KR101494952B1 - 비타민 d 화합물용 방출 시약 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 비타민 D-결합 단백질에 결합된 비타민 D 화합물을 방출하기 위한 시약 조성물, 비타민 D 의 검출을 위한 시험관내 방법 (이때 비타민 D 화합물은 상기 시약 조성물을 사용하여 비타민 D-결합 단백질로부터 방출됨), 및 상기 방식으로 수득되는 시약 혼합물에 관한 것이다. 사용되는 시약은, 가수분해시 0.1 M 내지 2.0 M 농도로 탄산 수소 이온 (HCO3) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염을 함유한다. 또한, 비타민 D 화합물을 방출하기 위한 개시된 시약 조성물의 용도, 및 통상적인 검출 시약 외에도 비타민 D 화합물을 방출하기 위한 시약 조성물을 함유하는 비타민 D 검출용 키트에 관한 것이다.

Description

비타민 D 화합물용 방출 시약{RELEASE REAGENT FOR VITAMIN D COMPOUNDS}
본 발명은 비타민 D-결합 단백질에 결합된 비타민 D 화합물을 방출하기 위한 시약 조성물, 비타민 D 화합물의 검출을 위한 시험관내 방법 (이때, 비타민 D 화합물은 이러한 시약 조성물의 사용에 의해 비타민 D-결합 단백질로부터 방출됨), 및 이러한 방식으로 수득되는 시약 혼합물에 관한 것이다. 또한, 비타민 D 화합물을 방출하기 위한 개시된 시약 조성물의 용도 및 통상적인 검출 시약 외에도 비타민 D 화합물을 방출하기 위한 시약 조성물을 함유하는 비타민 D 화합물을 검출하기 위한 키트에 과한 것이다.
비타민 D 의 알맞은 공급은 이미 제안된 용어 "비타민" 으로서 필수이다. 비타민 D 결핍은 구루병 또는 골다공증과 같은 심각한 질병을 초래한다. 비타민 D 는 지난 세기 초반에는 단일 물질로서 여전히 고려되었으나, 비타민 D 시스템은 지난 10 년 과정에서 비타민 D 대사산물의 복잡하고 다양한 네트워크로 변화하였다. 요즘, 40 개 초과의 상이한 비타민 D 대사 생성물이 공지되어 있다 (Zerwekh, J.E., Ann. Clin. Biochem. 41 (2004) 272-281).
인간은 오직 햇빛의 자외선이 피부에 작용하여서만 D3 비타민 또는 칼시페롤을 제조할 수 있다. 혈액에서, 비타민 D3 는 소위 비타민 D-결합 단백질에 결합되고, 25-히드록실화에 의해 25-히드록시비타민 D3 로 전환되는 곳인 간으로 이동된다. 요즘, 이미 언급된 2 개의 기관인 피부 및 간 외에도 다수의 다른 조직이 비타민 D 대사에 연계된 것으로 공지되어 있다 (Schmidt-Gayk, H. et al. (eds.), "Calcium regulating hormones, vitamin D metabolites and cyclic AMP" Springer Verlag, Heidelberg (1990) pp. 24-47). 25-히드록시비타민 D, 더욱 구체적으로는 25-히드록시비타민 D2 및 25-히드록시비타민 D3 은 이들의 양에 대해 인간 기관에서 비타민 D 의 중심 저장 형태이다. 필요한 경우, 이들 전구체가 신장에서 전환되어 생물학적으로 활성인 1α,25-디히드록시비타민 D (소위 D 호르몬) 을 형성한다. 생물학적으로 활성인 비타민 D 는 기타 칼슘 흡수 중 장으로부터의 칼슘 흡수를 조절하고, 골 무기화를 조절하고, 예를 들어 인슐린 시스템과 같은 다수의 다른 대사 경로에 영향 미친다.
비타민 D 수준 그 자체를 측정하는 것은, 환자의 비타민 D 상태를 측정할 때 식품 흡수 또는 햇빛에 노출에 따라 비타민 D (비타민 D2 및 비타민 D3) 의 농도가 수시로 변하기 때문에 이점이 거의 없다. 또한, 비타민 D 는 순환 (24 시간) 에서 상대적으로 짧은 생물학적 반감기를 갖고 따라서 이러한 이유로 환자의 비타민 D 상태를 측정하기 위한 적합한 매개변수가 아니다. 또한, 비타민 D 의 생물학적 활성 형태 (1,25-디히드록시비타민 D) 에도 동일하게 적용된다. 또한, 이들 생물학적 활성 형태는 상대적으로 적게 발생하고 25-히드록시비타민 D 와 비교시 농도가 매우 수시로 변한다. 이러한 이유로, 특히 25-히드록시비타민 D 의 양은 환자의 비타민 D 상태를 전반적으로 분석하는데 적합한 수단이다.
25-히드록시비타민 D 와 같은 비타민 D 대사산물은 비타민 D-결합 단백질에 의해 매우 높은 친화도로 그리고 제한된 정도로 알부민 및 몇몇 리포단백질에 결합된다. 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 대사산물을 방출하기 위한 적절한 방법은 정상 환경 하에서 임의의 또다른 단백질로부터 비타민 D 대사산물을 방출하는 것보다 더욱 적절할 것이다.
비타민 D-결합 단백질에 대한 25-히드록시비타민 D 또는 기타 비타민 D 화합물의 결합은 비타민 D 화합물의 측정을 심하게 복잡하게 만든다. 모든 공지된 방법은, 분석될 비타민 D 화합물이 비타민 D-결합 단백질과 형성된 착물로부터 방출되거나 탈착되는 것이 요구된다. 하기에서, 이는 단순화의 이유로 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하는 것으로 지칭되나, 물론 이는 비타민 D-결합 단백질 단독으로부터가 아닌 비타민 D 화합물 및 비타민 D-결합 단백질의 착물로부터만 방출될 수 있다.
비타민 D-결합 단백질은 산성 pH 에서 접혀지지 않으나 올바르게 재접힘되는 경향이 강하고 pH 가 중성 조건으로 되돌아갈때 분석물과 재결합한다. 따라서, 비타민 D 화합물을 우선 방출하는 것이 요구되고 이어서 분석될 비타민 D 화합물로부터 비타민 D-결합 단백질을 분리하는 것이 요구된다.
25-히드록시비타민 D 의 높은 임상적 중요성으로 인해 수많은 방법이 문헌을 통해 공지되어 있으며, 이들은 25-히드록시비타민 D 가 대략적인 신뢰도로 측정되게 한다.
예를 들어, 문헌 [Haddad, J.G. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 33 (1971) 992-995] 및 문헌 [Eisman, J.A. et al., Anal. Biochem. 80 (1977) 298-305] 은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 를 사용하는 혈액 샘플에서 25-히드록시비타민 D 농도를 측정하는 것을 기술한다.
25-히드록시비타민 D 를 측정하기 위한 또다른 접근법은 다른 것 중에서 우유에 존재하는 비타민 D-결합 단백질 유사물의 사용을 기초로 한다. 따라서, 문헌 [Holick, M.F. & Ray, R. (US 5,981,779)] 및 문헌 [DeLuca et al. (EP 0 583 945)] 은 이들 물질의 농도가 경쟁적 시험 절차에 의해 측정되는, 이들 물질의 비타민 D-결합 단백질로의 결합을 기초로 하는 히드록시비타민 D 및 디히드록시비타민 D 에 대한 비타민 D 검정을 기술하고 있다. 그러나, 이러한 방법의 필수전제조건은 우선 측정되는 비타민 D 대사산물이 본래의 혈액 또는 혈청 샘플로부터 단리되어야만 하고 예를 들어 크로마토그래피에 의해 정제되어야만 한다는 것이다.
문헌 [Armbruster, F.P. et al. (WO 99/67211)] 은 에탄올 침전에 의한 비타민 D 측정을 위해 제조되는 혈청 또는 혈장 샘플을 교시하고 있다. 이러한 방법에서, 단백질 침전은 원심분리에 의해 제거되고 에탄올성 상청액은 가용성 비타민 D 대사산물을 함유한다. 이들은 경쟁적 결합 검정에서 측정될 수 있다.
대안적으로는 EP 0 753 743 은, 페리오데이트 염을 사용하는 혈액 또는 혈청 샘플로부터 분리될 수 있음을 교시하고 있다. 이 경우, 비타민 D 화합물은 페리오데이트로 처리된 샘플로부터 단백질-미함유 상청액에서 측정된다. 몇몇 상업적 시험에서, 아세토니트릴은 혈청 또는 혈장 샘플의 추출을 위해 권장된다 (예를 들어, 방사면역측정법 (DiaSorin) 또는 "Immundiagnostik Company" 사제 비타민 D 시험에서).
최근, 다수의 상이한 방출 시약이 제안되었는데, 이는 원칙적으로 샘플에서 존재하는 임의의 결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하는데 적합한 것이다. 그러나, 이러한 방출 또는 탈착은 상대적으로 온화한 조건 하에서 수행되어, 결합 시험에서 시약을 방출하는 것으로 처리된 샘플의 직접적인 사용을 가능하게 한다 (예를 들어 WO 02/57797 및 US 2004/0132104 참조). 최근의 이러한 수많은 노력에도 불구하고, 모든 이용가능한 비타민 D 측정 방법은, 어려운 샘플 제조, 불량한 표준화, 시험 절차 사이의 불량한 조화 또는 스파이킹된 비타민 D 의 불량한 회수와 같은 단점을 갖는다 (특히 이에 대해 Zerwekh, J.E., supra 를 참조한다).
US 7,087,395 에서는, 금속 히드록시드 및 시클로덱스트린 및 이의 유도체, 및 금속 살리실레이트는 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하기 위해 사용되었고, 이는 비타민 D-결합 단백질 또는 다른 혈청 단백질의 비가역성 변성을 야기한다. Triton X100 또는 Tween-20 와 같은 계면활성제는, 비타민 D 화합물이 변성 후 샘플에서 지질 및 단백질에 비특이적으로 부착되는 것을 방지하기 위해 사용되었다.
