(taxol), 프로카르바진(procarbazine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen) 독소루비신(doxorubicin), 미토마이신(mitomycin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 트랜스플라티눔(transplatinum), 빈블라스틴(vinblastin) 및 메토트렉세이트(methotrexate)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다른 측면으로서, 상기 하이드로젤; 및 약제학적 활성 성분을 용매 내에서 혼합하는 단계를 포함하는 약제학적 활성 성분의 봉입 방법을 제공한다.

또 다른 측면으로서, 본 발명은, 에피클로로히드린이 PEG 말단에 도입된 프리폴리머(epichlorohydrin-modified PEG: EMP)을 준비하는 단계; 포스파닐 아미드(phosphonyl amide) 화합물을 준비하는 단계; 및 상기 EMP의 글리시딜 기와 상기 포스포닐 아미드 화합물의 아미드 기를 가교 시키는 단계를 포함하는, 하이드로젤의 제조 방법을 제공한다.

상기 EMP 화합물의 제조 방법은, 염기성 용액 내의 PEG에 에피클로로하이드린를 첨가시켜 혼합함을 포함한다.

상기 포스파닐 아미드(phosphonyl amide) 화합물은 N,N',N''-트리스(2-아미노에틸)포스포릭 트리아미드(TAEPT: N,N',N''-tris(2-aminoethyl)phosphoric triamide)이다.

상기 TAEPT 화합물의 제조 방법은, 제 1 유기 용매 내의 에탄-1,2-디아민(EDA) 및 POCl₃ 용액의 혼합 용액을 준비하고, 상기 혼합 용액 내의 용매를 제거한 후, 제 2 유기 용매 내 소듐 에톡사이드(EtONa) 용액과 혼합시킨 후 침전물을 제거하여 TAEPT 용액을 제공함을 포함한다.

상기 제 1 유기 용매는 벤젠, 톨루엔, 에틸벤젠, 또는 자일렌이다.

상기 제 2 유기 용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 또는 부탄올이다.

상기 제 1 유기 용매 내의 에탄-1,2-디아민(EDA) 및 POCl₃ 용액의 혼합 용액은, 5℃ 이하의 온도를 유지하면서, POCl₃ 를 첨가함을 특징으로 한다.

상기 EMP의 글리시딜 기와 상기 포스포닐 아미드 화합물의 아미드 기를 가교 시키는 단계는, 상기 TAEPT 용액에 추가 용매 없이 상기 EMP 화합물을 첨가시킴을 포함한다.

본 발명은 분해성 포스포아미드 프레임워크를 함유하는 PEG 하이드로젤 및 이의 제조를 위한 유망한 프로토콜을 제공한다. 한편, 해로운 물질 예컨대 염산의 생성을 효과적으로 억제한다. 기계적 강도, 팽윤 및 분해를 포함하는 수득된 하이드로젤의 특성은 EMP의 TAEPT의 비율 그리고 EMP의 분자량을 조절함에 의해 제어 가능하다. TAEPT에 대한 EMP의 더 낮은 비율 및 EMP의 높은 분자량은 더 낮은 기계적 강도, 더 높은 팽윤 정도 및 더 빠른 분해도를 가진 하이드로젤을 제공한다.

본 발명의 하이드로젤은 세포 독성 분석을 통해 293T 셀 라인에서 정상 세포에 대해 비독성임이 확인되었고 바이오물질로서 적용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 하이드로젤은, 암을 위한 임플란트로서 동시에 제공하면서 치료 효능을 개선하고 약물-관련 독성을 줄일 수 있는 효과적인 약 전달체로서 잠재력을 가지고 있다.

도 1은 CDCl₃에서 EMP 프리폴리머의 ¹H NMR 스펙트럼이다.
도 2는 CDCl₃에서 EMP 프리폴리머의 ¹³C NMR 스펙트럼이다.
도 3은 EMP 프리폴리머 및 PEG600의 FTIR 스펙트럼이다.
도 4는 TAEPT의 FAB 질량 스펙트럼이다.
도 5는 주파수에 의한 저장(G') 및 손실 계수(G'')를 가진, 40℃에서 측정된 (a) Gel2-A, (b) Gel2-B, (c) Gel2-C 및 (d) Gel4-B의 유동학적 특성이다.
도 6은 (a) 팽윤 비율 및 (b) 제조된 하이드로젤의 분해 성능; (c) 시험관 내 하이드로젤(Gel1-B, Gel2-B, Gel3-B 및 Gel4-B)의 시스템에서 293T 셀의 생존능력 분석이다.
도 7은, (a) 선천성 손쥐(murine) 종양 모델에서 DOX/Gel2-B의 우수한 치료 효능을 반영하는 종양 사진; (b) 상이한 치료제로 종양을 가진 마우스에서 종양 성장 억제를 보여준다.
도 8은 세 종류의 치료제를 받은 후 마우스의 몸무게 변화이다.

