KR101499286B1

KR101499286B1 - Anti-inflammatory compositions comprising cynandione A

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Publication number: KR101499286B1
Application number: KR1020120013012A
Authority: KR
Inventors: 김지영; 김성환; 이상민; 박지해; 박근형; 백남인; 이태훈
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2012-02-08
Filing date: 2012-02-08
Publication date: 2015-03-06
Also published as: KR20130091604A

Abstract

본 발명은 시난디온 A(cynandione A) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 항염증용 약제학적 조성물, 시난디온 A 또는 이의 염을 포함하는 염증의 예방 또는 개선용 식품 조성물, 화장료 조성물, 및 의약외품 조성물, 및 염증성 질환의 치료방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 염증 매개 인자인 NO, iNOS, PEG₂, COX-2, IL-6 및 IL-1β 등의 생성 억제 활성이 우수하여, 염증성 질환에 탁월한 효과가 있으며, 독성을 나타내지 않는 바, 염증성 질환의 예방, 개선, 또는 치료를 위한 안전한 제제로서 유용하게 사용될 수 있다The present invention relates to an antiinflammatory pharmaceutical composition comprising cynandione A or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a food composition for preventing or ameliorating inflammation comprising cinanideone A or a salt thereof, a cosmetic composition, and Quasi-drug compositions, and methods of treating inflammatory diseases. The composition according to the present invention is excellent in the inhibitory activity on the production of inflammatory mediators such as NO, iNOS, PEG ₂ , COX-2, IL-6 and IL-1β and has an excellent effect on inflammatory diseases. , As a safe preparation for the prevention, amelioration, or treatment of inflammatory diseases

Description

Anti-inflammatory compositions comprising cynandione A < RTI ID = 0.0 >

본 발명은 시난디온 A(cynandione A) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 항염증용 약제학적 조성물, 시난디온 A 또는 이의 염을 포함하는 염증의 예방 또는 개선용 식품 조성물, 화장료 조성물, 및 의약외품 조성물, 및 염증성 질환의 치료방법에 관한 것이다. The present invention relates to an antiinflammatory pharmaceutical composition comprising cynandione A or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a food composition for preventing or ameliorating inflammation comprising cinanideone A or a salt thereof, a cosmetic composition, and Quasi-drug compositions, and methods of treating inflammatory diseases.

염증반응은 조직의 손상, 외부의 자극 또는 다양한 감염원에 대한 생체조직의 방어 반응의 하나로, 혈관과 체액 내의 각종 염증 매개 인자 및 다양한 면역 세포의 유기적 상호작용으로 인한 효소 활성화, 염증매개물질 분비, 세포 침윤 및 체액 삼출, 순환 장애, 조직의 변질 및 과증식 등 일련의 복합적인 병리 현상이다. 염증반응의 과정은 초기에 대식세포가 상처부위로 모여들어 침입한 세균을 공격한 후, 상처부위에 혈장이 축적되고 혈류가 증가되어 발열, 홍반, 부종, 통증 현상 등의 외적 증상이 일어나게 된다. 이러한 염증 반응이 지속적으로 또는 과도하게 일어나면 오히려 질환의 주요 병리현상(과민성 알러지 질환, 만성 염증 질환)으로 진행되며, 심각한 이상 장애를 초래하게 된다.The inflammatory reaction is one of the damage of the tissue, the external stimulus, or the defense of the biotissue to various infectious agents. The inflammatory reaction is caused by enzymatic activation, inflammatory mediator secretion, cell mediated by various inflammatory mediators in blood vessels and body fluids, Infiltration and fluid exudation, circulatory disturbances, tissue degeneration and hyperplasia. During the inflammatory process, the macrophages accumulate at the wound site in the early stage, attack the invading bacteria, accumulate plasma at the wound area, and increase the blood flow, resulting in external symptoms such as fever, erythema, edema, and pain. If the inflammatory reaction continues or occurs excessively, it progresses to a major pathological condition (irritable allergic disease, chronic inflammatory disease) of the disease, resulting in serious abnormal disorder.

대부분의 염증 질환의 치료제로서 널리 사용되고 있는 제제인 비스테로이드성 소염제(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDS)는 시클로옥시게나제(cyclooxygenase, COX)라고 하는 아라키돈산(arachidonic acid)로부터 프로스타글란딘(prostaglandin)의 생합성에 관여하는 효소 활성을 억제함으로써, 항염증 작용을 나타내는데, 주 치료작용 외에 위장관 장애, 간장애, 신장애 등의 심각한 부작용을 야기하므로 장기간의 사용에 있어서 제약이 따르는 실정이다. 따라서, 부작용이 거의 없어 장기간 사용하는데 무리가 없으면서 항염증 효능에 탁월한 새로운 소염 진통제의 개발이 널리 요구되고 있다. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDS), a widely used agent for the treatment of most inflammatory diseases, are produced from arachidonic acid called prostaglandin, called cyclooxygenase (COX) Inhibition of the enzymatic activity involved in biosynthesis of the glycosaminoglycans, exhibits an anti-inflammatory action. In addition to the main therapeutic effect, it causes severe side effects such as gastrointestinal disorders, hepatic disorders, renal diseases and the like. Therefore, it is widely demanded to develop a new anti-inflammatory analgesic agent which is excellent in anti-inflammatory efficacy while having no side effects and being usable for a long time.

생체에 있어서 염증의 발생 원인으로서는 다양한 생화학적인 현상이 관여하고 있다. 대식세포(Macrophage)는 다양한 기능을 가진 세포로, 화학적 자극에 의하여 여러 가지 사이토카인(cytokine)과 산화질소(NO)를 생성하여 염증반응에서 중요한 역할을 한다. 염증반응의 결과로서, iNOS(inducible nitric oxide synthase)에 의해 생성된 산화질소의 상기 생리학적인 농도(Supraphysiological concentrations)가 다양한 염증 질환의 병리생물학에 있어서 역할을 하고 있다(Kobayashi Y. et al., J Leukoc Biol., 88, pp1157-62, 2010). 염증반응의 유도 물질들 중에서 LPS(lipopolysaccharide)는 백혈구와 같은 면역세포와 상호작용을 하며, 단핵세포의 대식세포들에 있어서 iNOS 이소 형태의 활성화에 의한 산화질소 농도의 증대에 의한 염증 반응에 있어서 중요한 역할을 하고 있다(Korhonen R. et al., Curr Drug Targets Inflamm Allergy., 4, pp471-79, 2005). LPS는 그람 음성 세균의 외막(outer membrane)에 존재하는 엔도톡신(endotoxin)이며, TLR4(tolllike receptor 4)와의 결합은 IL-6(interleukin-6) 및 케모카인(chemokines) 등 많은 사이토카인 유전자의 활성화를 이끄는 신호전달을 개시하고, 이는 그 부분의 염증을 유도한다. 특히 인터페론γ, TNF-α와 같은 사이토카인 자극에 의해 발현되는 유도성 질소산화물 합성효소(iNOS)는 장시간 동안 다량의 질소산화물(NO)을 생산한다. 이러한 산화적 스트레스는 IκB에 의하여 억제되어 있는 염증 반응의 전사인자인 NFκB 활성을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 활성화된 NFκB는 핵으로 이동하여 iNOS, IL-1β나 TNF-α와 같은 여러 종류의 사이토카인 등 염증반응을 유도하는 유전자 발현을 촉진시키는 것으로 알려져 있으며, 이들 인자들을 저해하면 염증 반응을 억제하는 것으로 알려져 있다(Karin M. et al., Cold Spring Harb Perspect Biol., 1, pp1-14, 2009). Various biochemical phenomena are involved in the cause of inflammation in living body. Macrophage is a multifunctional cell that produces various cytokines and nitric oxide (NO) by chemical stimulation and plays an important role in the inflammatory response. As a result of the inflammatory response, the above-mentioned supraphysiological concentrations of nitric oxide produced by iNOS (inducible nitric oxide synthase) play a role in pathological biology of various inflammatory diseases (Kobayashi Y. et al., J Leukoc Biol., 88, pp1157-62, 2010). Among the inducers of inflammation, LPS (lipopolysaccharide) interacts with immune cells such as leukocytes, and it is important in the inflammatory response by the increase of nitric oxide concentration by activation of iNOS isoform in monocyte macrophages (Korhonen R. et al., Curr Drug Targets Inflamm Allergy., 4, pp 471-79, 2005). LPS is an endotoxin present in the outer membrane of Gram-negative bacteria. Binding to TLR4 (tolllike receptor 4) results in activation of many cytokine genes such as IL-6 (interleukin-6) and chemokines Initiating signal transduction leading to inflammation in that area. In particular, inducible nitric oxide synthase (iNOS) expressed by cytokine stimuli such as interferon gamma and TNF-alpha produces a large amount of nitrogen oxides (NO) over a long period of time. These oxidative stresses are known to promote NFκB activity, a transcription factor of inflammatory responses inhibited by IκB. Activated NFκB is known to migrate to the nucleus and promote the expression of genes that induce inflammatory responses such as iNOS, IL-1β, and TNF-α. Various inhibitors of these factors inhibit the inflammatory response (Karin M. et al., Cold Spring Harb Perspect Biol., 1, pp1-14, 2009).

