KR101494139B1

KR101494139B1 - TF1-ATPase 재조합 단백질의 제조방법 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101494139B1
Application number: KR20140127088A
Authority: KR
Inventors: 엄숭호; 장민수
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2014-09-23
Filing date: 2014-09-23
Publication date: 2015-02-16

Abstract

본 발명은 회전 운동 특성을 가지는 TF1-ATPase 재조합 단백질(mTF1-ATPase)의 제조방법 등에 관한 것으로, 보다 상세하게는 TF1-ATPase 단백질 α 서브유닛의 193번째 아미노산을 세린으로 치환하고, γ 서브유닛의 107번째 아미노산을 시스테인으로 치환하여 시스테인을 γ 서브유닛에만 단 하나 존재하도록 함으로써 해당 부위에 약물 등을 결합시킬 수 있도록 하고, β 서브유닛에 히스티딘 태그를 추가함으로써 단백질 정제가 용이하고 바이오칩 등의 기판에 mTF1-ATPase를 부착할 수 있도록 한 mTF1-ATPase의 제조방법 및 mTF1-ATPase를 포함하는 약물 전달체에 관한 것이다.

Description

TF1-ATPase 재조합 단백질의 제조방법 및 이의 용도 {PREPARATION METHOD OF TF1-ATPASE RECOMBINANT PROTEIN AND USE THEREOF}

본 발명은 회전 운동 특성을 가지는 TF1-ATPase 재조합 단백질(mTF1-ATPase)의 제조방법 등에 관한 것이다.

기존의 약물 전달 방법은 약물을 가지고 있는 입자체가 혈류를 따라서 이동하면서 임의적으로 세포에 전달되거나 세포막에 있는 단백질 등과 같은 물질에 특이적인 결합을 하면서 전달을 하는 방식을 이용한다. 혈류에 의한 수동적인 전달이 이루어지다 보니 실제로 전달되는 입자체의 수가 적다는 문제가 있다.

이에 최근에는 능동적으로 입자체가 전달되는 방법에 대한 다양한 연구들이 진행되고 있으며, 입자체를 이동시킬 수 있는 구동력의 필요성이 대두되고 있다.

이러한 구동력 중 하나는 뉴런 간 인지능력 활성화 등 생체 내 다양한 생물리화학적 움직임 변화에 성능자이고, 움직임 변화의 기능을 하며, 이온펌프의 주요한 특성 중에 하나인 자가 운동 능력을 가진 F1-ATPase 단백질을 꼽을 수 있다. F1-ATPase 중 α₃β₃γ로 이루어진 복합체가 ATP를 연료로 사용하여 회전 운동을 할 수 있음이 알려져 있다.

그러나 F1-ATPase 단백질을 얻기 위해서는 천연 추출 등의 고가이며 수율이 낮으며, 고도의 기술 능력을 필요로 한다는 단점이 존재한다. 또한, 생물체에서 직접 추출한 단백질의 경우에는 공학적인 변형이 힘들다는 단점을 지니고 있어 이에 대한 개발이 요구되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 종래기술의 문제점을 극복하기 위하여, 경제적이면서 고수율로 mTF1-ATPase를 수득할 수 있는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 TF1-ATPase 재조합 단백질(mTF1-ATPase)의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 회전 운동 특성을 가지는 TF1-ATPase 재조합 단백질(mTF1-ATPase)을 포함하는 약물 전달체을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 TF1-ATPase 재조합 단백질(mTF1-ATPase)의 제조방법을 제공한다: a) 야생형 TF1-ATPase 단백질 α 서브유닛의 193번째 아미노산을 시스테인에서 세린으로 치환하는 단계; b) 야생형 TF1-ATPase 단백질 γ 서브유닛의 107번째 아미노산을 세린에서 시스테인으로 치환하는 단계; c) 야생형 TF1-ATPase 단백질 β 서브유닛의 N 말단에 6 내지 10개의 히스티딘 잔기로 구성되는 히스티딘 태그를 추가하는 단계; d) 상기 서브유닛이 α-γ-β 순으로 연결된 발현벡터를 제조하는 단계; e) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및 f) 상기 형질전환체를 배양하여 mTF1-ATPase 의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 mTF1-ATPase 는 α, γ, β 서브유닛의 α₃β₃γ 복합체일 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 α 서브유닛은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되고, 상기 β 서브유닛은 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되며, 상기 γ 서브유닛은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 발현벡터는 pT7, pET/Rb, pGEX, pET28a(+), pET-22b(+), pGEX 및 pPAL7로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균(E.coli)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 α, γ, β 서브유닛의 각 양 말단에는 제한효소 인식부위가 추가로 포함되어 있을 수 있다.

또한, 본 발명은 TF1-ATPase 재조합 단백질(mTF1-ATPase)을 포함하는 약물 전달체를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 mTF1-ATPase는 α, γ, β 서브유닛의 α₃β₃γ 복합체일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 약물 전달체는 mTF1-ATPase 의 시스테인과 직접 또는 링커를 통해 약물이 결합하는 것일 수 있다.

본 발명은 변화된 mTF1-ATPase를 만들기 위한 클로닝 방법을 이용하여 여러개의 서브 유닛으로 구성된 단백질 제작을 용이하게 할 수 있는 특징이 있다.