특히, 비타민 D 화합물을 시험하는 것을 자동화하는 것이 어렵다. 자동화를 위해서는, 매우 어려운 문제가 해결되어야 하는데, 즉 타이트로프 워크에서 생존해야 한다는 점이다: 한편으로는, 적합한 방출 시약의 도움으로, 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물가 방출되는 것이 요구되며, 다른 한편으로는, 샘플이 추가로 직접 분석될 수 있도록 하는 조건이 선택되는 것이 요구된다. 이러한 직접적인 추가의 분석의 필수전제조건은, 한편으로는, 내인성 비타민 D-결합 단백질이 결합하지 않고 이러한 분석 동안 비타민 D 화합물에 더이상 현저한 정도로 결합하지 않고 따라서 이러한 분석을 간섭하지 않으며, 다른 한편으로는, 항체와 같은 검출 시약 또는 비타민 D-결합 단백질의 결합을 간섭하지 않는 방출 시약을 사용한다는 것이다. 또한, 생화학적으로 상이하게 거동하는 비타민 D-결합 단백질의 상이한 대립형질이 인간 개체군에 존재하는 것으로 공지되어 있다. 비타민 D 화합물의 방출 및 측정은 다양한 대립형질/표현형에 대해 비교가능해야만 한다.
따라서, 본 발명의 목적은 비타민 D 화합물의 방출을 위한 시약 조성물을 개발하는 것이고, 특히 종래 기술의 문제점을 부분적으로 이상 극복할 수 있는 샘플에서 비타민 D-결합 단백질로부터의 히드록시비타민 D 화합물에 대한 시약 조성물을 개발하는 것이다. 비타민 D 화합물을 방출하기 위한 적합한 시약 조성물, 비타민 D 화합물을 측정하는 시험관내 방법, 이러한 시약 조성물을 사용하여 비타민 D 화합물을 측정하기 위한 키트가 하기에서 설명되며 첨부된 특허청구범위에 포함된다.
발명의 개요
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다:
a) 조사할 샘플을 제공하는 단계, 및
b) 단계 (a) 로부터의 샘플을, i) 가수분해시 0.1 M 내지 2.0 M 의 농도로 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염을 함유하는 시약, ii) 환원제, 및 iii) 알칼리화제와 혼합하고, 이로써 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하는 단계.
추가의 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 비타민 D 화합물을 측정하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다:
a) 조사할 샘플을 제공하는 단계,
b) 단계 (a) 의 샘플을, i) 가수분해시 0.1 M 내지 2.0 M 의 농도로 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염을 함유하는 시약, ii) 환원제, 및 iii) 알칼리화제와 혼합하고, 이로써 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하는 단계, 및
c) 단계 (b) 에서 방출된 비타민 D 화합물을 측정하는 단계.
추가의 구현예에서, 본 발명은 가수분해시 0.1 M 내지 2.0 M 의 농도로 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염 및 환원제를 포함하는 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하기 위한 시약 조성물에 관한 것이다.
추가의 구현예에서, 본 발명은, 조사되는 샘플, 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하기 위한 시약 조성물, 가수분해시 0.1 M 내지 2.0 M 의 농도로 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염 및 환원제, 및 알칼리화제를 포함하는 시약 혼합물에 관한 것이다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하기 위한 키트에 관한 것이며, 이는 가수분해시 0.1 M 내지 2.0 M 의 농도로 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염 및 환원제를 포함하는 시약 조성물을 함유한다.
도 1: 전처리 단계 동안 시약 혼합물의 pH 변화. 검정은 실시예 1.5 에서 개요된 바와 같이 수행된다. 시약 조성물 (A) 은 다양한 농도의 에틸렌 카르보네이트 (EC) 를 함유한다: 0.00 M (●), 0.10 M (◆), 0.30 M (□), 0.50 M (▲), 0.75 M (○), 1.00 M (■), 1.50 M (◇) EC. X 축은 시간 (분) 을 나타내고, Y 축은 pH 를 나타낸다.
도 2: 다양한 농도의 에틸렌 카르보네이트 (EC) 를 함유하는 시약 조성물 (A) 을 이용하는 실시예 1.5 에서 기술된 바와 같은 비타민 D 검정의 교정 곡선: 1.50 M (●), 1.00 M (□), 0.75 M (◆), 0.50 M (○), 0.30 M (▲) 및 0.10 M (◇) EC. X 축 은 농도 (ng/ml) 를 나타내고, Y 축은 Roche Diagnostics 사로부터 Elecsys® 시스템을 이용한 통상적으로 측정되는 계수를 나타낸다.
도 3: 다양한 농도의 환원제 디티오트레이톨 (DTT) 을 함유하는 시약 조성물 (A) 을 이용하는, 실시예 1.5 에 기술된 바와 같은 비타민 D 검정의 교정 곡선: 1.0 mM (□), 2.0 mM (●), 4.0 mM (◆), 6.7 mM (○), 10.0 mM/12.0 mM (▲), 15.0 mM (◇). X 축은 농도 (ng/ml) 를 나타내고, Y 축은 Roche Diagnostics 사로부터의 Elecsys® 시스템을 사용하는 통상적으로 측정되는 계수를 나타낸다.
도 4a: 방법 비교: 비타민 D 검정 (실시예 1) 및 액체 크로마토그래피-질량 분광분석기 (LC-TMS). 25-히드록시비타민 D 는 실시예 1.5 의 비타민 D 검정 및 LC-TMS 에 의해 측정되었고, 이때 0.5 M 의 에틸렌 카르보네이트 (EC) 를 갖는 시약 조성물 (A) 은 인큐베이션용으로 사용되었다. 다중 혈청 샘플에 대한 결과 (ng/ml) 를 LC-TMS 에 대한 X 축에 대해 플롯팅하고 실시예 1.5 의 비타민 D 검정에 대해서는 Y 축에 플롯팅하였다.
(
Figure 112012095049554-pct00001
) y = x
(
Figure 112012095049554-pct00002
) 선형 회귀
비타민 D 검정 = 2.0116 + 0.9036*x, 피어슨(Pearson) r = 0.9509
도 4b: 방법 비교: 비타민 D 검정 (실시예 1) 및 LC-TMS
25-히드록시비타민 D 는 실시예 1.5 의 비타민 D 검정 및 LC-TMS 에 의해 측정되었으며, 이때 에틸렌 카르보네이트 (EC) 를 갖지 않는 시약 조성물 (A) 이 인큐베이션을 위해 사용되었다. 다중 혈청 샘플에 대한 결과 (ng/ml) 를 LC-TMS 에 대해서는 X 축에 플롯팅하고 실시예 1.5 의 비타민 D 검정에 대해서는 Y 축 에 플롯팅하였다.
(
Figure 112012095049554-pct00003
) y = x
(
Figure 112012095049554-pct00004
) 선형 회귀
비타민 D 검정 = 0.7496 + 0.7338*x, 피어슨(Pearson) r = 0.7914
도 5: 0.5 M 의 에틸렌 카르보네이트 (◆), 0.5 M 의 Na2CO3 (○), 0.5 M 의 NaH2PO4 (▲), 0.5 M 의 NaCl (◇), 및 대조군 (□) 을 함유하는 시약 조성물 (A) 을 이용하는, 실시예 2 에 기술된 바와 같은 비타민 D 검정의 교정 곡선. X 축은 농도 (ng/ml) 를 나타내고, Y 축은 Roche Diagnostics 사로부터의 Elecsys® 시스템을 사용하여 통상적으로 측정되는 계수를 나타낸다.
도 6: 하기를 함유하는 시약 조성물 (A) 을 이용하는 실시예 3 에 기술된 바와 같은 비타민 D 검정의 교정 곡선:
◆: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 0.5 M EC, 또는
▲: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 또는
□: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA.
X 축은 농도 (ng/ml) 를 나타내고, Y 축은 Roche Diagnostics 사로부터의 Elecsys® 시스템을 사용하여 통상적으로 측정되는 계수를 나타낸다.
도 7: 하기를 함유하는 시약 조성물 (A) 을 이용하는 실시예 4 에 기술된 바와 같은 비타민 D 검정의 교정 곡선:
○: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 0.5 M EC (참조, 실시예 1.5), 또는
◆: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 0.5 M 디메틸 카르보네이트.
X 축은 농도 (ng/ml) 를 나타내고, Y 축은 Roche Diagnostics 사로부터의 Elecsys® 시스템을 사용하여 통상적으로 측정되는 계수를 나타낸다.
도 8: 하기를 함유하는 시약 조성물 (A) 을 이용하는 실시예 5 에서 기술된 바와 같은 비타민 D 검정의 교정 곡선:
◆: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 0.5 M EC (참조, 실시예 1.5), 또는
○: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 0.5 M NaHCO3, 또는
▲: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 0.5 M NaHCO3 + 0.5 M 에틸렌 글리콜, 또는
□: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT.
X 축은 농도 (ng/ml) 를 나타내고, Y 축은 Roche Diagnostics 사로부터의 Elecsys® 시스템을 사용하여 통상적으로 측정되는 계수를 나타낸다.
도 9: 하기를 함유하는 시약 조성물 (A) 을 이용한 실시예 4 에 기술된 바와 같은 비타민 D 검정의 교정 곡선:
◆: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 0.5 M EC (참조, 실시예 1.5) 또는
○: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 0.5 M 글리세롤 1,2 카르보네이트.
X 축은 농도 (ng/ml) 를 나타내고, Y 축은 Roche Diagnostics 사로부터의 Elecsys® 시스템을 사용하여 통상적으로 측정되는 계수를 나타낸다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는, 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다:
a) 조사할 샘플을 제공하는 단계,
b) 단계 (a) 로부터의 샘플을, i) 가수분해시 0.1 M 내지 2.0 M 의 농도로 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염을 함유하는 시약, ii) 환원제, 및 iii) 알칼리화제와 혼합하고, 이로써 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하는 단계.
본원에 사용되는 바와 같이, 하기 각 용어는 이 구획에 관련되어 의미를 갖는다.