최근 연구에 따르면, NO는 세 가지 주요한 NOS 이성질체(isoform)인 neuronal NOS(nNOS), endothelial NOS (eNOS), inducible NOS (iNOS)에 의해 아르기닌(arginine)으로부터 생성되는 자유라디칼이다. nNOS와 eNOS는 Ca² ⁺/칼모듈린(calmodulin)에 의해 조절되지만, iNOS는 인터루킨(interleukin), 인터페론(interferon), LPS와 같은 염증성 자극에 의해 전사 수준에서 조절된다. nNOS나 eNOS에 의해 수초 내에 소량 생성된 NO는 혈관확장, 신경전달, 병원체에 대한 세포파괴 등과 같은 정상적인 생리기능을 담당하지만, 대식세포에서 iNOS에 의해 과다 생성된 NO는 수퍼옥사이드(superoxide)와 반응하여 퍼옥시니트라이트(peroxynitrite)를 형성하고 이는 강력한 산화제로 작용하여 세포에 손상을 입히고, 염증성 자극에 의해 활성화된 대식세포에서 전사인자인 NFκB를 활성화시켜 염증반응, 암, 동맥경화 등 만성질환에 관련하는 것으로 알려져 있다. (Korhonen et al., Current Drugs Target, 4, p471-479, 2005; T. J. Guzik et al., Journal of Physiology and Pharmacology, 4, p469-487, 2003).According to a recent study, NO is a free radical generated from arginine by three major NOS isoforms: neuronal NOS (nNOS), endothelial NOS (eNOS), and inducible NOS (iNOS). nNOS and eNOS are controlled by Ca ² ⁺ / calmodulin (calmodulin), but, iNOS is regulated at the transcriptional level by inflammatory stimuli such as IL (interleukin), IFN (interferon), LPS. NO produced in a few seconds by nNOS or eNOS is responsible for normal physiological functions such as vasodilation, neurotransmission, cell destruction to pathogen, etc. However, overexpressed NO by iNOS in macrophages reacts with superoxide (Peroxynitrite), which acts as a powerful oxidant, damages cells and activates NFκB, a transcription factor in macrophages activated by inflammatory stimuli, to inhibit inflammation, cancer, arteriosclerosis, and other chronic diseases It is known to be related. (Korhonen et al ., Current Drugs Target , 4, pp. 471-479, 2005; TJ Guzik et al ., Journal of Physiology and Pharmacology , 4, pp. 469-487, 2003).

NO는 염증과 암을 포함한 다양한 병리생리학적 과정에서 iNOS에 의해 생성되는 것으로 알려져 있다. NOS는 염증, 혈관 확장, 신경전달, 종양세포와 신체의 항상성을 조절하는 중요한 효소로 L-아르기닌(L-arginine)으로부터 NO를 생성하며, 염증 상태에서는 대식세포에서 iNOS에 의해 NO를 다량 생성하여 여러 만성질환을 일으키는 것으로 알려져 있다. iNOS의 발현은 NF-κB 활성으로 유도되며 이는 대식세포에서 LPS나 사이토카인(cytokine)에 의해 염증성 매개물들이 과잉 생산되는 중요한 매커니즘이 된다. 따라서, iNOS 활성 억제제의 개발은 상기 질병의 치료제로서 개발 가능성이 높으며, 또한 이러한 관점에서 iNOS에 의한 NO 생성을 억제하는 화합물은 인체의 다양한 염증질환의 치료제로 사용될 수 있다.NO is known to be produced by iNOS in a variety of pathophysiological processes, including inflammation and cancer. NOS is an important enzyme that regulates inflammation, vasodilation, neurotransmission, tumor cell and body homeostasis. It produces NO from L-arginine and in the inflammatory state produces a large amount of NO by iNOS in macrophages It is known to cause many chronic diseases. Expression of iNOS is induced by NF-κB activation, which is an important mechanism by which macrophage LPS or cytokine overexpresses inflammatory mediators. Therefore, development of an iNOS activity inhibitor is highly likely to be developed as a therapeutic agent for the above diseases, and a compound that inhibits NO production by iNOS from this viewpoint can be used as a therapeutic agent for various inflammatory diseases of the human body.

또 다른 염증유발물질인 PGE₂, PGF_2a 그리고 PGI₂와 같은 프로스타글란딘은 아라키돈산(arachidonic acid)에서 유래한 일종의 호르몬으로 다양한 생리활성에 관여하고 상기 호르몬의 율속효소인 사이클로옥시게나아제(cyclooxygenase, COX)에 의해 발현이 조절된다. COX의 활성을 저해하여 프로스타글란딘의 합성을 저해하는 아스피린 인도메타신 같은 비스테로이드성 소염진통제는 관절염에 우수한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.In prostaglandins, such as other pro-inflammatory substance, PGE _2, PGF _2a and PGI ₂ is involved in a variety of physiological activities as a kind of hormones derived from arachidonic acid (arachidonic acid) and the rate limiting enzyme of the hormone cyclooxygenase (cyclooxygenase, COX ). &Lt; / RTI > Non-steroidal anti-inflammatory analgesics such as aspirin indomethacin, which inhibits the activity of COX and inhibit the synthesis of prostaglandins, are known to exert excellent effects on arthritis.

한편, TNF-α는 BCG, LPS 및 염증유발인자에 의해 활성화된 대식세포와 섬유아세포 등에서 생산되어 세포 살상 효과, 프로스타글란딘 및 IL-1, IL-6와 같은 사이토카인(cytokine)의 생산을 유도한다. 종양괴사인자로 발견된 TNF-α는 류마티스 관절염, 장기이식거부반응 등의 자가면역질환, 천식, 아토피성피부염 등의 알러지성 염증질환 및 폐혈증, 급성간질환 등의 급성면역질환 등에 대한 관련성이 보고되면서 TNF-α의 합성을 억제하는 화합물에 대한 개발 연구가 활발하게 진행되고 있다.On the other hand, TNF-α is produced in macrophages and fibroblasts activated by BCG, LPS and inflammation inducers, leading to the production of cytokines such as cytotoxic effects, prostaglandins and IL-1 and IL-6 . TNF-α, which is found as a tumor necrosis factor, is associated with autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis and organ transplant rejection, allergic inflammatory diseases such as asthma and atopic dermatitis, and acute immune diseases such as hematemesis and acute liver disease , The development of a compound that inhibits the synthesis of TNF-α has been actively studied.

다음으로 ICAM-1, VCAM-1을 포함한 세포 부착 분자(CAM)는 혈관내피세포 표면에서 발현되는 세포부착물질군의 대표적인 단백질이며, 염증반응시에 발현량이 급속히 진행되어 혈류중의 면역세포들이 염증발생부위에 흡착하게 되며 이는 염증반응의 증폭작용에 중요한 작용을 한다. 또한 최근 연구결과에 의하면, 염증반응에 있어서 ICAM-1, VCAM-1을 포함하는 다양한 CAM의 발현이 중요한 염증매개인자로 연구되고 있으며 이들은 염증 환자의 지표 단백질로 활용이 되고 있는 실정이다. 따라서, CAM 발현의 저해작용을 통한 항염증 및 항동맥경화 물질의 탐색연구가 활발히 진행 중에 있다.
Next, the cell adhesion molecule (CAM) including ICAM-1 and VCAM-1 is a representative protein of the cell adhesion substance group expressed on the vascular endothelial cell surface, and the expression level rapidly progresses during the inflammatory reaction, It is adsorbed at the site of development, which plays an important role in the amplification of the inflammatory reaction. Recent studies have shown that the expression of various CAMs including ICAM-1 and VCAM-1 is an important inflammatory mediator in the inflammatory response, and they are used as an indicator protein in inflammatory patients. Therefore, search for anti-inflammatory and anti-arteriosclerotic substances through inhibition of CAM expression is actively under way.

한편, 시난디온 A(cynandione A)는 CCl₄에 의해 손상된 간세포 보호 효과 정도만이 연구된 상태이고, 아직까지 시난디온 A에 대한 연구는 거의 진행된 바 없다.
On the other hand, cynandione A has only been studied for the hepatocyte protective effect damaged by CCl ₄ , and research on cinanideone A has not been conducted yet.

이에, 본 발명자들은 부작용이 없으면서 우수한 항염증 효과를 갖는 물질을 찾고자 예의 노력한 결과, 시난디온 A가 염증 반응에 의해 증가된 산화질소 생성을 억제하고, 각종 염증성 사이토카인, 염증 매개 인자, 및 세포 부착 분자 등의 발현을 억제함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
As a result of efforts to find a substance having an excellent anti-inflammatory effect without side effects, the present inventors have found that cinanideone A inhibits the production of nitric oxide, which is increased by inflammatory reaction, and inhibits various inflammatory cytokines, inflammatory mediators, And the like, thereby completing the present invention.

본 발명의 목적은 시난디온 A(cynandione A) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 항염증용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide an anti-inflammatory pharmaceutical composition comprising cynandione A or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명의 다른 목적은 시난디온 A 또는 이의 염을 포함하는 염증의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a food composition for preventing or ameliorating inflammation comprising cinanideone A or a salt thereof.

본 발명의 또 다른 목적은 시난디온 A 또는 이의 염을 포함하는 염증의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다. It is still another object of the present invention to provide a cosmetic composition for preventing or ameliorating inflammation comprising cinanideone A or a salt thereof.

본 발명의 또 다른 목적은 시난디온 A 또는 이의 염을 포함하는 염증의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다. It is still another object of the present invention to provide a quasi-drug composition for preventing or ameliorating inflammation comprising cinanideone A or a salt thereof.

