KR101505902B1 - 사슴 품종 판별용 올리고뉴클레오티드 분자를 이용한 녹용품종 판별 방법 및 녹용 품종 판별용 ｄｎａ 칩 - Google Patents

사슴 품종 판별용 올리고뉴클레오티드 분자를 이용한 녹용품종 판별 방법 및 녹용 품종 판별용 ｄｎａ 칩 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사슴 품종 판별용 올리고뉴클레오티드 분자를 이용한 녹용 품종 판별 방법 및 녹용 품종 판별용 DNA 칩에 관한 것으로, 구체적으로는 러시아 사슴(Cervus elaphus sibiricus), 중국 사슴(Cervus elaphus bartrianus), 뉴질랜드 사슴 및 캐나다 사슴(C. elaphus canadensis , ELK) 유전자의 가변서열을 분석하여 선별된 사슴 품종 판별용 올리고뉴클레오티드 분자를 이용하는 녹용 품종 판별 방법 및 녹용 품종 판별용 DNA 칩에 관한 것이다. 본 발명의 녹용 품종 판별 방법 및 DNA 칩은 절편된 상태에서는 감별이 어려운 녹용의 품종을 정확히 감별하여 녹용이 아닌 다른 동물 뿔의 불법 유통의 방지 및 녹용의 불법 유통을 방지하는데 효과적으로 이용될 수 있다.
녹용 품종, DNA 칩

Description

사슴 품종 판별용 올리고뉴클레오티드 분자를 이용한 녹용 품종 판별 방법 및 녹용 품종 판별용 ＤＮＡ 칩{The method to identify Cervi Parvum Cornu species using diagnosing oligonucleotide of Cervus species and a Cervi Parvum Cornu species diagnosing DNA chip}
본 발명은 사슴 품종 판별용 올리고뉴클레오티드 분자를 이용한 녹용 품종 판별 방법 및 녹용 품종 판별용 DNA 칩에 관한 것으로, 보다 상세하게는 러시아 사슴(Cervus elaphus sibiricus), 중국 사슴(Cervus elaphus bartrianus), 뉴질랜드 사슴 및 캐나다 사슴(C. elaphus canadensis, ELK) 유전자의 가변서열을 분석하여 선별된 사슴 품종 판별용 올리고뉴클레오티드 분자를 이용하는 녹용 품종 판별 방법 및 녹용 품종 판별용 DNA 칩에 관한 것이다.
사슴은 산중에 서식하면서 나뭇잎과 열매, 즉 종자를 먹고 살며, 몸은 유약하고 크기는 1.5 m 정도이며 사지가 가늘고 길며 앞 뒤 발꿈치에 땅을 밟을 수 있는 굽이 있다. 사슴 중에서 암사슴은 뿔이 없고 수사슴만 가지 모양의 뿔을 가지고 있으며, 연령에 따라 가지를 치게 된다. 초기에는 뿔에 유상의 자갈색 털이 나 있으며 점차 혈관이 많아지며 이때를 녹용이라 하고, 매년 여름에 뿔을 갈고 나오는데 어린 사슴은 뿔이 없으며, 2년째부터 비로소 가지가 없는 뿔이 나고 3년 후부터는 한 가지씩 늘어 네 가지까지 나고 멈춘다. 가는 털로 덮인 초생유각은 피부의 하층, 곧 진피에서 변화 발달한 것이라, 처음에는 유연한 가지상을 이루어 버섯과 비슷하므로, 이를 녹용(Cornu cervi)이라 한다.
녹용의 외면은 자갈색을 나타내고 광택이 있으며 갈색의 가는 털이 나있다. 내부에는 수용 혹은 혈용이라고 하는 혈관이 있고, 녹용에는 판토크린, 탄산암모니움, 단백질, 녹용종, 교질, 연골소, 칼슘 및 성장호르몬 등의 여러 가지 성분이 함유되어 있다. 성질은 따뜻하고 독이 없고 달며 짠 맛이 난다. 이중 녹용정과 교질은 뇌세포의 활성화 촉진, 생식기능의 증강, 체력강화, 여성의 부정기 출혈 등의 생리작용 치료, 저혈압 및 빈혈개선에 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 성장호르몬은 어린이의 발육촉진, 식욕증진, 골격의 발육불량개선, 유아의 이빨 돋기 지연개선 및 유아의 보행지연 개선 등의 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 그리고 탄산암모니움, 단백질, 연골소, 칼슘 등은 면역증강으로 질병에 대한 예방적 효과, 내분비장애 개선, 특히 갑상선 기능저하개선, 위장운동 촉진 및 식욕증진, 신경쇠약치료 및 개선, 병후회복, 노화방지와 기억력 증진에 효과가 있고, 뇌수를 보익하고 치아를 견고하게 하며, 정액과 혈액을 충족시키고 원기를 북돋아 준다고 동의보감에 기록되어 있다.
현재 국내에 유통되는 녹용으로는 중국산 녹용(유통명: 깔깔이), 뉴질랜드산 녹용(유통명: 뉴자), 러시아산 녹용(유통명: 원용) 등이 있으며 캐나다산 녹용은 캐나다 사슴(C. elaphus canadensis , ELK)의 광록병으로 인해 2000년 이후에는 유통이 금지되었다. 하지만 중국을 통한 밀무역을 통하여 일부 캐나다산 녹용이 유통되고 있으며 일부에서는 원용과 혼용되어 사회적인 문제가 된 바가 있다. 현재 녹용은 대부분 절편된 상태로 유통되기 때문에 이를 육안으로 구분하여 종을 판별하기에는 거의 불가능하다.