또한, mTF1-ATPase의 회전 운동 특성을 이용하면 현존하는 모터 중 가장 작은 모터가 될 수 있으며, 생체 물질인 단백질로 만들어진 모터라는 이점을 이용하여 체내 약물 전달 등에도 유용하게 사용될 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 단백질 mTF1-ATPase와 야생형 TF1-ATPase의 아미노산 서열을 비교한 모식도이다.
도 2는 본 발명의 단백질 mTF1-ATPase 각 서브유닛(α, β, γ)의 아미노산 서열이다(서열번호 1 내지 3).
도 3은 본 발명의 단백질 mTF1-ATPase α 서브유닛의 염기 서열이다(서열번호 4).
도 4는 본 발명의 단백질 mTF1-ATPase β 서브유닛의 염기 서열이다(서열번호 5)
도 5는 본 발명의 단백질 mTF1-ATPase γ 서브유닛의 염기 서열이다(서열번호 6)
도 6은 본 발명의 mTF1-ATPase의 각 서브유닛의 유전자를 플라스미드 벡터 pPAL7에 도입시키는 방법에 대한 모식도이다.
도 7은 재조합 플라스미드를 만드는 과정에 필요한 플라스미드 및 중간 생성물 플라스미드를 전기영동 한 1% 아가로스 겔 사진이다: (a) pPAL 7 벡터, (b) pUC57 벡터에 α 서브 유닛이 삽입되어 있는 플라스미드, (c) pPAL7에 α 서브유닛이 삽입되어진 재조합 플라스미드, (d) γ 서브유닛이 pUC57에 삽입되어 있는 플라스미드, (e) pPAL7 벡터에 α 서브유닛, γ 서브유닛 순으로 삽입되어 있는 플라스미드, (f) pUC57 벡터에 β 서브유닛이 삽입되어 있는 플라스미드. 모든 겔 사진의 Lane 1은 1kbp DNA ladder이고, Lane 2는 원형의 플라스미드, Lane 3은 두 종류의 제한효소를 이용하여 자른 선형 형태이다.
도 8은 pPAL 7 플라스미드 벡터에 mTF1-ATPase의 세 가지 서브유닛의 유전자가 모두 삽입된 mTF1-ATPase_pPAL7 재조합 플라스미드가 만들어졌음을 확인한 전기영동 사진이다: Lane 1, 1kbp DNA ladder; Lane 2, mTF1-ATPase_pPAL7의 원형 형태; Lane 3, 제한효소 BamH I을 처리; Lane 4, 제한효소 BamH I과 EcoR I을 처리; Lane 5, 제한효소 BamH I, EcoR I과 Not I을 처리; Lane 6, 제한효소 BamH I, EcoR I, Not I과 Spe I을 처리.
도 9는 mTF1-ATPase를 정제하는 결과를 나타내는 SDS-PAGE 사진이다.
도 10은 mTF1-ATPase의 시간별 ATP 소모량을 측정한 결과에 대한 그래프이다.

본 발명자들은 회전 운동을 할 수 있는 F1-ATPase 단백질의 제조방법 및 용도에 대하여 연구한 결과 본 발명을 완성하였다. 이에, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 TF1-ATPase 재조합 단백질(mTF1-ATPase)의 제조방법을 제공한다:

a) 야생형 TF1-ATPase 단백질 α 서브유닛의 193번째 아미노산을 시스테인에서 세린으로 치환하는 단계;

b) 야생형 TF1-ATPase 단백질 γ 서브유닛의 107번째 아미노산을 세린에서 시스테인으로 치환하는 단계;

c) 야생형 TF1-ATPase 단백질 β 서브유닛의 N 말단에 6 내지 10개의 히스티딘 잔기로 구성되는 히스티딘 태그를 추가하는 단계;

d) 상기 서브유닛이 α-γ-β 순으로 연결된 발현벡터를 제조하는 단계;

e) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및

f) 상기 형질전환체를 배양하여 mTF1-ATPase 의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계.

본 발명은 회전 운동을 가시적으로 관찰이 가능하도록 아미노산 서열에 돌연변이를 일으킨 TF1-ATPase 재조합 단백질(mTF1-ATPase)을 경제적이면서도 고순도로 생산할 수 있는 제조방법을 제공한다.

가장 바람직하게 상기 mTF-ATPase은 α, γ, β 서브유닛의 α₃β₃γ 복합체로서, 상기 α 서브유닛은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되고, 상기 β 서브유닛은 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되며, 상기 γ 서브유닛은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성될 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 상기 아미노산 서열과 90% 이상의 높은 상동성을 가지는 서열은 모두 사용가능하다.

본 발명자들은 TF1-ATPase 재조합 단백질(mTF1-ATPase)의 제조를 위한 새로운 박테리아 서브클로닝(subcloning) 방법을 설계하였으며, mTF1-ATPase가 대장균(E.coli) 시스템에서 쉽게 발현이 되도록 최적의 핵산 서열을 재디자인 하였다. 상기 서브클로닝 방법은 여러 개의 서브유닛으로 구성된 mTF1-ATPase를 효율적으로 발현하기 위하여 각 서브유닛에 해당하는 유전자를 하나의 백본 플라스미드(발현벡터)에 높은 수율로 삽입하는 방법을 제시한 것이며, 본 발명에서는 상기 서브클로닝 방법을 사용하기 위한 사전 작업으로 각 유전자에 대한 제한효소 자리를 디자인 하는 방법도 제시하였다. 각 유전자의 양 말단(5' 및 3' 말단)에 서로 다른 제한효소 인식부위를 디자인함에 있어서, 각 제한효소 자리는 전체 유전자에서 유일해야 하며, 연결될 유전자들 중에서 앞쪽의 유전자의 3'말단(예를 들어, α 서브유닛을 코딩하는 유전자의 3'말단)과 뒤에 연결될 유전자의 5'말단(예를 들어, γ 서브유닛을 코딩하는 유전자의 5'말단)의 제한효소 자리는 같게 디자인하여야 한다. 그리고 유전자의 양 말단에 디자인 한 제한효소 자리는 백본 플라스미드의 여러 제한효소 부위(Multiple Cloning Site, MCS)에 존재해야 한다. 상기와 같이 디자인된 유전자를 하나씩 차례대로 백본 플라스미드에 삽입하는 방법을 이용하여 재조합 발현벡터를 만들 수 있다.