본 발명의 또 다른 목적은 시난디온 A 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물을 염증성 질환의 치료가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환 치료방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for treating inflammatory diseases comprising administering a composition comprising cinanideone A or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject in need of treatment of an inflammatory disease.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 시난디온 A(cynandione A) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 항염증용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다. In one aspect, the present invention provides an anti-inflammatory pharmaceutical composition comprising cynandione A or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명에서 시난디온 A(cynandione A)는 하기 화학식 1의 화합물로 표기될 수 있다. 시난디온 A는 일반적인 화학 합성에 의해 수득되거나, 천연물로부터 분리되거나, 또는 판매되는 것을 구입하여 사용할 수 있다. In the present invention, cynandione A can be represented by the following formula (1). Cinandione A can be obtained by conventional chemical synthesis, separated from natural products, or sold.

본 발명에서 시난디온 A의 염은 약학적으로 허용가능한 염으로서, 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용할 수 있다.Salts of cinandione A in the present invention are pharmaceutically acceptable salts and acid addition salts formed by pharmaceutically acceptable free acids may be useful.

유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 아황산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 말레산, 퓨마르산, 글루코산, 메탈설폰산, 아세트산, 글리콜산, 석신산, 타타르산, 4-톨루엔 설폰산, 갈락투론산, 엠본산, 글루탐산, 시트르산, 아스파르탄산 등을 사용할 수 있다.As the free acid, organic acid and inorganic acid can be used. As the inorganic acid, hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid, sulfurous acid, phosphoric acid and the like can be used. As the organic acid, citric acid, acetic acid, maleic acid, fumaric acid, , Acetic acid, glycolic acid, succinic acid, tartaric acid, 4-toluenesulfonic acid, galacturonic acid, embonic acid, glutamic acid, citric acid and arpartic acid.

본 발명에 의한 부가염은 통상의 방법, 즉, 시난디온 A를 수혼화성 유기용매, 예를 들면 아세톤, 메탄올, 에탄올, 또는 아세토니트릴 등에 녹이고 당량 또는 과량의 유기산을 가하거나 무기산의 산 수용액을 가한 후 침전시키거나 결정화시켜서 제조하거나, 또는 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조하거나 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.The addition salt according to the present invention may be prepared by dissolving Sinanthione A in a water-miscible organic solvent such as acetone, methanol, ethanol, acetonitrile or the like, adding an equivalent amount or excess amount of an organic acid, Followed by precipitation or crystallization, or by evaporating a solvent or excess acid, followed by drying or precipitation of the precipitated salt by suction filtration.

본 발명은 시난디온 A의 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염 뿐만 아니라 이로부터 제조될 수 있는 동일한 효능을 나타내는 용매화물, 수화물 및 입체 이성질체도 모두 발명의 범주 내로 포함할 수 있다. The present invention includes both compounds of Sinanthione A and their pharmaceutically acceptable salts, as well as solvates, hydrates and stereoisomers which exhibit the same potency as can be prepared therefrom, all within the scope of the invention.

본 발명의 조성물은 시난디온 A에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. The composition of the present invention may contain at least one active ingredient which exhibits the same or similar function in addition to cinanideione A.

본 발명의 상기 조성물은 염증성 질환을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.The composition of the present invention may be used to prevent or treat inflammatory diseases.

본 발명에서, 용어 "염증"이란 외부 감염원 (박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발 물질)의 침입에 의하여 형성되는 농양의 병리적 상태를 의미할 수 있으며, "염증성 질환"이란 상기와 같은 염증을 동반하는 질병을 의미한다.In the present invention, the term "inflammation" may mean a pathological condition of an abscess formed by the infiltration of an external infectious agent (bacteria, fungi, viruses, various kinds of allergens) It means a disease accompanied by inflammation.

상기 염증성 질환은 염증 반응과 관련 있는 질병이라면 제한되지 않으며, 예를 들어, 류마티스 관절염, 동맥경화, 아토피성 피부염, 부종, 전신성 홍반성 루푸스, 경피증, 궤양성 대장염, 건선, 아나필랙시스, 피부염, 당뇨병성 망막증, 망막염, 황반 변성, 포도막염, 결막염, 관절염, 강직성 척추염, 골관절염, 골다공증, 알레르기, 당뇨, 당뇨성 신장병, 신염, 신장염, 쇼그렌 증후군, 크론씨 병, 자가 면역 췌장염, 치주질환, 천식, 이식편 대 숙주 질환, 만성 골반 염증 질환, 자궁내막염, 비염, 편도염, 중이염, 인후염, 방광염, 또는 만성 전립선염 등일 수 있다. 바람직하게는, 류마티스 관절염, 동맥경화, 또는 아토피성 피부염 일 수 있다. The inflammatory disease is not limited as long as it is a disease associated with an inflammatory reaction and includes, for example, rheumatoid arthritis, arteriosclerosis, atopic dermatitis, edema, systemic lupus erythematosus, scleroderma, ulcerative colitis, psoriasis, Diabetic nephropathy, nephritis, nephritis, Sjogren's syndrome, Crohn's disease, autoimmune pancreatitis, periodontal disease, asthma, grafts, diabetic retinopathy, retinitis, macular degeneration, uveitis, conjunctivitis, osteoarthritis, osteoarthritis, osteoarthritis, osteoporosis, Chronic pelvic inflammatory disease, endometritis, rhinitis, tonsillitis, otitis media, sore throat, cystitis, or chronic prostatitis. Preferably, it can be rheumatoid arthritis, arteriosclerosis, or atopic dermatitis.

본 발명의 일 실시예에서는 시난디온 A가 염증을 유도하는 리포폴리사카라이드(LPS)에 의해 증가된 산화질소(NO)의 생성을 저해하고, 염증 유발인자인 프로스타글란딘, iNOS, COX-2의 유전자 및 단백질 발현을 저해하며, 염증반응에 의해 유도된 IL-1, IL-6, TNF-α의 유전자 발현이 저해하고, 세포 부착 분자인 ICAM-1, VCAM-1의 단백질 발현을 저해하는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라, 시난디온 A가 LPS로 증가된 IκB-α의 인산화를 저해하고, NF-κB의 핵 내 이동을 저해하며, 핵 내의 타겟 DNA의 결합 활성을 저해할 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 항염증 활성을 마우스 동물 모델에서도 확인하였으며, 특히, 시난디온 A는 항염증 활성을 나타내는 모든 범위 내에서 세포 독성을 나타내지 않는 안전한 물질임을 확인하였는 바, 시난디온 A는 부작용 없이 염증성 질환을 효과적으로 치료하고 개선할 수 있다. In one embodiment of the present invention, cinandione A inhibits the production of nitric oxide (NO), which is increased by lipopolysaccharide (LPS), which induces inflammation, and inhibits inflammation inducers such as prostaglandins, iNOS, and COX-2 Inhibits the expression of IL-1, IL-6, and TNF-α induced by inflammation and inhibits protein expression of cell adhesion molecules, ICAM-1 and VCAM-1 Respectively. In addition, it was confirmed that cinandione A inhibits the phosphorylation of IκB-α increased by LPS, inhibits NF-κB translocation in the nucleus, and inhibits the binding activity of the target DNA in the nucleus. In addition, the anti-inflammatory activity was confirmed in a mouse animal model. In particular, it was confirmed that cinanideone A is a safe substance that does not exhibit cytotoxicity within the entire range of anti-inflammatory activity. Sinanideone A is an inflammatory disease Can be effectively treated and improved.

본 발명에서, 용어 "예방"이란 조성물의 투여에 의해 염증성 질환에 의한 증상을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"란 조성물의 투여에 의해 염증성 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.In the present invention, the term "prevention" means any action that inhibits or slows the onset of an inflammatory disease by administration of the composition. By " treatment " It means all the actions that benefit and change.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌 글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 유슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier. The composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier may be of various oral or parenteral formulations. In the case of formulation, it can be prepared using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, humectants, disintegrants, surfactants and the like which are usually used. Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which may contain one or more excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose lactose, gelatin, and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc, and the like may also be used. Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, syrups and the like. Various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives and the like may be included in addition to water and liquid paraffin, which are simple diluents commonly used. have. Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. Examples of the non-aqueous solvent and the suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate. Examples of the suppository base include witepsol, macrogol, tween 61, cacao paper, laurin, glycerogelatin and the like. The pharmaceutical composition may be selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, syrups, suspensions, solutions, emulsions, syrups, sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze- It can have one formulation.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. The composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. In the present invention, "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level will vary depending on the species and severity, age, sex, , Sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including co-administered drugs, and other factors well known in the medical arts. The composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And can be administered singly or multiply. It is important to take into account all of the above factors and to administer the amount in which the maximum effect can be obtained in a minimal amount without side effects, which can be easily determined by a person skilled in the art.

본 발명의 조성물은 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
The composition of the present invention can be used alone or in combination with methods using surgery, hormone therapy, drug therapy and biological response modifiers for the prevention or treatment of inflammatory diseases.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 시난디온 A 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물을 염증성 질환의 치료가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환의 치료방법을 제공한다. In another aspect, the present invention provides a method for treating an inflammatory disease, comprising administering to a subject in need thereof a composition comprising cinandione A or a pharmaceutically acceptable salt thereof of the present invention for treatment of an inflammatory disease do.

본 발명에서, 용어 "개체"란 염증성 질환이 이미 발병되었거나 발병될 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다.In the present invention, the term "individual" refers to all animals, including humans, who have already developed or are capable of developing an inflammatory disease.

상기 염증성 질환, 예방 및 치료는 상기에서 설명한 바와 같다.The above inflammatory diseases, prevention and treatment are as described above.

