KR101485495B1 - 베타-마이오신 중사슬의 발현을 활성화하는 마이크로-ｒｎａ의 동정 - Google Patents

베타-마이오신 중사슬의 발현을 활성화하는 마이크로-ｒｎａ의 동정 Download PDF

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Abstract

본 발명은 β-마이오신 중사슬(β-MHC)의 발현을 유도하고 빠른 골격근 수축 단백질 유전자를 억제하는 마이크로RNA, miR-208의 동정에 관한 것이다. 이런 기능의 억제는 심장 섬유증, 심장 비대 및/또는 심부전에 대한 치료로 제안되며, 이런 기능의 증가는 근골격계 질환의 치료에서 느린 섬유 유전자들을 억제하고 빠른 섬유 유전자들을 활성화하는데 사용될 수 있다.
마이크로RNA, β-마이오신 중사슬, 심장 비대, 심부전

Description

베타-마이오신 중사슬의 발현을 활성화하는 마이크로-ＲＮＡ의 동정{Identification of a micro-RNA that activates expression of beta-myosin heavy chain}
본 발명은 일반적으로 발달생물학 및 분자생물학의 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 심장근육세포 및 골격근육세포에서 유전자 제어와 세포 생리학에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 β-마이오신 중사슬(β-MHC)의 발현의 감소를 일으키는 miRNA의 억제에 관한 것으로, 이를 통해 심장 비대와 심부전을 치료한다. 또한 근골격계 질환을 처리하기 위해 miRNA의 상승 조절(up-regulation)도 고려한다.
심장에 가해진 일의 양이 증가함에 따른 심장 비대는 기본적인 적응기전이다. 이것은 자연 자극, 내분비 자극 또는 기계적 자극 중 임의의 것 또는 이의 조합에 의한 세로 크기 및 질량(세포수 이외)의 정량적 증가를 나타내는 특별한 반응이다. 심장 비대에 관여하는 다른 인자인 고혈압은 울혈성 심부전의 상습적인 전조이다. 심부전이 발생하면, 주로 좌심실이 비대해지고 팽창되고, 방출 분획(ejection fraction)과 같은 수축 기능의 지수가 감소한다. 분명한 것은, 심장 비대 반응은 복잡한 증상이고 심장 비대에 이르는 경로의 해명은 다양한 자극에 의 한 심장 질환의 치료에 유익할 것이다.
병리학적 심근 비대는 심근세포 단백질의 증가와 초기 배아 발달을 연상시키는 유전자 프로파일의 발현을 특징으로 한다. 구체적으로, β-마이오신 중사슬(β-MHC), 골격 α-액틴(sACT) 및 심방 및 뇌 나트륨배설촉진 펩티드(각각 ANP 및 BNP)의 발현이 증가하는 반면, 성인 심장 근육-특이적 유전자, α-마이오신 중사슬(α-MHC) 및 근소포체 Ca2+ - ATPase(SERCA)의 발현은 감소한다. 특히, 인간의 심부전의 발병에서 MHC 아이소형 발현의 변화들에 대한 역할을 나타내는 주목하지 않을 수 없는 증거가 있다. 실제로, α-MHC mRNA와 단백질 양은 심부전 환자에서 현저하게 감소하고 베타-차단제 치료를 통한 좌심실 방출 분획의 개선은 α-MHC 발현의 정상화와 관련이 있다. 또한, 인간 α-MHC 유전자의 돌연변이는 확장성 심근병증과 관련이 있는 것으로 확인되었고, 비록 양이 적더라도, α-MHC 발현의 양은 정상적인 심장 기능에 중요하다는 것을 나타낸다. 따라서, α- 및 β-MHC는 심장 비대의 발달에 역할을 한다는 것은 분명하나, 이런 생성물들이 병적 상태를 유발 및/또는 유지하는데 작용하는 정확한 특징은 알려지지 않고 있다.
따라서, 본 발명에 따라, miR-208 발현 또는 활성의 조절제를 심장 세포들에 투여하는 것을 포함하여 심장 수축과 재형성을 제어하는 방법의 한 실시예가 제공된다. 한 실시예에서, miR-208 발현 또는 활성의 조절제를 심장 세포들에 투여하는 것을 포함하여 심장 수축 단백질 유전자 발현을 제어하는 방법이 제공된다. 상기 조절제는 miR-208 발현 또는 활성의 효현제 또는 길항제일 수 있다. 본 발명의 특정 태양들에서, miR-208 발현 또는 활성의 조절제를 심장 세포들에 투여하는 것을 포함하여 심장 세포들에서 β-MHC 발현을 감소시키는 방법이 제공된다. 본 발명의 다른 태양들에서, 내인성 miR-208 발현 또는 활성을 증가시키는 것 또는 외인성 miR-208을 심장 세포들에 투여하는 것을 포함하여 심장 세포들에서 β-MHC 발현을 증가시키는 방법이 제공된다. 본 발명의 한 태양에서, 심장 세포들에서 miR-208 발현 또는 활성의 억제제를 투여하는 것을 포함하여 심장 세포들에서 빠른 골격근 수축 단백질 유전자의 발현을 증가시키는 방법이 제공된다. 본 발명의 다른 태양에서, 내인성 miR-208 발현 또는 활성을 증가시키는 것 또는 외인성 miR-208을 심장 세포들에 투여하는 것을 포함하여 심장 세포들에서 빠른 골격근 수축 단백질 유전자의 발현을 감소시키는 방법이 제공된다. 본 발명의 방법들에 따라 증가하거나 감소할 수 있는 빠른 골격근 수축 단백질 유전자들의 예들은 골격 트로포닌 I; 트로포닌 T3, 마이오신 경사슬 또는 α-골격 액틴이다.
한 실시예에서, 본 발명은 심장 비대, 심부전 또는 심근경색 후 재형성이 있는 환자를 확인하는 단계; 및 환자의 심장 세포들에서 miR-208의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는 병적 심장 비대 또는 심부전을 치료하는 방법을 제공한다. 다른 실시예에서, 병적 심장 비대 또는 심부전이 나타날 위험이 있는 환자를 확인하는 단계; 및 환자의 심장 세포에서 miR-208의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는 병적 심장 비대 또는 심부전을 예방하는 방법을 제공한다.
한 실시예에서, 본 발명은 상기 환자의 심장 세포들에서 miR-208의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는 심근 경색의 치료 방법을 제공한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 환자의 심장 세포들에서 miR-208의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는 심장 비대 및 확장성 심근병증을 예방하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 환자의 심장 세포들에서 miR-208의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는 심장 비대의 진행을 억제하는 방법을 제공한다. 특정 실시예들에서, 본 발명은 환자의 심장 세포들에서 miR-208의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는 심부전 또는 심장 비대가 있는 환자의 운동 지구력을 증가시키고, 입원 기간을 감소시키고, 삶의 질을 향상시키고, 질병률 및 사망률을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 태양들에서, 병적 상태하에서 miR-208의 억제제를 투여함으로써 심장 세포들에서 α-MHC 발현을 증가시키는 방법이 제공된다.