이에, 본 발명자들은 러시아 사슴(Cervus elaphus sibiricus), 중국 사슴(Cervus elaphus bartrianus), 뉴질랜드 사슴 및 캐나다 사슴(C. elaphus canadensis , ELK) 유전자의 가변서열을 분석하여 사슴 종별 간 판별용 올리고뉴클레오티드 분자를 선별하였으며, 상기 판별용 올리고뉴클레오티드 분자를 이용하여 녹용의 품종을 간단하고 정확하게 구별할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 러시아 사슴(Cervus elaphus sibiricus), 중국 사슴(Cervus elaphus bartrianus), 뉴질랜드 사슴 및 캐나다 사슴(C. elaphus canadensis , ELK) 유전자의 가변서열을 분석하여 선별된 사슴 종별 간 판별용 올리고뉴클레오티드 분자를 이용하는 녹용 품종 판별 방법 및 녹용 품종 판별용 DNA 칩을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 러시아 사슴(Cervus elaphus sibiricus), 중국 사슴(Cervus elaphus bartrianus), 뉴질랜드 사슴 및 캐나다 사슴(C. elaphus canadensis, ELK)의 품종 판별용 올리고뉴클레오티드 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 사슴 품종 판별용 올리고뉴클레오티드 분자를 이용하여 녹용 품종을 판별하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 기판에 상기 사슴 품종 판별용 올리고뉴클레오티드 분자 또는 그의 상보적인 올리고뉴클레오티드 분자가 집적된 녹용 품종 판별용 DNA 칩을 제공하다.
아울러, 본 발명은 상기 녹용 품종 판별용 DNA 칩을 이용하여 녹용 품종을 판별하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 러시아 사슴(Cervus elaphus sibiricus), 중국 사슴(Cervus elaphus bartrianus), 뉴질랜드 사슴 및 캐나다 사슴(C. elaphus canadensis , ELK) 의 품종 판별용 올리고뉴클레오티드 분자를 제공한다.
구체적으로, 하기에 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 사슴 품종 판별용 올리고뉴클레오티드 분자를 제공한다:
a) 서열번호 19로 기재되는 서열 내에서 선택되고, 상기 서열 중 2번째 염기는 C 또는 T이며, 18번째 염기는 A 또는 G이고, 상기 염기를 포함하는 17 ~ 50 bp의 연속적인 핵산;
b) 서열번호 20으로 기재되는 서열 내에서 선택되고, 상기 서열 중 16번째 염기는 C 또는 T이며, 상기 염기를 포함하는 16 ~ 50 bp의 연속적인 핵산;
c) 서열번호 21로 기재되는 서열 내에서 선택되고, 상기 서열 중 14번째 염기는 T 또는 C이며, 상기 염기를 포함하는 15 ~ 50 bp의 연속적인 핵산;
d) 서열번호 22로 기재되는 서열 내에서 선택되고, 상기 서열 중 19번째 염기는 G 또는 A이며, 상기 염기를 포함하는 19 ~ 50 bp의 연속적인 핵산;
e) 서열번호 23으로 기재되는 서열 내에서 선택되고, 상기 서열 중 5번째 염기는 A 또는 G이며, 상기 염기를 포함하는 15 ~ 50 bp의 연속적인 핵산; 및
f) 서열번호 24로 기재되는 서열 내에서 선택되고, 상기 서열 중 16번째 염기는 C 또는 T이며, 상기 염기를 포함하는 15 ~ 50 bp의 연속적인 핵산.
상기 a)의 핵산은 본 명세서에서는 서열번호 5, 10 또는 11로 기재되어 있으며, 상기 b)의 핵산은 서열번호 6 또는 12로 기재되어 있고, 상기 c)의 핵산은 서열번호 7 또는 13으로 기재되어 있으며, 상기 d)의 핵산은 서열번호 8 또는 14로 기재되어 있고, 상기 e)의 핵산은 서열번호 15 또는 17로 기재되어 있으며, 상기 f)의 핵산은 서열번호 16 또는 18로 기재되어 있다.
상기 핵산들의 길이는 너무 짧으면 원하는 서열에 특이적이지 않고, 너무 길면 미스매치(mismatch) 될 수 있으므로, 16 ~ 35 bp의 크기를 갖는 것이 바람직하며, 16 ~ 25 bp의 크기를 갖는 것이 더욱 바람직하나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 b)는 추가적으로 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드 분자를 포함한다:
ⅰ) 서열번호 20으로 기재되는 서열 내에서 선택되고, 상기 서열 중, 2번째 내지 6번째 염기는 AACAA이며, 10번째 내지 14번째 염기는 ACCCC이며, 16번째 내지 18번째 염기는 TGA이며, 상기 염기를 포함하는 18 ~ 50 bp의 연속적인 핵산;
ⅱ) 서열번호 20으로 기재되는 서열 내에서 선택되고, 상기 서열 중, 1번째 염기는 G이며, 5번째 염기는 T이며, 10번째 염기는 T이며, 16번째 염기는 T이며, 상기 염기를 포함하는 18 ~ 50 bp의 연속적인 핵산;
ⅲ) 서열번호 20으로 기재되는 서열 내에서 선택되고, 상기 서열 중, 5번째 염기는 T이며, 10번째 염기는 T이며, 16번째 염기는 T이며, 상기 염기를 포함하는 18 ~ 50 bp의 연속적인 핵산; 및
ⅳ) 서열번호 20으로 기재되는 서열 내에서 선택되고, 상기 서열 중, 10번째 염기는 T이며, 16번째 염기는 T이며, 상기 염기를 포함하는 18 ~ 50 bp의 연속적인 핵산.
또한, 상기 c)는 추가적으로 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드 분자를 포함한다.