1. 실시예

(1) 물질

분자량 (200, 300, 400 및 600)의 PEG, 포스포러스 옥시클로라이드(POCl₃, 99%), 프탈이미드-포타슘(99%), 에탄-1,2-디아민(EDA, 99%), 트리에틸아민(TEA), 에피클로로하이드린 및 독소루브리신 히디로클로라이드(DOX)를 Sigma Aldrich로부터 구입하였고, 추가 정제 없이 직접 사용하였다. 톨루엔, 헥산, 에탄올, 테트라히드로푸란(THF), 디클로로메탄(CH₂Cl₂), 및 아세톤을 사용 전 증류에 의해 정제하였다.

(2) 특성 분석

퓨리어 트랜스폼 적외선(Fourier transform Infrared: FT-IR) 분석은 4000-500 cm^-1에서 Shimadzu Prestige-21 IR 스펙트로미터에 기록되었다. 핵 자기 공명(Nuclear magnetic resonance: NMR) 스펙트럼은 용매로서 CDCl₃로 Bruker Avance-400 MHz 스펙트로미터에 기록하였다. 빠른 원자 충돌 질량(Fast atom bombardment mass: FAB-MS) 스펙트럼은 업데이트된 MS-9 VG 또는 상업적 FAB 소스를 가진 ZAB-HF (VG Analytical U.K.) 질량 스펙트로미터를 사용하여 얻었다. 8 kV 전위로 가속되고 추출된, 8 keV의 제논 원자의 주 빔(primary beam)에 의해 이온은 생성되었다. 하이드로젤의 기계적 특성을 조사하는 수단으로서, 저장 계수(G') 및 손실 계수(G'')를 40℃, 1-1000 rad/s의 주파수 및 일정한 스트레인(2%)에서의 20mm 직경 아크릴 상판, 평행 플레이트의 회전 레오미터(rotational rheometer)(Physica Rheometers UDS200, Anton Paar Ltd.)로 측정하였다. 측정을 위해, 20mm 직경 및 1mm 두께의 건조된 하이드로젤 디스크를 제조하였고, 그 다음에 이들은 40℃에서 10mM 포스페이트 버퍼 염수(PBS; pH 7.4)에서 팽윤되었다. 하이드로젤 표면으로부터 물을 측정 전에 주의깊게 닦았다. 하이드로젤이 다루기에 불충분한 물리적 온전함을 가질때 까지 G'를 규칙적 간격으로 측정하였다.

(3) EMP 프리폴리머의 합성[도해 2의 (1) 참조]

도해 2

삼목 500mL 플라스크에 소듐 히드록사이드 펠렛(24.0 g, 0.6 mol), 물(1.5 g), 및 PEG200(20.0 g, 0.1 mol)의 혼합물을 넣고, 40℃ 미만의 온도에서 기계적 교반기에 의해 강하게 교반하여 에멀젼을 형성하였다. 계속된 교반 하에, 에피클로로히드린(54.0 g, 0.6 mol)을 점적 방식으로 첨가하였고 그 다음에 상기 혼합물을 추가 2시간 동안 40℃에서 교반하였다. 이 혼합물을 여과시켰고 디클로로메탄(2x40 mL)으로 두 번 세척하였다. 상기 결합된 유기 용액을 마그네슘 설페이트로 건조시켰고 진공에서 농축시켜 정제 없이 생성물을 수득하였다. 다른 EMP를 위와 유사한 방법에 따라 합성하였다.

2a: 수율: 95%. ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 3.62-3.68 (m 2H), 3.40-3.60 (m, 18.10H), 3.28-3.35 (m 2H), 2.98-3.03 (m 2H), 2.60-2.65 (t 2H), 2.40-2.49 (m 2H); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz): δ 72.11, 71.02, 50.05, 44.23; FT-IR (KBr) 2875, 1986, 1652, 1461, 1356, 1298, 1254, 1123, 1039, 943, 915, 855, 762 cm^-1.

2b: 수율: 96%. ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 3.63-3.69 (m 2H), 3.35-3.60 (m, 28.46H), 3.28-3.35 (m 2H), 3.01-3.04 (m 2H), 2.62-2.68 (t 2H), 2.48-2.51 (m 2H); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz): δ 72.11, 71.02, 50.05, 44.23; FT-IR (KBr) 2875, 1985, 1651, 1463, 1354, 1299, 1253, 1124, 1040, 942, 915, 856, 762 cm^-1.

2c: 수율: 93%. ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 3.65-3.71 (m 2H), 3.39-3.62 (m, 39.04H), 3.30-3.35 (m 2H), 3.01-3.08 (m 2H), 2.65-2.68 (t 2H), 2.48-2.51 (m 2H); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz): δ 72.11, 71.02, 50.05, 44.23; FT-IR (KBr) 2874, 1987, 1653, 1462, 1354, 1299, 1253, 1123, 1041, 942, 915, 854, 762 cm^-1.