본 발명의 특정 태양들에서, miR-208의 발현 또는 활성을 억제하는 것은 miR-208의 안타고미르를 투여하는 것을 포함한다. 한 실시예에서, 본 발명은 miR-2008 안타고미르를 제공한다. miR-208 발현 또는 활성의 안타고미르 또는 다른 조절제의 투여는 표적 장기, 조직 또는 세포 타입에 전달하는데 적합한 당업계에 공지된 임의의 방법에 의할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 특정 태양들에서, miR-208의 조절제는 정맥 주사, 관절내 주사, 경피 주사, 심장막속 주사 또는 조직(예를 들어, 심장 조직, 골격근 조직) 속으로의 직접 주사에 의해 투여될 수 있다. 일부 태양들에서, 투여는 miR-208의 경구, 경피, 복강, 피하, 서방형 방출, 제어형 방출, 지연형 방출, 좌약 또는 설하 투여를 포함한다.
본 발명의 특정 태양들에서, 환자의 병적 심장 비대 또는 심부전을 치료 또는 예방하는 방법은 환자에게 보조 심장 비대 치료제를 투여하는 단계를 더 포함한다. 보조 치료제는, 예를 들어, 베타차단제, 아이오노트로페, 이뇨제, ACE-I, AII 길항제, BNP, Ca++- 차단제 및 ERA 또는 HDAC 억제제일 수 있다. 상기 보조 치료제는 miR-208의 억제 이전, 동시 또는 이후에 투여될 수 있다.
병적 심장 비대 또는 심부전의 치료는 병적 심장 비대 또는 심부전의 하나 이상의 증상을 증가시키는 것으로 정의될 수 있다. 개선된 증상들은, 예를 들어. 증가된 운동 능력, 증가된 심장 분출 부피, 감소된 좌심실이완말기압, 감소된 폐모세혈관쐐기압, 증가된 심박출량 또는 심박출계수, 낮은 폐동맥압, 감소된 좌심실수축 및 이완말 크기, 감소된 좌심실 및 우심실 벽 긴장, 감소된 벽 장력, 증가된 삶의 질 및 감소된 질환 관련 질병률 또는 사망률일 수 있다. 병적 심장 비대의 치료는 심장 비대로부터 심부전으로의 전이를 지연하는 것으로 정의될 수 있다.
본 발명의 특정 실시예들에서, 병적 심장 비대 또는 심부전이 나타날 위험이 있는 환자의 병적 비대 또는 심부전을 예방하는 방법들이 제공된다. 병적 심장 비대 또는 심부전이 나타날 위험이 있는 환자는 장기간 조절되지 않는 고혈압, 불치성 판막 질환, 만성 협심증, 최근 심근경색, 심장 질환 또는 병적 비대에 대한 울혈성 소인을 포함하는 하나 이상의 위험 인자들을 나타낼 수 있다. 특정 태양에서, 위험한 환자는 심장 비대에 대한 유전 소인을 가진 것으로 진단될 수 있다. 본 발명의 일부 태양들에서, 위험한 환자는 심장 비대의 가족력을 가질 수 있다.
한 실시예에서, 본 발명은 miR-208을 골격근 세포들에 투여하는 것을 포함하여 골격근 세포들에서 빠른 골격근 수축 단백질 유전자의 발현 또는 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 한 실시예에서, 본 발명은 근골격계 질환을 갖거나 위험이 있는 환자를 확인하는 단계; 및 상기 환자의 골격근 세포들에서 miR-208의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 단계를 포함하여 환자의 근골격계 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 근골격계 질환은, 예를 들어, 불용성 위축, 무중력 상태에 반응한 근육 쇠약 또는 탈신경일 수 있다. 본 발명의 특정 태양들에서, 근골격근계 질환을 치료 또는 예방하는 방법은 보조 비-miR-208 치료제를 투여하는 단계를 더 포함한다.
miR-208의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 것은 miR-208을 환자에게 투여하는 것 또는 miR-208을 발현하는 발현 벡터를 환자에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 바이러스성 발현 벡터이다. 바이러스성 발현 벡터는, 예를 들어, 아데노바이러스 또는 레트로바이러스 발현 벡터일 수 있다. 특정 태양들에서, 발현 벡터는 비-바이러스성 발현 벡터이다. 본 발명의 특정 태양들에서, miR-208 또는 miR-208을 암호화하는 발현 벡터는 지질 운반체와 관련이 있다. 선택적으로, 간단히 miR-208 자체를 제공할 수 있고, 선택적으로 리포솜 또는 나노입자와 같은 전달 운반체 내에 포함될 수 있다. miR 208이 심장 특이적이라는 사실은 다른 장기들에서의 원치 않는 부작용을 예방할 것이다.
한 실시예에서, 본 발명은 (a) 세포에 후보 화합물을 접촉시키는 단계; (b) miR-208 활성 또는 발현을 측정하는 단계; 및 (c) 단계(b)에서의 활성 또는 발현과 후보 화합물의 부존재하에서의 활성 또는 발현과 비교하는 단계를 포함하여 miR-208의 조절제를 동정하는 방법을 제공하고, 측정된 활성들 또는 발현 사이의 차이가 후보 화합물이 miR-208의 조절제라는 것을 나타낸다. 본 발명의 특정 태양들에서, 세포는 인비트로로 후보 화합물과 접촉된다. 본 발명의 다른 태양들에서, 세포는 인비보로 후보 화합물과 접촉된다. miR-280의 조절제는 miR-208의 효현제 또는 길항제일 수 있다. 본 발명의 방법들에 따라 선별될 수 있는 후보 화합물들의 비제한적인 예들은 펩타이드, 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오티드 또는 소형 분자이다.
miR-208 활성 또는 발현을 측정하는 것은 miR-208의 발현 수준을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 당업자는, 예를 들어, 노던 블로팅 또는 RT-PCR을 포함하는 RNA 발현 수준을 측정하기 위한 여러 방법을 잘 알 것이다. miR-208 활성 또는 발현을 측정하는 것은 miR-208의 활성을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, miR-208의 활성을 측정하는 것은 miR-208에 의해 제어되는 유전자의 발현 또는 활성을 측정하는 것을 포함한다. miR-208에 의해 제어되는 유전자들은, 예를 들어, α 및 β-마이오신 중사슬과 빠른 골격 트로포닌 I, 트로포닌 T3과 같은 빠른 골격근 단백질 유전자, 마이오신 경사슬 및 알파 골격 액틴을 포함한다. 본 발명의 특정 태양들에서, miR-208의 활성을 측정하는 것은 α-마이오신 중사슬 발현 레벨 대 β-마이오신 중사슬 발현 레벨의 비율을 측정하는 것을 포함한다. 당업자는 miR-208에 의해 제어된 유전자들의 발현 또는 활성을 측정하기 위한 여러 방법을 잘 알 것이다. 이런 방법들은, 예를 들어, 노던 블로팅, RT-PCT, ELISA 또는 웨스턴 블로팅을 포함한다.
한 실시예에서, 본 발명은 (a) 세포에 후보 화합물을 접촉시키는 단계; (b) miR-208 활성 또는 발현을 측정하는 단계; 및 (c) 단계(b)에서의 활성 또는 발현과 후보 화합물의 부존재하에서의 활성 또는 발현과 비교하는 단계를 포함하는 방법에 의해 동정된 miR-208의 조절제를 제공하고, 측정된 활성들 또는 발현 사이의 차이는 후보 화합물이 miR-208의 조절제라는 것을 나타낸다. miR-208의 조절제들은 본 발명의 방법들에 따라 심장 질환들 및/또는 근골격계 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물들에 포함될 수 있다.