ⅰ) 서열번호 21로 기재되는 서열 내에서 선택되고, 상기 서열 중, 4번째 및 5번째 염기는 AG이며, 7번째 염기는 T이며, 9번째 내지 11번째 염기는 GAG이며, 14번째 내지 16번째 염기는 TGA이며, 상기 염기를 포함하는 16 ~ 50 bp의 연속적인 핵산; 및
ⅱ) 서열번호 21로 기재되는 서열 내에서 선택되고, 상기 서열 중, 4번째 및 5번째 염기는 AG이며, 7번째 염기는 T이며, 9번째 및 10번째 염기는 GA이며, 14번째 내지 16번째 염기는 TGA이며, 상기 염기를 포함하는 16 ~ 50 bp의 연속적인 핵산.
또한, 상기 d)는 추가적으로 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드 분자를 포함한다:
ⅰ) 서열번호 22로 기재되는 서열 내에서 선택되고, 상기 서열 중, 3번째 염기는 C이며, 5번째 염기는 G이며, 8번째 염기는 A이며, 10번째 내지 16번째 염기는 CTGCGGA이며, 19번째 염기는 A이며, 상기 염기를 포함하는 19 ~ 50 bp의 연속적인 핵산; 및
ⅱ) 서열번호 22로 기재되는 서열 내에서 선택되고, 상기 서열 중, 1번째 염 기는 T이며, 19번째 염기는 A이며, 상기 염기를 포함하는 19 ~ 50 bp의 연속적인 핵산.
또한, 본 발명은 상기 사슴 품종 판별용 올리고뉴클레오티드 분자를 이용하여 녹용 품종을 판별하는 방법을 제공한다. 구체적으로,
1) 대상체에서 추출한 DNA를 주형으로 하여 사슴의 유전자를 PCR로 증폭시키는 단계;
2) 상기 단계 1)의 PCR 증폭 산물을 전기영동으로 확인한 후, 염기서열 분석하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 분석된 염기서열에서 본 발명의 사슴 품종 판별용 올리고뉴클레오티드 분자의 서열을 확인하여 사슴 품종을 판별하는 단계를 포함한다.
본 발명자들은 러시아 사슴(Cervus elaphus sibiricus), 중국 사슴, 뉴질랜드 사슴 및 캐나다 사슴(C. elaphus canadensis, ELK)의 품종을 판별하기 위하여 먼저, 상기 사슴들로부터 분리한 전체 DNA 중 미토콘드리아 DNA의 ATPase8(ATP synthase subunit; Entrez gi: 84095031, REGION 7793..7993) 및 CO1(cytochrome c oxidase subunit 1; Entrez gi: 84095031, REGION 5350..6894) 유전자를 PCR 방법을 이용하여 증폭시켰다. ATPase8 유전자 부위를 증폭하기 위해서 Kenta & Michinari(Animal Science Journal 75:295~302, 2004)가 보고한 프라이머의 서열을 일부 변형하여 ATP8-S 프라이머(센스 프라이머; 서열번호 1) 및 ATP8-AS 프라이머(안티센스 프라이머; 서열번호 2)로 이용하였고, CO1 유전자 부위를 증폭하기 위해 서 상기와 동일한 논문에 보고된 프라이머의 서열을 일부 변형하여 CO1-S1(센스 프라이머; 서열번호 3) 및 CO1-AS 프라이머(안티센스 프라이머; 서열번호 4)로 이용하였다. 증폭된 PCR 산물을 전기영동으로 확인한 후, 염기서열 분석을 하였다. 그 결과, ATPase8 유전자 부위에서는 4개의 가변서열(서열번호 19 내지 서열번호 22)을 확인할 수 있었고, CO1 유전자 부위에서는 1개의 가변서열(서열번호 9)을 확인할 수 있었다. 참고로 상기 PCR로 수득된 증폭 산물은 ATPase8 유전자는 약 732 bp이었으며, CO1 유전자는 약 2085 bp이었다. 실제 ATPase8 유전자는 201bp (Entrez gi: 84095031, REGION 7793..7993), CO1 유전자는 1545 bp(Entrez gi: 84095031, REGION 5350..6894)이므로, 본 PCR 산물은 각각 ATPase8와 CO1의 ORF(open reading frame) 및 이의 상단부(upstream) 또는 하단부(downstream)를 포함하고 있다.
상기 서열번호 19는 ATPase8 유전자 전체서열 중에서 31번째부터, 서열번호 20은 ATPase8 유전자 전체서열 중에서 380번째부터, 서열번호 21은 ATPase8 유전자 전체서열 중에서 190번째부터, 서열번호 22은 ATPase8 유전자 전체서열 중에서 68번째부터 시작되는 서열이며, 서열번호 9는 CO1 유전자 전체서열 중에서 1617번째부터 시작되는 서열이다.
ATPase8 유전자의 4개의 가변서열 가운데에서 서열번호 19(5'-A Y AATAATTATATCAAT R -3')의 서열에 대해, 두 번째의 서열이 중국 사슴에서는 C였으며, 러시아 사슴, 캐나다 사슴 및 뉴질랜드 사슴에서는 T의 염기를 나타내었다. 또한, 상기 서열번호 19에서 마지막 서열이 중국 사슴 및 뉴질랜드 사슴에서 A로 나타났으며, 캐나다 사슴 및 러시아 사슴에서는 G로 나타났다(도 1 참조). 이는 서열번호 5(5'-A C AATAATTATATCAAT A -3')는 중국 사슴으로 판별할 수 있는 올리고뉴클레오티드 분자가 될 수 있으며, 또한 서열번호 10(5'-A T AATAATTATATCAAT A -3')의 서열은 뉴질랜드 사슴을 판별할 수 있는 올리고뉴클레오티드 분자가 될 수 있으며, 아울러, 서열번호 11(5'-A T AATAATTATATCAAT G -3')은 캐나다 사슴 또는 러시아 사슴을 판별할 수 있는 올리고뉴클레오티드 분자가 될 수 있음을 의미한다.