이와 관련하여, 본 발명의 일실시예에서는 호열성 바실러스 PS3의 야생형(wild type) TF1-ATPase를 이루는 단백질 중 α₃β₃γ 복합체에서 상기와 같이 2개의 특정 아미노산을 치환하고, 히스티딘 태그(Histidine tag)를 추가하여 mTF1-ATPase를 제조하였으며, 이를 대장균용 발현벡터에 삽입한 다음 숙주세포인 대장균 균주에 도입하여 형질전환체를 제조함으로써 mTF1-ATPase를 함유하는 산물을 수득하였다. 보다 상세하게, 상기 mTF1-ATPase는 야생형 TF1-ATPase α 서브유닛의 아미노산 서열에서 193번째의 시스테인(cysteine)을 세린(serine)으로, γ 서브유닛의 아미노산 서열에서 107번째의 세린(serine)을 시스테인(cysteine)으로 치환하고, β 서브유닛의 N 말단에 10개의 히스티딘(histidine) 잔기로 구성되는 히스티딘 태그를 추가하여 제조하였다. 상기와 같은 아미노산의 변화로 인해 mTF1-ATPase에는 티올기(-SH)를 가진 아미노산인 시스테인은 γ 서브유닛에만 단 하나 존재하게 되어 화학적 변화 및 특정 물질의 부착을 할 수 있도록 하였으며, 히스티딘 태그로 금속 기판에 mTF1-ATPase를 부착시킬 경우 회전 운동을 관찰할 수 있도록 하였다.

이때, 상기 히스티딘 태그는 6개 내지 10개의 히스티딘(histidine) 잔기로 구성될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기 발현벡터에는 mTF1-ATPase를 코딩하는 유전자가 작동 가능하게 연결되어 포함되며, 상기 발현 벡터는 pT7, pET/Rb, pGEX, pET28a(+), pET-22b(+), pGEX 및 pPAL7로 이루어진 군으로부터 선택되는 대장균에 형질전환 가능한 다양한 벡터를 사용하는 것이 바람직하고, pPAL7를 사용하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 숙주세포는 대장균(E.coli)을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서는 대장균 코돈에 최적화된 mTF1-ATPase를 코딩하는 유전자 서열로 재구성하여, 단백질 발현을 위한 조작의 용이성과 빠른 성장 프로필, 재조합 단백질의 높은 수율 등의 이점을 가지도록 하였다.

상기 α₃β₃γ 복합체인 mTF1-ATPase 단백질을 코딩하는 유전자는, α 서브유닛은 서열번호 4의 염기서열로 구성되고, 상기 β 서브유닛은 서열번호 6의 염기서열로 구성되며, 상기 γ 서브유닛은 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 상기 염기서열과 적어도 60%이상의 상동성을 가지는 염기서열은 모두 사용가능하다.

본 발명의 제조방법은 상기한 바와 같이, 각 α 서브유닛, γ 서브유닛, β 서브유닛이 발현벡터 또는 서로 다른 서브유닛과 연결될 수 있도록 5' 및 3' 말단에 제한효소 인식부위를 추가로 포함할 수 있으며, 이를 위해 해당 부위에 제한효소 인식 염기서열이 삽입되거나 적절하게 치환되는 등의 염기 변형이 있을 수 있다.

나아가 본 발명의 mTF1-ATPase는 자가 운동 능력을 나타내는 특징이 있는 바 약물 전달체로 사용할 수 있는데, 약물을 가지고 있는 입자체와 결합하여 약물을 이동시킬 수 있는 구동력으로 사용하거나 또는 mTF1-ATPase 내에는 티올기(-SH)를 가지는 아미노산인 시스테인이 단 하나만 존재하므로 상기 티올기에 직접 또는 링커를 통해 약물이 결합시켜 사용할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

TF1 - ATPase 돌연변이체( mTF1 - ATPase )의 제조

<1-1> 재조합 발현 벡터 mTF1 - ATPase _ pPAL7 의 제조

자연에 존재하는 호열성 바실러스(Bacillus sp.) PS3의 TF1-ATPase를 주형으로, 대장균에서 단백질 발현에 최적화 된 코돈을 이용하여 특정부위돌연변이유발 (site-specified mutagenesis) 방법을 통해 재조합 발현 벡터 mTF1-ATPase_pPAL7을 제조하였다. 호열성 바실러스 PS3의 TF1-ATPase는 δ, α, γ, β, ε 등 총 5 가지의 서브유닛 단백질들이 콤플렉스를 이루어 형성된다. 본 발명자들은 이 중 회전 운동에 필요한 α, γ, β 서브유닛만을 사용하였으며, 이에, 본 발명에서는 α₃β₃γ 복합체를 mTF1-ATPase라고 명칭한다.

<1-2> mTF1 - ATPase 의 서브 유닛 단백질 및 유전자 디자인

야생형 호열성 바실러스 PS3의 TF1-ATPase에 대하여, E.coli 시스템 상에서 TF1-ATPase 단백질을 고수율로 발현시키기 위해 상기 실시예 <1-1>과 같이 코돈 최적화 및 염기서열 돌연변이를 유발함과 동시에 mTF1-ATPase의 회전 운동에 적합하도록 아미노산 서열에 변화를 주어 다음과 같이 제조하였다.

코돈 최적화 및 돌연변이를 가진 유전자를 합성하기 위하여 GenScript Corporation(Piscataway, NJ, USA)을 이용하였으며, 이 결과로써 얻어진 mTF1-ATPase의 염기서열은 도 3 내지 5에 나타내었다(서열번호 4 내지 6).

상기 얻어진 핵산은 야생형 TF1-ATPase 단백질의 α 서브유닛 아미노산 서열에서 193번째의 cysteine을 serine으로 치환한 (Cα193S) 돌연변이 단백질을 코딩하는 염기서열(서열번호 4), γ 서브유닛의 아미노산 서열에서 107번째의 serine을 cysteine으로 치환한 (Sγ107C) 돌연변이 단백질을 코딩하는 염기서열(서열번호 5)이다. 또한, 야생형 TF1-ATPase 단백질의 β 서브유닛 아미노산 첫 부분에 10개의 histidine을 (10ㅧhis tag)을 추가한 돌연변이 단백질을 코딩하는 아미노산이다(서열번호 6). 상기 야생형 TF1-ATPase 단백질의 α, γ, β 서브유닛에 돌연변이를 일으킨 아미노산 서열은 도 2에 나타낸 바와 같다(서열번호 1 내지 3).