2d: 수율: 95%. ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 3.62-3.68 (m 2H), 3.36-3.56 (m, 56.24H), 3.25-3.32 (m 2H), 2.95-3.04 (m 2H), 2.58-2.67 (t 2H), 2.42-2.50 (m 2H); ¹³C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 72.11, 71.02, 50.05, 44.23; FT-IR (KBr) 2876, 1987, 1653, 1463, 1354, 1300, 1253, 1124, 1041, 942, 915, 857, 762 cm^-1.

(4) TAEPT 의 합성[도해 2의 (2)가 참조된다 ]

톨루엔(20 mL) 내 EDA(5.34 mL, 0.08 mol)에, 톨루엔(30 mL) 내 POCl₃(1.86 mL, 0.02 mol)를 0.8mL/분의 속도로 첨가하였고, 5℃ 이하의 온도를 유지하면서 강하게 교반시켰다. 60℃에서 2시간 동안 교반 후, 톨루엔을 경사법에 의해 제거하였고, 후에 80mL의 에탄올에 용해된 4.08g(0.06 mol) 소듐 에톡사이드(EtONa)의 용액을 첨가하였다. 60℃에서 또 다른 3시간 동안의 교반 후, 형성된 NaCl 침전물을 여과시켜 80% 수율의 노란 빛깔의 갈색 액체 생성물을 제공하였다.

FT-IR (cm^-1) 672 (P-N-C), 1044 (P-N-C), 1186 (P=O), 3344 (N-H); Fab-MS m/z (%) 225.39 [M + H]⁺.

(5) 하이드로젤의 제조

표 1에서와 같이, 용매 없이(에탄올-), EMP와 TAEPT의 미리 정해진 양을 균일하게 혼합시켰고 수득된 투명 용액을 폴리테트라플루오로에틸렌 몰드로 캐스팅하였다. 10시간 동안 50℃에서 경화 후 하이드로젤을 수득하였다.

	TAEPT	TAEPT	TAEPT
2a	Gel1-A	Gel1-B	Gel1-C
2b	Gel2-A	Gel2-B	Gel2-C
2c	Gel3-A	Gel3-B	Gel3-C
2d	Gel4-A	Gel4-B	Gel4-C

Gel은 상이한 EMP와 TAEPT를 혼합함에 의해 형성된 하이드로젤을 의미한다; 예를 들어 Gel2-B는 2b와 TAEPT의 하이드로젤을 가리킨다. 숫자 다음의 대문자는 EMP와 TAEPTdml 몰 비를 가리킨다. A는 10:3이고 B는 10:7이며, C는 10:11이다.

(6) 평형 팽윤 비율의 측정(Measurement of equilibrium swelling ratios: ESR )

37℃의 물에서 하이드로젤의 팽윤 시험을 수행하였다. ESR을 시험하기 위해 중량법을 사용하였다. 2일 동안 특정 용매에서 샘플을 침지시킨 후, 상기 샘플을 제거하였고, 젖은 필터 종이로 닦아 표면 상의 여분의 물을 제거하였고 중량을 쟀다. 5번 측정의 평균을 각 샘플에 대해 취하였고, ESR를 아래와 같이 계산하였다: ESR = Ws/Wd, 여기서 Ws는 각 온도에서 팽윤된 샘플에서 물의 중량(습윤 중량-건조 중량)이고 Wd는 샘플의 건조 중량이다.

(7) 분해 시험

하이드로젤을 pH 7.4의 PBS(1 M, 20 mL)에 침지시켰고, 5% CO₂ 하에 37℃에서 배양시켰다. 하이드로젤 무게의 변화를 측정하였고 분해 전의 이의 초기 값에 표준화 하였다. 무게 손실(%) = (Wt/Wd) x 100%, 여기서 Wt는 특정 시간에서 분해된 중량이다. 모든 분해 시험을 3회 수행하였다. 모든 실험은 살균 조건에서 수행하여서 박테리아 및 곰팡이 오염을 차단하였다.

(8) 시험관 내 세포독성 시험

MTT(3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드; 티아졸일 블루) 분석을 문헌[L. D. Zhang, Y. ?I. Jeong, S. D. Zheng, S. I. Jang, H. S. Suh, D. H. Kang and I. Kim, Polym. Chem., DOI: 10.1039/c2py20755a]에 따라 수행하였다. 독성 생성물 또는 해로운 반응을 탐지하기 위해, 시험관 내 세포 독성 시험을 수행하였다. 살아있는 세포로 배양되는 경우 MTT 시약은 진한 청색 포르마잔 크리스탈을 생성하는 노란색 테트라졸리움 염이다. 그래서 MTT의 포르마잔으로의 환원 수준은 세포 대사의 수준을 반영할 수 있다. ISO10993-5 시험 방법으로서 표준으로, 제조된 하이드로젤(Gel1-B, Gel2-B, Gel3-B 및 Gel4-B, 참조 표 1)를 15분 동안 몹시 압축된 스팀으로 살균하였고 각각 추출 배지에 두었고 24시간 동안 37℃에서 담가 두었다(steeped). 그 다음에, 이 하이드로젤을 제거하였고 추출물을 세포 독성의 평가를 위해 저장하였다.