본 발명의 조성물은 기존의 염증성 질환의 치료제와 병행하여 투여할 수 있으며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 목적하는 바에 따라 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
The composition of the present invention may be administered in combination with a conventional therapeutic agent for inflammatory diseases. The administration route of the composition may be administered through any conventional route as long as it can reach the target tissue. , Intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, oral, intranasal, intrapulmonary, rectal, and the like.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 시난디온 A 또는 이의 염을 포함하는 염증의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. In yet another aspect, the present invention provides a food composition for preventing or ameliorating inflammation comprising cinanideone A or a salt thereof.

보다 구체적으로, 본 발명의 조성물은 염증의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품 조성물에 첨가할 수 있다.More specifically, the composition of the present invention may be added to a health functional food composition for the purpose of preventing or improving inflammation.

본 발명의 조성물을 건강기능식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 건강기능식품 또는 건강기능식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 바람직하게는 15 중량부 이하, 보다 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 조절 및 위생을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안정성 면에서 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.When the composition of the present invention is used as a health functional food additive, the composition may be added as it is or may be used together with other health functional foods or health functional food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method. The amount of the active ingredient to be mixed can be appropriately determined depending on the purpose of use. Generally, the composition of the present invention may be added in an amount of preferably not more than 15 parts by weight, more preferably not more than 10 parts by weight, based on the raw material, in the production of food or beverage. However, in the case of long-term intake intended for health control and hygiene, the amount may be less than the above range, and since there is no problem in terms of stability, the active ingredient may be used in an amount in the above range.

본 발명의 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 조성물을 첨가할 수 있는 건강기능식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있고, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함할 수 있으며, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품을 포함할 수 있다.There is no particular limitation on the kind of the health functional food of the present invention. Examples of the health functional food to which the composition can be added include dairy products such as meat, sausage, bread, chocolate, candy, snack, confectionery, pizza, ramen and other noodles, gums, ice cream, Alcoholic beverages, and vitamin complexes, and may include all the health functional foods in the conventional sense, and foods used as feeds for animals.

또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물이 음료의 형태로 사용될 경우에는 통상의 음료와 같이 여러 가지 감미제, 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스와 같은 디사카라이드, 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨과 같은 당알콜일 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 이에 제한되지는 않으나, 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 바람직하게는 약 0.01 내지 0.04g, 보다 바람직하게는 0.02 내지 0.03g일 수 있다. 상기 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제 및 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제일 수 있다.In addition, when the health functional food composition of the present invention is used in the form of a drink, it may contain various sweetening agents, flavoring agents, or natural carbohydrates as additional components such as ordinary beverages. The natural carbohydrates may be polysaccharides such as disaccharides such as monosaccharides such as glucose and fructose, maltose, sucrose, dextrin, cyclodextrins, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol. The ratio of the natural carbohydrate is not limited thereto, but may be about 0.01 to 0.04 g, more preferably 0.02 to 0.03 g per 100 ml of the composition of the present invention. The sweeteners may be natural sweeteners such as tau martin and stevia extract, and synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame.

상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.In addition to the above, the health functional food composition of the present invention may contain various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloid thickening agents, pH adjusting agents, stabilizers, , Alcohols, carbonating agents used in carbonated drinks, and the like. It may also contain flesh for the production of natural fruit juices, fruit juice drinks and vegetable drinks.

상기 본 발명의 식품 조성물은 염증의 예방 또는 개선을 위한 사료첨가제의 형태로 제공될 수 있다. 상기 사료첨가제는 가금류, 가축 등에게 꾸준히 섭취하게 함으로써 염증을 예방할 수 있고, 이미 발생한 염증을 치료할 수 있다.The food composition of the present invention may be provided in the form of a feed additive for preventing or improving inflammation. The feed additive can be prevented from being irritated by continuously ingesting the feed additive into poultry, domestic animals, etc., and the inflammation that has already occurred can be treated.

본 발명의 사료첨가제는 공지의 담체, 안정제 등을 포함할 수 있으며, 필요에 따라 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 포함할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있다. 본 발명의 사료첨가제는 가금류 및 가축 등에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.
The feed additive of the present invention may contain known carriers, stabilizers and the like and may contain various nutrients such as vitamins, amino acids and minerals, antioxidants, antibiotics, antibacterial agents and other additives as needed, The shape thereof may be a suitable state such as powder, granule, pellet, suspension and the like. The feed additive of the present invention can be supplied to poultry, livestock and the like singly or in a mixture with feed.

또 다른 양태로서, 본 발명은 시난디온 A 또는 이의 염을 포함하는 염증의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다. In another aspect, the present invention provides a cosmetic composition for preventing or improving inflammation comprising cinanideone A or a salt thereof.

보다 구체적으로, 본 발명의 조성물은 염증의 예방 또는 개선을 목적으로 화장료 조성물에 첨가할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 상기 유화 제형으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 상기 가용화 제형으로는 유연화장수 등이 있다. 적합한 제형은 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 바이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태일 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태일 수 있다. More specifically, the composition of the present invention can be added to cosmetic compositions for the purpose of preventing or improving inflammation. The cosmetic composition of the present invention can be produced in the form of a general emulsified formulation and a solubilized formulation. Examples of the emulsified formulations include nutritive lotions, creams, essences, and the like, and the solubilization formulations include softening longevity. Suitable formulations include, but are not limited to, solutions, gels, solid or paste anhydrous products, emulsions obtained by dispersing the oil phase in water, suspensions, microemulsions, microcapsules, microgranules or ionic (liposomes) A cream, a skin, a lotion, a powder, an ointment, a spray, or a conical stick. It may also be in the form of a foam or in the form of an aerosol composition further containing a compressed propellant.

상기 화장료 조성물은 추가적으로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장료 조성물에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.
The cosmetic composition may further contain at least one selected from the group consisting of fatty substances, organic solvents, solubilizers, thickening and gelling agents, softening agents, antioxidants, suspending agents, stabilizers, foaming agents, perfumes, surfactants, water, ionic or nonionic emulsifiers, Auxiliaries such as ionic sequestering agents, chelating agents, preservatives, vitamins, blocking agents, moisturizers, essential oils, dyes, pigments, hydrophilic or lipophilic active agents, lipid vesicles or any other ingredients conventionally used in cosmetic compositions &Lt; / RTI >

또 다른 양태로서, 본 발명은 시난디온 A 또는 이의 염을 포함하는 염증의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다. In another aspect, the present invention provides a quasi-drug composition for preventing or ameliorating inflammation comprising cinanideone A or a salt thereof.

보다 구체적으로, 본 발명의 조성물은 염증의 예방 또는 개선을 목적으로 의약외품 조성물에 첨가할 수 있다.More specifically, the composition of the present invention may be added to a quasi-drug composition for the purpose of preventing or improving inflammation.

본 발명에서 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니하며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염형 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미한다.The term "quasi-drug" in the present invention means a fiber, a rubber product or the like used for the purpose of treating, alleviating, treating or preventing a disease of a human or an animal, Or products similar to those that are not machinery, preparations used for sterilization, insecticides and similar uses for the prevention of infectious diseases, for the purpose of diagnosing, treating, alleviating, treating, or preventing diseases of human beings or animals Means goods, machinery, or apparatus other than the apparatus, machinery or equipment of the commodity being used and used for the purpose of giving pharmacological effects to the structure and function of humans or animals.

본 발명의 조성물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.When the composition of the present invention is used as a quasi-drug additive, the composition may be added as it is or may be used together with other quasi-drugs or quasi-drugs, and may be appropriately used according to a conventional method. The amount of the active ingredient to be mixed can be appropriately determined depending on the purpose of use.

본 발명의 의약외품 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 패치, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제일 수 있다.
The quasi-drug composition of the present invention may be a disinfectant cleaner, a shower foam, a gagrin, a wet tissue, a detergent soap, a hand wash, a patch, a humidifier filler, a mask, an ointment or a filter filler.

본 발명의 시난디온 A는 독성을 나타내지 않으며, 염증 매개 인자인 NO, iNOS, PEG2, COX-2, IL-6 및 IL-1β 생성 억제 활성이 우수하여, 염증성 질환에 탁월한 효과가 있으므로 염증성 질환의 예방, 개선, 또는 치료를 위한 안전한 제제로서 유용하게 사용될 수 있다Cinnandione A of the present invention does not exhibit toxicity and is excellent in the inflammatory mediators such as NO, iNOS, PEG2, COX-2, IL-6 and IL-1β production inhibitory activity and thus has an excellent effect on inflammatory diseases. Can be usefully used as a safe preparation for prevention, amelioration, or treatment