다른 실시예에서, 본 발명은 (a) 세포에 후보 화합물을 접촉시키는 단계; (b) miR-208 활성 또는 발현을 측정하는 단계; 및 (c) 단계(b)에서의 활성 또는 발현과 후보 화합물의 부존재하에서의 활성 또는 발현과 비교하는 단계를 포함하는 방법에 의해 동정된 miR-208의 억제제를 제공하고, 후보 화합물의 부존재하에서 세포에서의 활성 또는 발현과 비교했을 때 후보 화합물과 접촉된 세포에서의 활성 또는 발현의 감소는 후보 화합물이 miR-208의 억제제라는 것을 나타낸다.
한 실시예에서, 본 발명은 심장 비대 또는 심부전을 가진 환자를 확인하는 단계; 및 miR-208 억제제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하여 병적 심장 비대 또는 심부전을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 특정 태양들에서, miR-208 억제제는 (a) 세포에 후보 화합물을 접촉시키는 단계; (b) miR-208 활성 또는 발현을 측정하는 단계; 및 (c) 단계(b)에서의 활성 또는 발현과 후보 화합물의 부존재하에서의 활성 또는 발현과 비교하는 단계를 포함하는 방법에 의해 동정될 수 있고, 후보 화합물의 부존재하에서 세포에서의 활성 또는 발현과 비교했을 때 후보 화합물과 접촉된 세포에서의 활성 또는 발현의 감소는 후보 화합물이 miR-208의 억제제라는 것을 나타낸다.
다른 실시예에서, 본 발명은 근골격계 질환을 갖거나 근골격계 질환이 나타날 위험이 있는 환자를 확인하는 단계; 및 miR-208 효현제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하여 근골격계 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 특정 태양에서, miR-208 효현제는 (a) 세포에 후보 화합물을 접촉시키는 단계; (b) miR-208 활성 또는 발현을 측정하는 단계; 및 (c) 단계(b)에서의 활성 또는 발현과 후보 화합물의 부존재하에서의 활성 또는 발현과 비교하는 단계를 포함하는 방법에 의해 동정될 수 있고, 후보 화합물의 부존재하에서 세포들에서 활성 또는 발현과 비교된 후보 화합물과 접촉된 세포에서 miR-208의 활성 또는 발현의 증가는 후보 화합물이 miR-208의 효현제라는 것을 나타낸다.
한 실시예에서, 본 발명은 형질전환된 비-인간 포유류를 제공하며, 이의 세포들은 기능성 miR-208을 발현하는데 실패했다. 다른 실시예에서, 본 발명은 형질전환된 비-인간 포유류를 제공하며, 이의 세포들은 상기 비-인간 포유류의 세포들에서 활성인 이종 프로모터의 제어 하에서 miR-208 코딩 영역을 포함한다. 형질전환 포유류는, 예를 들어, 생쥐 또는 쥐일 수 있다. 프로모터는 골격근 특이적 프로모터 또는 심장근 특이적 프로모터와 같은 조직 특이적 프로모터일 수 있다. 특정 실시예들에서, 본 발명은 하나의 또는 둘의 천연 miR-208 대립유전자가 없는 형질전환된 비-인간 포유류 세포를 제공한다.
"한"("a" 또는 "an")이라는 단어는 청구항 및/또는 명세서에서 "포함하는" 이란 용어와 함께 사용될 때 "하나"를 의미할 수 있으나, "하나 또는 그 이상", "적어도 하나" 및 "하나 이상"의 의미와 일치한다.
본 발명에서 논의된 임의의 실시예는 본 발명의 임의의 방법 또는 조성물에 대해 실행될 수 있고 반대 경우도 마찬가지이다. 게다가, 본 발명의 조성물들과 키트들은 본 발명의 방법들을 성취하는데 사용될 수 있다.
명세서 전체에서, "약" 이란 용어는 값을 측정하는데 사용되는 장치 또는 방법에 대한 오차의 표준 편차를 포함하는 값을 나타내는데 사용된다.
"또는" 이란 용어는 단지 대안 또는 대안이 서로 포함된 이라는 것을 명백하게 나타내지 않는 한, "및/또는"을 의미하는데 사용되며, 비록 설명이 단지 대안 및 "및/또는"을 의미하는 정의를 뒷받침하는 경우에도 그렇다.
명세서 및 청구항(들)에서 사용된 대로, "포함하는" 이란 단어는 포괄적이거나 개방형이고 추가의, 언급되지 않은 요소들 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
본 발명의 다른 목적, 형태 및 장점은 다음 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명과 특정 실시예들은, 본 발명의 특정 실시예들을 나타내며, 단지 설명을 위해 제공되기 때문에, 본 발명의 취지 및 범위 내에서 다양한 변화 및 변형이 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다.
다음 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 발명의 특정 태양들을 추가로 설명하기 위해 포함된다. 본 발명은 구체적인 실시예들의 상세한 설명과 함께 하나 이상의 도면들을 참조하여 더욱 잘 이해될 것이다.
도 1 - miR -208은 심장α- MHC 유전자에 포함된다. miR-208은 α MHC 유전자의 인트론 27에 의해 암호화된다. *는 서열 보존을 나타낸다.
도 2 - miR -208은 α- MHC 유전자와 동일한 발현 패턴을 가진다. 어른 쥐 조직들의 노던 분석에 의한 miR-208 전사물의 탐지. U6 mRNA는 부하 대조군으로 작용한다.
도 3a-c - 타이로드 호르몬에 의한 miR -208 발현의 제어. (도 3a) α- 및 βMHC의 PTU/T3 제어에 대한 다이어그램. (도 3b) 쥐를 T3의 존재 및 부존재하에서 한 주 동안 PTU로 치료하였고 αMHC및 β MHC mRNAs를 실시간 PCR로 탐지하였다. (도 3c) 쥐를 한 주 동안 PTU 또는 PTU + T3로 치료하였고, miR-208의 발현을 노던 블럿으로 탐지하였다. 각 조건하에서 네 동물의 심장을 분석하였다.
도 4a-c - α- MHC 발현의 억제가 miR -208의 레벨을 감소시킨다. (도 4a-b) 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18 및 21일에 α- 및 β MHC 전사물의 상대적 발현 레벨. (도 4c) PTU 치료 동안 지정한 시간에서 심장 쥐 조직에서 miR-208의 노던 블럿 분석.
도 5a-b - miR -208 유전자 녹아웃( gene knockout ). (도 5a) 상동 재조합에 의한 miR-208 돌연변이 쥐를 발생시키는 전략. pre-miRNA 서열은 loxP 위치 옆에 있는 네오마이오신 저항 카세트(Neo)로 교체되었다. 네오마이신 카세트는 이형접합성 쥐를 CAG-Cre 형질전환 유전자를 가진 형질전환 쥐에 품종 개량함으로써 쥐 배선에서 제거되었다. DTA, 다이프테리아 톡신 A.(도 5b) 야생형(WT) 및 miR-208 돌연변이(KO) 쥐의 심장들의 노던 분석에 의한 miR-208 전사물들의 탐지.