또한, 서열번호 20(5'-RWMYHWAATHYYMYT Y RW-3')에서 캐나다 사슴은 뒤에서 세 번째의 서열이 C를 나타내었으며, 다른 품종의 사슴(중국 사슴, 뉴질랜드 사슴 및 러시아 사슴)에서는 T를 나타내었다(도 2 참조). 이는 서열번호 6(5'-ATCTCTAATCTTATT C AT-3')은 캐나다 사슴을 판별할 수 있는 올리고뉴클레오티드 분자로 이용될 수 있으며, 서열번호 12(5'-ATCTCTAATCTTATT T AT-3')의 서열은 중국 사슴, 뉴질랜드 사슴 또는 러시아 사슴을 판별할 수 있는 올리고뉴클레오티드 분자로 이용될 수 있음을 의미한다.
또한, 서열번호 21(5'-TTAMSCYARWRAT Y SW-3')에서, 중국 사슴 및 뉴질랜드 사슴에서는 뒤에서 세 번째의 서열에 T가 나타났으며, 캐나다 사슴 및 러시아 사슴에서는 C가 나타났다(도 3 참조). 이는 서열번호 7(5'-TTACCCCAATAAT T CT-3')은 중국 사슴 또는 뉴질랜드 사슴을 판별할 수 있는 올리고뉴클레오티드 분자로 이용될 수 있으며, 서열번호 13(5'-TTACCCCAATAAT C CT-3')의 서열은 캐나다 사슴 또는 러시아 사슴을 판별할 수 있는 올리고뉴클레오티드 분자로 이용될 수 있음을 의미한다.
또한, 서열번호 22(5'-YTYTSAAWTMWRMRKWTC R A-3')에서 캐나다 사슴 및 러시아 사슴에서는 뒤에서 두 번째 서열에서 G가 나타났으며, 중국 사슴 및 뉴질랜드 사슴에서는 A를 나타내었다(도 4 참조). 이는 서열번호 8(5'-CTTTCAATTAAAAATTTC G A-3')은 캐나다 사슴 또는 러시아 사슴을 판별할 수 있는 올리고뉴클레오티드 분자로 이용될 수 있으며, 서열번호 14(5'-CTTTCAATTAAAAATTTC A A-3')의 서열은 중국 사슴 또는 뉴질랜드 사슴을 판별할 수 있는 올리고뉴클레오티드 분자로 이용될 수 있음을 의미한다.
CO1 유전자 부위에서는 1개의 가변서열(서열번호 9; 5'-TGAG R KRTKWKWRWAAWATW ATATAATTTTGTCAAGGTTA AGWYASRKGWRADDV Y YSY-3')이 나타났으나, 올리고뉴클레오티드로 이용하기엔 뉴클레오티드의 숫자가 너무 많아 상기 서열번호 9의 1번째 서열에서부터 20 bp(5'-TGAG R KRTKWKWRWAAWATW-3'; 서열번호 23) 및 41번째 서열인 A에서부터 20 bp(5'-AGWYASRKGWRADDV Y YSY-3'; 서열번호 24)의 두 부분으로 나누어 나타내었다. 서열번호 23에서 캐나다 사슴, 뉴질랜드 사슴 및 러시아 사슴에서는 5번째의 서열이 A이었으며, 중국 사슴에서는 G의 서열을 나타내었다. 서열번호 24에서 뉴질랜드 사슴 및 중국 사슴에서는 16번째 서열이 C이었으며, 캐나다 사슴 및 러시아 사슴에서는 T이었다(도 5 참조). 이는 서열번호 15(5'-GGGGT T TTCACCTGTAACTT-3')는 뉴질랜드 사슴, 러시아 사슴 및 캐나다 사슴을 판별할 수 있는 올리고뉴클레오티드 분자로 이용될 수 있으며, 서열번호 16(5'-AATATTTTACTAACA C CTCA-3')은 뉴질랜드 사슴 및 중국 사슴을 판별할 수 있는 올리고뉴클레오티드 분자로 이용될 수 있으며 또한, 서열번호 17(5'-GGGGT C TTCACCTGTAACTT-3')의 서열은 중국 사슴을 판별할 수 있는 올리고뉴클레오티 드로 분자로 이용될 수 있으며, 아울러, 서열번호 18(5'-AATATTTTACTAACA T CTCA-3')은 캐나다 사슴 및 러시아 사슴을 판별할 수 있는 올리고뉴클레오티드 분자로 이용될 수 있음을 의미한다.
종합하면, 중국 사슴 판별용 올리고뉴클레오티드 분자로는 서열번호 5, 7, 12, 14, 16 또는 17 기재의 염기서열이 이용될 수 있으며, 뉴질랜드 사슴 판별용 올리고뉴클레오티드 분자로는 서열번호 7, 10, 12, 14, 15 또는 16 기재의 염기서열이 이용될 수 있으며, 러시아 사슴 판별용 올리고뉴클레오티드 분자로는 서열번호 8, 11, 12, 13, 15 또는 18 기재의 염기서열이 이용될 수 있으며, 캐나다 사슴 판별용 올리고뉴클레오티드 분자로는 서열번호 6, 8, 11, 13, 15 또는 18 기재의 염기서열이 이용될 수 있다.
녹용의 품종을 판별하기 위하여 상기의 사슴 종별 간의 판별용 올리고뉴클레오티드 분자를 이용할 경우, 상기 판별용 올리고뉴클레오티드 분자(서열번호 5 내지 18)들을 조합하여 이용하는 것이 바람직하며, 상기 서열에 몇 개의 염기가 추가될 수도 있다.