돌연변이 시킨 mTF1-ATPase를 이루고 있는 α, γ, β 서브유닛 단백질을 암호화하는 유전자를 각각 합성하였으며, 각 유전자의 양 말단에는 서브유닛 간에 연결될 수 있거나 벡터로 사용될 pPAL7과 연결될 수 있는 제한효소 자리를 가지도록 디자인하였다. 즉, α 서브유닛의 유전자는 5' 말단에 pPAL7과 연결될 수 있는 SpeI과 3' 말단에 γ와 연결될 수 있는 BamHI을 제한효소 자리로 가지고, γ 서브유닛의 유전자는 5' 말단에 α와 연결될 수 있는 BamHI과 3' 말단에 β와 연결될 수 있는 EcoRI을 제한효소 자리로 가지며, β 서브유닛의 유전자는 5' 말단에 γ와 연결될 수 있는 EcoRI과 3' 말단에 pPAL7과 연결될 수 있는 NotI을 제한효소 자리로 가지도록 하였다. 이때, 각 서브유닛의 유전자는 합성 후 pUC57 벡터에 삽입하여 준비해 두었다.

각 서브유닛에 해당하는 유전자는 하나씩 pPAL7 벡터에 다음과 같은 방법으로 α 서브유닛 - γ 서브유닛 - β 서브유닛(α-γ-β) 순으로 삽입하였다. 먼저 α 서브유닛_pUC57과 pPAL7 벡터를 SpeI과 BamHI으로 절단한 후 1% 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 절단된 유전자만을 gel-purification kit로 추출했다. 그리고 추출된 두 가지의 유전자를 T4 리가아제로 연결하여 α 서브유닛_pPAL7 플라스미드를 제조하였다. 다음으로 γ 서브유닛 유전자를 삽입하기 위하여 α 서브유닛_pPAL7 플라스미드와 γ 서브유닛_pUC57 플라스미드를 BamH I과 EcoR I 제한효소로 절단하고 gel-purification kit를 이용하여 절단된 유전자만을 추출했다. 추출된 두 가지 유전자를 T4 리가아제로 연결하여 α-γ 콤플렉스_pPAL7 플라스미드를 제조하였다. 마지막으로 β 서브유닛 유전자를 삽입하기 위하여 α-γ 콤플렉스_pPAL7 플라스미드와 β 서브유닛_pUC57 플라스미드를 EcoR I과 Not I 제한효소로 절단하고 gel purification 키트를 이용하여 절단된 유전자만을 추출했다. 추출된 두 가지 유전자를 T4 리가아제로 연결하여 mTF1-ATPase_pPAL7 플라스미드를 제조하였다.(도 6 및 도 7 참조)

상기와 같이 제조된 mTF1-ATPase_pPAL7 플라스미드를 25g/L LB broth 액체 배지 상에서 42℃로 1분 동안 열 충격법(heat shock)을 주어 대장균 Top10 균주에 도입시켰다. 이에 의해 형질 전환된 대장균을 암피실린(ampicillin) 100μg/ml (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)이 첨가된 LB agarose 플레이트에서 16시간동안 배양하였다. 이후, 콜로니를 선택하여 암피실린 100μg/ml을 첨가한 LB 액체 배지에 16시간 배양한 후 mini-prep으로 플라스미드 상에 각 서브유닛이 모두 존재함을 확인하였다(도 8 참조). 또한, Bioneer Corporation(Daejeon, Korea)의 시퀀싱 서비스를 이용하여 정확한 염기서열을 확인하였다.

mTF1 - ATPase 단백질 생산 및 정제

다음과 같은 방법으로 mTF1-ATPase 단백질을 발현시켜 정제하였다.

<2-1> 단백질 발현 유도 및 정제

상기 실시예 <1-2>에서 대장균 시스템에서 mTF1-ATPase를 발현시키기 위하여 플라스미드 복제용 대장균 균주인 Top10에 형질 전환시킨 mTF1-ATPase_pPAL7 플라스미드를, mini-prep으로 추출하여 42℃에서 1분 동안 열 충격을 가함으로써 단백질 발현용 대장균 균주인 BL21 세포 내로 도입시켰다. 이후 mTF1-ATPase_pPAL7 플라스미드를 포함하고 있는 BL21 세포를 20℃에서 OD₆₀₀이 0.3~0.4 사이의 값을 가질 때까지 암피실린 100μg/ml을 함유하고 있는 LB broth 액체 배지에서 배양시킨 후 최종 농도 0.1mM의 IPTG(isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. IPTG 처리 후 20℃에서 16시간동안 더 배양한 다음 원심분리기를 이용하여 10000rpm으로 30분간 박테리아 세포들을 침전시켰다. 그리고 상층액을 제거한 뒤 100mM 인산나트륨(pH 7.2)과 2% 트윈-20을 포함한 세포 용해 완충액을 배양액 대비 1/10 부피비로 이용하여 세포를 재현탁하고, 세포를 고주파 분해로 용해시켰으며, 이물질을 제거하기 위해 추가로 원심 분리를 하였다.

다음으로, 세포 파쇄물을 정제하기 위하여 500μl의 tag affinity beads slurry(Profinity eXact Purification Resin, Bio-RAD, Hercules, CA, USA)를 5ml의 Piers Centrifuge Column(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)에 넣어, 칼럼을 4ml의 세척 버퍼(100mM 인산 나트륨, pH 7.2)로 두 번 세척했다. 그리고 총 5ml의 세포 파쇄물을 칼럼에 추가하여 4℃에서 40분 동안 회전 운동을 하면서 표적 단백질이 비드(bead)에 붙을 수 있도록 반응시켰다. 반응 후, 칼럼에 있는 용액을 원심분리기를 이용하여 제거한 다음 세척 버퍼로 세 번 세척하였다. 그 다음 칼럼에 1.5ml의 용출 버퍼(100mM 인산 나트륨, pH 7.2, 100mM 플루오르화 나트륨)을 추가하여 25℃에서 1시간 동안 표적 단백질이 비드에서 떨어져 나올 수 있도록 반응시켰으며, 용출된 용액을 100k Amiconㄾ Ultra Centrifugal Filter(Millipore, Eschborn, Germany)을 이용하여 50μl 부피로 정제하였다.

<2-2> 표적 단백질의 정제 여부 확인

정제된 단백질 및 정제 과정을 확인하기 위하여 10% 아크릴 아마이드 겔을 이용하여 SDS-PAGE를 실시하였다. 그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 정제된 mTF1-ATPase는 세 개의 밴드가 나타났으며, 이 밴드의 크기는 각각 α(54.6kDa), β(51.9kDa), γ(32.2kDa) 서브유닛의 크기와 일치하였다. 또한, 밴드의 진하기는 3(α):3(β):1(γ)의 비율로 나타났으며, 이는 mTF1-ATPase를 이루는 각 서브유닛의 존재 비율과 일치하였다.