본원에 사용되는 단수형은 대상으로 하는 것의 하나 또는 하나 초과의 갯수 (즉 하나 이상) 를 지칭한다.
표현 "하나 이상의" 는 1 내지 50 를 의미하고, 바람직하게는 1 내지 20 을 지칭하고, 또한 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 또는 15 를 지칭한다.
달리 언급되지 않는 한 용어 "비타민 D 화합물" 은 하기 구조식 I 및 II 에 따르는 비타민 D2 의 골격 또는 비타민 D3 의 골격을 포함하는 모든 자연 발생 화합물을 포함하는 것으로 이해된다.
화학식 I
Figure 112012095049554-pct00005
화학식 II
Figure 112012095049554-pct00006
구조식 I 및 II 에서, 비타민 D 의 위치는 스테로이드 명명법에 따른다. 25-히드록시비타민 D 는 구조식 I 및 II 의 25 위치에서 히드록실화하는 비타민 D 대사산물를 나타내고, 즉 25-히드록시비타민 D2 및 25-히드록시비타민 D3 을 나타낸다. 추가로 공지된 히드록시비타민 D 화합물은 예를 들어, 1,25-디히드록시비타민 D 및 24,25-디히드록시비타민 D 형태이다.
1,25-디히드록시비타민 D 는 구조식 I 및 II 의 위치 25 및 위치 1 에서 히드록실화된 비타민 D 의 활성 형태 (소위 D 호르몬) 를 지칭한다.
기타 익히 공지된 비타민 D 화합물은 24,25-디히드록시비타민 D2, 24,25-디히드록시비타민 D3 및 C3-에피 25-히드록시비타민 D 이다.
놀랍게도, 본 발명자들에 의해, 본 발명에 개시된 시험관내 방법에서 알칼리 조건 하에서 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염의 존재는, 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하게 하는 것으로 밝혀졌다.
본 발명에 따른 "수소 카르보네이트 이온" (바이카르보네이트 이온) 은 경험상 화학식 HCO3 - 과의 음이온이고 61.01 달톤의 분자 질량을 갖는다.
본 발명에 따른 "수소 카르보네이트 염" 은 탄산 수소 나트륨 (NaHCO3), 탄산 수소 칼륨 (KHCO3), 탄산 수소 암모늄 (NH4HCO3), 탄산 수소 칼슘 (Ca(HCO3)2) 및 탄산 수소 마그네슘 (Mg(HCO3)2) 으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따른, "가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질" 은 카르보네이트 에스테르 또는 피로카르보네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물이다.
본 발명에 따른 "카르보네이트 에스테르" 는 2 개의 알콕시 기로 플랭크된 카르보닐 기이다. 이들 카르보네이트의 일반 구조는 R1O(C=O)OR2 이다. 시클릭 카르보네이트 에스테르 (예를 들어, 에틸렌 카르보네이트) 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르 (예를 들어, 디메틸 카르보네이트) 및 이의 히드록실화 또는 할로겐화 유도체가 이용가능하다.
바람직하게는 본 방법의 단계 i) 에 따른, 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염은, 각각, 0.1 M 내지 1.5 M 의 농도, 또는 0.2 M 내지 1.0 M 의 농도, 또는 0.1, 0.2, 0.3 또는 0.4 M 이상, 또는 2.0, 1.7, 1.5, 1.3, 1.0 또는 0.75 M 이하의 농도를 갖는다.
구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출할 수 있는 시험관내 방법에 관한 것이다:
a) 조사할 샘플을 제공하는 단계,
b) 단계 (a) 로부터의 샘플을, i) 0.1 내지 2.0 M 의 농도로 탄산 수소 염을 함유하는 시약, ii) 환원제, 및 iii) 알칼리화제와 혼합하고, 이로써 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하는 단계.
바람직하게는, 방법의 단계 i) 에 따른 상기 탄산 수소 염은, 각각, 0.1 M 내지 1.5 M 의 농도, 또는 0.2 M 내지 1.0 M 의 농도, 또는 0.1, 0.2, 0.3 또는 0.4 M 이상의 농도, 또는 2.0, 1.7, 1.5, 1.3, 1.0 또는 0.75 M 이하의 농도를 갖는다.
바람직한 구현예에서, 탄산 수소 염은, 탄산 수소 나트륨, 탄산 수소 칼륨, 탄산 수소 암모늄, 탄산 수소 칼슘 및 탄산 수소 마그네슘으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 바람직한 구현예에서, 탄산 수소 염은 탄산 수소 나트륨, 탄산 수소 칼륨 및 탄산 수소 암모늄으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가로 바람직한 탄산 수소 염은 탄산 수소 나트륨 및 탄산 수소 칼륨으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다:
a) 조사할 샘플을 제공하는 단계,
b) 단계 (a) 로부터의 샘플을, i) 가수분해시 0.1 내지 2.0 M 의 농도로 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질을 함유하는 시약, ii) 환원제, 및 iii) 알칼리화제와 혼합하고, 이로써 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하는 단계.
바람직하게는, 방법의 단계 i) 에 따른 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 상기 물질은, 각각, 0.1 M 내지 1.5 M 의 농도, 또는 0.2 M 내지 1.0 M 의 농도, 또는 0.1, 0.2, 0.3 또는 0.4 M 이상 또는 2.0, 1.7, 1.5, 1.3, 1.0 또는 0.75 M 이하의 농도를 갖는다.
바람직한 구현예에서, 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질은 각각 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르 또는 이의 히드록실화 또는 할로겐화 유도체이다. 또한 바람직한 구현예에서, 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질은 각각 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르 또는 이의 할로겐화 유도체이다. 또한 바람직한 구현예에서, 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르 또는 이의 할로겐화 유도체는 에틸렌 카르보네이트, 디메틸 카르보네이트, 프로필렌 카르보네이트, 비닐렌 카르보네이트, 트리메틸렌 카르보네이트, 에리트리톨 비스카르보네이트, 글리세롤 1,2-카르보네이트, 4-클로로-1,3-디옥솔란-2-온, 4,5-디클로로-1,3-디옥솔란-2-온, 2,5-디옥사헥산디오산 디메틸 에스테르, 피로카르보네이트, 1,2 부틸렌 카르보네이트, 시스 2,3 부틸렌 카르보네이트 및 트랜스 2,3 부틸렌 카르보네이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가로 바람직한 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르 또는 이의 할로겐화 유도체는 에틸렌 카르보네이트, 디메틸 카르보네이트, 프로필렌 카르보네이트, 비닐렌 카르보네이트, 트리메틸렌 카르보네이트, 에리트리톨 비스카르보네이트, 글리세롤 1,2-카르보네이트, 4-클로로-1,3-디옥솔란-2-온 및 4,5-디클로로-1,3-디옥솔란-2-온으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가로 바람직한 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르는 에틸렌 카르보네이트, 디메틸 카르보네이트, 글리세롤 1,2-카르보네이트, 프로필렌 카르보네이트 및 비닐렌 카르보네이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가로 바람직한 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르는 에틸렌 카르보네이트, 디메틸 카르보네이트, 글리세롤 1,2-카르보네이트 및 프로필렌 카르보네이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가로 바람직한 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르는 에틸렌 카르보네이트, 디메틸 카르보네이트 및 글리세롤 1,2-카르보네이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.
구현예에서, 방법의 단계 i) 에 따른 상기 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르는 0.1 M 내지 2.0 M 의 농도를 갖는다. 바람직하게는 상기 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르는, 각각, 0.1 M 내지 1.5 M 의 농도, 또는 0.2 M 내지 1.0 M 의 농도, 또는 0.1, 0.2, 0.3 또는 0.4 M 이상 또는 2.0, 1.7, 1.5, 1.3, 1.0 또는 0.75 M 이하의 농도를 갖는다.
구현예에서, 본 발명의 방법에 따른 단계 (i) 의 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염을 함유하는 시약은, 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하기 위한 적절한 조건 하에서 2 M 이상의 수용액에 가용성이다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 방법에 따른 단계 (i) 의 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염을 함유하는 시약은, 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하기 위한 적절한 조건 하에서 1.5 M 이상, 더욱 바람직하게는 1.0 M 이상의 수용액에 가용성이다. 본 발명에 따른 방법의 단계 (i) 의 시약을 얻기 위해 물에 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염을 용해시킬 수 있는 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염은 25℃ 에서 수용성이어야만 한다. 수용액에 용해되는 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염은 드롭 아웃 또는 결정화 없이 4℃ 의 온도에서 저장될 수 있어야만 한다.
알칼리화제에 대한, 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염의 몰비는, 각각, 바람직하게는 1:3 내지 3:1, 보다 바람직하게는 1:2 내지 2:1, 보다 바람직하게는 1:1.5 내지 1.5:1 이다.
또한, 당업자는, 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및/또는 탄산 수소 염에 대한 알칼리화제의 몰비가 반응성 이온 OH- 또는 HCO3 - 의 상응하는 농도로 계산한다는 것을 숙지하고 있다.
가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 상이한 물질 및/또는 상이한 탄산 수소 염의 2 개 이상의 혼합물이 각각 본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있음이 당업자에게 공지되어 있다. 알칼리화제에 대한, 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및/또는 탄산 수소 염의 혼합물의 몰비는 바람직하게는 1:3 내지 3:1, 보다 바람직하게는 1:2 내지 2:1, 보다 바람하게는 1:1.5 내지 1.5:1 이다.
이론에 얽매이지 않으면서, 시약 조성물에서 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염의 존재는가 pH 의 이동을 유도하는 것으로 익히 알려져 있다. 시약 조성물에서 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염의 더욱 낮은 농도는 전처리 반응 동안 시약 혼합물의 더욱 느린 pH 감소를 야기한다. 시약 조성물에서 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염의 더욱 높은 농도는 전처리 반응 동안 시약 혼합물의 더욱 신속한 pH 감소를 야기한다. 또한, 알칼리 완충제 조건에서 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염 및 환원제의 합의된 작용으로 인해 비타민 D-결합 단백질의 비가역성 변성이 달성되고 이로써 비타민 D 화합물의 더욱 늦은 검출이 촉진되는 것으로 보인다.