도 1은 RAW264.7 세포에 대한 시난디온 A의 NO 생성 저해 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 RAW264.7 세포에 대한 시난디온 A의 PGE₂ 생성 저해 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 RAW264.7 세포에 대한 시난디온 A의 세포독성 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 혈관내피세포에 대한 시난디온 A의 세포독성 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 RAW264.7 세포에 대한 시난디온 A의 iNOS와 COX-2 유전자 발현 저해 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 RAW264.7 세포에 대한 시난디온 A의 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 유전자 발현 저해 효과를 나타낸 것이다.
도 7은 혈관내피세포에 대한 시난디온 A의 ICAM-1, VCAM-1, IL-1β, IL-6, 및 TNF-α유전자 발현 저해 효과를 나타낸 것이다.
도 8은 RAW264.7 세포에 대한 시난디온 A의 iNOS와 COX-2의 단백질 발현 저해 효과를 나타낸 것이다.
도 9는 혈관내피세포에 대한 시난디온 A의 ICAM-1과 VCAM-1 단백질 발현 저해 효과를 나타낸 것이다.
도 10은 RAW264.7 세포에 대한 시난디온 A의 IκB-α의 인산화 저해 효과를 나타낸 것이다.
도 11은 RAW264.7 세포에 대한 시난디온 A의 NF-κB 핵 내 이동 저해 효과를 나타낸 것이다.
도 12는 RAW264.7 세포에 대한 시난디온 A의 핵 내의 타겟 DNA 결합 활성 저해 효과를 나타낸 것이다.
도 13은 시난디온 A에 의한 혈관내피세포와 면역세포의 기능성 부착활성 저해 효과를 나타낸 것이다.
도 14는 마우스모델에 대한 시난디온 A의 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 생성 저해 효과를 나타낸 것이다.
도 15는 마우스모델에 대한 시난디온 A의 iNOS와 COX-2의 단백질 발현 저해 효과를 나타낸 것이다. Figure 1 shows the inhibitory effect of Sinanthion A on NO production on RAW264.7 cells.
Figure 2 shows the inhibitory effect of cinanideone A on PGE ₂ production in RAW 264.7 cells.
Fig. 3 shows the cytotoxicity test results of cinanideone A against RAW264.7 cells.
4 shows cytotoxicity test results of cinanideone A on vascular endothelial cells.
Fig. 5 shows inhibitory effects of Sinanthion A on iNOS and COX-2 gene expression in RAW264.7 cells.
FIG. 6 shows the inhibitory effect of cinanideone A on IL-1β, IL-6 and TNF-α gene expression in RAW264.7 cells.
FIG. 7 shows the inhibitory effect of cinanideone A on ICAM-1, VCAM-1, IL-1β, IL-6 and TNF-α gene expression in vascular endothelial cells.
Fig. 8 shows inhibitory effects of synandione A on iNOS and COX-2 protein expression in RAW264.7 cells.
FIG. 9 shows the inhibitory effect of Sinanthion A on ICAM-1 and VCAM-1 protein expression on vascular endothelial cells.
Fig. 10 shows the phosphorylation inhibitory effect of IκB-a of cinanideone A on RAW264.7 cells.
11 shows the inhibitory effect of cinanideone A on NF-κB nuclear transfer in RAW264.7 cells.
Fig. 12 shows the effect of inhibiting target DNA binding activity in the nucleus of Sinanthion A against RAW264.7 cells.
13 shows the inhibitory effect of cinanideone A on the functional adhesion of vascular endothelial cells and immune cells.
Fig. 14 shows IL-1β, IL-6 and TNF-α production inhibitory effects of cinanideone A on the mouse model.
Fig. 15 shows the inhibitory effect of synandione A on iNOS and COX-2 protein expression on mouse models.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are for further illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예Example 1: One: 시난디온Sinan Dion A ( A ( cynandionecynandione A)의 준비 A) Preparation

시난디온 A(cynandione A)의 항염증 효과를 확인하기 위하여, 먼저 시난디온 A를 준비하였다. 구체적으로, 백하수오 뿌리 분말 5 kg을 80% 메탄올 수용액 10 L로 실온에서 12시간 동안 2회 추출하였다. 얻어진 추출물을 여과하고 감압 농축하여 메탄올 추출물(845 g)을 얻었다. 얻어진 메탄올 추출물을 에틸아세테이트(3 L × 3)와 물(3 L)로 분배 추출하였고, 다시 물 층을 n-부탄올(3 L × 3)로 분배 추출하였다. 각 층을 감압 농축하여 에틸아세테이트 분획물(CWE, 78 g), n-부탄올 분획물(CWB, 91 g) 및 물 분획물(CWH, 650 g)을 얻었다. 에틸아세테이트 분획물(78 g)로부터 SiO₂ 칼럼 크로마토그래피(column chromatography(c.c.)) (φ 15 × 16 cm, n-헥산-에틸아세테이트)를 실시하여 19개의 분획물(CWE-1 ~ CWE-19)을 얻었다. 그 중 CWE-7 분획물(4.53 g)에 대하여 SiO₂ c.c.(φ 4.5 ×15 cm, 클로로포름:메탄올:물 = 10:5:1)를 실시하여 6개의 분획(CWE-7-1 ~ CWE-7-6)으로 나누었고, 시난디온 A[CWE-7-5, 300 mg, TLC(SiO₂ F254) Rf 0.50, CHCl₃:MeOH = 10:1]를 분리하였다.
To confirm the anti-inflammatory effect of cynandione A, Sinanthione A was first prepared. Specifically, 5 kg of white soda root powder was extracted twice with 10 L of 80% aqueous methanol solution for 12 hours at room temperature. The obtained extract was filtered and concentrated under reduced pressure to obtain a methanol extract (845 g). The obtained methanol extract was partitioned with ethyl acetate (3 L × 3) and water (3 L), and the water layer was further extracted with n - butanol (3 L × 3). Each layer was concentrated under reduced pressure to obtain ethyl acetate fraction (CWE, 78 g), n -butanol fraction (CWB, 91 g) and water fraction (CWH, 650 g). 19 fractions (CWE-1 to CWE-19) were obtained from the ethyl acetate fraction (78 g) by SiO ₂ column chromatography (cc) (φ 15 × 16 cm, n -hexane-ethyl acetate) . 7 fractions (CWE-7-1 to CWE-7) were obtained by performing SiO ₂ cc (φ 4.5 × 15 cm, chloroform: methanol: water = 10: 5: 1) on CWE- -6) as nanueotgo, Sinan dione a [CWE-7-5, 300 mg , TLC (SiO 2 F254) Rf 0.50, CHCl 3: 1: MeOH = 10] were isolated.

실시예Example 2: 산화질소( 2: Nitric oxide ( nitricnitric oxideoxide , , NONO ) 생성 측정) Production measurement

96-웰 플레이트에서 마우스 대식세포인 RAW264.7 (1 × 10⁴cells/mL)를 10% FBS, 페니실린(100 unit/mL), 스트렙토마이신설페이트(100 ㎍/mL)가 포함된 DMEM 배지로 37℃, 5% 이산화탄소의 환경에서 배양하였으며, 시난디온 A(40, 20, 10, 5, 0 μM)를 처리한 후, 리포폴리사카라이드(LPS, 1 ㎍/mL)를 처리하여 24시간 배양하였다. 배양된 세포 배지 100 ㎕를 Griess 시약(5% (v/v), 인산 및 0.1% (w/v) 나프틸에틸렌디아민-염산에 용해된 동량의 1% (w/v) 설파닐아미드) 100 ㎕에 혼합한 후, 실온에서 10 분 동안 배양하였으며, 그 후 마이크로플레이트 리더를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 신선한 배지는 모든 실험에서 무처리군으로 사용하였다. 시료에서의 산화질소(NO)의 양은 배지에서 준비된 소듐니트라이트(sodium nitrite) 표준곡선으로부터 계산되었다.Mouse macrophages RAW264.7 (1 x 10 ⁴ cells / mL) were cultured in 96-well plates in DMEM medium containing 10% FBS, penicillin (100 unit / mL) and streptomycin sulfate (100 μg / mL) (LPS, 1 ㎍ / mL) and cultured for 24 hours after treatment with Cinandione A (40, 20, 10, 5, 0 μM) and then with lipopolysaccharide . 100 [mu] l of the cultured cell culture medium was diluted with Griess reagent (1% (w / v) sulfanilamide dissolved in 5% (v / v) phosphoric acid and 0.1% (w / v) naphthylethylenediamine- After incubation at room temperature for 10 minutes, the absorbance was measured at 540 nm using a microplate reader. Fresh medium was used as untreated group in all experiments. The amount of nitrogen oxide (NO) in the sample was calculated from the sodium nitrite standard curve prepared in the medium.

그 결과, LPS를 처리한 군에서 NO의 생성이 유의적으로 증가하였으나, 시난디온 A를 추가적으로 처리한 군에서는 LPS로 증가된 NO의 생성량이 시난디온 A의 농도 의존적으로 감소함을 확인할 수 있었다. 특히, 시난디온 A를 40μM 처리한 군에서는 LPS를 처리하지 않은 군 보다 NO의 생성량이 적음을 확인할 수 있었다(도 1).
As a result, NO production was significantly increased in the LPS treated group, but it was confirmed that the amount of NO increased by LPS in the group treated with Shinanideone A was decreased in a concentration dependent manner. In particular, it was confirmed that the amount of NO produced was less in the group treated with 40 袖 M of cinanideone A than in the group not treated with LPS (Fig. 1).

실시예Example 3: 프로스타글란딘( 3: prostaglandin ( ProstaglandinProstaglandin EE ₂₂ , , PGEPGE ₂₂ ) 생성 측정) Production measurement

96-웰 플레이트에서 마우스 대식세포인 RAW264.7 (1 × 10⁴cells/mL)를 10% FBS, 페니실린(100 unit/mL), 스트렙토마이신설페이트(100 ㎍/mL)가 포함된 DMEM 배지로 37℃, 5% 이산화탄소의 환경에서 배양하였으며, 시난디온 A(40, 20, 10, 5, 0 μM)를 처리한 후, LPS (1 ㎍/mL)를 처리하여 24시간 배양하였다. 배양된 세포 배지 100 ㎕를 상업적으로 판매되고 있는 프로스타글란딘 E₂ 효소 면역 분석 키트(Prostaglandin E₂ enzyme immunoassay kit (assay designs사, USA))의 사용순서에 따라, 혼합 후에 사용법 시간 동안 처리를 해주고, 그 후 마이크로플레이트 리더를 이용하여 570 nm ~ 590 nm에서 흡광도를 측정하였다. 신선한 배지는 모든 실험에서 무처리군으로 사용하였다. 시료에서의 프로스타글란딘의 생성량은 사용한 키트속에 들어있는 분석 버퍼(assay buffer)에 준비된 PGE₂ 스탠다드 표준곡선으로부터 계산되었다.Mouse macrophages RAW264.7 (1 x 10 ⁴ cells / mL) were cultured in 96-well plates in DMEM medium containing 10% FBS, penicillin (100 unit / mL) and streptomycin sulfate (100 μg / mL) (40, 20, 10, 5, and 0 μM), and treated with LPS (1 μg / mL) for 24 hours. 100 [mu] l of the cultured cell culture medium was added to a commercially available prostaglandin E ₂ enzyme immunoassay kit (Prostaglandin E ₂ enzyme immunoassay kit (assay designs, USA)) was used for the usage time after mixing and then the absorbance was measured at 570 nm to 590 nm using a microplate reader. Fresh medium was used as untreated group in all experiments. The amount of prostaglandin produced in the sample was calculated from the PGE ₂ standard standard curve prepared in the assay buffer contained in the kit used.