도 6a-b - miR -208 결실은 α- MHC 발현을 바꾸지 않는다. (도 6a) 지정한 유 전자형들의 쥐들의 심장들의 RNA로부터 RT-PCR에 의한 α MHC 전사물들의 분석. αMHC 엑손들에 대한 프라이머의 위치들이 도시되며 프라이머 쌍들은 샘플들의 각 세트 위이다. (도 6b) 지정한 유전자형들의 신생 생쥐들의 심장들에서 αMHC 및 βMHC 단백질 레벨의 웨스턴 분석. 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로지나제(GAPDH)를 로딩 컨트롤(loading control)로 탐지하였다.
도 7 - miR -208 녹아웃에서 빠른 골격 유전자에서 빠른 골격 유전자들의 상승 조절.
도 8 - miR -208 녹아웃에서 심장 부하 반응 유전자들의 조절 곤란.
도 9 - 심장 유전자 조절에서 miR -208의 역할에 대한 모델. α MHC 유전자는 miR-208을 암호화하고, THRAP1 및 골격근 유전자들(및 대개 추가 표적들)의 발현을 음성적으로 제어한다. α- 및 βMHC 유전자들은 연결되고 miR-208은 부하 신호화 및 PTU에 의한 T3 시그널링에 대한 차단에 반응하여 βMHC의 상승 제어하는데 필요하다. α 및 βMHC는 각각 빠른 및 느린 수축성을 향상시킨다.
도 10 - 인간 심장 샘플들: 심장 부전 아님 vs . 심장 부전.
도 11 - miR -208의 예상 표적으로서 THRAP1. THRAP1의 3'UTR에서 추정 miR-208 결합 위치의 서열 배열은 높은 레벨의 상동성과 서열 보존을 나타낸다.
도 12 - 3' UTR THRAP1 루시페라제 측정.
도 13 - miR -208 돌연변이 생쥐들의 심장들에서 빠른 골격근 유전자들의 상승 조절.
도 14 a-e - TAB 후 야생형 및 miR -208 -/- 동물들의 분석.
(도 14a) α MHC mRNA 발현은 21일 동안 모조 수술(sham operation) 또는 TAB 후 야생형 및 miR-208-/- 쥐에서 실시간 PCR에 의해 탐지하였다. (도 14b). MiR-208을 야생형 및 mir-208-/- 생쥐들의 심장 조직의 노던 블럿으로 탐지하였다. (도 14c) 심초음파 분석은 FS에서 감소를 나타냈는데, 이는 TAB에 반응하여 miR-208-/- 및 야생형 새끼들 모두에서 좌심실 수축기(LVIDs) 확장이 증가하기 때문이다. TAB 후 수축기(a) 또는 이완기(d)에서 전벽 및 후벽(AW 및 PW) 두께는 야생형 동물(그룹당 n = 5-7)과 비교하여 miR-208-/- 동물들에서 둔화된 비대 반응을 나타낸다. * p< 0.05는 상응하는 야생형 그룹과 비교된다. (도 14d) 야생형 및 miR-208 형질전환 생쥐들의 심장들의 노던 분석에 의한 miR-208 전사물들의 탐지. (도 14e) αMHC, βMHC, ANF 및 BNP에 대한 전사물들은 표현된 유전형의 심장들에서 실시간 PCR로 탐지하였다. 값들은 야생형 생쥐들(n = 3)과 비교한 발현(±SEM)에서 배로 증가한 것으로 나타난다.
도 15 a-g - MiR-208 -/- 생쥐들은 압력 과부하에 반응하여 감소된 심장 비대를 나타낸다. (도 15a) 야새형 및 miR-208-/- 생쥐들의 심장들의 조직 조각은 마슨 트라이크롬(Masson trichrome)을 위해 염색하였다. miR-208이 없으면 21일 동안 TAB 받은 야생형 생쥐들에서 보인 심장 비대와 섬유증이 감소한다. 스케일 바는 상 부 패널에서 2mm 및 하부 패널에서 20㎛와 동일하다. (도 15b) βMHC, ANF 및 BNP에 대한 전사물들은 모조 수술 또는 TAB 후 야생형 및 miR-208-/- 생쥐들의 심장들에서 실시간 PCR로 탐지하였다. 값들은 모조 수술된 야생형 생쥐들(n = 3)과 비교한 발현(±SEM)에서 배로 증가한 것으로 나타난다. (도 15c) 모조 수술과 TAB 21일 후 어른 야생형 및 miR-208 돌연변이 생쥐들에서 αMHC 및 βMHC 단백질 레벨의 웨스턴 분석. (도 15d) 칼시네우린 형질전환 유전자(CnA-Tg)를 발현하는 6주 생쥐들의 심장 및 miR-208-/-의 심장의 조직 조각; CnA-Tg는 마슨 트라이크롬을 위해 염색하였다. miR-208이 없으면 CnA-Tag 생쥐들에서 보인 심장 비대와 섬유증이 감소한다. 스케일 바는 상부 패널에서 2mm 및 하부 패널에서 20㎛와 동일하다. (도 15e) βMHC, ANF 및 BNP에 대한 전사물들은 표현된 유전형으로부터 심장들에서 실시간 PCR로 탐지하였다. 값들은 모조 수술된 야생형 생쥐들(n = 3)과 비교한 발현(±SEM)에서 배로 증가한 것으로 나타난다. (도 15f) CnA 형질전환 유전자의 존재 및 부존재하에서 어른 야생형 및 miR-208 돌연변이 생쥐들에서 αMHC 및 βMHC 단백질 레벨의 웨스턴 분석. (도 15g) 어른 야생형 및 miR-208 형질전환 동물에서 αMHC 및 βMHC 단백질 레벨의 웨스턴 분석.
도 16 a-c - PTU 치료 후 야생형 및 miR -208 -/- 동물들의 분석.
(도 16a) MiR-208을 PTU 치료 후 야생형 및 miR-208-/- 생쥐들의 심장 조직의 노던 블럿에 의해 탐지하였다. (도 16b) 심초음파검사는 PTU에 반응하여 야생형 및 miR-208-/- 생쥐들에서 심박동수(HR) 및 분획단축율(FS)의 현저한 감소를 나타냈는데, 이는 이완기(d) 및 수축기(s)에서 LV 확장(LVID)의 증가와 후 및 전 LV 벽(AW, PW)(n=6)의 얇아짐 때문이다. (도 16c) ANF 및 BNP에 대한 전사물들은 PTU 처리 후 야생형 및 miR-208-/- 생쥐들의 심장들에서 실시간 PCR로 탐지하였다. 값들은 규칙적인 먹이를 제공받은 야생형 생쥐들과 비교한 발현(±SEM)에서 배로 증가한 것으로 나타난다.