대조군과의 비교에 있어서, 인간 배아 신장 293T 셀을 추출 배지(RPMI1640, 10% 송아지 혈청)에서 배양하였다. 습윤 분위기에서 배양을 37℃에서 유지하였다. 세포가 80% 합류에 도달되는 경우, 세포들을 1-mM 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)를 함유하는 0.25% 트립신으로 트립신화하였다.

293T 세포를 웰 당 4×10³ 세포의 밀도에서 96-웰 플레이트의 웰에서 시딩하였다. 24시간 동안 배양 후, 배양 배지를 제거하였고 120μL의 제조된 추출 배지로 교체하였다. 또 다른 48시간 배양 후, 각 웰을 가져왔고, MTT(20μL) 용액을 각 웰에 더했다. 37℃에서 4시간 동안 배양된 후, 150μL의 디메틸 술폭사이드를 첨가하여 포르마잔 크리스탈을 용해시켰다. 쉐이커에 의해 용해된 용액을 약 10분 와류시켰다. 포르마잔 용액의 광학 밀도를 570nm에서 ELISA 리더(Multiscan MK3, Labsystem Co. Finland)에 의해 탐지하였다. 참조 목적으로, 각각 동일한 시딩 조건 하에 셀을 깨끗한 배양 배지에서 시딩하였다(음성 대조군).

(9) DOX의 Gel2-B로의 로딩

항암 약물(DOX)를 문헌[Z. X. Liu, L. Wang, C. Y. Bao, X. X. Li, L. Cao, K. Dai and L. Y. Zhu, Biomacromolecules, 2011, 12, 2389-2395]에 따라 Gel2-B 네트워크로 제자리에 로딩하였다. 간단히, 약물(DOX, 20 mg)을 THF로 초기에 용해시켰고 그 다음에 에피클로로하이드린-개질된 PEG와 혼합시켰다(EMP; 사용된 PEG의 분자량=300)(500 mg). THF와 같은 용매를 감압 하에서 제거하여 EMP와 약물의 혼합물을 얻었다. 그 다음에 TAEPT(132 mg)를 첨가하였고 10시간 동안 50℃에서 가교 후 DOX-함유 Gel2-B을 형성하였다. DOX-함유 Gel2-B을 쥐에 이식한 후, 샘플을 3mm 직경 디스크로 절단하였고(10 mg), 0.3 mg의 약물이 함듀되었다.

(10) 마우스

건강한, 암컷 BALb/C 마우스(6-8 주 나이 및 20-25 g)을 Orient Bio Co. Ltd.(대한민국)로부터 구입하였다. 동물 실험의 모든 절차를 승인된 프로토콜에 따라 그리고 실험 동물의 적절한 사용 및 주의에 대한 NIH 가이드라인에 따라 수행하였다.

(11) 항암 활성

20 μl의 CT-26 마우스 대장 암종의 5×10⁵ 셀을 BALb/C 마우스 피하 내로 주의깊게 접종하였다. 종양 접종 후 정해진 날 후, 무게 kg 당 30mg Gel2-B의 용량으로 빈 Gel2-B를 이식하면서, 치료제(순수한 DOX, DOX-로딩된 Gel2-B 및 빈 Gel2-B)을 주입하거나 무게 kg 당 6 mg DOX의 양을 종양 주위에 피하 내로 이식하였다. 종양 크기의 판단을 위해, 각 개별 종양 크기를 칼리퍼로 측정하였고, 종용 크기를 다음 식으로 계산하였다: 종양 크기(mm³) = (폭 x 길이²)/2

(12) 통계 분석

모든 실험의 결과는 독립된 실험에서 수행된 3번의 샘플의 평균 값(±SD)이다. 다중 샘플 사이의 비교는 단일 팩터 분석의 변화(ANOVA)로 수행하였다. 2개의 샘플 사이의 비교를 양측 스튜던츠 t-검정(two-tailed Student’s t-test)으로 수행하였고, 두 데이터 세트 사이의 차이를 p< 0.005 인 경우에 큰 것으로 하였다.