상기에서 기술한 본 발명의 사슴 품종 판별용 올리고뉴클레오티드 분자는 녹용 품종을 빠르고 간편하게 판별할 수 있으며, 정확한 결과를 도출할 수 있으므로, 다른 동물 뿔의 불법 유통의 방지 및 녹용의 불법 유통(캐나다산 녹용의 유통)을 방지하는데 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 기판에 상기 사슴 품종 판별용 올리고뉴클레오티드 분자 또 는 그의 상보적인 올리고뉴클레오티드 분자가 집적된 녹용 품종 판별용 DNA 칩을 제공한다.
상기 기판은 플라스틱, 센서칩, 폴리프로필렌, 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐(Polyvinyl) 수지로 합성된 96 웰 플레이트(96 well plate), 폴리스틸렌(Polystyrene) 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
아울러, 본 발명은 상기 녹용 품종 판별용 DNA 칩을 이용하여 녹용 품종을 판별하는 방법을 제공한다. 구체적으로,
1) 대상체에서 추출한 DNA를 주형으로 하여 사슴의 유전자를 PCR로 증폭시키는 단계;
2) 단계 1)에서 PCR로 증폭된 DNA에 형광물질을 표지하는 단계;
3) 단계 2)의 형광물질이 표지된 DNA와 본 발명의 녹용 품종 판별용 DNA 칩을 혼성화시키는 단계; 및
4) 세척 후, 형광을 판독하여 사슴 품종을 판별하는 단계를 포함하는 녹용 품종 판별 방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 유전자는 ATPase8(ATP synthase subunit) 또는 CO1(cytochrome c oxidase subunit 1)이며, ATPase8 유전자는 서열번호 1 및 서열번호 2에 기재된 프라이머로 증폭될 수 있으며, CO1 유전자는 서열번호 3 및 서열 번호 4에 기재된 프라이머로 증폭될 수 있다.
상기 단계 2)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용하는 것이 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 녹용 품종 판별용 DNA 칩을 이용하여 녹용 품종을 판별하는 방법의 예를 들자면, 우선, 서열번호 5(5'-A C AATAATTATATCAAT A -3'), 서열번호 6(5'-ATCTCTAATCTTATT C AT-3'), 서열번호 10(5'-A T AATAATTATATCAAT A -3') 및 서열번호 11(5'-A T AATAATTATATCAAT G -3')의 올리고뉴클레오티드 분자를 기판에 각각 일렬로 집적하여 녹용 품종을 판별용 DNA 칩을 제조한다.
녹용 품종 판별을 원하는 대상체에서 추출한 DNA를 주형으로 하여 사슴의 ATPase8 유전자를 PCR로 증폭시킨 후, 수득된 PCR 산물을 형광물질로 표지한다. 이어서 형광물질로 표지된 PCR 산물을 본 발명의 녹용 품종 판별용 DNA 칩에 혼성화시킨다.
세척 후, 서열번호 5 기재의 올리고뉴클레오티드 분자가 집적된 자리에서 형광이 확인되었다면, 이는 중국 사슴(중국산 녹용, 유통명; 깔깔이)이라고 판별할 수 있다. 만약 서열번호 10 기재의 올리고뉴클레오티드 분자가 집적된 자리에서 형광이 확인되었다면, 이는 뉴질랜드 사슴(뉴질랜드산 녹용, 유통명; 뉴자)이라고 판별할 수 있다. 만약 서열번호 6 기재의 올리고뉴클레오티드 분자가 집적된 자리에서 형광이 확인되었다면, 이는 캐나다 사슴(캐나다산 녹용, 유통명; 엘크)이라고 판별할 수 있다. 또는, 서열번호 11기재의 올리고뉴클레오티드 분자가 집적된 자리에서 형광이 확인되었다면, 이는 캐나다 사슴(캐나다산 녹용, 유통명; 엘크) 또는 러시아 사슴(러시아산 녹용, 유통명; 원용)이라고 판별할 수 있다.
상기에서 살펴보았듯이, 본 발명의 녹용 품종 판별용 DNA 칩은 캐나다 사슴, 중국 사슴, 뉴질랜드 사슴 및 러시아 사슴의 품종을 신속·정확하게 판별하여 다른 동물 뿔의 불법 유통뿐만 아니라 캐나다산 녹용의 불법 유통을 방지하는데 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 사슴 종별 간 판별용 올리고뉴클레오티드 분자를 이용한 사슴 품종 판별 방법은 건조된 녹용의 절편에서도 편리하고 신속정확하게 녹용의 품종을 판별할 수 있으므로, 다른 동물 뿔의 불법 유통의 방지 및 녹용의 불법 유통(캐나다산 녹용)을 방지하는데 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 녹용 시료 준비
녹용 표준시료의 채취는 러시아 사슴(Cervus elaphus sibiricus)은 러시아 고르노알타이 공화국의 사슴 농장을 방문하여 직접 채취 하였으며, 중국 사슴(Cervus elaphus bartrianus), 뉴질랜드 사슴 및 캐나다 사슴(C. elaphus canadensis, ELK)은 국내 무역 업체와 사슴 농장을 통하여 구입하였다. 녹용의 혈액 또는 조직으로부터 분리한 전체 DNA를 G-Spin™ Genomic DNA Extraction Kit(iNtRON Biotechnology, 한국)을 이용하여 사용자 지침에 따라 추출하였다.
< 실시예 2> 종 판별을 위한 유전자의 증폭
본 발명에 사용된 미토콘드리아 DNA는 모계 유전으로 세대와 종에 따른 염기 치환이 빠른 장점이 있어 오랫동안 종 판별에 사용되어 왔다. Kenta & Michinari(Animal Science Journal 75:295~302, 2004)의 논문에 기재된 바와 같이 미토콘드리아 DNA내에 포함된 ATPase8(ATP synthase subunit)의 유전자는 가변 부위가 많은 부분 중에 하나이다.