구현예에서, 본 방법에 따른 단계 ii) 의 환원제는 2-머캅토에탄올, 2-머캅토에틸아민-HCl, TCEP, 시스테인-HCl, 디티오트레이톨 (DTT), N-메틸말레이미드, Ellman's 시약 및 1,2-디티올란-3-카르복실산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 구현예에서, 본 방법에 따른 단계 ii) 의 환원제는, 단계 ii) 의 환원제가 티올기를 함유하는 것을 특징으로 한다.
추가의 구현예에서, 본 방법에 따른 단계 ii) 의 환원제는 2-머캅토에탄올, 2-머캅토에틸아민-HCl, TCEP, 시스테인-HCl 및 디티오트레이톨 (DTT) 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
구현예에서, 본 방법에 따른 단계 ii) 의 환원제는 2 mM 내지 30 mM 의 농도, 추가의 구현예에서, 3 mM 내지 20 mM 의 농도, 추가의 구현예에서, 3.5 mM 내지 15 mM 의 농도, 및 추가의 구현예에서, 4 mM 내지 10 mM 의 농도를 갖는다.
"알칼리화제" 는 알칼리 히드록시드 또는 알칼리 토금속 히드록시드일 수 있다 (즉, 수용액 중에서). 또한, 알칼리화제는 알칼리 히드록시드 및/또는 알칼리 토금속 히드록시의 혼합물을 포함할 수 있으며, 즉, NaOH 및 KOH, NaOH 및 LiOH, NaOH 및 Ca(OH2), KOH 및 Ca(OH)2, KOH 및 LiOH, 및 다른 조합을 포함할 수 있다.
"알칼리 히드록시드" 는 알칼리 금속 양이온 및 히드록시드 음이온 (OH-) 으로 구성되는 화합물의 부류이다. 알칼리 히드록시드는 예컨대 NaOH, KOH, LiOH, RbOH 및 CsOH 이다. "알칼리 금속" 은 하기 주기율표의 1 족 (IUPAC) 을 형성하는 일련의 화학 원소이다: 리튬 (Li), 나트륨 (Na), 칼륨 (K), 루비듐(Rb), 세슘 (Cs), 및 프랑슘 (Fr).
"알칼리 토금속 히드록시드" 는 알칼리 토금속 양이온 및 2 히드록시드 음이온 (OH-) 으로 구성된 화합물 부류이다. 주기율표의 2 족 (IUPAC) (IIA 족) 을 포함한다: 베릴륨 (Be), 마그네슘 (Mg), 칼슘 (Ca), 스트론튬 (Sr), 바륨 (Ba) 및 라듐 (Ra).
구현예에서, 본 발명의 방법에 따른 단계 iii) 의 알칼리화제는 NaOH, KOH, Ca(OH)2 및 LiOH 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 구현예에서, 본 방법에 따른 단계 iii) 의 알칼리화제는, 각각, 0.1 M 내지 2.0 M 의 농도, 또는 0.1 M 내지 1.5 M 의 농도, 또는 0.2 M 내지 1.75 M 의 농도 또는 0.2 M 내지 1.0 M 의 농도, 또는 0.1, 0.2, 0.3 또는 0.4 M 이상 또는 2.0, 1.7, 1.5, 1.3, 1.0 또는 0.75 M 이하의 농도를 갖는다.
추가의 구현예에서, 본 방법에 따른 단계 iii) 의 알칼리화제는 NaOH 및 KOH 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 알칼리화제는, 샘플 + 시약 i) + 환원제 ii) + 알칼리화제 iii) 의 혼합물 중에서, 각각, 0.1 M 내지 0.6 M 의 농도, 또는 0.2 M 내지 0.5 M 의 농도, 또는 0.1 또는 0.2 M 이상, 또는 0.6 또는 0.5 M 이하의 최종 농도를 갖는다.
추가의 구현예에서, 조사되는 샘플에 대해 단계 i) ii) 및 iii) 의 3 개의 시약의 혼합비는 바람직하게는 1:3 내지 3:1 이다.
구현예에서, 단계 a) 의 샘플, 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염을 함유하는 단계 i) 의 시약 + 단계 ii) 의 환원제 + 본 방법에 따른 단계 iii) 의 알칼리화제는 임의의 피페팅 순서로 첨가될 수 있다. 추가의 구현예에서, 혼합시, 본 발명의 방법에 따른 단계 b) 는, 9.5 내지 14 의 pH 값 및 10, 12, 15, 또는 20 초 이상의 시간을 가지며, 추가로 바람직하게는 단계 b) 는 10.5 내지 14 의 pH 값 및 10, 12, 15, 또는 20 초 이상의 시간을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 방법의 구현예에서, 단계 a) 의 조사할 샘플을, 단계 b) 에서 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염을 함유하는 단계 i) 의 시약, 단계 ii) 의 환원제, 단계 iii) 의 알칼리화제와 혼합하고 인큐베이션하였다. 인큐베이션 단계 b) 는 필요한 만큼 수행될 수 있다. 인큐베이션 시간은 예를 들어 15 초 내지 24 h 이다. 하나의 구현예에서, 본 방법에 따른 단계 b) 의 혼합물은 1 내지 60 분 동안 인큐베이션되고 이로써 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출한다.
본 방법에 따른 단계 b) 의 성분의 농도는, 특정 pH 범위 및 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염, 환원제 및 알칼리화제 각각의 농도가 조사되는 샘플로 인큐베이션되는 동안 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하기에 적절하도록 당업자에 의해 용이하게 선택된다.
알칼리 조건은 비타민 D-결합 단백질의 변성을 야기하고 조사되는 샘플에 존재하는 비타민 D 의 방출을 야기한다. 알칼리화제의 농도는 전처리 반응에서 "시약 혼합물"( = 조사되는 샘플 + 본 발명에 따른 시약 조성물 + 알칼리화제) 의 pH 를 pH 10.0 이상, 바람직하게는 pH 10.5 이상, 보다 바람직하게는 11.0 이상으로 증가시키기에 충분하다. 당업자는, 시약 혼합물의 pH 가, 조사할 샘플 + 본 발명에 따른 시약 조성물 + 알칼리화제의 혼합물 시점에서 측정되어야만 한다는 것을 숙지하고 있다. 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및/또는 탄산 수소 염의 가수분해로 인해, pH 는 시약 혼합물에서 감소될 것이다 (도 1 및 실시예 1.5 참조).
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "샘플" 은 시험관내 평가의 목적으로 개체로부터 수득되는 생물학적 샘플을 지칭한다. 구현예에서, 본 방법에서 조사되는 샘플은 액체 샘플이다. 본 발명의 추가의 구현예에서 샘플은 임의의 체액을 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, 조사되는 샘플이 혈액, 혈청 또는 혈장이고, 혈청 또는 혈장이 가장 바람직하다. 추가의 구현예에서, 액체 샘플은 필터지 또는 필터막 상에서 건조된다. 구현예에서, 본원에서 사용되는 샘플은 개체로부터 수득되는 샘플의 분취량을 지칭한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 비타민 D 화합물을 측정하는 시험관내 방법을 포함한다:
(a) 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하는 단계, 및
(b) 단계 (a) 에서 방출되는 비타민 D 화합물을 측정하는 단계.
추가의 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 비타민 D 화합물을 측정하는 시험관내 방법을 포함한다:
(a) 관심 샘플에서 비타민 D-결합 단백질에 결합된 비타민 D 화합물을 방출하는 단계, 및
(b) 단계 (a) 에서 방출되는 비타민 D 화합물을 측정하는 단계.
추가의 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 비타민 D 화합물을 측정하는 시험관내 방법에 관한 것이다:
a) 조사되는 샘플을 제공하는 단계,
b) 단계 (a) 로부터의 샘플을, i) 가수분해시 0.1 내지 2.0 M 의 농도로 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염을 함유하는 시약, ii) 환원제, 및 iii) 알칼리화제와 혼합하고, 이로써 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하는 단계, 및
c) 단계 (b) 에서 방출되는 비타민 D 화합물을 측정하는 단계.
추가의 구현예에서, 본 발명은 비타민 D 화합물을 측정하는 시험관내 방법을 포함하며, 이때 비타민 D 화합물은 25-히드록시비타민 D2, 25-히드록시비타민 D3, 24,25-디히드록시비타민 D2, 24,25-디히드록시비타민 D3 및 C3-에피 25-히드록시비타민 D 를 포함하는 군으로부터 선택된다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 비타민 D 화합물을 측정하는 시험관내 방법을 포함하며, 이때 측정되는 비타민 D 화합물은 25-히드록시비타민 D2, 25-히드록시비타민 D3, 24,25-디히드록시비타민 D2 및 24,25-디히드록시비타민 D3 를 포함하는 군으로부터 선택된다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 비타민 D 화합물을 측정하는 시험관내 방법을 포함하며, 이때 비타민 D 화합물 25-히드록시비타민 D2 및/또는 25-히드록시비타민 D3 이 측정된다.