도 17a-b - miR -208에 의한 β MHC 유전자의 갑상선 호르몬 반응성의 제어. (도 17a) PTU 처리 후 기선 및 2주에서 야생형 및 miR-208 돌연변이 생쥐들에서 αMHC 및 βMHC 발현의 웨스턴 분석. (도 17b) α MHC 및 β MHC에 대한 전사물들을 PTU 처리 후 야생형 및 miR-208-/- 생쥐들의 심장들에서 실시간 PCR로 탐지하였다. 값들은 규칙적인 먹이를 제공받은 야생형 생쥐들(n =3)과 비교하여 발현(±SEM)에서 배로 증가한 것으로 나타난다.
도 18a-d - MiR -208 표적들 THRAP1. (도 18a) THRAP1의 3' UTR에서 추정 miR-208 결합 부위의 서열 배열은 높은 레벨의 상보성과 서열 보존을 나타낸다. (도 18b) COS1 세포들은 miR-126과 miR-208을 위한 발현 플라스미드와 함께, THRAP1의 3' UTR 루시페라제 구조물로 감염시켰다. 값들은 리포터 단독과 비교하여 루시페라제 발현(±SD)에서 배로 증가한 것으로 나타난다. (도 18) COS 1을 HA-MCD-WT UTR 또는 HA-MCD 돌연변이 UTR로 감염시켰고 pCMV-miR-208의 투여량을 0.1-2㎍의 범위로 증가시켰다. HA-레벨들을 면역블럿을 사용하여 탐지하였다. (도 18d) 야생형 또는 miR-208-/- 동물들의 400㎍의 단백질을 사용하는 THRAP1-면역침강된 심장 세포 용해물에 대한 THRAP1 특이적 항체를 사용하는 THRAP1 웨스턴 블럿.
도 19 - THRAP1 전사물들의 RT - PCR 분석. 야생형 또는 miR-208-/- 생쥐들의 심장들의 RNA의 RT-PCR에 의한 THRAP1 전사물들의 분석. mRNA 전사물들에서 프라이머들의 위치가 나타난다.
도 20 - 갑상선 호르몬 수용체 신호화 표적들의 실시간 PCR 분석.
SERCA2a 및 PLB, 및 GLUT4에 대한 전사물들을 야생형 또는 miR-208-/- 생쥐들의 심장들에서 실시간 PCR로 탐지하였다. 값들은 야생형 생쥐들과 비교하여 발현(±SEM)에서 배로 변하는 것으로 나타난다.
도 21 - 야생형, miR -208 -/- 및 miR -208 -/- 생쥐들의 심장들에서 miR -499의 발현을 나타내는 노던 블럿. 야생형 및 돌연변이 생쥐들에서 Myh7b 뿐만 아니라 miR-208 및 miR-499의 발현 사이에 직접적인 상관관계가 있다.
도 22 - Myh7b 좌위 및 그 안의 영역을 암호화하는 miR -499의 위치의 구조.
도 23 - 심장 및 가자미근에서 miR -499의 발현을 나타내는 RNA 블럿. Mir-499는 비복근/족저근(GP), 전경골근(TA) 또는 장족지신전근(EDL)과 같은 빠른 골격근 섬유들에서 발현되지 않는다.
도 24 - 심장 질환을 가진 야생형 생쥐들에서 miR-499의 발현을 나타내는 노던 블럿. MI, 심근경색증, CnA Tg, 칼시네우린 형질전환 생쥐들.
도 25 - 심근육에서 miR -208에 의한 miR -499의 제어의 체계적인 다이어그램.
도 26a-c - 심장 비대 동안 MiRNA 발현. (도 26a) 21일 동안 가짜 및 TAB 및 CnA Tg 생쥐들 이후 견본 심장들의 H&E 염색 부분. 스케일 바는 2mm이다. (도 26b) 심장의 각 형태에서 발현이 변화한 마이크로 RNAs의 수를 나타내는 벤다이어그램이 아래 도시된다. (도 26c) 심장 비대 동안 발현이 변하는 마이크로 RNAs의 노던 블럿. U6 RNA는 로딩 컨트롤로 탐지되었다.
도 27 - MiR -29 발현은 심장 부하에 반응하여 하강 조절된다. 칼시네우린 형질전환(CnA) 또는 TAB에 의해 유도된 야생형 생쥐들(WT) 및 심장 비대와 섬유증을 가진 생쥐들의 심장들은 왼쪽에 도시된다. 심장의 각 형태에서 miR-29의 발현의 상대 레벨은 오른쪽에 도시된다.
도 28 - 야생형과 비교한 miR -208 녹아웃 생쥐들의 심장들의 마이크로어레이 분석. 마이크로어레이 분석을 6주가 된 야생형 및 miR-208 결손 심장(null hearts)들로부터 분리된 mRNA에 수행하였다. miR-208 다음에 가장 하강 조절된 miRNA는 miR-499이다.
도 29 - MiR -29군은 miR -208 널 심장들에서 급격하게 상승 조절된다.
도 30 - miR -29군은 섬유증에 관여하는 콜라겐 및 세포외기질의 다른 성분들을 암호화하는 mRNAs 를 표적화한다.
도 31 - miR -208 및 miR -29군에 의한 심장 섬유증의 대조군에 대한 모델.
정상 심장에서, miR-208은 miR-29의 발현을 억제한다. miR-208이 없으면, miR-29 발현은 상승 조절되어, 부하에 반응하는 세포외기질 및 섬유증의 발현을 예 방한다. miR-208, -499 및 -29의 기능은 연관된다. miR-208의 손실은 miR-499의 발현을 억제하고 miR-29의 발현을 상승 조절함으로써 심장을 보호할 수 있고, 그 결과 섬유증을 막는다.
심부전은 전세계에서 질병과 사망의 주요 원인들 중 하나이다. 미국에서만, 3백만 명이 현재 심근병증을 가지고 살며 다른 4십만 명이 매년 이 병으로 진단되는 것으로 추정된다. "울혈성 심근병증"으로도 불리는 확장성 심근병증(DCM)은 가장 일반적인 형태의 심근병증이고, 100,000명당 거의 40이 가진 것으로 추정된다(Durand et al., 1995). 비록 DCM의 다른 원인들이 있지만, 유사한 확장성 심근병증은 "특발성" DCM의 대략 20%에 해당하는 것으로 확인되었다. DCM 질환의 대략 절반이 특발성이고, 나머지는 공지된 질환 과정과 관련이 있다. 예를 들어, 심각한 심근 손상은 항암치료에 사용된 특정 약물들(예를 들어, 독소루비신 및 다우노리부신)로부터 발생할 수 있다. 또한, 여러 DCM 환자들은 만성 알콜중독이다. 다행히도, 이런 환자들의 경우, 알콜 소비가 질환의 초기에 감소하거나 중단될 경우, 심근 이상의 진행이 멈추거나 역전될 수 있다. 주산기 심근병증은 DCM의 다른 특발성 형태인데, 이는 이 질환은 감염성 후유증과 관련이 있기 때문이다. 간단하게, DCM을 포함하는 심근병증들은 중요한 공중보건 문제이다.