2. 결과

(1) EMP 프리폴리머 및 TAEPT 의 합성

본 발명에서, 용매 없이 상업적으로 입수 가능한 에피클로로하이드린에 의해 PEG의 말단을 개질시켰다. 이에 대해서는 논문 [S. P. Zustiak and J. B. Leach, Biomacromolecules, 2010, 11, 1348-1357]이 참조된다. 아래 도해 2에서 보는 바와 같이, 어떤 용매 및 상전환 촉매 없이 90% 수산화나트륨 수용액 내에서 PEG와 에피클로로하이드린 사이의 반응을 진행시켜 성공적으로 그리고 매우 효율적으로 EMP를 제조하였다.

도해 2

이와 같이 제조된 프리폴리머 EMP를 분리 후 가교 반응을 위해 직접 사용하였다. EMP의 구조적 특성 분석은 여러 기술로 신중히 수행하였다.

도 1은 ¹H-NMR 스펙트럼은 모든 제조된 EMP 프리폴리머는 메틸렌 및 메틴과 같은 특별한 작용기의 유사한 화학적 시프트를 보여준다. δ 3.62-3.68 (m, 2H) 및 3.28-3.35 (m, 2H)에서 2a의 특징적 피크가 메틸렌 하이드로젠(C₁ 및 C₂)에 할당된다. δ 2.98-3.03 (m, 2H)에서 피크들은 메틴 하이드로젠(b)의 신호를 나타내고, 한편, δ 2.60-2.65 (t, 2H) 및 2.40-2.49 (m, 2H)에서는 메틸렌 하이드로젠(a₁ 및 a₂)의 존재 때문이다. 상기 결과들은, 에피클로로하이드린이 화학적으로 PEG 사슬의 두 말단에 연결됨을 의미한다. 추가 입증 ¹³C-NMR 및 FT-IR 스펙트럼에서 확인될 수 있으며, 여기서 새로운 특징적 신호들은 도 2 및 도 3에서 각각 2a로부터 2d로 타겟 EMP에서 명백히 관찰된다. 예를 들어, PEG200의 2a로의 변경 후, ¹³C-NMR 스펙트럼에서 δ 50.05 및 44.23에서의 새로운 신호들 및 FT-IR 스펙트럼에서 915 및 762 cm^-1에서 새로운 특징적 흡수 피크가 관찰된다.

TAEPT의 합성에 있어서, 온도는 매우 중요하고 수율 및 구조에 영향을 끼친다. 원하는 생성물을 수득하기 위해, POCl₃의 첨가 중 5℃ 이하의 반응 온도를 유지하는 것이 요구된다. 왜냐하면, 더 높은 온도는 쉽게 TAEPT의 다이머 또는 트리머의 형성을 이끌기 때문이다. 본 발명에서, TAEPT는 FAB-MS m/z (%) 225.39 [M + H]⁺의 FAB-MS 스펙트럼(도 4)에 의해 입증된 단량체로서 합성하였다. 또한 TAEPT의 구조를 특별한 프레임워크 예컨대 각각 (P-N-C) 672, (P-N-C) 1044, (P=O) 1186 및 (N-H) 3344 cm^{- 1}를 보여주기 위한 FT-IR 스펙트럼에 의해 분석하였다. 이 스펙트럼은 본원에 도시되지 않음.

(2) 하이드로젤의 제조 및 특성

액체 상태 EMP 전구체와 TAEPT는 매우 높은 활성도를 가지는데, 이는 각각 구조 내의 에폭시 및 아민 작용기 때문이고, 따라서 적절한 온도 하에서 용매 없이 가교 반응을 위해 사용될 수 있었다. 상기 에폭시 고리는 친핵성 치환 반응을 통해 제 1 아민 기에 의해 화학적으로 개환될 수 있었다. 따라서 상기 하이드로젤은 표 1에 열거된 바와 같이 EMP와 TAEPT의 단순 혼합에 의해 형성될 수 있었고 그 다음에 상기 혼합물을 10시간 동안 50℃에서 경화시켰다. 불투명한 혼합물은 젤의 형성을 가리키는 투명한 콜로이드가 되었다.