시약 조성물:
하나의 구현예에서, 본 발명은 조사되는 샘플에서 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하기 위한 시약 조성물에 관한 것이고, 이는 가수분해시 0.1 내지 2.0 M 의 농도로 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염 및 환원제를 함유한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 조사되는 샘플에서 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하기 위한 시약 조성물에 관한 것이고, 이는 가수분해시 0.1 내지 1.5 M 의 농도로 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염 및 환원제를 함유한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 조사되는 샘플에서 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물의 방출을 위한 시약 조성물에 관한 것이고, 이는 가수분해시 0.2 내지 1.0 M 의 농도로 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염 및 환원제를 함유한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 조사되는 샘플에서 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물의 방출을 위한 시약 조성물에 관한 것이고, 이는 가수분해시 0.1, 0.2, 0.3 또는 0.4 M 이상의 농도로 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염 및 환원제를 함유한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 조사되는 샘플에서 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하기 위한 시약 조성물에 관한 것이며, 이는 가수분해시 2.0, 1.7, 1.5, 1.3, 1.0 또는 0.75 M 이하의 농도로 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염 및 환원제를 함유한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 조사되는 샘플에서 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물의 방출을 위한 시약 조성물에 관한 것이고, 이는 0.1 M 내지 2.0 M 농도의 탄산 수소 염 및 환원제를 함유한다. 바람직하게는 상기 시약 조성물은, 각각, 0.1 M 내지 1.5 M 의 농도, 또는 0.2 M 내지 1.0 M 의 농도, 또는 0.1, 0.2, 0.3 또는 0.4 M 이상의 농도, 또는 2.0, 1.7, 1.5, 1.3, 1.0 또는 0.75 M 이하의 농도의 탄산 수소 염, 및 환원제를 함유한다. 또한 바람직한 구현예에서, 시약 조성물에서 탄산 수소 염은 탄산 수소 나트륨, 탄산 수소 칼륨, 탄산 수소 암모늄, 탄산 수소 칼슘 및 탄산 수소 마그네슘으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 시약 조성물에서 추가로 바람직한 탄산 수소 염은, 탄산 수소 나트륨, 탄산 수소 칼륨 및 탄산 수소 암모늄으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 시약 조성물에서 추가로 바람직한 탄산 수소 염은 탄산 수소 나트륨 및/또는 탄산 수소 칼륨이다. 추가의 구현예에서, 본 발명은 조사되는 샘플에서 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물의 방출을 위한 시약 조성물에 관한 것이며, 이는 가수분해시 0.1 M 내지 2.0 M 의 농도로 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 환원제를 함유한다. 바람직하게는 상기 시약 조성물은, 각각, 0.1 M 내지 1.5 M 의 농도, 또는 0.2 M 내지 1.0 M 의 농도, 또는 0.1, 0.2, 0.3 또는 0.4 M 이상의 농도, 또는 2.0, 1.7, 1.5, 1.3, 1.0 또는 0.75 M 이하의 농도로 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질, 및 환원제를 함유한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 조사되는 샘플에서 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물의 방출을 위한 시약 조성물에 관한 것이고, 이는 0.1 M 내지 2.0 M 의 농도로 각각 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르 또는 이의 히드록실화 또는 할로겐화 유도체, 및 환원제를 함유한다. 바람직하게는 상기 시약 조성물은, 각각, 0.1 M 내지 1.5 M 의 농도, 또는 0.2 M 내지 1.0 M 의 농도, 또는 0.1, 0.2, 0.3 또는 0.4 M 이상, 또는 2.0, 1.7, 1.5, 1.3, 1.0 또는 0.75 M 이하의 농도로 각각 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르 또는 이의 할로겐화 유도체, 및 환원제를 함유한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 조사되는 샘플에서 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물의 방출을 위한 시약 조성물에 관한 것이고, 이는 0.1 M 내지 2.0 M 의 농도로 각각 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르 또는 이의 할로겐화 유도체 및 환원제를 함유한다. 바람직하게는 상기 시약 조성물은 각각, 0.1 M 내지 1.5 M 의 농도, 또는 0.2 M 내지 1.0 M 의 농도, 또는 0.1, 0.2, 0.3 또는 0.4 M 이상, 또는 2.0, 1.7, 1.5, 1.3, 1.0 또는 0.75 M 이하의 농도로, 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르 또는 이의 할로겐화 유도체, 및 환원제를 함유한다. 또한 바람직한 구현예에서, 시약 조성물에서 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르 또는 이의 할로겐화 유도체는 에틸렌 카르보네이트, 디메틸 카르보네이트, 프로필렌 카르보네이트, 비닐렌 카르보네이트, 트리메틸렌 카르보네이트, 에리트리톨 비스카르보네이트, 글리세롤 1,2-카르보네이트, 4-클로로-1,3-디옥솔란-2-온, 4,5-디클로로-1,3-디옥솔란-2-온, 2,5-디옥사헥산디오산 디메틸 에스테르, 피로카르보네이트, 1,2 부틸렌 카르보네이트, 시스 2,3 부틸렌 카르보네이트 및 트랜스 2,3 부틸렌 카르보네이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 시약 조성물에서 추가로 바람직한 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르 또는 이의 할로겐화 유도체는 에틸렌 카르보네이트, 디메틸 카르보네이트, 프로필렌 카르보네이트, 비닐렌 카르보네이트, 트리메틸렌 카르보네이트, 에리트리톨 비스카르보네이트, 글리세롤 1,2-카르보네이트, 4-클로로-1,3-디옥솔란-2-온 및 4,5-디클로로-1,3-디옥솔란-2-온으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 시약 조성물에서 추가로 바람직한 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르는 에틸렌 카르보네이트, 디메틸 카르보네이트, 글리세롤 1,2-카르보네이트, 프로필렌 카르보네이트, 비닐렌 카르보네이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 시약 조성물에서 추가로 바람직한 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르는 에틸렌 카르보네이트, 디메틸 카르보네이트, 글리세롤 1,2-카르보네이트 및 프로필렌 카르보네이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 시약 조성물에서 추가로 바람직한 시클릭 또는 비-시클릭 카르보네이트 에스테르는 에틸렌 카르보네이트, 디메틸 카르보네이트 및 글리세롤 1,2-카르보네이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 환원제가 2-머캅토에탄올, 2-머캅토에틸아민-HCl, TCEP, 시스테인-HCl, 디티오트레이톨 (DTT), N-메틸말레이미드, Ellman's 시약 및 1,2-디티올란-3-카르복실산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 시약 조성물에 관한 것이다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 환원제가 티올 기를 함유하는 것을 특징으로 하는 시약 조성물에 관한 것이다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 환원제가 2-머캅토에탄올, 2-머캅토에틸아민-HCl, TCEP, 시스테인-HCl 및 디티오트레이톨 (DTT) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 시약 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 특정 구현예에서, 환원제의 농도는 2 mM 내지 30 mM, 추가의 구현예에서, 3 mM 내지 20 mM, 추가의 구현예에서, 3.5 mM 내지 15 mM, 추가의 구현예에서, 4 mM 내지 10 mM 이다.
환원제의 수용능이 관능기, 즉 환원기의 존재에 의존적인지가 당업자에게 공지되어 있다. 따라서, 활성 환원기의 수를 고려하여 환원제의 적절한 농도를 선택하는 것이 당업자에게 공지되어 있다.
비타민 D-결합 단백질을 위한 유전자 코드는 상이한 대립형질의 형태로 인간 개체군에서 발생한다. 이들 대립형질에 의해 코딩되는 폴리펩티드가 생화학적으로 상이하고 즉 상이한 표현형을 야기함이 공지되어 있다. 또한, 이들 생화학적 차이는 비타민 D 화합물의 결합 및 방출에 영향을 미친다. 본 발명에 따른 시약 조성물은 비타민 D-결합 단백질의 표현형에 독립적으로 비타민 D 화합물을 방출하기에 적합하다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구현예는 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하기 위한 본 발명에 따른 시약 조성물의 용도이다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 시약 조성물은 비타민 D-결합 단백질의 표현형과는 독립적으로, 조사되는 샘플 각각에서 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하기 위해 사용된다.
비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하기 위한 목적으로, 본 발명에 따른 시약 조성물은 조사되는 샘플, 예를 들어, 혈청 또는 혈장, 및 알칼리화제와 혼합된다.
시약 혼합물:
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "시약 혼합물" 은 조사되는 샘플, 본 발명에 따른 시약 조성물, 및 알칼리화제를 포함한다.
추가의 구현예에서, 시약 혼합물은 알칼리화제가 NaOH, KOH, Ca(OH)2 및 LiOH 로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
추가의 구현예에서, 시약 혼합물은 사용되는 알칼리화제가, 각각, 0.1 M 내지 2.0 M 의 농도, 또는 0.1 M 내지 1.5 M 의 농도, 또는 0.2 M 내지 1.75 M 의 농도, 또는 0.2 M 내지 1.0 M 의 농도, 또는 0.1, 0.2, 0.3 또는 0.4 M 이상, 또는 2.0, 1.7, 1.5, 1.3, 1.0 또는 0.75 M 이하의 농도를 갖는 것을 특징으로 한다.
추가의 구현예에서, 시약 혼합물은 알칼리화제가 NaOH 및 KOH 로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
추가의 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 알칼리화제는, 각각, 0.1 M 내지 0.6 M 의 농도, 또는 0.2 M 내지 0.5 M 의 농도, 또는 0.1, 또는 0.2 M 이상, 또는 0.6, 또는 0.5 M 이하의 최종 농도를 갖는다.
구현예에서, 조사되는 샘플에 대해 시약 조성물 및 알칼리화제의 혼합비는 바람직하게는 1:3 내지 3:1 이다.
조사되는 샘플, 개시되는 시약 조성물 및 알칼리화제는 임의의 피페팅 순서로 첨가되어 시약 혼합물을 형성할 수 있다. 추가의 구현예에서, 혼합시 시약 혼합물은 10, 12, 15, 또는 20 초 이상 동안 및 9.5 내지 14 의 pH 값을 특징으로 하며, 추가로 바람직하게는, 시약 혼합물은 혼합시 10, 12, 15 또는 20 초 이상 동안 및 10.5 내지 14 의 pH 값을 특징으로 한다.
조사되는 샘플은 본 발명에 따른 시약 조성물 및 알칼리화제와 혼합되고 인큐베이션된다. 또한, 이러한 단계는 소위 전처리 단계로 불릴 수 있다. 전처리 단계는 요구되는 한 수행될 수 있다. 인큐베이션 시간은 예를 들어 15 초 내지 24 h 동안이다. 하나의 구현예에서, 시약 혼합물은 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하기 위해 1 내지 60 분 동안 인큐베이션된다. 또다른 구현예에서, 시약 혼합물은 4 내지 10 분 동안 인큐베이션되어 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출한다.
시약 혼합물 및 이의 성분의 농도는, 각각, 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염, 환원제 및 알칼리화제의 원하는 농도 및 pH 범위가 조사되는 샘플과의 인큐베이션 동안 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하기에 적절하도록 당업자에 의해 용이하게 선택된다.