이에, 본 발명자들은 ATPase8을 사슴의 품종 구분을 위한 하나의 부위로 사용하였다. 프라이머는 Kenta & Michinari(2004)에 의해 보고된 것을 일부 변형하여 사용하였으며 프라이머쌍(센스 프라이머 및 안티센스 프라이머)의 염기 서열은 하기 표 1과 같다.
또한, 현재 세계적인 종 구분의 연구(http://www.barcodinglife.org)에 많이 사용되는 CO1(cytochrome c oxidase subunit 1)을 함께 비교하였고 Kenta & Michinari(2004)에 보고된 프라이머를 일부 변형하여 사용하였으며, 프라이머쌍(센 스 프라이머 및 안티센스 프라이머)의 염기 서열은 하기 표 1과 같다.
프라이머 서열
유전자명
 프라이머쌍
센스 프라이머 안티센스 프라이머
ATPase8 5'-ggacgcaattccaggccgcct-3';
서열번호 1		 5'-tgctcacaggggaatggctatg-3';
서열번호 2
CO1 5'-ttcaatctacttctcccgccgc-3';
서열번호 3		 5'-aggataatagccggtaggattg-3';
서열번호 4
ATPase8 유전자의 PCR 조건은 94℃에서 2분 동안 전-변성화(pre-denaturation)시킨 후, 94℃에서 20초; 64℃에서 20초; 및 72℃에서 1분의 한 사이클을 35회 반복한 다음, 72℃에서 3분간 최종 확장(extension)시켜 반응을 종결시켰다. CO1 유전자의 PCR 조건은 94℃에서 2분 동안 전-변성화(pre-denaturation)시킨 후, 94℃에서 20초; 61℃에서 20초; 및 72℃에서 1분의 한 사이클을 35회 반복한 다음, 72℃에서 3분간 최종 확장(extension)시켜 반응을 종결시켰다.
상기와 같이 수행하여 PCR로 수득한 증폭 산물은 ATPase8 유전자는 약 732 bp이었으며, CO1 유전자는 약 2085 bp이었다.
<실시예 3> ATPase 8 유전자의 가변 서열 조사
상기 실시예 2에서 수득한 ATPase8 유전자의 증폭 산물을 코스모 주식회사(한국)에 의하여 시퀀싱함으로써 염기 서열 정보를 얻은 후, 상기 서열정보들을 Bioedit 프로그램(http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html)으로 정렬하였다.
그 결과, ATPase8 유전자 부위에서는 4개의 가변서열(서열번호 5 내지 8)을 확인할 수 있었다. 하기 서열번호 19는 ATPase8 유전자의 전체서열 중에서 31번째 염기부터 시작되는 서열이었으며, 서열번호 19의 서열 내에서 두 번째의 염기가 중국 사슴에서는 C였으며 중국 사슴을 제외한 나머지 품종(러시아 사슴, 캐나다 사슴 및 뉴질랜드 사슴)에서는 T의 염기를 갖고 있었다. 또한, 마지막의 염기는 중국 사슴 및 뉴질랜드 사슴에서는 A를 나타났으며, 반면 캐나다 사슴 및 러시아 사슴은 G를 나타내었다(도 1).
<서열번호 19>
Figure 112007057808896-pat00001
또한, ATPase8 유전자 염기서열 가운데에서 하기 서열번호 20은 ATPase8 유전자의 전체서열 중에서 380번째 염기(ATPase8의 하단부)부터 시작되는 서열이었으며, 서열번호 20 중, 캐나다 사슴에만 뒤에서 세 번째 서열이 C이었으며, 다른 품종의 사슴(중국 사슴, 뉴질랜드 사슴 및 러시아 사슴)에서는 T를 나타내었다(도 2). 추가적으로, 뉴질랜드 사슴에서는 서열번호 20으로 기재되는 서열 중에서 1번째 염기는 A 또는 G이며, 2번째 내지 6번째 염기는 AACAA 또는 TCTCT이었으며, 10번째 내지 14번째 염기는 ACCCC 또는 CTTAT이었으며, 16번째 내지 18번째 염기는 TGA인 것으로 나타났다. 또한, 러시아 사슴에서는 서열번호 20으로 기재되는 서열 중에서 1번째 염기가 G 또는 A이며, 5번째 및 10번째 염기는 T 또는 C이며, 16번째 염기는 T인 것으로 나타났다. 아울러, 러시아 사슴에서는 서열번호 20으로 기재되는 서열 중에서 5번째 염기는 T이었으며, 10번째 염기는 T이었으며, 16번째 염기는 T인 것으로 나타났고, 서열번호 20으로 기재되는 서열 중에서 10번째 염기는 T이었으며, 16번째 염기는 T인 것으로 나타났다.
<서열번호 20>
Figure 112007057808896-pat00002
더 나아가, ATPase8 유전자 염기서열 가운데에서 190번째 염기부터 시작되는 하기 서열번호 21 중, 중국 사슴 및 뉴질랜드 사슴에서는 뒤에서 세 번째의 서열이 T로 나타났으며, 캐나다 사슴 및 러시아 사슴에서는 C로 나타났다(도 3). 추가적으로, 중국 사슴 및 뉴질랜드 사슴에서는 서열번호 21로 기재되는 서열 내에서 4번째 및 5번째 염기는 AG이었으며, 7번째 염기는 T이었으며, 9번째 내지 11번째 염기는 GAG인 것으로 나타났다. 아울러, 뉴질랜드 사슴에서는 서열번호 21로 기재되는 서열 내에서 4번째 및 5번째 염기는 AG이었으며, 7번째 염기는 T이었으며, 9번째 및 10번째 염기는 GA이었으며, 14번째 내지 16번째 염기는 TGA인 것으로 나타났다.