측정 결과, LPS 처리에 따라 증가된 프로스타글란딘의 생성량은 시난디온 A의 처리에 따라 감소되었으며, 시난디온 A의 농도 의존적으로 감소되었다(도 2).
As a result of the measurement, the amount of prostaglandin increased by LPS treatment was decreased according to the treatment with Sinanthion A, and the concentration of Sinanthion A was decreased in a concentration-dependent manner (FIG. 2).

실시예Example 4: 4: 시난디온Sinan Dion A의 세포독성 실험 A cytotoxicity experiment

시난디온 A의 세포독성 실험은 MTT 분석법으로 측정하였다. 세포독성 실험 배양액은 배양실험 종료 3시간 전에 MTT 용액 (인산완충용액-살린 속에 10 mg/mL, pH 7.4) 5 mL를 첨가하였다. 세포는 반응 종료까지 계속 배양시켰다. 배양은 포르마잔의 용해성을 증가시키기 위해 DMSO를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 540 nm에서 광학 밀도(OD)는 ELISA 마이크로플레이트 리더를 사용하여 측정하였다.The cytotoxicity test of Sinanthion A was measured by MTT assay. Cytotoxicity To the culture solution, 5 mL of MTT solution (phosphate buffer solution-10 mg / mL in saline, pH 7.4) was added 3 hours before the end of the culture. Cells were continuously incubated until termination of the reaction. The culture was stopped by adding DMSO to increase the solubility of formazan. Optical density (OD) at 540 nm was measured using an ELISA microplate reader.

RAW264.7 대식세포 또는 인간의 혈관내피세포(HUVECs)에 시난디온 A를 5, 10, 20, 40 μM의 양으로 처리하여 세포 독성을 측정한 결과, 모든 군에서 세포 독성이 관찰되지 않아, 시난디온 A가 매우 안전한 물질임을 확인할 수 있었다(도 3, 도 4).
RAW264.7 Cytotoxicity was measured by treatment of cytandanide A in the amounts of 5, 10, 20, and 40 μM in macrophages or human vascular endothelial cells (HUVECs). As a result, cytotoxicity was not observed in all groups, Dion A was found to be a very safe material (Figs. 3 and 4).

실시예Example 5: 5: iNOSiNOS , , COXCOX -2, -2, ILIL -1, -One, ICAMICAM -1, -One, VCAMVCAM -1, -One, TNFTNF -α 및 -α and ILIL -6의 -6 mRNAmRNA 발현 측정 Expression measurement

DMSO를 이용해 시난디온 A 10 mM을 만들었으며, 이를 농도별로 희석하여 RAW264.7 세포 또는 혈관내피세포(HUVECs)에 처리하였다. 그런 후, LPS를 처리하고 24시간 배양한 뒤 세포에서 RNA 전체를 분리하고 각각의 유전자에 대한 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다.DMSO was used to generate 10 mM Sinanthion A, which was diluted by concentration and treated with RAW264.7 cells or vascular endothelial cells (HUVECs). Then, the cells were treated with LPS and incubated for 24 hours. Then, the whole RNA was isolated from the cells and RT-PCR was performed using primers for the respective genes.

사용한 프라이머는 하기와 같았다. The primers used were as follows.

iNOS: 5’-TCT TCG AAA TCC CAC CTG AC-3’ (sense, 서열번호 1) 및 5’-CCA TGA TGG TCA CAT TCT GC- 3’ (antisense, 서열번호 2)3 '(sense, SEQ ID NO: 1) and 5'-CCA TGA TGG TCA CAT TCT GC-3' (antisense, SEQ ID NO: 2)

TNF-α: 5’- TTG ACC TCA GCG CTG AGT TG-3’ (sense, 서열번호 3) 및 5’-CCT GTA GCC CAC GTC GTA GC-3’ (antisense, 서열번호 4)3 '(sense, SEQ ID NO: 3) and 5'-CCT GTA GCC CAC GTC GTA GC-3' (antisense, SEQ ID NO: 4)

IL-6: 5’-GAG GAT ACC ACT CCC AAC AG-3’ (sense, 서열번호 5) 및 5′-TTC ACA GAG GAT ACC ACT CC-3′ (antisense, 서열번호 6) IL-6: 5'-GAG GAT ACC ACT CCC AAC AG-3 '(sense, SEQ ID NO: 5) and 5'- TTC ACA GAG GATAC ACT CC-

IL-1β: 5’- GAA GCT GTG GCA GCT ACC TAT GTC T-3′ (sense, 서열번호 7) 및 5’- CTC TGC TTG TGA GGT GCT GAT GTA C-3’ (antisense, 서열번호 8)(Sense, SEQ ID NO: 7) and 5'-CTC TGC TTG TGA GGT GCT GAT GTA C-3 '(antisense, SEQ ID NO: 8)

COX-2: 5′-GTG GGC CGC CCT AGG CAC CAG-3′ (sense, 서열번호 9) 및 5′-GGA GGA AGA GGA TGC GGC AGT-3′ (antisense, 서열번호 10)3 '(sense, SEQ ID NO: 9) and 5'-GGA GGA AGA GGA TGC GGC AGC-3' (antisense, SEQ ID NO: 10)

ICAM-1: 5’-CTC CAA TGT GCC AGG CTT G -3’ (sense, 서열번호 11) 및 5’-CAG TGG GAA AGT GCC ATC CT-3’ (antisense, 서열번호 12)ICAM-1: 5'-CTC CAA TGT GCC AGG CTT G -3 '(sense, SEQ ID NO: 11) and 5'-CAG TGG GAA AGT GCC ATC CT-

VCAM-1: 5’-GTC TTC ACC ACC ATG GAG AA-3’ (sense, 서열번호 13) 및 5’-AGG AGG CAT TGC TGA TGA TC-3 (antisense, 서열번호 14) AGC CAT TGC TGA TGA TC-3 (antisense, SEQ ID NO: 14) and VCAM-1: 5'-GTC TTC ACC ACC ATG GAG AA-

상기 프라이머들을 이용하여 95℃에서 10분동안 초기 변성(initial denaturation) 시켰으며, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 및 72℃에서 30초 조건으로 23 내지 28회 증폭하였다. The primers were subjected to initial denaturation at 95 ° C for 10 minutes and amplified 23 to 28 times at 95 ° C for 30 seconds, 58 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds.

수행 결과, RAW264.7 세포에서 LPS 처리로 인해 증가된 iNOS와 COX-2의 유전자 발현이 시난디온 A를 처리함에 따라 농도 의존적으로 감소하게 됨을 확인하였다(도 5).As a result, it was confirmed that the gene expression of iNOS and COX-2 increased due to LPS treatment in RAW264.7 cells was decreased in a concentration-dependent manner by treatment with cinanide Dion A (FIG. 5).

또한, RAW264.7 세포에서 LPS 처리로 인해 증가된 IL-1β, IL-6, TNF-α의 유전자 발현이 시난디온 A를 처리함에 따라 농도 의존적으로 감소하게 됨을 확인하였다(도 6). In addition, it was confirmed that gene expression of IL-1β, IL-6, and TNF-α increased due to LPS treatment in RAW264.7 cells was reduced in a concentration-dependent manner when treated with cinanide A (FIG.

또한, 혈관내피세포에서 LPS 처리로 인해 증가된 ICAM-1, VCAM-1, IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 유전자 발현량이 시난디온 A를 처리함에 따라 농도 의존적으로 감소하게 됨을 확인하였다(도 7).
In addition, it was found that the gene expression levels of ICAM-1, VCAM-1, IL-1β, IL-6 and TNF-α increased by LPS treatment in vascular endothelial cells were decreased in a dose dependent manner (Fig. 7).

실시예Example 6: 6: iNOSiNOS , , COXCOX -2, -2, ICAMICAM -1, 및 -1, and VCAMVCAM -1의 단백질 발현 측정-1 protein expression measurement

시난디온 A가 iNOS와 COX-2의 단백질 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여 RAW264.7 대식세포에 시난디온 A를 농도별로 처리하고 동시에 LPS (1 ㎍/mL)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 그런 후 세포를 용해시켜 모은 총 단백질들을 전기영동법으로 분리한 후 전환하여, iNOS와 COX-2의 항체를 가지고 웨스턴 블랏을 이용하여 iNOS와 COX-2의 발현량을 측정하였다.To determine the effect of cinandione A on protein expression of iNOS and COX-2, synandilide A was treated with RAW264.7 macrophages in a concentration-dependent manner, and LPS (1 ug / mL) was treated at the same time for 24 hours . Then, the total proteins collected by dissolving the cells were separated by electrophoresis, and the expression amounts of iNOS and COX-2 were measured using iNOS and COX-2 antibodies by Western blotting.