본 발명에 따른 mTF1-ATPase의 α 서브유닛 아미노산 말단에는 pPAL7 발현벡터에 의한 8kDa의 칼럼 친화 펩타이드 도메인을 가지고 있으며, 이 도메인에 의해 α 서브유닛 뿐만 아니라 α 서브유닛을 구성체로 사용하는 mTF1-ATPase가 선택적으로 포획된다. 단백질 정제 과정 중 최종 용출 단계에서는 용출 버퍼에 의해 8kDa의 상기 칼럼 친화 펩타이드 도메인이 α 서브유닛에서 분리되기 때문에, 용해액에서의 α 서브유닛보다 8kDa 낮은 54.6kDa의 크기가 나타났다.

<2-3> mTF1 - ATPase 단백질 발현 수율 측정

상기 실시예 <2-2>로부터 얻은 정제된 단백질 및 정제 과정에 얻은 용액은, 표준물질로 우혈청알부민(Bovine Serum Albumin, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)을 사용하여 브래드포드 분석법으로 단백질의 농도를 측정하였다. mTF1-ATPase를 발현시킬 수 있는 대장균을 50ml 액체 배지 (Luria Bertani 배지)에 0.1mM IPTG를 처리하여 24시간 키웠을 때 대장균의 무게는 423.5mg 이었으며, 여기서 나온 단백질 중에서 물에 녹은 총 단백질 양은 723.6mg이었고, 정제 과정을 거친 후에 나온 mTF1-ATPase 양은 총 0.34mg 이었다.

mTF1 - ATPase 의 활성 측정

mTF1-ATPase는 온전한 F-ATPase가 아니더라도 ATP를 소모하며 회전 운동을 할 수 있다. ADP-GloTM Max Assay kit (Promega, Madison, WI, USA)을 사용하여 mTF1-ATPase의 시간별 ATP 소모량을 측정하였다.