<서열번호 21>
Figure 112007057808896-pat00003
아울러, ATPase8 유전자 염기서열 가운데에서 68번째 염기부터 시작되는 하기 서열번호 22 중, 캐나다 사슴 및 러시아 사슴에서는 뒤에서 두 번째의 서열이 G로 나타났고, 중국 사슴 및 뉴질랜드 사슴은 A로 나타났다(도 4). 추가적으로, 중국 사슴 및 뉴질랜드 사슴에서는 서열번호 22로 기재되는 서열 내에서 3번째 염기는 C 또는 T이었으며, 5번째 염기는 G 또는 C이었으며, 8번째 염기는 A 또는 T이었으며, 10번째 내지 16번째 염기는 CTGCGGA 또는 AAAAATT이었으며, 19번째 염기는 A인 것으로 나타났다. 아울러, 중국 사슴 및 뉴질랜드 사슴에서는 서열번호 22로 기재되는 서열 내에서 1번째 염기는 T 또는 C이었으며, 19번째 염기는 A인 것으로 나타났다.
<서열번호 22>
Figure 112007057808896-pat00004
< 실시예 4> CO1 유전자의 가변 서열 조사
상기 실시예 2에서 수득한 CO1 유전자의 증폭 산물을 코스모 주식회사(한국)에 의하여 시퀀싱함으로써 염기 서열 정보를 얻은 후, 상기 서열정보를 Bioedit 프로그램(http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html)으로 정렬하였다.
그 결과, CO1 유전자 부위에서는 1개의 가변서열(서열번호 9)을 확인할 수 있었다. 그러나 상기 CO1 유전자 전체서열 중에서 1617번째 염기(Entrez gi:84095031에서는 6965번째 염기)로부터 시작되는 서열번호 9는 올리고뉴클레오티드로 이용하기엔 너무 길어 상기 서열번호 9의 1번째 서열에서부터 20 bp(서열번호 23; 5'-TGAG R KRTKWKWRWAAWATW-3') 및 41번째 서열인 A에서 부터 20 bp(서열번호 24; 5'-AGWYASRKGWRADDV Y YSY-3')의 두 부분으로 나누었다.
상기 서열번호 23 중, 캐나다 사슴 및 러시아 사슴에서 5번째 염기는 A이었으며, 중국 및 뉴질랜드 사슴에서는 G이었다. 상기 서열번호 24에서 뉴질랜드 사슴 및 중국 사슴에서는 16번째의 서열이 C이었으며, 캐나다 사슴 및 러시아 사슴에서는 T이었다(도 5).
<서열번호 9>
Figure 112007057808896-pat00005
<서열번호 23>
Figure 112007057808896-pat00006
<서열번호 24>
Figure 112007057808896-pat00007
도 1은 사슴의 ATPase 8 염기서열의 분석 결과를 나타낸 그림이다:
C1 ~ C8, ATP-K1 및 ATP-K2: 중국 사슴(유통명; 깔깔이);
N1 ~ N8 및 ATP-N1: 뉴질랜드 사슴(유통명; 뉴자);
L3 ~ L8: 캐나다 사슴(유통명; 엘크); 및
P2-ATP ~ P9-ATP, siberi, ATP-Y1 및 ATP-Y2: 러시아 사슴(유통명; 원용).
도 2는 사슴의 ATPase 8 염기서열의 분석 결과를 나타낸 그림이다:
C1 ~ C8, ATP-K1 및 ATP-K2: 중국 사슴 녹용(유통명; 깔깔이);
N1 ~ N8 및 ATP-N1: 뉴질랜드(유통명; 뉴자);
L3 ~ L8: 캐나다(유통명; 엘크); 및
P2-ATP ~ P19-ATP, siberi, ATP-Y1 및 ATP-Y2: 러시아 사슴(유통명; 원용).
도 3은 사슴의 ATPase 8 염기서열의 분석 결과를 나타낸 그림이다:
C5 ~ C8, ATP-K1 및 ATP-K2: 중국 사슴(유통명; 깔깔이);
elaphus AB24: 중국 사슴(Cervus elaphus) 미토콘드리아 DNA, 16,731bp
N1 ~ N8, ATP-N1: 뉴질랜드 사슴(유통명; 뉴자);
L3 ~ L8: 캐나다 사슴(유통명; 엘크); 및
P2-ATP ~ P13-ATP, siberi, ATP-Y1 및 ATP-Y2: 러시아 사슴(유통명; 원용).
도 4는 사슴의 ATPase 8 염기서열의 분석 결과를 나타낸 그림이다:
C1 ~ C8, ATP-K1 및 ATP-K2: 중국 사슴(유통명; 깔깔이);
elaphus AB24: 중국 사슴(Cervus elaphus) 미토콘드리아 DNA, 16,731bp
N1 ~ N8, ATP-N1: 뉴질랜드 사슴(유통명; 뉴자);
L3 ~ L8: 캐나다 사슴(유통명; 엘크); 및
P2-ATP ~ P9-ATP, siberi, ATP-Y1 및 ATP-Y2: 러시아 사슴(유통명; 원용).
도 5는 사슴의 CO1 염기서열의 분석 결과를 나타낸 그림이다:
AB245427: 중국 사슴(Cervus elaphus) 미토콘드리아 DNA, 16371bp
뉴질랜드 1 내지 6: 뉴질랜드 사슴(유통명; 뉴자);
sibiricus 1 및 2; 러시아 사슴(유통명; 원용);
엘크 1 내지 6; 캐나다 사슴(유통명; 엘크); 및
중국산1 및 중국산2; 중국 사슴(유통명; 깔깔이).