시약 혼합물 및 이의 성분의 농도는, 특정 pH 범위 및 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염, 환원제 및 알칼리화제의 원하는 농도가, 각각, 조사되는 샘플과의 인큐베이션 동안, 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하기에 적절하도록 용이하게 선택된다.
구현예에서, 시약 혼합물은 또한 본 발명의 시약 조성물을 위해 기술된 바와 같이 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염의 바람직한 물질을 포함한다.
비타민 D 화합물의 검출은 바람직하게는, 25-히드록시비타민 D2, 25-히드록시비타민 D3, 24,25 디히드록시비타민 D2, 24,25-디히드록시비타민 D3 및 C3-에피 25-히드록시비타민 D 를 포함하는 군으로부터 선택되는 비타민 D 화합물 하나 이상이 검출되도록 수행된다.
비타민 D 화합물의 특이적 검출에서, 추가의 인큐베이션 단계가 전처리 단계 이후 수행된다. 시약 혼합물에 존재하는 환원제의 잔재는 비특이적 단백질, 바람직하게는 예를 들어 인간 혈청 알부민 (HSA) 의 첨가에 의해 차폐될 수 있다. 이러한 비특이적 단백질은 분리되어 첨가될 수 있거나 검출 시약을 또한 포함하는 용액에서 단순히 포함될 수 있다. 환원제의 수용능을 감소시키는 잔류물을 차폐함으로써, 단백질성 특이적 결합제를 사용하는 비타민 D 화합물의 검출이 절충되지 않을 수 있다.
당업자에게 숙지된 바와 같이, 특이적 결합제를 포함하는 용액은 시약 혼합물에 대한 특이적 결합제를 함유하는 용액의 첨가 이후 pH 가 특이적 결합제에 대한 비타민 D 화합물의 필수전제 결합을 보장하는 pH 완충계를 함유할 것이다. 비타민 D 화합물에 대한 특이적 결합제의 결합이 발생하는 한 최종 pH 가 반드시 요구되지는 않는다. 비타민 D-결합 단백질이 특이적 결합제로서 사용되는 경우, 이러한 인큐베이션 단계 동안 pH 는 바람직하게는 pH 6.0 내지 pH 9.0 사이에서 선택된다. 항체가 비타민 D 화합물에 대한 특이적 결합제로서 사용되는 경우, 이러한 인큐베이션 단계 동안 pH 는 바람직하게는 pH 5.5 내지 pH 7.5 일 것이다.
특이적 결합제를 포함하는 용액은 바람직하게는 20 mM 내지 400 mM 인 완충계를 함유한다. 또한 바람직하게는 완충제는 50 mM 내지 350 mM 또는 100 mM 내지 300 mM 의 몰농도를 갖는다.
비타민 D 화합물의 검출을 위한 시험관내 방법은 본 발명의 개시에 기초할 수 있고 다양한 방식으로 수행될 수 있다.
원칙적으로, 하나 이상의 비타민 D 화합물에 결합하는 모든 단백질성 결합 파트너, 예컨대 특이적으로 결합하는 폴리펩티드는 특이적 결합제로서 사용될 수 있다. 특이적 결합제는 항체 또는 비타민 D-결합 단백질 그 자체일 수 있다.
많은 시판되는 시험 시스템은 아비딘 또는 스트렙타비딘 (SA) 로 코팅되는 고체 상의 사용을 기초로 하며, 예를 들어 SA-코팅된 마이크로티트리 플레이트 또는 SA-로 코팅된 라티스로 코팅된다.
비오틴화된 분석물 유도체는 예를 들어 시험 절차 동안 또는 그 전에 이러한 SA 고체 상에 결합된다. 비타민 D 화합물을 검출할 때 이러한 비오틴화된 분석물 유도체 화합물은 예를 들어 비오틴화된 25-히드록시비타민 D2 및/또는 비오틴화된 25-히드록시비타민 D3 일 수 있다.
하나의 구현예에서, 검출의 시험관내 방법은 경쟁적 검정으로서 수행된다. 그러한 경쟁 시험에서, 비타민 D 화합물의 유도체는 특이적 결합제의 결합 부위에 대한 샘플로부터 상응하는 비타민 D 화합물과 시험 경쟁물에 대한 소정의 양으로 첨가된다. 샘플에서 비타민 D 화합물이 더욱 많을수록, 검출 신호는 더욱 적다.
하나의 구현예에서, 비타민 D 화합물의 유도체는 비오틴화 비타민 D 화합물이다. 추가의 구현예에서, 비오틴화 비타민 D 화합물은 비오틴화 25-히드록시비타민 D2 및/또는 비오틴화 25-히드록시비타민 D3 이다. 추가의 구현예에서, 비오틴화 비타민 D 화합물은 비오틴화 25-히드록시비타민 D2 이다.
상기 언급된 바와 같이, 본 명세서에 개시된 바와 같은 검출 방법에서 사용되기에 바람직한 특이적 결합제는 항체 및 비타민 D-결합 단백질이다. 비타민 D-결합 단백질, 경쟁적 검정 포맷에서 사용되는 경우, 이는 하나 이상의 (비오틴화) 비타민 D 화합물 유도체에 대한 이의 결합이 경쟁하는 모든 비타민 D 화합물의 통합된 측정을 야기할 것이다. 하나의 구현예에서, 비타민 D-결합 단백질은 검출가능하게 라벨링될 것이며, 예를 들어 루테닐화된다.
용도:
하나의 구현예에서, 본 발명은 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하기 위한 알칼리화제와 함께 시약 조성물의 용도에 관한 것이다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 비타민 D-결합 단백질로부터 조사되는 샘플에 존재하는 것으로 예상되는 비타민 D 화합물을 방출하기 위한 알칼리화제와 함께 시약 조성물의 용도에 관한 것이다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 비타민 D 화합물을 검출하는 방법에서 비타민 D 화합물을 방출하기 위한 알칼리화제와 함께 시약 조성물의 용도에 관한 것이다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 비타민 D 화합물을 검출하는 방법에서 비타민 D-결합 단백질로부터 샘플에 존재하는 것으로 예상되는 비타민 D 화합물을 방출하기 위한 1 M 내지 1.5 M 의 알칼리화제의 용액과 함께, 0.1 M 내지 2.0 M 의 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염, 2 mM 내지 30 mM 의 환원제를 함유하는 시약 조성물의 용도에 관한 것이다.
또한 구현예에서, 시약 조성물의 용도는 본 발명의 시약 조성물에 대해 기술되는 바와 같이 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염의 바람직한 물질을 포함한다.
키트 :
하나의 구현예에서, 본 발명은 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물의 방출을 위한 키트에 관한 것이며, 이는 가수분해시 0.1 M 내지 2.0 M 의 농도로 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염 및 환원제를 포함하는 시약 조성물을 함유한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물의 검출용 키트에 관한 것이며, 이는 0.1 M 내지 2.0 M 의 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염, 환원제, 및 알칼리화제를 갖는 시약 조성물을 포함하는 것을 특징으로 한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물의 검출용 키트에 관한 것이며, 이는 0.1 M 내지 2.0 M 의 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염, 2 mM 내지 30 mM 의 환원제, 및 알칼리화제를 갖는 시약 조성물을 포함하는 것을 특징으로 한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물의 검출용 키트에 관한 것이며, 이는 검출 성분 외에도, 0.1 M 내지 2.0 M 의 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염, 2 mM 내지 30 mM 의 환원제, 1 M 내지 1.5 M 의 알칼리화제 용액을 갖는 시약 조성물을 포함하는 것을 특징으로 한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 특이적 결합제를 포함하는 용액 외에도, 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염, 환원제, 알칼리화제 용액을 갖는 시약 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 비타민 D 화합물의 검출용 키트에 관한 것이다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 0.1 M 내지 2.0 M 의 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염, 2 mM 내지 30 mM 의 환원제, 1 M 내지 1.5 M 의 알칼리화제 용액 및 특이적 결합제를 포함하는 용액을 갖는 시약 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 비타민 D 화합물 검출용 키트에 관한 것이다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 0.1 M 내지 2.0 M 의 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염, 2 mM 내지 30 mM 의 2-머캅토에탄올, 2-머캅토에틸아민-HCl, TCEP, 시스테인-HCl 및 디티오트레이톨 (DTT) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 환원제, 1 M 내지 1.5 M 의 NaOH, KOH, Ca(OH)2 및 LiOH 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 알칼리화제 용액 및 특이적 결합제를 포함하는 용액을 갖는 시약 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 비타민 D 화합물 검출용 키트에 관한 것이다.
또한 구현예에서, 키트는 본 발명의 시약 조성물에 대해 기술된 바와 같이 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염의 바람직한 물질을 포함한다.
본 발명에 따른 시약 조성물은 비타민 D 화합물용 자동화 시험에서 사용되는데 적합한 것으로 증명되었다. 본 발명은 특히 바람직하게는 비타민 D 화합물의 검출을 위한 시험에서 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하기 위한 본 발명에 따른 시약 조성물의 용도에 관한 것이다. 비타민 D 화합물용 시험은 바람직하게는 완전히 자동화된다. 이 경우, 완전히 자동화된다는 것은, 조사되는 샘플 비타민 D 화합물을 측정하기 위한 모든 성분을 함유하는 시약 팩을 자동화된 분석기에 두고 모든 추가의 단계가 분석기에 의해 자동적으로 수행된다는 것을 의미한다. 특히 바람직하게는, 완전히 자동화된 시험은 Roche Diagnostics 로부터의 Elecsys® 분석기에서 수행된다.
추가의 구현예에서, 본 발명에 따른 시약 조성물은 25-히드록시비타민 D2, 25-히드록시비타민 D3, 24,25 디히드록시비타민 D2, 24,25-디히드록시비타민 D3 및 C3-에피 25-히드록시비타민 D 를 포함하는 군으로부터 선택되는 비타민 D 화합물의 검출을 위한 시험관내 방법에서 사용된다.