물리적 특성 예컨대 팽윤비 및 기계적 특성은 가교 밀도에 크게 영향 받았다. 일반적으로 높은 가교 밀도는 우수한 기계적 강도 및 낮은 팽윤비를 제공한다. 이러한 가교 밀도는 크게 반응물질들 사이의 비율에 크게 의존한다. 본 발명에서는 주파수에 따른 이의 저장(G') 및 손실 탄성률(G'')를 시험함에 의해 하이드로젤의 기계적 특성을 입증하였다. 도 5(a, b 및 c)에 도시된 바와 같이, EMP의 TAEPT에 대한 비율이 감소함에 따라, G' 및 G'' 값 모두를 점차 접근되고 감소되었고, 이는 형성된 하이드로젤의 가교 밀도는 점차 감소됨을 가리켰다. PEG의 증가된 분자량은 또한 EMP의 TAEPT의 비율이 하이드로젤의 제조 중 고정된 상황에서, 도 5(c, d)에서 보는 바와 같이 G' 및 G''에 의해 확인된 낮은 가교 밀도를 가지는 하이드로젤을 형성하도록 하였다. 형성된 하이드로젤의 팽윤비는 중량법(gravimetric method)에 의해 입증하였다. 그 결과는 도 6a에 도시되어 있다. 도 6a는 EMP의 TAEPT에 대한 비율이 감소함에 따라 팽윤력이 증가되었음을 보여준다. 동시에, 또한 EMP 프리폴리머의 분자량은 팽윤력을 결정하는데 있어서 결정적 파라미터였다. 더 높은 분자량은 더 높은 팽윤비를 가진 하이드로젤을 제공하였다. 이 결과는 EMP의 TAEPT에 대한 더 낮은 비율 및 EMP 프리폴리머의 더 높은 분자량은 더 낮은 기계적 강도 및 더 높은 팽윤도를 가진 하이드로젤을 유도함을 입증하였고, 나아가 낮은 분자량 그리고 혼합물 내의 높은 백분율 조성의 EMP는 형성된 하이드로젤의 가교 밀도를 증가시키는데 좋음을 암시한다.

종래에는[L. D. Zhang, Y. -I. Jeong, S. D. Zheng, S. I. Jang, H. S. Suh, D. H. Kang and I. Kim, Polym. Chem., DOI: 10.1039/c2py20755a], 제조된 하이드로젤은 pH 민감성 분해 과정을 나타내는 여러 pH 값에서 가수분해에 의해 포스포에스테르 및 포스포아미드 프레임워크를 브레이킹함에 의해 분해될 수 있었다. 본 발명에서도, 구조에 있어서 포스포아미드 링커와 같은 유사한 프레임워크를 가진 하이드로젤은 또한 유사한 가수분해에 의해 분해될 수 있다. 하이드로젤의 가수분해 실험은 pH 7.4 조건에서 수행하였고 분해는 중량 분석에 의해 확인하였다. 도 6b에 도시된 바와 같이, 분해 속도는 가교도의 변화와 선형적이었다. 즉, 더 높은 팽윤도를 가진 하이드로젤은 더 빠른 속도로 분해될 수 있었다. 예를 들어, Gel2-C는 시험된 샘플 중에 가장 빠른 팽윤비를 가지고, 이는 또한 가장 빠른 분해를 보여주었다. 유사하게, Gel2-A는 가장 낮은 팽윤비 때문에 가장 느린 분해를 보여주었다.

Gel2-C의 경우에, 혼합에 있어서 높은 TAEPT 함량 때문에 가교 반응은 주로 EMP의 글리시딜 에테르와 TAEPT의 1차 아민(-NH₂) 사이에서 발생되었고, 따라서, Gel2-C의 포스포아미드 프레임워크를 주 가교 지점으로 만들었다. 포스포아미드가 P-N 결합의 가수분해를 통해 분해 가능한 프레임워크이기 때문에, 많은 포스포아미드 프레임워크를 함유하는 Gel2-C는 수용액 내에서 용해가능한 분자로 쉽게 분해될 수 있을 것이다.

하이드로젤이 Gel2-A(EMP:TAEPT=10:3)와 같은 EMP의 TAEPT에 대한 높은 분자량 비율로 제조되는 경우, EMP의 글리시딜 에테르는 TAEPT의 1차 아민 기에 의해 초기에 개환되었고, EMP의 글리시딜 에테르와 개환된 글리시딜 에테르(C-OH)로부터 발생된 히드록실 사이에 주로 발생된 가교 과정이 뒤따랐고, 따라서, 이는 낮은 분해능을 가진 하이드로젤을 제공하였다. 하이드로젤의 낮은 가교 밀도는 높은 팽윤도 및 더 빠른 분해를 제공한다. 그래서, EMP의 분자량을 높이고 EMP의 TAEPT에 대한 비율을 줄임은 제조된 하이드로젤의 가교 밀도를 줄임에 의해 높은 팽윤도 및 빠른 분해도를 가진 하이드로젤을 만들 수 있었다.

(3) 시험관 내 새포독성 분석

약 전달 시스템을 위한 생물학적 임플란트 또는 장치로서 사용될 수 있고 비독성인, 종래의 하이드로젤과 비교하여 유사한 구조 또는 동일한 조성을 가지고 있기 때문에, 본 발명의 하이드로젤은 비독성이다. 이에 대해서는 논문 [L. D. Zhang, Y. -I. Jeong, S. D. Zheng, S. I. Jang, H. S. Suh, D. H. Kang and I. Kim, Polym. Chem., DOI: 10.1039/c2py20755a; 및 Z. X. Liu, L. Wang, C. Y. Bao, X. X. Li, L. Cao, K. Dai and L. Y. Zhu, Biomacromolecules, 2011, 12, 2389-2395]이 참조된다.