<110> purimed CO. <120> The method to identify Cervi Parvum Cornu species using diagnosing oligonucleotide of Cervus species and a Cervi Parvum Cornu species diagnosing DNA chip <130> 7p-05-48 <160> 24 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATP8-S <400> 1 ggacgcaatt ccaggccgcc t 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATP8-AS <400> 2 tgctcacagg ggaatggcta tg 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CO1-S1 <400> 3 ttcaatctac ttctcccgcc gc 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CO1-AS <400> 4 aggataatag ccggtaggat tg 22 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Cervus sp. <400> 5 acaataatta tatcaata 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Cervus sp. <400> 6 atctctaatc ttattcat 18 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Cervus sp. <400> 7 ttaccccaat aattct 16 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Cervus sp. <400> 8 ctttcaatta aaaatttcga 20 <210> 9 <211> 59 <212> DNA <213> Cervus sp. <400> 9 tgagrkrtkw kwrwaawatw atataatttt gtcaaggtta agwyasrkgw raddvyysy 59 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Cervus sp. <400> 10 ataataatta tatcaata 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Cervus sp. <400> 11 ataataatta tatcaatg 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Cervus sp. <400> 12 atctctaatc ttatttat 18 <210> 13 <211> 16 <212> DNA <213> Cervus sp. <400> 13 ttaccccaat aatcct 16 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Cervus sp. <400> 14 ctttcaatta aaaatttcaa 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Cervus sp. <400> 15 ggggttttca cctgtaactt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Cervus sp. <400> 16 aatattttac taacacctca 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Cervus sp. <400> 17 ggggtcttca cctgtaactt 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Cervus sp. <400> 18 aatattttac taacatctca 20 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Cervus sp. <400> 19 ayaataatta tatcaatr 18 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Cervus sp. <400> 20 rwmyhwaath yymytyrw 18 <210> 21 <211> 16 <212> DNA <213> Cervus sp. <400> 21 ttamscyarw ratysw 16 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Cervus sp. <400> 22 ytytsaawtm wrmrkwtcra 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Cervus sp. <400> 23 tgagrkrtkw kwrwaawatw 20 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Cervus sp. <400> 24 agwyasrkgw raddvyysy 19

Claims (27)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 1) 대상체에서 추출한 DNA를 주형으로 하여 사슴의 유전자를 PCR로 증폭시키는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 PCR 증폭 산물을 전기영동으로 확인한 후, 염기서열 분석하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)의 염기서열 분석 결과, 하기와 같이 판정하는 단계를 포함하는 녹용 품종 판별 방법:
    a) 분석결과 서열번호 5 또는 서열번호 17일 때, 중국 사슴으로 판정하는 단계;
    b) 분석결과 서열번호 6일 때, 캐나다 사슴으로 판정하는 단계;
    c) 분석결과 서열번호 7일 때, 중국 또는 뉴질랜드 사슴으로 판정하는 단계;
    d) 분석결과 서열번호 8일 때, 러시아 또는 캐나다 사슴으로 판정하는 단계;
    e) 분석결과 서열번호 10일 때, 뉴질랜드 사슴으로 판정하는 단계;
    f) 분석결과 서열번호 11일 때, 러시아 또는 캐나다 사슴으로 판정하는 단계;
    g) 분석결과 서열번호 12일 때, 중국, 뉴질랜드 및 러시아 사슴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 사슴으로 판정하는 단계;
    h) 분석결과 서열번호 13일 때, 러시아 또는 캐나다 사슴으로 판정하는 단계;
    i) 분석결과 서열번호 14일 때, 중국 또는 뉴질랜드 사슴으로 판정하는 단계;
    j) 분석결과 서열번호 15일 때, 뉴질랜드, 러시아 및 캐나다 사슴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 사슴으로 판정하는 단계;
    k) 분석결과 서열번호 16일 때, 중국 또는 뉴질랜드 사슴으로 판정하는 단계; 및
    l) 분석결과 서열번호 18일 때, 러시아 또는 캐나다 사슴으로 판정하는 단계.
  14. 제 13항에 있어서, 단계 1)의 유전자는 ATPase8(ATP synthase subunit) 또는 CO1(cytochrome c oxidase subunit 1)인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 ATPase8 유전자는 서열번호 1 및 서열번호 2에 기재된 프라이머로 증폭되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 14항에 있어서, 상기 CO1 유전자는 서열번호 3 및 서열번호 4에 기재된 프라이머로 증폭되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 서열번호 5 내지 8, 및 서열번호 10 내지 18로 기재되는 핵산 서열의 올리고뉴클레오티드 분자 전부 또는 그의 상보적인 올리고뉴클레오티드 분자 전부가 기판에 집적된 녹용 품종 판별용 DNA 칩.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 기판은 플라스틱, 센서칩, 폴리프로필렌, 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐(Polyvinyl) 수지로 합성된 96 웰 플레이트(96 well plate), 폴리스티렌(Polystyrene) 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 DNA 칩.
  23. 1) 대상체에서 추출한 DNA를 주형으로 하여 사슴의 유전자를 PCR로 증폭시키는 단계;
    2) 단계 1)에서 PCR로 증폭된 DNA에 형광물질을 표지하는 단계;
    3) 단계 2)의 형광물질이 표지된 DNA와 제 21항의 녹용 품종 판별용 DNA 칩을 혼성화시키는 단계; 및
    4) 세척 후, 형광을 판독하여 사슴 품종을 판별하는 단계를 포함하는 녹용 품종 판별 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 단계 1)의 유전자는 ATPase8(ATP synthase subunit) 또는 CO1(cytochrome c oxidase subunit 1)인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 ATPase8 유전자는 서열번호 1 및 서열번호 2에 기재된 프라이머로 증폭되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 24항에 있어서, 상기 CO1 유전자는 서열번호 3 및 서열번호 4에 기재된 프라이머로 증폭되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 23항에 있어서, 상기 단계 2)의 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020070080024A 2007-08-09 2007-08-09 사슴 품종 판별용 올리고뉴클레오티드 분자를 이용한 녹용품종 판별 방법 및 녹용 품종 판별용 ｄｎａ 칩 KR101505902B1 (ko)

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