상기 언급된 바와 같이, 25-히드록시비타민 D2 및 25-히드록시비타민 D3 은 특히 진단용 비타민 D 형태와 관계가 있다. 본 발명에 따른 시험관내 방법에서, 둘 모두의 25-히드록시비타민 D2 또는 25-히드록시비타민 D3 에 대한 특이적 항체를 통한 25-히드록시비타민 D2 또는 25-히드록시비타민 D3 의 특이적 검출이 또한 바람직한 구현예이다.
실제 보호 범위는 본 발명은 하기 실시예 및 도면에 의해 추가로 명확해진다. 본 발명에 첨부된 특허청구범위로부터 나온다.
실시예 1
25- 히드록시비타민 D 의 검출을 위한 검정
시판되는 검정법을 제조사의 지시사항에 따라 사용하였다. 25-히드록시비타민 D 측정을 문헌에 기술된 바와 같이 LC-MS/MS (Vogeser, M. et al., Clin. Chem. 50 (2004) 1415-1417) 에 의해 또는 HPLC (25(OH)비타민 D3 용 시험, "Immundiagnostik" Company, Bensheim, 주문 번호 KC 3400) 에 의해 수행하였다.
성분의 제조 및 신규 시험을 위한 일반적 시험 절차를 하기에서 기술한다:
1.1 히드록시비타민 D 2 -3-2'- 시아노에틸 에테르의 합성
20.6 mg (50 μmol) 의 25-히드록시비타민 D2 (Fluka No. 17937) 를 아르곤 분위기 하에서 내부 온도계를 장착한 25 ml 3목 둥근 바닥 플라스크에서 10 ml 의 건식 아세토니트릴에 용해시켰다. 1.5 ml 의 tert-부탄올/아세토니트릴 (9:1) 을 용액에 첨가하고 냉욕에서 6℃ 로 냉각시켰다. 이어서 820㎕ 의 아크릴로니트릴 용액 (1.0 ml 아세토니트릴 중 86㎕ 아크릴로니트릴) 을 첨가하고 15 분 동안 6℃ 에서 교반하였다. 이어서, 205㎕ 의 칼륨 히드라이드 용액 (0.5 ml 의 tert-부탄올/아세토니트릴 9:1 중 25 mg KH) 을 첨가하였다. 깨끗한 용액이 수득된 후 간단한 응결이 발생하였다. 반응 용액을 추가의 45 분 동안 6℃ 에서 교반하고 이어서 60 분 동안 4℃ 에서 교반하였다.
이어서 반응 용액을 10 ml 의 메틸-tert-부틸 에테르로 희석하고 각각 10 ml H2O 로 2 회 세척하였다. 유기 상을 약 1 g 의 무수 황산 나트륨으로 건조시키고, G3 유리 프릿 상에 여과시키고 회전 증발기에서 증발시켰다. 고 진공 하에 건조시켜 약 55 mg 의 질량을 갖는 점성이 있는 깨끗한 잔사를 형성하였다.
1.2 히드록시비타민 D 2 -3-3-아미노프로필 에테르의 합성
상기 수득되는 전체 니트릴을 15 ml 의 디에틸 에테르에 용해시키고, 교반하면서, 7.5 ml 의 디에틸 에테르 중의 7.5 mg 의 리튬 히드라이드 현탁액과 혼화시켰다. 반응 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 이후, 6.6 ml 디에틸 에테르 중 38.4 mg 리튬 알루미늄 히드라이드의 현탁액을 첨가하였다. 이러한 결과는 혼합물의 강한 혼탁을 초래한다. 반응 혼합물을 실온에서 추가의 4 시간 동안 교반하고, 이어서 반응 혼합물을 빙욕에서 0-5℃ 로 냉각하고 35 ml 의 물을 조심스럽게 첨가하였다. 6.6 ml 의 10 M 수산화 칼륨 용액의 첨가에 의해 pH 를 강하게 염기성으로 만들었다.
각각 65 ml 의 메틸-tert-부틸 에테르로 3 회 추출하였다. 결합된 유기 상을 약 5 g 의 무수 황산 나트륨을 이용하여 건조시키고 여과하고 회전 증발기에서 실온에서 증발시켰다. 잔사를 건조시켜 오일 펌프를 사용하여 질량을 일정하게 하였다. 미정제 생성물을 5 ml DMSO 및 3.0 ml 아세토니트릴에 용해시키고 제조용 HPLC 에 의해 정제하였다.
용리액 A = Millipore-H2O + 0.1 % 트리플루오로아세트산;
용리액 B = 95 % 아세토니트릴 + 5 % Millipore-H2O + 0.1 % TFA;
구배: 100 분에서 50 % B 내지 100 % B
유속: 30 ml/분
온도: 실온
컬럼 치수:
Figure 112012095049554-pct00007
= 5.0 cm; L = 25 cm
컬럼 물질: Vydac C18/300Å × 15-20 ㎛
det. 파장: 226 nm
생성물 함량이 분석적 HPLC (Vydac C18/300Å × 5 ㎛; 4.6 x 250 mm) 에 따라 85 % 초과인 분획을 둥근 바닥 플라스크에 풀링하고 동결건조시켰다. 무색의 동결건조물로서 13.7 mg (수율: 58 %) 을 수득하였다.
1.3 히드록시비타민 D 2 -3-3'-N-( 헤미수베릴 )아미노프로필-에테르-비오틴-(베타- Ala )- Glu - Glu - Lys (엡실론) 접합체 (= Ag - Bi ) 의 합성
13.7 mg (25 μmol) 의 히드록시비타민 D2-3-3'-아미노프로필 에테르를 3.5　ml DMSO 에 용해시키고, 28.7 mg (30 μmol) 의 비오틴-(beta-Ala)-Glu-Glu-Lys(에피손)-헤미수베레이트-N-히드록시숙시니미드 에스테르 (Roche Applied Science, No. 11866656) 및 12.5㎕ 의 트리에틸아민을 첨가하고 이를 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 용액을 4.5 ml 의 DMSO 로 희석하고, 0.45 ㎛ 마이크로여과기를 통해 여과하고 이어서 제조용 HPLC 에 의해 정제하였다 (조건은 실시예 2.3 b) 참조). 분석적 HPLC 에 따라 85 % 초과의 생성물을 함유하는 분획을 풀링하고 동결건조시켰다. 9.8 mg (수율: 30 %) 정제된 비오틴 접합체를 수득하였다.
1.4 비타민 D-결합 단백질의 루테닐화 및 겔 여과 크로마토그래피에 의한 정제
비타민 D-결합 단백질을, 100　mM 칼륨 포스페이트 / 150 mM 나트륨 클로라이드 완충제 (pH 8.5) 로 이동시키고 단백질 농도를 5-10 mg/ml 로 조정하였다. 루테닐화 시약 (루테늄 (II) 트리스 (바이피리딜)-N-히드록시숙시니미드 에스테르) 를 DMSO 에 용해하고 3 내지 1 의 몰비로 항체 용액에 첨가하였다. 45 분의 반응 시간 후, l-라이신의 첨가에 의해 반응을 중지시키고 루테닐화된 비타민 D-결합 단백질 (= DBP-Ru) 을 Superdex 200 컬럼 상에서 겔 여과에 의해 정제하였다.
1.5 검정에서의 시험 절차
조사할 샘플을 Roche Diagnostics 사로부터의 Elecsys® 시스템을 사용하여 측정하였다.
조사할 샘플을 시약 조성물 (A) 및 알칼리화제 (B) 와 혼합함으로써 시약 혼합물을 형성하였다.
이 실시예에서, 시약 혼합물은 15㎕ 의 시약 조성물 (A) 및 10㎕ 의 알칼리화제 (B) 와 혼합된 15㎕ 의 샘플로 형성된다. 시약 혼합물을 9 분 동안 인큐베이션하였다. 다음 단계에서, 70㎕ 의 검출 시약 (용액 C) 을 시약 혼합물에 첨가하고 추가의 9 분 동안 인큐베이션하였다. 마지막 단계에서, 비오틴화 벽 항원 (용액 D) (60㎕) 및 스트렙타비딘 (SA) (30㎕) 로 코팅된 자화될 수 있는 폴리스티렌 입자 30㎕를 첨가하였다 (현탁액 E). 추가적으로 9 분의 인큐베이션 후 결합된 루테닐화된 비타민 D-결합 단백질의 양을 통상적으로 측정하였다 (참조, 도 1, 2, 3, 4a, 4b).
시약 조성물 (A) 는 하기를 함유한다:
10 mM NaOH
4 mM EDTA
6.7 mM 디티오트레이톨 (DTT)
0.5 M 에틸렌 카르보네이트 (EC)
pH 5.5
알칼리화제 (B) 는 하기를 함유한다:
1.375 M NaOH
루테닐화된 비타민 D-결합 단백질 (DBP-Ru) 을 갖는 용액 C 는 하기를 함유한다:
0.2 M 비스-트리스-프로판 (pH 7.5)
2.5% 인간 혈청 알부민 (HSA)
50 mM NaCl
1% 만니톨
0.1% 옥시피리온
0.12 ㎍/mL DBP-Ru
비오틴화 벽 항원을 갖는 용액 D 는 하기를 함유한다:
0.2 M 비스-트리스-프로판 (pH 8.6)
0.5% 트윈-20 용액
0.1% 옥시피리온
30 ng/ml 비오틴
0.0108 ㎍/mL Ag-Bi (실시예 1.1)
SA-코팅된 라텍스 입자를 갖는 현탁액 E 는 하기를 함유한다:
470 ng/ml 의 결합 용량을 갖는 0.72 mg/ml 의 SA-코팅된 자화될 수 있는 폴리스티렌 입자
실시예 2
카르보네이트 에스테르 대 금속 염 , 포스페이트 완충제 및 카르보네이트의 비교
조사할 샘플을 Roche Diagnostics 사로부터 Elecsys® 시스템을 사용하여 측정하였다. 총 검정 절차를 실시예 1.5 에 나타낸다.