관상동맥질환, 심근경색, 울혈성 심부전 및 심장 비대를 포함하는 심장 질환 및 이의 징후들은 오늘날 미국에서 중요한 건강 위험을 분명하게 나타낸다. 진단, 치료 및 이런 질환들을 앓고 있는 환자들의 지원 비용은 수십억 달러를 넘는다. 심 장 질환의 2개의 특히 심각한 징후는 심근경색과 심장 비대이다. 심근경색의 경우, 아테로마성 동맥 경화증의 결과로 통상적으로 급성 혈전성 관상 폐색이 관상 동맥에서 발생하고 심근 세포 사망을 일으킨다. 심장근육세포들은 최종적으로 분화되고 세포 분할을 할 수 없기 때문에, 세포들이 사망하면 급성 심근경색의 과정 동안 흉터 조직으로 대체된다. 흉터 조직은 수축성이 없고, 심장 기능에 영향을 주지 못하고, 심장 수축시 확장하거나 심실의 크기 및 유효 반경을 증가시켜, 예를 들어, 비대하게 됨으로써 종종 심장 기능에 해로운 역할을 한다. 심장 비대의 경우, 한 이론은 비정상적 발달과 비슷하고 심장에서 발달 신호들이 비대 질환에 영향을 줄 수 있는 지의 문제가 제기되는 질환으로 간주한다. 심장 비대는 고혈압, 기계적 부하, 심근경색, 심장성 부정맥, 내분비선 장애 및 심장 수축성 단백질 유전자들의 유전자 돌연변이를 포함하는 거의 모든 형태의 심장 질환에 대한 심장의 적응반응이다. 비대 반응은 초기에는 심박출량을 증가시키는 보상기전인 반면, 비대가 지속되면 DCN, 심부전 및 돌연사를 일으킬 수 있다. 미국에서, 대략 50만 명이 매년 심부전으로 진단되며, 사망률이 50%에 달하고 있다.
심장 비대의 원인과 효과는 상세하게 입증되었으나, 기본 분자 메커니즘은 설명되지 못하고 있다. 이런 메커니즘을 이해하는 것은 심장 질환의 예방과 치료에서 중요한 문제이고 심장 비대와 심부전을 구체적으로 표적으로 하는 새로운 약물들의 설계에서 치료 방법으로 중요할 것이다. 병적 심장 비대는 통상적으로 심장 손상이 심부전을 일으킬 정도로 심할 때까지 어떤 증상들도 나타내지 않기 때문에, 심근병증의 증상들은 심부전과 관련이 있는 것들이다. 이런 증상들은 숨가쁨, 과로 에 의한 피로, 호흡곤란에 의해 바로 눕지 못함(좌위호흡), 발작성 야간성 호흡곤란, 심장 크기 확대, 및/또는 하지부종을 포함한다. 또한 환자들은 혈압 증가, 기타 심잡음, 심잡음, 폐색전증 및 전신색전증, 가슴통증, 폐울혈 및 심계항진이 나타난다. 또한 DCM은 박출계수(즉, 고유 수축 기능 및 재형성의 치수)를 감소시킨다. 이 질환은 심실 확장과 감소된 심근 수축에 의한 현저하게 손상된 수축 기능을 특징으로 하며, 여러 환자들에게 확장성 심부전을 일으킨다. 또한 손상된 심장들은 근세포/심근 이상의 결과로 세포/실 재형성을 겪어서, "DCM 표현형"에 영향을 준다. DCM을 가진 환자들은 심실빈맥 및 심실세동을 포함하는 생명을 위협하는 부정맥의 발생이 매우 증가한다. 이런 환자들에서, 실신(현기증)의 발생은 돌연사의 전조로 간주된다.
확장성 심근병증의 진단은 확장된 심실, 특히 확장된 실의 증명에 통상적으로 의존한다. 확장은 통상적으로 가슴 X-레이에서 볼 수 있으나, 초음파 심장진단도를 사용하여 더욱 정확하게 판단된다. DCM의 종종 급성 심근염, 심장판막증, 관상 동맥 질환, 고혈압 심장병과 구별하기 어렵다. 일단 확장성 심근병증의 진단이 내려지면, 잠재적으로 가역적인 원인들을 확인하고 치료하고 나아가 심장 손상을 예방하는 모든 노력이 이루어진다. 예를 들어, 관상 동맥 질환 및 심장판막증은 배제해야 한다. 빈혈, 비정상 빈맥, 영양결핍, 알콜중독, 갑상선 질환 및/또는 다른 문제들은 집중해서 제어되어야 한다.
상기한 대로, 약리학적 물질들에 의한 치료는 심부전의 징후들을 감소 또는 완화하는 주요 메커니즘을 여전히 나타낸다. 이뇨제들 경증 내지 중증 심부전에 대 한 치료의 첫 번째 방향을 구성한다. 불행하게도, 많은 통상적으로 사용된 이뇨제들(예를 들어, 티아지드)은 여러 부작용이 있다. 예를 들어, 어떤 이뇨제들은 혈청 콜레스테롤과 트라이글리세라이드를 증가시킬 수 있다. 또한, 이뇨제들은 일반적으로 심각한 심부전을 앓고 있는 환자들에 대해 효과가 없다.
만일 이뇨제들이 효과가 없으면, 혈관확장 물질들이 사용될 수 있다; 안지오텐신 전환(ACE) 억제제들(예를 들어, 에날로프릴 및 리시노프릴)은 증상 완화를 제공할 뿐만 아니라 사망률도 감소시키는 것으로 보고되었다(Young et al, 1989). 그러나, ACE 억제제들은 특정 질환 상태(예를 들어, 신동맥협착증)를 가진 환자들에게 금지되는 나쁜 효과들과 관련이 있다. 유사하게는, 심근 수축제 치료(즉, 심근육 수축의 힘을 증가시킴으로써 심박출량을 향상시키는 물질)는 위장 문제들 및 중추 신경계 이상을 포함하는 부반응들과 관련이 있다.
따라서, 현재 사용된 약리학적 물질들은 특히 환자 집단에 심각한 단점들을 가진다. 새롭고, 안전하며 효과적인 물질들의 이용가능성은 현재 이용가능한 약리학적 방법을 사용할 수 없거나 이런 방법들로부터 적절한 완화효과를 얻지 못하는 환자들을 이롭게 하는 것은 의심의 여지가 없을 것이다. DCM을 가진 환자들에 대한 예후는 변할 수 있고, 심실 이상의 정도에 의존하며, 대부분의 사망이 진단 5년 이내에 사망한다.
I. 본 발명
어른 심장에서 α- 내지 β-MHC 동질체의 비율은 심장 수축의 주요 결정 요소이다. β-MHC, 어른 심장에서 주요 마이오신 동질체는 비교적 낮은 ATPase 활성 을 나타내는 반면에, α-MHC는 높은 ATPase 활성을 가진다. 심근경색, 고혈압 및 다른 질환들과 같은 여러 병적 자극에 반응하여, β-MHC 발현이 증가하고 α-MHC 발현은 감소하여 근원섬유 ATPase 활성을 감소시키고 심장 근원섬유의 수축속도를 감소시켜 결국 수축 이상을 유도한다. 현저하게는, 심장의 α-MHC 양의 적은 변화는 심장 기능에 중대한 영향을 줄 수 있다.