그 결과, RAW264.7 세포에서 LPS 처리로 인해 증가된 iNOS와 COX-2의 단백질 발현이 시난디온 A를 처리함에 따라 농도 의존적으로 감소하게 됨을 확인하였다(도 8).As a result, it was confirmed that the protein expression of iNOS and COX-2 increased due to LPS treatment in RAW264.7 cells was decreased in a concentration-dependent manner by treatment with cygnanide A (FIG. 8).

또한, 시난디온 A가 ICAM-1, VCAM-1의 단백질 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여 인간 혈관내피세포(HUVECs)에 시난디온 A을 농도별로 처리하고 동시에 LPS (1 ㎍/mL)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 그런 후 세포를 용해시켜 모은 총 단백질들을 전기영동법으로 분리한 후 전환하여, ICAM-1과 VCAM-1 항체를 가지고 웨스턴 블랏을 이용하여 ICAM-1과 VCAM-1의 발현량을 측정하였다.In order to examine the effect of cinanideone A on the protein expression of ICAM-1 and VCAM-1, synandilide A was administered to human vascular endothelial cells (HUVECs) in a concentration-dependent manner and LPS (1 μg / mL) And cultured for 24 hours. Then, the total proteins collected by dissolving the cells were separated by electrophoresis, and the expression levels of ICAM-1 and VCAM-1 were measured using ICAM-1 and VCAM-1 antibodies by Western blotting.

그 결과, 혈관내피세포에서 LPS 처리로 인해 증가된 ICAM-1 및 VCAM-1의 단백질 발현이 시난디온 A를 처리함에 따라 농도 의존적으로 감소하게 됨을 확인하였다(도 9).
As a result, it was confirmed that the protein expression of ICAM-1 and VCAM-1, which were increased by LPS treatment in vascular endothelial cells, decreased in a concentration-dependent manner upon treatment with cinanide Dion A (FIG.

실시예Example 7: IκB-α의 인산화 및 분해 정도 측정 7: Measurement of phosphorylation and degradation of IκB-α

시난디온 A가 IκB-α의 인산화 및 분해에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여, RAW264.7 대식세포에 시난디온 A를 농도별로 처리하고, 동시에 LPS (1 ㎍/mL)를 처리하여 3시간 동안 배양하였다. 그런 후 세포를 용해시켜 모은 총 단백질들을 전기영동법으로 분리한 후 전환하여, p-IκB-α와 IκB-α 항체를 가지고 웨스턴 블랏을 이용하여 p-IκB-α와 IκB-α의 발현량을 측정하였다.To determine the effect of cinandione A on the phosphorylation and degradation of IκB-α, synandione A was treated with RAW264.7 macrophages in a concentration-dependent manner, and LPS (1 μg / mL) Respectively. Then, the total proteins collected by dissolving the cells were separated by electrophoresis, and the expression levels of p-IκB-α and IκB-α were measured using p-IκB-α and IκB-α antibodies by Western blot Respectively.

그 결과, RAW264.7 세포에서 LPS 처리로 인해 증가된 IκB-α의 인산화가 시난디온 A를 처리함에 따라 농도 의존적으로 저해됨을 확인하였다(도 10).
As a result, it was confirmed that the phosphorylation of IκB-a increased by LPS treatment in RAW264.7 cells was inhibited in a concentration-dependent manner by treating Sinanthion A (FIG. 10).

실시예Example 8: 8: p65p65 단백질의 핵 내 이동량 측정 Measurement of protein migration in nucleus

시난디온 A가 핵 내로 이동하는 p65 단백질에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여 RAW264.7 대식세포에 시난디온 A를 농도별로 처리하고 동시에 LPS (1 ㎍/mL)를 처리하여 2시간 동안 배양하였다. 그런 후 세포를 용해시켜 모은 핵 내 단백질들을 전기영동법으로 분리한 후 전환하여, p65 와 PCNA 항체를 가지고 웨스턴 블랏을 이용하여 핵 내 p65 와 PCNA의 발현량을 측정하였다. To determine the effect of cinandione A on the p65 protein migrating into nucleus, RAW264.7 macrophages were treated with cytandidione A at a concentration and simultaneously treated with LPS (1 ㎍ / mL) for 2 hours. Then, the proteins in the nucleus collected by dissolving the cells were separated by electrophoresis and then converted into p65 and PCNA by Western blotting with p65 and PCNA antibody.

그 결과, RAW264.7 세포에서 LPS 처리로 인해 증가된 핵 내의 p65 단백질 발현이 시난디온 A를 처리함에 따라 농도 의존적으로 저해되었다(도 11). 즉, 시난디온 A가 p65의 핵 내 이동을 저해함을 알 수 있었다.
As a result, increased p65 protein expression in the nucleus due to LPS treatment in RAW264.7 cells was inhibited in a concentration-dependent manner by treatment with cygnanide A (Fig. 11). In other words, it was found that cinanideone A inhibited the migration of p65 in the nucleus.

실시예Example 9: 9: NFNF -κB 단백질의 핵 내 -KB protein in the nucleus DNADNA 에 결합하는 활성 정도 측정 Measure the degree of activity binding to

시난디온 A가 핵 내에서 DNA에 결합하는 NF-κB 단백질의 결합 활성도에 어떤 영향을 미치는지 측정하기 위해, RAW264.7 대식세포에 시난디온 A을 농도별로 처리하고 동시에 LPS (1 ㎍/mL)를 처리하여 2시간 동안 세포를 배양하였다. 그런 후 세포를 용해하여 핵 추출물을 제조하였다. 핵 추출물 (5 ㎍)을 이중-스트랜드 NF-κB 올리고뉴클레오타이드와 혼합하고, [γ-³²P]dATP로 말단을 라벨화하였다. 결합 반응은 50 mM Tris-HCl, pH 7.9, 0.42 M KCl, 6 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 5 mM MgCl₂, 20% 글리세롤, 0.5 mM PMSF, 0.75 mM 스페르미딘(Spermidine), 0.15 mM 스페르민(Spermine) 및 10% 수크로즈(Sucrose)가 포함된 반응 용액 40 ㎕에서 실온에서 30분간 수행하였다. NF-κB의 p65 서브유닛에 대한 항체를 방사선으로 라벨화된 프로브를 첨가하기에 앞서 4℃에서 30분간 반응 혼합물 내 핵 추출물로 공동 배양하였다. 10, 50배 라벨화되지 않은 올리고뉴클레오타이드와 경쟁하여 결합 특이성을 검사하였다. 반응 물질을 0.5% Tris boric acid EDTA(TBE) 버퍼 내에서 6% 폴리아크리아미드 젤(polyacryamide gel)을 이용하여 전기영동으로 분리하였다. 젤을 80℃에서 한 시간 동안 말린 뒤, -70℃에서 24시간 동안 X 선 필름에 노출시켰다. To determine how synandione A affects the binding activity of the NF-κB protein bound to DNA in the nucleus, synandilide A was added to RAW264.7 macrophages and treated with LPS (1 μg / mL) And the cells were cultured for 2 hours. The cells were then lysed to prepare a nuclear extract. The nuclear extract (5 μg) was mixed with double-stranded NF-κB oligonucleotide and labeled with [γ- ³² P] dATP. The binding reaction was carried out in a buffer containing 50 mM Tris-HCl, pH 7.9, 0.42 M KCl, 6 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 5 mM MgCl ₂ , 20% glycerol, 0.5 mM PMSF, 0.75 mM Spermidine, Spermine and 10% sucrose for 30 minutes at room temperature. Antibodies to the p65 subunit of NF-κB were co-incubated with nuclear extracts in the reaction mixture at 4 ° C for 30 minutes prior to addition of the radiolabeled probe. The binding specificity was checked by competition with 10, 50 fold unlabeled oligonucleotides. The reactants were separated by electrophoresis in a 6% polyacryamide gel in 0.5% Tris boric acid EDTA (TBE) buffer. The gel was dried at 80 DEG C for one hour and then exposed to X-ray film at -70 DEG C for 24 hours.

그 결과, RAW264.7 세포에서 LPS 처리로 인해 증가된 NF-κB 단백질의 핵 내 표적 단백질에 대한 결합 활성이 시난디온 A를 처리함에 따라 농도 의존적으로 저해되었다(도 12).
As a result, the binding activity of the NF-κB protein to the target protein in the nucleus, which was increased due to LPS treatment in RAW264.7 cells, was inhibited in a concentration-dependent manner by treatment with cinanideone A (FIG. 12).

실시예Example 10: 10: 시난디온Sinan Dion A가 혈관내피세포( A is a vascular endothelial cell ( HUVECsHUVECs )와 면역세포() And immune cells ( U937U937 )의 기능성 부착활성에 미치는 영향 측정) On the functional adhesion activity

내피세포에서 염증성 세포 부착분자의 발현량의 증가는 백혈구와 그 밖에 다른 면역세포와의 부착성을 증가시키는 것으로 이미 잘 알려져 있는데, LPS로 CAM이 활성화되어 있는 혈관내피세포에 시난디온 A를 처리하였을 때 세포부착이 감소하는지를 세포 부착 분석법(cell adhesion assay)을 통해서 확인하였다. It is well known that the increase in the expression level of inflammatory cell adhesion molecules in endothelial cells increases the adhesion between leukocytes and other immune cells. LPS has been used to treat CAM-activated vascular endothelial cells with cinanideone A Cell adhesion was determined by cell adhesion assay.