세포 독성의 실제 입증을 위해, 하이드로젤(Gel1-B, Gel2-B, Gel3-B 및 Gel4-B)를 시험관 내 표준 MTT 과장을 통해 시험될 모델 젤로서 사용하였고 293T 셀 라인을 이 시스템에서 사용하였다. 560 nm에서 포르마잔 크리스탈의 흡수는 살아 있는 세포의 수를 반영할 수 있었다. 합리적인 선형 범위 내에서 흡수와 세포 수 사이의 직접 비율 관계를 보여주었다. 세포 생존능 백분율은 상응하는 대조군의 양에 의해 나눠진 하이드로젤 추출 그룹의 평균량이었고, 단일 세포 군은 각 실험에서 대조군으로서 사용되었고 이의 흡수는 6개의 평행 실험 사이에서 유사하였다. 도 6c의 결과는 하이드로젤은 293T 셀에 대한 심각한 세포파괴는 없음을 보여주고, 생물의학 용도를 위한 잠재적 물질일 수 있음을 보여준다.

(4) 생체 내 항암 효능의 판단

화학 요법 및 면역 요법의 조합으로 구성되는 암 치료는 암 치료요법의 효능을 추가로 개선하기 위해 강하게 이용되고 있다. 최근에, 암 약물을 함유하는 하이드로젤은 임의의 관련 부작용을 부수적으로 완화시키면서 암 부위에 항암 약물의 치료적 효능을 증대시키기 위한 시도에서 사용되고 있다. 천연 바이오폴리머 중 가장 유명한 PEG는 의학 및 약제학적 용도에서 현재 큰 관심을 받고 있다. PEG-기재 하이드로젤은 상당한 관심을 끌고 있는데, 이는 다목적 생약(biomedicine) 용도에 바람직할 것이며, 왜냐하면 PEG는 생체 적합성을 가지고 있고 혈액 및 세포 단백질과의 면역 반응을 피하기 때문이다.

PEG 기재 하이드로젤은 이의 생체적합성 및 생분해성 때문에 항암 약물 전달 시스템의 개발을 위한 유망한 의학적 디바이스이다. 종양 내 주사를 통해 약물의 치효 효과를 향상시키기 위해, 우두 바이러스 백신을 가진 하이드로젤은 화학-면역요법을 위해 사용되었고 이 생분해성 하이드로젤 시스템은 성공적 화학-면역 요법 프로토콜을 위한 효과적인 항암 약물 전달 시스템임을 보여준다.

본 발명에서, 이 생의학 용도를 위한 하이드로젤의 잠재력을 입증하기 위해, 새롭게 합성된 하이드로젤(Gel2-B)을 선택하여 이의 조절 능력 및 암 치료를 위한 생체 내 DOX 전달의 효능을 조사하였다. DOX는 이전에 보고된 방법에 따라 젤 제조 중 Gel2-B 내로 정량화로 포함되었다. 본 발명자는 CT-26 종양을 가진 누드 마우스에서 DOX-통합된 Gel2-B (DOX/Gel2-B)의 항암 능력을 평가하였다. 음성 대조군으로서, 마우스의 군(n=5)에 DOX를 주입하거나 빈 Gel2-B를 이식했다. 종양 접종 후 종양 크기를 60일 동안 모니터하였고 60일째에 마우스에 생성된 종양의 이미지를 캡쳐했다. 도 7(a 및 b)에 도시된 바와 같이, 순수한 DOX 및 빈 Gel2-B로 치료된 군에서의 종양 효과에 비해, DOX/Gel2-B의 조합은 가장 높은 종양 억제를 보였다.

Gel2-B는 또한 마우스에 피하 주입 후 생체 내 분해를 나타냈지만, 시험관에서보다 분해 속도는 훨씬 더 느렸다. 흥미롭게도, 마우스는 심각한 부작용, 예컨대 퍼스 및 염증을 보이지 않았고 하이드로젤의 이식 후 건강한 모습을 유지했다. 치료제의 독성을 확인하려는 노력에서, 본 발명자들은 도 8에서 기재된 DOX/Gel2-B, Gel2-B 및 순수한 DOX 제형으로 치료된 마우스의 무게의 변화를 평가하였다. DOX 또는 Gel2-B만의 군의 결과에 비해서, DOX/Gel2-B는 치료된 마우스의 무게에 명백히 영향을 주지 않았다. 치료된 마우스의 무게의 약간의 증가는 60일 치료 후에 나타났다. 이 결과들은 암 약물과의 조합에 의해 임의의 유발된 심각한 부작용을 만들지 않을 수 있음을 보여준다.

5×10⁵ CT-26 셀을 마우스 피아헤 접종하였다. 화살표는 CT-26 셀 접종 후 화학 치료제의 주입 일을 가리킨다. 제시된 데이터는 세 번 수행된 실험 중 대표적 하나의 실험이고 5마리의 마우스 ± S.D.의 평균을 나타낸다.