마이크로RNAs(miRs)는 더 큰 pre-miRs부터 유도된 소형 ~22-뉴클레오티드 RNAs이다. MiRs는 이들의 서열이 완전히 상보적일 때, 열화를 촉진하거나 이들의 서열들이 불일치할 때 번역을 억제함으로써 표적 mRNAs의 억제 인자로 작용한다. 마이크로RNA-208(miR-208)은 α-MHC 유전자의 인트론으로 암호화되고 구체적으로 심장에서 발현된다. 본 발명자들은 miR-208 녹아웃 생쥐들을 만들었고 miR-208은 어른 심장에서 β-MHC 유전자 발현의 활성화뿐만 아니라 다른 수축 단백질 유전자들의 발현을 위해 필요하다는 것을 발견하였다. 또한, miR-208 억제는 심장 섬유증에 심각한 감소를 유도한다. 이런 발견들은 miR-208의 발현을 조절하기 위한 전략은 인간의 심장 수축성에 중대한 영향, 예를 들어, 심장 손상 후 심장에서 β-MHC 발현을 예방하고 α-MHC 발현을 유지하는 miR-208의 억제를 가질 것이라는 것을 나타낸다.
본 발명의 다른 태양은 내인성 miR-208 유전자를 치료적으로 활성화하거나 외인성 miR-208을 아데노바이러스 벡터 또는 다른 것을 사용하여 도입함으로써 miR-208 발현 또는 활성의 상승작용이다 - 다시 α-MHC 유전자에 돌연변이가 있는 사람들의 치료를 위해, β-MHC 발현을 상승시키기 위해 전위 발현의 아데노바이러 스 시스템 수단을 사용할 필요가 없다. miR-208 돌연변이 생쥐들의 심장에서 여러 빠른 골격근 수축성 단백질 유전자들의 상승 조절은 miR-208은 전형적으로 빠른 골격근 유전자 프로그램을 억제한다는 것을 나타낸다. 심장에서 이런 유전자들의 활성화는 심장 수축성을 제어하기 위한 잠재적인 방법을 나타낸다.
또한, 본 발명자들은 골격근에서 빠른 섬유를 억제하여 느린 섬유 유전자들의 상호 발현을 활성화하기 위해 miR-208의 사용을 제안하며, 이는 강화된 인슐린 민감성과 골격근 내성과 연관된다. 느린 섬유 유전자들의 억제와 빠른 섬유 유전자들의 활성화는 무용성 위축, 무중력에 반응한 근육 손실 및 탈신경을 포함하는 여러 근골격 질환과 관련이 있다.
따라서, 본 발명자들은 miR-208은 심장 섬유증을 제어하는 심장에서 β-MHC 유전자 발현의 근-특이적이고 필수적인 제어제라는 것을 발견하였다. miR-208이 β-MHC 발현과 빠른 골격근 유전자들의 발현을 제어한다는 발견은 완전히 새로운 것인데 이는 심장 수축성과 골격근 기능을 제어하기 위해 이 마이크로RNA를 사용하기 때문이다.
II . miRNAs
A. 배경기술
2001년에, 여러 그룹이 꼬마선충, 초파리 및 인간으로부터 대형 그룹의 "마이크로RNA"(miRANs)를 분리하고 동정하기 위해 새로운 복제 방법을 사용하였다(Lagos- Quintana et al, 2001; Lau et al, 2001; Lee and Ambros, 2001). 수백의 miRNAs가 내인성 siRNAs를 갖지 않는 식물 및 동물-인간 포함-에서 동정되었다. 따라서, siRNAs와 유사하지만, miRNAs는 뚜렷이 구별된다.
따라서 지금까지 발견된 miRNAs는 길이가 대략 21-22 뉴클레오티드이고 비-단백질-암호화 유전자들로부터 전사된 더 긴 전구체들로부터 발생한다. 캐링턴 등.(2003)의 리뷰 참조. 전구체들은 자가-상보 영역에서 서로에 대해 접힌 구조들을 형성한다; 그런 후에 동물에서 뉴클리아제 다이서(nuclease Dicer) 또는 식물에서 DCL1에 의해 처리된다. miRNA 분자들은 정확한 또는 부정확한 염기-쌍과 이들의 표적들을 통한 번역을 방해한다.
miRNAs는 유전자 제어에 관여한다. lin -4 및 let -7을 포함하는 일부 miRNAs는 표적 mRNAs의 부분적으로 상보적인 3' 미번역 영역(3' UTRs)에 결합함으로써 단백질 합성을 억제한다. 식물에서 발견된 스케어크로우(Scarecrow) miRNAs를 포함하는 다른 것은 siRNA처럼 기능하고 완벽하게 상보적인 mRNA 서열들에 결합하여 표적 전사물을 파괴한다(Grishok et al., 2001).
마이크로RNAs에 대한 연구는 과학자들이 이 분자들이 진핵 유전자 발현의 제어에 관여한다는 명백한 역할을 알기 시작함에 따라 증가하고 있다. 2개의 가장 잘 이해된 miRNAs, lin-4 및 let-7은 주요 mRNAs의 집단의 번역을 제어함으로써 꼬마 선충에서 발달 시기를 제어한다(Pasquinelli, 2002에서 검토). 수백 miRNAs가 꼬마 선충, 초파리, 쥐 및 인간에서 동정되었다. 유전자 발현을 제어하는 분자들에 대해 예상되는 것과 같이, miRNA 레벨은 조직 및 발달 상태 사이에서 변하는 것을 보여주었다. 또한, 한 연구는 두 miRNAs의 감소된 발현과 만성 림프성 백혈병 사이에 강한 상관관계를 보여주어, miRNAs와 암 사이에 가능한 관련을 제공한다(Calin, 2002). 이 분야는 아직 초기 단계이지만, miRNAs는 고등 진핵세포에서 유전자 발현을 제어하는데 전사 인자들만큼 중요하다는 견해가 있다.
세포 분화, 초기 발달 및 세포사망과 같은 세포 진화 및 지방 대사에 중요한 역할을 하는 miRNAs의 약간의 예들이 있다. lin -4 및 let -7 모두는 꼬마 선충 발달에서 한 유충 상태로부터 다른 상태로의 경로를 제어한다(Ambros, 2003). mir-14 및 반탐(bantam)은 세포 사망에 관여하는 유전자들의 발현을 제어함으로써, 세포 죽음을 제어하는 초파리 miRNAs이다(Brennecke et al, 2003, Xu et al, 2003). MiR14는 지방 대사에 관련된다(Xu et al, 2003). Lsy-6 및 miR-273은 화학민감성 뉴런에서 비대칭성을 제어하는 꼬마 선충 miRNAs이다(Chang et al., 2004). 세포 분화를 제어하는 다른 동물 miRNA는 miR-181이고, 조혈 세포 분화를 유도한다(Chen et al., 2004). 이런 분자들은 공지된 기능들을 가진 모든 종류의 동물 miRNAs를 나타낸다. miRNAs의 기능들을 잘 이해하면 정상적인 발달, 분화, 세포간 및 세포내 정보교환, 세포 주기, 혈관 신생, 세포 사망 및 다른 세포 과정에 기여하는 제어 네트워크를 틀림없이 밝혀낼 것이다. 여러 생물학적 기능에서 이들의 중요한 역할을 고려하면, miRNAs는 치료적 개입 또는 진단 분석을 위해 중요한 지침들을 제공할 것이다.
miRNAs와 같은 분자들의 기능의 특징을 나타내는 것은 분자들을 세포 속에 주입하는 단계 또는 세포들로부터 분자들을 제거하는 단계 및 결과를 측정하는 단계를 포함한다. miRNA를 세포들 속에 주입해서 세포 사망이 일어나는 경우, miRNA는 세포 사망 경로에 틀림없이 관여한다. miRNA를 주입하고 세포들로부터 miRNA를 제거하는 방법이 기술되어 있다. 2개의 최근 공개공보는 특이적 miRNAs의 활성을 억제하는데 사용될 수 있는 안티센스 분자들을 개시한다(Meister et al., 2004; Hutvagner et al., 2004)). 다른 공개공보는 내인성 RNA 폴리머라제에 의해 전사되고 세포들 속에 감염될 때 특이적 miRNAs를 생산하는 플라스미드의 용도를 개시한다(Zeng et al., 2002). 이런 두 시약 세트는 단일 miRNAs를 평가하는데 사용되고 있다.