<3-1> mTF1 - ATPase 의 시간별 ATP 소모량 측정

mTF1-ATPase의 반응을 위해 10mM 인산 나트륨 버퍼(pH 7.4), 50mM 염화 칼륨, 10mM 염화 마그네슘, 1mg/ml 소 혈청 알부민 단백질(BSA)와 1mM ATP 성분의 반응 버퍼를 만들고, 상기 반응 버퍼 25μl에 10μg의 mTF1-ATPase를 추가하여 10, 20, 30, 40, 50, 60, 120, 180, 240분 단위로 반응을 시켰다. 효소 반응을 종료하기 위해서 25μl의 ADP-Glo™ Reagent를 첨가하고 남아있는 ATP를 제거하기 위하여 40분간 반응을 시켰다. 이후 50μl의 ADP-GloTM Max Detection Reagent를 첨가하여 용액 내에 효소 반응으로 생성된 ADP를 ATP로 다시 전환을 하기 위해 1시간의 반응 시간을 가졌다. 이 반응 시간동안 ADP-GloTM Max Detection Reagent에 있던 루시퍼라제가 전환된 ATP와 루시페린을 이용하여 발광을 하게 되며, 발광은 용액 내에 남아있던 ADP, 즉, 전환된 ATP 양에 따라 빛의 세기가 결정되는데 이를 광도계로 측정을 하였다. 그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, mTF1-ATPase는 150분 동안 1mM (25nmol)의 ATP 중에서 90%를 소모할 수 있으며, 효소 활성도는 0.13 unit/mg이었다. 이때, unit은 1분 동안 25℃에서 1μmol의 ATP를 소모하는데 필요한 mTF1-ATPase 양을 의미하는 것으로, 150분 이후에는 mTF1-ATPase의 활성은 거의 나타나지 않고 더 이상의 ATP 소모는 보이지 않았다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration <120> PREPARATION METHOD OF TF1-ATPASE RECOMBINANT PROTEIN AND USE THEREOF <130> PB14-11937 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 506 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha subunit of mTF1-ATPase - a.a. seq. <400> 1 Thr Ser Lys Gly Met Ser Ile Arg Ala Glu Glu Ile Ser Ala Leu Ile 1 5 10 15 Lys Gln Gln Ile Glu Asn Tyr Glu Ser Gln Ile Gln Val Ser Asp Val 20 25 30 Gly Thr Val Ile Gln Val Gly Asp Gly Ile Ala Arg Ala His Gly Leu 35 40 45 Asp Asn Val Met Ser Gly Glu Ala Val Glu Phe Ala Asn Ala Val Met 50 55 60 Gly Met Ala Leu Asn Leu Glu Glu Asn Asn Val Gly Ile Val Ile Leu 65 70 75 80 Gly Pro Tyr Thr Gly Ile Lys Glu Gly Asp Glu Val Arg Arg Thr Gly 85 90 95 Arg Ile Met Glu Val Pro Val Gly Glu Thr Leu Ile Gly Arg Val Val 100 105 110 Asn Pro Leu Gly Gln Pro Val Asp Gly Leu Gly Pro Val Glu Thr Thr 115 120 125 Glu Thr Arg Pro Ile Glu Ser Arg Ala Pro Gly Val Met Asp Arg Arg 130 135 140 Ser Val His Glu Pro Leu Gln Thr Gly Ile Lys Ala Ile Asp Ala Leu 145 150 155 160 Val Pro Ile Gly Arg Gly Gln Arg Glu Leu Ile Ile Gly Asp Arg Gln 165 170 175 Thr Gly Lys Thr Ser Val Ala Ile Asp Thr Ile Ile Asn Gln Lys Asp 180 185 190 Gln Asn Met Ile Ser Ile Tyr Val Ala Ile Gly Gln Lys Glu Ser Thr 195 200 205 Val Ala Thr Val Val Glu Thr Leu Ala Lys His Gly Ala Pro Asp Tyr 210 215 220 Thr Ile Val Val Thr Ala Ser Ala Ser Gln Pro Ala Pro Leu Leu Phe 225 230 235 240 Leu Ala Pro Tyr Ala Gly Val Ala Met Gly Glu Tyr Phe Met Ile Met 245 250 255 Gly Lys His Val Leu Val Val Ile Asp Asp Leu Ser Lys Gln Ala Ala 260 265 270 Ala Tyr Arg Gln Leu Ser Leu Leu Leu Arg Arg Pro Pro Gly Arg Glu 275 280 285 Ala Tyr Pro Gly Asp Ile Phe Tyr Leu His Ser Arg Leu Leu Glu Arg 290 295 300 Ala Ala Lys Leu Ser Asp Ala Lys Gly Gly Gly Ser Leu Thr Ala Leu 305 310 315 320 Pro Phe Val Glu Thr Gln Ala Gly Asp Ile Ser Ala Tyr Ile Pro Thr 325 330 335 Asn Val Ile Ser Ile Thr Asp Gly Gln Ile Phe Leu Gln Ser Asp Leu 340 345 350 Phe Phe Ser Gly Val Arg Pro Ala Ile Asn Ala Gly Leu Ser Val Ser 355 360 365 Arg Val Gly Gly Ala Ala Gln Ile Lys Ala Met Lys Lys Val Ala Gly 370 375 380 Thr Leu Arg Leu Asp Leu Ala Ala Tyr Arg Glu Leu Glu Ala Phe Ala 385 390 395 400 Gln Phe Gly Ser Asp Leu Asp Lys Ala Thr Gln Ala Asn Val Ala Arg 405 410 415 Gly Ala Arg Thr Val Glu Val Leu Lys Gln Asp Leu His Gln Pro Ile 420 425 430 Pro Val Glu Lys Gln Val Leu Ile Ile Tyr Ala Leu Thr Arg Gly Phe 435 440 445 Leu Asp Asp Ile Pro Val Glu Asp Val Arg Arg Phe Glu Lys Glu Phe 450 455 460 Tyr Leu Trp Leu Asp Gln Asn Gly Gln His Leu Leu Glu His Ile Arg 465 470 475 480 Thr Thr Lys Asp Leu Pro Asn Glu Asp Asp Leu Asn Gln Ala Ile Glu 485 490 495 Ala Phe Lys Lys Thr Phe Val Val Ser Gln 500 505 <210> 2 <211> 286 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gamma subunit of mTF1-ATPase - a.a. seq. <400> 2 Met Lys Pro Leu Ala Ser Leu Arg Asp Ile Lys Thr Arg Ile Asn Ala 1 5 10 15 Thr Lys Lys Thr Ser Gln Ile Thr Lys Ala Met Glu Met Val Leu Thr 20 25 30 Ser Lys Leu Asn Arg Ala Glu Lys Arg Glu Ile Val Arg Pro Tyr Met 35 40 45 Glu Lys Ile Gln Glu Val Val Ala Asn Val Ala Leu Ala Ala Arg Ala 50 55 60 Ser His Pro Met Leu Val Ser Arg Pro Val Lys Lys Thr Gly Tyr Leu 65 70 75 80 Val Ile Thr Ser Asp Arg Gly Leu Ala Gly Ala Tyr Asn Ser Asn Val 85 90 95 Leu Arg Leu Val Tyr Gln Thr Ile Gln Lys Arg His Ala Cys Pro Asp 100 105 110 Glu Tyr Ala Ile Ile Val Ile Gly Arg Val Gly Leu Ser Phe Phe Arg 115 120 125 Lys Arg Asn Met Pro Val Ile Leu Asp Ile Thr Arg Leu Pro Asp Gln 130 135 140 Pro Ser Phe Ala Asp Ile Lys Glu Ile Ala Arg Lys Thr Val Gly Leu 145 150 155 160 Phe Ala Asp Gly Thr Phe Asp Glu Leu Tyr Met Tyr Tyr Asn His Tyr 165 170 175 Val Ser Ala Ile Gln Gln Glu Val Thr Glu Arg Lys Leu Leu Pro Leu 180 185 190 Thr Asp Leu Ala Glu Asn Lys Gln Arg Thr Val Tyr Glu Phe Glu Pro 195 200 205 Ser Gln Glu Glu Ile Leu Asp Val Leu Leu Pro Gln Tyr Ala Glu Ser 210 215 220 Leu Ile Tyr Gly Ala Leu Leu Asp Ala Lys Ala Ser Glu His Ala Ala 225 230 235 240 Arg Met Thr Ala Met Lys Asn Ala Thr Asp Asn Ala Asn Glu Leu Ile 245 250 255 Arg Thr Leu Thr Leu Ser Tyr Asn Arg Ala Arg Gln Ala Ala Ile Thr 260 265 270 Gln Glu Ile Thr Glu Ile Val Ala Gly Ala Asn Ala Leu Gln 275 280 285 <210> 3 <211> 483 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> beta subunit of mTF1-ATPase - a.a. seq. <400> 3 Met His His His His His His His His His His Thr Arg Gly Arg Val 1 5 10 15 Ile Gln Val Met Gly Pro Val Val Asp Val Lys Phe Glu Asn Gly His 20 25 30 Leu Pro Ala Ile Tyr Asn Ala Leu Lys Ile Gln His Lys Ala Arg Asn 35 40 45 Glu Asn Glu Val Asp Ile Asp Leu Thr Leu Glu Val Ala Leu His Leu 50 55 60 Gly Asp Asp Thr Val Arg Thr Ile Ala Met Ala Ser Thr Asp Gly Leu 65 70 75 80 Ile Arg Gly Met Glu Val Ile Asp Thr Gly Ala Pro Ile Ser Val Pro 85 90 95 Val Gly Gln Val Thr Leu Gly Arg Val Phe Asn Val Leu Gly Glu Pro 100 105 110 Ile Asp Leu Glu Gly Asp Ile Pro Ala Asp Ala Arg Arg Asp Pro Ile 115 120 125 His Arg Pro Ala Pro Lys Phe Glu Glu Leu Ala Thr Glu Val Glu Ile 130 135 140 Leu Glu Thr Gly Ile Lys Val Val Asp Leu Leu Ala Pro Tyr Ile Lys 145 150 155 160 Gly Gly Lys Ile Gly Leu Phe Gly Gly Ala Gly Val Gly Lys Thr Val 165 170 175 Leu Ile Gln Glu Leu Ile His Asn Ile Ala Gln Glu His Gly Gly Ile 180 185 190 Ser Val Phe Ala Gly Val Gly Glu Arg Thr Arg Glu Gly Asn Asp Leu 195 200 205 Tyr His Glu Met