Claims (17)

1. 주쇄로서 하기 화학식 1로 표시되는 중합체의 가교 지점(A₁)에 하기 화학식 2로 표시되는 가교 분자의 가교 지점(A₃) 또는 화학식 1로 표시되는 다른 중합체의 가교 지점(A₂)이 결합되고, 하기 화학식 1의 화합물의 가교지점(A₂) 지점은 화학식 1의 다른 화합물의 가교지점(A₁)과 가교된 화합물을 포함하는, 하이드로젤:
   

   

   화학식 1
   

   

   화학식 2
   상기 화학식 1에서, n은 1 이상의 정수이고; A₁ 및 A₂는 다른 분자와 가교되는 가교지점이며,
   상기 화학식 2에서, m은 1 내지 5의 정수이고, A₃는 다른 분자와 가교되는 가교지점이다.
   
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서,
   상기 화학식 2의 m은 1인, 하이드로젤.
   
4. 제 1항에 있어서,
   상기 하이드로젤은, 말단에 글리시딜 기가 수식된 폴리에틸렌글리콜(PEG)의 글리시딜 기와, 아미드 말단을 가진 포스파닐 화합물의 아미드 기가 반응하여 공유 결합된 화합물인, 하이드로젤.
   
5. 제 4항에 있어서,
   상기 포스파닐 화합물은 하기 화학식 3로 표현되는, N, N' , N''-트리스(2-아미노에틸)포스포릭 트리아미드(TAEPT)인, 하이드로젤:
   

   

   화학식3.
   
6. 제 1항 및 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 하이드로젤; 및 상기 하이드로젤의 내부에 봉입된 약제학적 활성 성분을 포함하는 약물 전달체로서, 상기 약제학적 활성 성분은 도세탁셀(Docetaxel)인, 약물 전달체.
   
7. 삭제
8. 삭제
9. 제 1항 및 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 하이드로젤; 및 약제학적 활성 성분을 용매 내에서 혼합하는 단계를 포함하는 약제학적 활성 성분의 봉입 방법으로서, 상기 약제학적 활성 성분은 도세탁셀(Docetaxel)인, 약제학적 활성 성분의 봉입 방법.
   
10. 에피클로로히드린이 PEG 말단에 도입된 프리폴리머(epichlorohydrin-modified PEG: EMP)을 준비하는 단계;
    포스파닐 아미드(phosphonyl amide) 화합물을 준비하는 단계;
    상기 EMP의 글리시딜 기와 상기 포스포닐 아미드 화합물의 아미드 기를 친핵성 치환반응에 따라 가교 시키는 단계를 포함하고,
    상기 포스파닐 아미드 화합물은 N,N',N''-트리스(2-아미노에틸)포스포릭 트리아미드(TAEPT: N,N',N''-tris(2-aminoethyl)phosphoric triamide)인,
    하이드로젤의 제조 방법.
    
11. 제 10항에 있어서,
    상기 EMP 화합물의 제조 방법은, 염기성 용액 내의 PEG에 에피클로로하이드린를 첨가시켜 혼합함을 포함하는,
    하이드로젤의 제조 방법.
    
12. 삭제
13. 제 10항에 있어서,
    상기 TAEPT 화합물의 제조 방법은, 제 1 유기 용매 내의 에탄-1,2-디아민(EDA) 및 POCl₃ 용액의 혼합 용액을 준비하고, 상기 혼합 용액 내의 용매를 제거한 후, 제 2 유기 용매 내 소듐 에톡사이드(EtONa) 용액과 혼합시킨 후 침전물을 제거하여 TAEPT 용액을 제공함을 포함하는,
    하이드로젤의 제조 방법.
    
14. 제 13항에 있어서,
    상기 제 1 유기 용매는 벤젠, 톨루엔, 에틸벤젠, 또는 자일렌인,
    하이드로젤의 제조 방법.
    
15. 제 13항에 있어서,
    상기 제 2 유기 용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 또는 부탄올인,
    하이드로젤의 제조 방법.
    
16. 제 14항에 있어서,
    제 1 유기 용매 내의 에탄-1,2-디아민(EDA) 및 POCl₃ 용액의 혼합 용액은, 5℃ 이하의 온도를 유지하면서, POCl₃ 를 첨가함에 의해 제조함을 특징으로 하는,
    하이드로젤의 제조 방법.
    
17. 제 13항에 있어서,
    상기 EMP의 글리시딜 기와 상기 포스포닐 아미드 화합물의 아미드 기를 가교 시키는 단계는, 상기 TAEPT 용액에 추가 용매 없이 상기 EMP 화합물을 첨가시킴을 포함함을 특징으로 하는,
    하이드로젤의 제조 방법.

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