구체적으로, HUVECs을 0.1% 젤라틴이 도포되어진 상태의 48 웰 플레이트에 배양하고 LPS로 CAM을 인위적으로 활성화시킨 뒤, 시난디온 A를 농도별로 처리한 후, 세포를 12시간동안 배양하였다. 그런 다음, PBS로 세포를 세척한 후, 면역세포인 U937 세포를 칼세인 AM을 이용하여 형광염색한 후 2.5 ×10⁵ cells/well의 농도로 HUVECs이 깔려진 위에 동시에 처리하였다. 1시간 동안 CO₂ 배양기에서 배양한 후, PBS로 다시 세척하였다. 마지막으로 형광 현미경(Carl Zeiss, Germany)으로 형광 이미지를 분석하였다. 추가적으로 Wallace Victor 21420 Multilabel counter(Perkin-Elmer, Norwalk, CT)를 이용하여 각각의 웰의 형광성을 측정하였다. Specifically, HUVECs were cultured in a 48 well plate coated with 0.1% gelatin, artificially activated CAM by LPS, treated with cytandilide A at different concentrations, and then cells were cultured for 12 hours. Then, the cells were washed with PBS, and U937 cells, which were immune cells, were fluorescently stained with Calcine AM and treated at the same concentration of HUVECs at a concentration of 2.5 × 10 ⁵ cells / well. CO ₂ for 1 hour After incubation in an incubator, the cells were washed again with PBS. Finally, fluorescence images were analyzed with a fluorescence microscope (Carl Zeiss, Germany). In addition, the fluorescence of each well was measured using a Wallace Victor 21420 Multilabel counter (Perkin-Elmer, Norwalk, Conn.).

그 결과, LPS로 인해 증가된 혈관 내피세포 및 면역세포의 세포 부착 기능의 활성화가 시난디온 A를 처리함에 따라 감소됨을 확인하였다(도 13).
As a result, it was confirmed that activation of cell adhesion function of vascular endothelial cells and immune cells increased due to LPS was reduced by treatment with cinanide Dion A (FIG. 13).

실시예Example 11: 마우스모델에서 11: In the mouse model 시난디온Sinan Dion A에 의한 By A iNOSiNOS 와 Wow COXCOX -2의 -2 of 발현양Expression level 측정 및 전-염증성 사이토카인의 생성량 측정 Measurement and measurement of the production of pro-inflammatory cytokines

시난디온 A가 마우스모델에서도 세포 내의 활성과 비슷하게 나타나는지를 확인하기 위해서, 수컷 C57BL/6N의 7 ~ 8주령 마우스를 가지고 활성을 테스트하였다. 마우스는 12시간 주기로 낮과 밤의 환경을 조사해 주었으며, 먹이와 물의 경우는 자유롭게 접근을 할 수 있도록 허용하였다. 마우스는 5마리씩 대조군(오직 PBS만 처리한 군), LPS(4 mg/kg), LPS+시난디온 A(0.1 mM), LPS+시난디온 A(1 mM)의 4개의 그룹으로 나뉘었다. 24시간 간격으로 시난디온 A(0.1 mM, 1 mM)와 PBS를 복강주사로 주입해주었고, 2번째 주입 후 12시간이 지난 후에 LPS(4 mg/kg)와 PBS을 주입해 주었다. LPS와 PBS 주입 12시간 후에 마우스를 경추탈골의 방법을 통해 죽인 후 전체 혈액샘플을 심장천자(cardiac puncture)의 방법을 통해서 1.5 mL 튜브에 모았고, 이를 일정시간 동안 실온에 나두었다. 그런 다음, 4℃, 20분 동안 12,000 ×g의 원심분리를 통해 혈청샘플을 얻었으며, 이를 상업적으로 판매되고 있는 마우스 전-염증성 사이토카인 ELISA 키트(Mouse Proinflammatory cytokine ELISA kit (eBioscience, USA))의 사용 순서에 따라 혼합한 후에 사용법 시간 동안 처리를 해주고, 그 후 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료에서의 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 생성량은 사용한 키트 속에 들어있는 분석 버퍼(assay buffer)에 준비된 각각의 스탠다드 표준곡선으로부터 계산되었다. 마우스 비장의 경우, 각각의 마우스에서 비장을 적출하여 그 조직을 갈아서 세포를 분리해낸 후 12시간 동안 5% CO₂, 37℃의 환경에서 배양 시켰고, 그런 다음 세포를 용해시켜 모은 총 단백질을 전기영동법으로 분리한 후 전환하여, iNOS 또는 COX-2의 항체를 가지고 웨스턴 블랏을 이용하여 NOS 또는 COX-2의 발현량을 측정하였다. Activity was tested with 7-8 week old male C57BL / 6N mice in order to determine whether cinanideone A appears similar to intracellular activity in mouse models. The mice were examined for day and night conditions at 12-hour intervals, and allowed access to food and water freely. Five mice were divided into four groups: control (only PBS treated group), LPS (4 mg / kg), LPS + cinanideone A (0.1 mM) and LPS + cinanideone A (1 mM). LPS (4 mg / kg) and PBS were injected intraperitoneally with cyanadione A (0.1 mM, 1 mM) and PBS at 24-hour intervals, and 12 hours after the second injection. After 12 hours of LPS and PBS injection, mice were sacrificed by cervical dislocation and whole blood samples were collected in a 1.5 mL tube by cardiac puncture method and left at room temperature for a certain period of time. Serum samples were then obtained by centrifugation at 12,000 x g for 20 min at 4 ° C and were analyzed using a commercially available mouse proinflammatory cytokine ELISA kit (eBioscience, USA) After mixing according to the order of use, treatment was carried out for the duration of use, and then the absorbance was measured at 450 nm using a microplate reader. The amount of IL-1β, IL-6 and TNF-α produced in the samples was calculated from each standard standard curve prepared in the assay buffer contained in the kit used. In the case of mouse spleen, the spleen was extracted from each mouse, and the tissue was ground to separate the cells. Then, the cells were cultured in an environment of 5% CO ₂ and 37 ° C for 12 hours. Then, the total proteins collected by dissolving the cells were subjected to electrophoresis And then the amount of expression of NOS or COX-2 was measured using Western blot with iNOS or COX-2 antibody.

그 결과, 마우스에 시난디온 A를 처리한 군에서 LPS로 인해 증가된 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 생성량이 감소되었으며(도 14), 마우스에 시난디온 A를 처리한 군에서 LPS로 인해 증가된 iNOS 및 COX-2의 단백질 발현량이 감소되었다(도 15).
As a result, the amount of IL-1β, IL-6 and TNF-α increased due to LPS was reduced in the group treated with cinanideone A in mice (FIG. 14) Increased the amount of protein expression of iNOS and COX-2 (Fig. 15).

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Anti-inflammatory compositions comprising cynandione A <130> PA111028KR <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for iNOS <400> 1 tcttcgaaat cccacctgac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for iNOS <400> 2 ccatgatggt cacattctgc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for TNF-alpha <400> 3 ttgacctcag cgctgagttg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for TNF-alpha <400> 4 cctgtagccc acgtcgtagc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for IL-6 <400> 5 gaggatacca ctcccaacag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for IL-6 <400> 6 ttcacagagg ataccactcc 20 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for IL-1beta <400> 7 gaagctgtgg cagctaccta tgtct 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for IL-1beta <400> 8 ctctgcttgt gaggtgctga tgtac 25 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for COX-2 <400> 9 gtgggccgcc ctaggcacca g 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for COX-2 <400> 10 ggaggaagag gatgcggcag t 21 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for ICAM-1 <400> 11 ctccaatgtg ccaggcttg 19 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for ICAM-1 <400> 12 cagtgggaaa gtgccatcct 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for VCAM-1 <400> 13 gtcttcacca ccatggagaa 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for VCAM-1 <400> 14 aggaggcatt gctgatgatc 20 <110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Anti-inflammatory compositions comprising cynandione A <130> PA111028KR <160> 14 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for iNOS <400> 1 tcttcgaaat cccacctgac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer for iNOS <400> 2 ccatgatggt cacattctgc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for TNF-alpha <400> 3 ttgacctcag cgctgagttg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer for TNF-alpha <400> 4 cctgtagccc acgtcgtagc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for IL-6 <400> 5 gaggatacca ctcccaacag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer for IL-6 <400> 6 ttcacagagg ataccactcc 20 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for IL-1beta <400> 7 gaagctgtgg cagctaccta tgtct 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer for IL-1beta <400> 8 ctctgcttgt gaggtgctga tgtac 25 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for COX-2 <400> 9 gtgggccgcc ctaggcacca g 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer for COX-2 <400> 10 ggaggaagag gatgcggcag t 21 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for ICAM-1 <400> 11 ctccaatgtg ccaggcttg 19 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer for ICAM-1 <400> 12 cagtgggaaa gtgccatcct 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for VCAM-1 <400> 13 gtcttcacca ccatggagaa 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer for VCAM-1 <400> 14 aggaggcatt gctgatgatc 20

Claims

A pharmaceutical composition for preventing or treating rheumatoid arthritis or arteriosclerosis comprising cynandione A or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

delete

A food composition for preventing or ameliorating rheumatoid arthritis or arteriosclerosis comprising cynandione A or a salt thereof.

delete

A quasi-drug composition for preventing or ameliorating rheumatoid arthritis or arteriosclerosis comprising cynandione A or a salt thereof.

A method of treating rheumatoid arthritis or an artery of an animal other than a human, comprising administering a composition comprising cynandione A or a pharmaceutically acceptable salt thereof to an animal other than a human in need of treatment for rheumatoid arthritis or arteriosclerosis. Cure treatment method.