Lys Asp Ser Gly Val Ile Ser Lys Thr Ala Met Val 210 215 220 Phe Gly Gln Met Asn Glu Pro Pro Gly Ala Arg Met Arg Val Ala Leu 225 230 235 240 Thr Gly Leu Thr Met Ala Glu Tyr Phe Arg Asp Glu Gln Gly Gln Asp 245 250 255 Gly Leu Leu Phe Ile Asp Asn Ile Phe Arg Phe Thr Gln Ala Gly Ser 260 265 270 Glu Val Ser Ala Leu Leu Gly Arg Met Pro Ser Ala Ile Gly Tyr Gln 275 280 285 Pro Thr Leu Ala Thr Glu Met Gly Gln Leu Gln Glu Arg Ile Thr Ser 290 295 300 Thr Ala Lys Gly Ser Ile Thr Ser Ile Gln Ala Ile Tyr Val Pro Ala 305 310 315 320 Asp Asp Tyr Thr Asp Pro Ala Pro Ala Thr Thr Phe Ser His Leu Asp 325 330 335 Ala Thr Thr Asn Leu Glu Arg Lys Leu Ala Glu Met Gly Ile Tyr Pro 340 345 350 Ala Val Asp Pro Leu Val Ser Thr Ser Arg Ala Leu Ala Pro Glu Ile 355 360 365 Val Gly Glu Glu His Tyr Gln Val Ala Arg Lys Val Gln Gln Thr Leu 370 375 380 Glu Arg Tyr Lys Glu Leu Gln Asp Ile Ile Ala Ile Leu Gly Met Asp 385 390 395 400 Glu Leu Ser Asp Glu Asp Lys Leu Val Val His Arg Ala Arg Arg Ile 405 410 415 Gln Phe Phe Leu Ser Gln Asn Phe His Val Ala Glu Gln Phe Thr Gly 420 425 430 Gln Pro Gly Ser Tyr Val Pro Val Lys Glu Thr Val Arg Gly Phe Lys 435 440 445 Glu Ile Leu Glu Gly Lys Tyr Asp His Leu Pro Glu Asp Arg Phe Arg 450 455 460 Leu Val Gly Arg Ile Glu Glu Val Val Glu Lys Ala Lys Ala Met Gly 465 470 475 480 Val Glu Val <210> 4 <211> 1521 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha subunit of mTF1-ATPase - base seq. <400> 4 actagtaaag gcatgtccat ccgtgcagaa gaaatctccg ccctgattaa acagcaaatt 60 gaaaactatg aaagccagat ccaagtgagc gatgtcggca ccgtgattca ggttggtgat 120 ggcatcgccc gtgcacatgg cctggacaac gttatgagcg gtgaagccgt cgaatttgct 180 aacgcggtga tgggcatggc actgaatctg gaagaaaaca atgtcggtat tgtgatcctg 240 ggtccgtata ccggcattaa agaaggtgac gaagtgcgtc gcacgggccg tattatggaa 300 gttccggtcg gcgaaaccct gatcggtcgc gtggttaatc cgctgggtca gccggttgat 360 ggtctgggcc cggtcgaaac cacggaaacg cgtccgatcg aatcacgtgc accgggcgtg 420 atggatcgtc gctcggttca tgaaccgctg cagaccggta ttaaagccat cgacgcactg 480 gtgccgattg gtcgtggcca gcgcgaactg attatcggcg atcgccaaac cggtaaaacg 540 tccgttgcca tcgatacgat catcaaccag aaagaccaaa acatgatcag catctatgtc 600 gcaattggcc agaaagaatc taccgttgcg acggtcgtgg aaaccctggc aaaacacggt 660 gctccggatt acaccatcgt tgtcacggca agcgcatctc aaccggcacc gctgctgttt 720 ctggctccgt atgcgggcgt ggccatgggt gaatacttca tgattatggg caaacatgtt 780 ctggtggtta tcgatgacct gagtaaacag gcggcggcat atcgtcaact gtccctgctg 840 ctgcgtcgcc cgccgggtcg tgaagcctat ccgggtgaca tcttttatct gcatagccgt 900 ctgctggaac gcgctgcgaa actgagcgat gcgaaaggcg gtggctctct gaccgccctg 960 ccgtttgtgg aaacgcaggc gggcgatatt agtgcctaca tcccgaccaa cgttatttcc 1020 atcacggatg gtcagatttt cctgcaatca gacctgtttt tctcgggcgt gcgtccggca 1080 atcaatgctg gtctgagtgt ttcccgcgtc ggtggcgccg cacagattaa agcaatgaaa 1140 aaagtggctg gtaccctgcg tctggatctg gctgcgtatc gcgaactgga agcttttgcg 1200 cagttcggct cagatctgga caaagcgacc caagccaacg tggcacgtgg tgctcgcacg 1260 gtggaagttc tgaaacagga tctgcaccaa ccgatcccgg tcgaaaaaca ggtgctgatt 1320 atctatgcgc tgacccgtgg cttcctggat gacattccgg tggaagatgt tcgtcgcttt 1380 gaaaaagaat tttacctgtg gctggaccag aatggtcaac atctgctgga acacatccgc 1440 accacgaaag atctgccgaa cgaagatgac ctgaatcagg cgattgaagc ctttaagaaa 1500 accttcgtcg tgtcgcaata a 1521 <210> 5 <211> 861 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gamma subunit of mTF1-ATPase - base seq. <400> 5 atgaaaccgc tggcaagcct gcgtgacatc aaaacccgta tcaatgcgac caaaaagacc 60 tcacaaatta ccaaagccat ggaaatggtg ctgacgtcga aactgaaccg tgcagaaaaa 120 cgcgaaattg ttcgtccgta tatggaaaaa atccaggaag tggttgcaaa tgtcgctctg 180 gcagcacgtg caagccatcc gatgctggtc tctcgtccgg tgaagaaaac cggctacctg 240 gttatcacga gtgaccgcgg cctggcaggt gcttataact ccaatgttct gcgcctggtc 300 taccagacca ttcaaaaacg tcacgcttgc ccggatgaat atgcgattat cgtgatcggc 360 cgtgttggtc tgagcttttt ccgtaaacgc aacatgccgg ttattctgga tatcacccgt 420 ctgccggacc agccgtcctt tgcagatatt aaagaaatcg cacgtaaaac cgtgggcctg 480 tttgctgatg gcacgttcga cgaactgtat atgtattaca accattacgt cagcgcgatt 540 cagcaagaag tgaccgaacg caaactgctg ccgctgacgg acctggccga aaataaacag 600 cgtaccgttt atgaatttga accgtctcaa gaagaaattc tggacgtcct gctgccgcag 660 tatgctgaaa gcctgatcta cggtgcgctg ctggatgcga aagcctctga acacgcagct 720 cgcatgaccg cgatgaaaaa cgccacggat aacgcaaatg aactgatccg taccctgacg 780 ctgagctaca atcgtgcccg ccaggcggcc attacccaag aaatcacgga aatcgtcgct 840 ggcgcaaacg ctctgcaatg a 861 <210> 6 <211> 1452 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta subunit of mTF1-ATPase - base seq. <400> 6 atgcatcatc atcatcatca tcatcatcat catacgcgtg gccgtgtcat ccaagtcatg 60 ggtccggtgg tggatgttaa atttgaaaac ggccatctgc cggcaatcta caatgctctg 120 aaaattcagc acaaagcacg taacgaaaat gaagtcgata ttgacctgac cctggaagtg 180 gctctgcatc tgggcgatga caccgtgcgt acgatcgcga tggcctcaac cgatggcctg 240 atccgcggta tggaagttat tgacacgggt gcaccgatct cggtcccggt gggtcaggtc 300 accctgggtc gtgtctttaa cgtgctgggc gaaccgattg atctggaagg tgacatcccg 360 gcagatgctc gtcgcgaccc gattcaccgt ccggcaccga aattcgaaga actggctacc 420 gaagttgaaa tcctggaaac gggcattaaa gtggttgatc tgctggcacc gtatatcaaa 480 ggcggtaaaa ttggtctgtt tggcggtgct ggcgttggta aaaccgtcct gattcaggaa 540 ctgattcata acatcgcgca agaacacggc ggtatcagcg tgttcgccgg cgttggtgaa 600 cgtacgcgcg aaggcaatga tctgtatcat gaaatgaaag acagcggtgt gatttctaaa 660 accgcgatgg tttttggcca gatgaacgaa ccgccgggtg cacgtatgcg tgtggcactg 720 accggtctga cgatggccga atactttcgt gatgaacagg gccaagacgg tctgctgttc 780 attgataata tctttcgttt cacccaggcg ggtagtgaag tttccgcact gctgggtcgt 840 atgccgagcg caattggtta tcagccgacc ctggctacgg aaatgggcca gctgcaagaa 900 cgcatcacct ctacggcgaa aggttcaatt acgtcgatcc aggcaattta tgtgccggct 960 gatgactaca ccgatccggc accggcaacc acgttctcac atctggatgc caccacgaac 1020 ctggaacgta aactggcgga aatgggcatt tatccggccg tcgatccgct ggtgtctacc 1080 tctcgcgcac tggctccgga aatcgttggt gaagaacact atcaggttgc acgtaaagtc 1140 cagcaaaccc tggaacgcta caaagaactg caagatatta tcgccattct gggcatggac 1200 gaactgtccg atgaagacaa actggtcgtg catcgcgcgc gtcgcatcca gtttttcctg 1260 agtcaaaatt ttcacgtggc cgaacagttc acgggccaac cgggttccta tgttccggtc 1320 aaagaaaccg ttcgtggctt taaagaaatc ctggagggta aatacgatca cctgccggaa 1380 gaccgtttcc gcctggtggg tcgcattgaa gaagttgtcg aaaaagcgaa agccatgggc 1440 gtggaagttt aa 1452