실시예 1.5 에서 벗어나, 시약 조성물 (A) 은 각각 0.5 M 에틸렌 카르보네이트 (EC), 0.5 M Na2CO3, 0.5 M NaCl 또는 0.5 M NaH2PO4 를 함유한다.
시약 조성물 (A):
10 mM NaOH
4 mM EDTA
6.7 mM DTT
0.5 M 의, EC, Na2CO3, NaCl 또는 NaH2PO4
10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT 를 함유하는 시약 조성물 (A) 을 대조군으로서 사용하였다. 결과를 도 5 에 나타냈다. 알칼리 전처리 (시약 혼합물) 에 존재하는 카르보네이트 에스테르 (0.5 M EC (◆)) 는 경쟁적 검정에서 신호 증강 효과를 야기하였다. 특히, 신호 역학은 EC (□) 가 없는 시험에 비해 개선되었다. 염 (0.5 M NaCl, (◇)) 는 효과를 나타내지 않았다. 0.5 M Na2CO3 (○) 또는 0.5 M NaH2PO4 (▲) 의 첨가는 신호에 대해 미미한 효과를 나타냈다.
실시예 3
카르보네이트 에스테르의 존재/부재 하의 알칼리 전처리
조사할 샘플을 Roche Diagnostics 사로부터 Elecsys® 시스템을 사용하여 측정하였다. 검정 절차를 실시예 1.5 에 나타냈다.
실시예 1.5 에서 벗어나, 하기를 함유하는 3 개의 상이한 시약 조성물을 제조하였다:
◆: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 0.5 M EC (참조, 실시예 1.5) 또는
▲: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT 또는
□: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA.
샘플 + ◆ (실시예 1.5 에 기술된 바와 같은 시약 조성물 (A) + 알칼리화제 (B)), ▲, 또는 □ 각각 중 하나 (= 시약 혼합물) 의 4 분의 전처리 인큐베이션 후, 용액 C 의 첨가 전에, 시약 혼합물의 pH 를 비스-트리스-프로판 (pH 6.3) 의 첨가에 의해 pH 9 로 설정하였다 (도 6). 알칼리 전처리 (시약 혼합물) 에 존재하는 카르보네이트 에스테르 EC 는 경쟁적 검정에서 신호 증강 효과를 야기하였다. 특히 신호 역학이 EC 없는 시험과 비교시 개선되었다.
실시예 4
에틸렌 카르보네이트 대 디메틸 카르보네이트
조사할 샘플을 Roche Diagnostics 사로부터 Elecsys® 시스템을 사용하여 측정하였다. 검정 절차를 실시예 1.5 에 나타냈다.
실시예 1.5 에서 벗어나, 하기를 함유하는 2 개의 상이한 시약 조성물 (A) 를 제조하였다:
○: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 0.5 M EC (참조, 실시예 1.5) 또는
◆: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 0.5 M 디메틸 카르보네이트.
둘 모두의 카르보네이트 에스테르, 에틸렌 카르보네이트 또는 디메틸 카르보네이트 각각은 동일한 검정 성능을 나타냈다 (도 7).
실시예 5
에틸렌 카르보네이트의 가수분해 생성물의 효과
조사할 샘플을 Roche Diagnostics 사로부터 Elecsys® 시스템을 사용하여 측정하였다. 검정 절차를 실시예 1.5 에서 나타냈다.
실시예 1.5 에서 벗어나, 하기를 함유하는 5 개의 상이한 시약 조성물 (A) 를 제조하였다:
◆: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 0.5 M EC (참조, 실시예 1.5) 또는
○: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 0.5 M NaHCO3 또는
▲: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 0.5 M NaHCO3 + 0.5 M 에틸렌 글리콜
□: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT.
EC 의 알칼리 가수분해 생성물은 에틸렌 글리콜이고, 이는 검정 (▲) 에 영향을 미치지 않았다. 수소 카르보네이트 염 (NaHCO3) 은 또한 신호 증강 효과를 나타냈으나, 카르보네이트 에스테르 만큼은 아니다 (도 8).
실시예 6
에틸렌 카르보네이트 대 글리세롤 1,2 카르보네이트
조사할 샘플을 Roche Diagnostics 사로부터 Elecsys® 시스템을 사용하여 측정하였다. 검정 절차를 실시예 1.5 에 나타냈다.
실시예 1.5 에서 벗어나, 하기를 함유하는 2 개의 상이한 시약 조성물 (A) 을 제조하였다:
◆: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 0.5 M EC (참조, 실시예 1.5) 또는
○: 10 mM NaOH, 4 mM EDTA, 6.7 mM DTT, 0.5 M 글리세롤 1,2 카르보네이트.
둘 모두의 카르보네이트 에스테르, 에틸렌 카르보네이트 또는 글리세롤 1,2 카르보네이트는, 각각, 동일한 검정 성능을 나타냈다 (도 9).

Claims (19)

  1. 하기 단계를 포함하는, 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하기 위한 시험관내 방법:
    a) 조사할 샘플을 제공하는 단계, 및
    b) 단계 (a) 로부터의 샘플을,
    i) 가수분해시 0.1 M 내지 2.0 M 농도로 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 0.1 M 내지 2.0 M 농도의 탄산 수소 염을 함유하는 시약,
    ii) 환원제, 및
    iii) 알칼리화제
    와 혼합함으로써, 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하는 단계,
    여기서, 가수분해시 0.1 M 내지 2.0 M 농도로 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질은 에틸렌 카르보네이트, 디메틸 카르보네이트, 프로필렌 카르보네이트, 비닐렌 카르보네이트, 트리메틸렌 카르보네이트, 에리트리톨 비스카르보네이트, 글리세롤 1,2-카르보네이트, 4-클로로-1,3-디옥솔란-2-온, 4,5-디클로로-1,3-디옥솔란-2-온, 2,5-디옥사헥산디오산 디메틸 에스테르, 피로카르보네이트, 1,2 부틸렌 카르보네이트, 시스 2,3 부틸렌 카르보네이트 및 트랜스 2,3 부틸렌 카르보네이트로 이루어진 군으로부터 선택됨.
  2. 제 1 항에 있어서, 단계 (i) 에 따른 시약이 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하기 위한 적절한 조건 하에서 수용액에 가용성인 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 단계 (i) 에 따른 시약이 0.1 M 내지 2.0 M 의 농도로 탄산 수소 염을 함유하는 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 단계 (i) 에 따른 시약이 0.1 M 내지 2.0 M 의 농도로 가수분해시 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질을 함유하는 방법.
  5. 삭제
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 샘플이 액체 샘플인 방법.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 샘플이 혈액, 혈청 또는 혈장인 방법.
  8. 하기 단계를 포함하는, 비타민 D 화합물을 측정하기 위한 시험관내 방법:
    a) 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 방법에 따라 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하는 단계, 및
    b) 단계 (a) 에서 방출되는 비타민 D 화합물을 측정하는 단계.
  9. 제 8 항에 있어서, 비타민 D 화합물이 25-히드록시비타민 D2, 25-히드록시비타민 D3, 24,25-디히드록시비타민 D2, 24,25-디히드록시비타민 D3 및 C3-에피 25-히드록시비타민 D 로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 비타민 D 화합물 25-히드록시비타민 D2, 25-히드록시비타민 D3, 또는 25-히드록시비타민 D2 및 25-히드록시비타민 D3 을 측정하는 방법.
  11. 가수분해시 0.1 M 내지 2.0 M 의 농도로 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 및 환원제를 포함하는, 비타민 D-결합 단백질로부터 비타민 D 화합물을 방출하기 위한 시약 조성물로서,
    여기서, 가수분해시 0.1 M 내지 2.0 M 농도로 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질은 에틸렌 카르보네이트, 디메틸 카르보네이트, 프로필렌 카르보네이트, 비닐렌 카르보네이트, 트리메틸렌 카르보네이트, 에리트리톨 비스카르보네이트, 글리세롤 1,2-카르보네이트, 4-클로로-1,3-디옥솔란-2-온, 4,5-디클로로-1,3-디옥솔란-2-온, 2,5-디옥사헥산디오산 디메틸 에스테르, 피로카르보네이트, 1,2 부틸렌 카르보네이트, 시스 2,3 부틸렌 카르보네이트 및 트랜스 2,3 부틸렌 카르보네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시약 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 환원제가 2-머캅토에탄올, 2-머캅토에틸아민-HCl, TCEP, 시스테인-HCl, 디티오트레이톨 (DTT), N-메틸말레이미드, 엘만 (Ellman) 시약 및 1,2-디티올란-3-카르복실산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 시약 조성물.
  13. 제 11 항에 있어서, 환원제가 2-머캅토에탄올, 2-머캅토에틸아민-HCl, TCEP, 시스테인-HCl 및 디티오트레이톨 (DTT) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 시약 조성물.
  14. 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 환원제가 2 mM 내지 30 mM 의 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 시약 조성물.
  15. 혈액, 혈청 또는 혈장인 조사할 샘플, 가수분해시 0.1 M 내지 2.0 M 의 농도로 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질 또는 탄산 수소 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질 및 환원제를 포함하는 시약 조성물, 및 NaOH, KOH, Ca(OH)2 및 LiOH 로 이루어진 군으로부터 선택되는 알칼리화제를 포함하는 시약 혼합물로서,
    여기서, 가수분해시 0.1 M 내지 2.0 M 의 농도로 탄산 수소 이온 (HCO3 -) 을 방출할 수 있는 물질은 에틸렌 카르보네이트, 디메틸 카르보네이트, 프로필렌 카르보네이트, 비닐렌 카르보네이트, 트리메틸렌 카르보네이트, 에리트리톨 비스카르보네이트, 글리세롤 1,2-카르보네이트, 4-클로로-1,3-디옥솔란-2-온, 4,5-디클로로-1,3-디옥솔란-2-온, 2,5-디옥사헥산디오산 디메틸 에스테르, 피로카르보네이트, 1,2 부틸렌 카르보네이트, 시스 2,3 부틸렌 카르보네이트 및 트랜스 2,3 부틸렌 카르보네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시약 혼합물.
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