Claims

하기 단계를 포함하는 TF1-ATPase 재조합 단백질(mTF1-ATPase)의 제조방법:
a) 야생형 TF1-ATPase 단백질 α 서브유닛의 193번째 아미노산을 시스테인에서 세린으로 치환하는 단계;
b) 야생형 TF1-ATPase 단백질 γ 서브유닛의 107번째 아미노산을 세린에서 시스테인으로 치환하는 단계;
c) 야생형 TF1-ATPase 단백질 β 서브유닛의 N 말단에 6 내지 10개의 히스티딘 잔기로 구성되는 히스티딘 태그를 추가하는 단계;
d) 상기 서브유닛이 α-γ-β 순으로 연결된 발현벡터를 제조하는 단계;
e) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및
f) 상기 형질전환체를 배양하여 mTF1-ATPase의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계.
제1항에 있어서,
상기 mTF1-ATPase는 α, γ, β 서브유닛의 α₃β₃γ 복합체인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 α 서브유닛은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되고, 상기 β 서브유닛은 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되며, 상기 γ 서브유닛은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 발현벡터는 pT7, pET/Rb, pGEX, pET28a(+), pET-22b(+), pGEX 및 pPAL7로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 숙주세포는 대장균(E.coli)인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 α, γ, β 서브유닛의 각 양 말단은 제한효소 인식부위를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
TF1-ATPase 재조합 단백질(mTF1-ATPase)을 포함하는 약물 전달체.
제7항에 있어서,
상기 mTF1-ATPase는 α, γ, β 서브유닛의 α₃β₃γ 복합체인 것을 특징으로 하는, 약물 전달체.
제8항에 있어서,
상기 α 서브유닛은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되고, 상기 β 서브유닛은 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되며, 상기 γ 서브유닛은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는, 약물 전달체.
제7항에 있어서,
상기 약물 전달체는 mTF1-ATPase의 시스테인과 직접 또는 링커를 통해 약물이 결합하는 것을 특징으로 하는, 약물 전달체.