B. miR -208
MiR-208은 α-MHC 유전자의 27th 인트론 내에 위치한 인트론 miRNA이다. 도 1. 인간, 생쥐, 쥐 및 개에 대한 miR-208에 대한 pre-miRNA 암호화 서열들이 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17에 각각 제공된다. 성숙한 miR-208 서열은 SEQ ID NO: 5에 제공된다. α-MHC와 같이, miR-208은 심장에서만 발현된다. 도 2.
miRNA 표적들의 동정을 위해 PicTar 알고리즘을 사용하면(Krek et al., 2005), 본 발명자들은 miR-208에 대한 예상 표적으로서 갑상선 호르몬 수용체 관련 단백질 1(THRAP 1)을 동정하였다. 인간, 침팬지, 생쥐, 쥐, 개, 닭, 복어 및 제브라다니오 THRAP1 3' UTR 서열들은 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, and SEQ ID NO: 13에 각각 제공된다.
C. miR -208의 억제제들
일반적으로, miRNAs의 억제제들은 miRNAs의 기능을 막는 miRNAs에 상보적인 짧은, 화학적으로-가공된 단일-가닥 올리고뉴클레오티드인 "안타고미어스"의 형태를 가진다(Krutzfeldt et al., 2005). 다른 방법들은 안티센스 2'-O-메틸(2'-OMe) 올리고리보뉴클레오티드에 의한 miRNAs 및 특정 "약물-유사" 특성들(안정성을 위한 화학적 변형; 전달을 위한 콜레스테롤 접합)을 갖도록 가공된 소형 간섭 이중-가닥 RNAs(siRNAs)의 억제를 포함한다(Krutzfeldt et al., 2005).
III. 심장 비대 치료 방법
A. 치료 요법
심장 질환의 환경에서 심장 비대의 현재 의학적 치료는 적어도 2 종류의 약물: 레닌-안지오텐신 시스템의 억제제 및 β-아드레날린 차단제의 사용을 포함한다(Bristow, 1999). 심부전의 환경에서 병적 비대를 치료하기 위한 치료제들은 안지오텐신 II 전환 효소(ACE) 억제제 및 β-아드레날린 차단제를 포함한다(Eichhorn and Bristow, 1996). 심장 비대의 치료를 위해 개시된 다른 약학적 물질들은 안지오텐신 II 수용체 길항제(미국특허 제 5,604,251) 및 뉴로펩타이드 Y 길항제(WO 98/33791)를 포함한다. 현재 구입가능한 약학적 화합물들에도 불구하고, 심장 비대 및 심부전의 예방 및 치료는 치료 과제를 계속해서 제공한다.
비-약리학적 치료는 약리학적 치료에 대한 부가물로 주로 사용된다. 비-약리학적 치료의 한 수단은 식품에서 나트륨을 줄이는 것을 포함한다. 또한, 비-약리학적 치료는 음성 수축 촉진제(예를 들어, 특정 칼슘 채널 차단제 및 항부정맥제 유사 다이아이소파이라미드), 심장독소(예를 들어, 암페타민) 및 혈장 부피 확장제(예를 들어, 비스테로이드성 항염제 및 글루코코르티코이드)를 포함하는 특정 촉진 제들의 제거를 포함한다.
본 발명의 한 실시예에서, miR-208의 억제제를 사용하는 심장 비대 또는 심부전의 치료 방법들이 제공된다. 현재의 용도를 위해서, 치료는 감소된 운동 능력, 감소된 심장 분출 부피, 증가된 좌심실이완말기압, 증가된 폐모세혈관쐐기압, 감소된 심박출량, 심박출계수, 증가된 폐동맥압, 증가된 좌심실수축 및 이완말 크기, 증가된 좌심실 벽 긴장, 벽 장력 및 우심실에 대한 동일 벽 두께와 같은 심장 비대의 증상들 중 하나 이상을 감소시키는 단계를 포함한다. 또한, miR-208의 억제제들의 사용은 심장 비대 및 그 결과로 발생하는 이의 관련 증상을 예방할 수 있다.
치료 요법들은 치료 상태에 따라 변할 수 있다. 그러나, 장기간 치료가 대부분의 상황에서 적절한 것으로 보인다. 질환이 진행하는 동안 짧은 시간대 내와 같이, miR-208의 억제제들로 간헐적으로 심장 비대를 치료하는 것이 바람직할 수 있다.
B. 병합 요법.
다른 실시예에서, 다른 치료 방법들과 병합해서 miR-208의 억제제를 사용하는 것이 고려된다. 따라서, 상기한 치료법들 이외에, 환자에게 더욱 "표준적인" 약리학적 심장 치료를 제공할 수 있다. 다른 치료법들의 예는, 제한 없이, 소위 "베타-차단제", 항-고혈압제, 강심제, 항혈전제, 혈관확장제, 호르몬 길항제, 수축 촉진제, 이뇨제, 엔도텔린 수용체 길항제, 칼슘 채널 차단제, 포스포디에스테라제 억제제, ACE 억제제, 안지오텐신 타입 2 길항제 및 사이토카인 차단제/억제제, 및 HDAC 억제제를 포함한다.
병합 요법은 심장 세포와 두 약물을 포함하는 단일 조성물 또는 약리학적 제제를 접촉하거나 동시에 세포와 2개의 구별된 조성물 또는 제제를 접촉함으로써 성취될 수 있고, 한 조성물은 발현 구조물을 포함하고 다른 것은 약물을 포함한다. 선택적으로, miR-208의 억제제를 사용하는 치료는 수분에서 수주까지의 간격으로 다른 약물(들)의 투여 보다 먼저 또는 나중에 일어날 수 있다. 다른 약물 및 발현 구조물이 세포에 개별적으로 사용되는 실시예들에서, 상당한 기간이 각 전달의 시간 사이에 만료되지 않아서, 약물 및 발현 구조물은 여전히 세포에 대해 유익한 병합 효과를 낼 수 있다. 이런 경우에, 통상적으로 세포를 약 12-24 시간, 더욱 바람직하게는 약 6-12시간 내에서 약물과 발현 구조물을 접촉시키는 것이 고려되고, 단지 약 12시간의 지연 시간이 가장 바람직하다. 일부 상황들에서, 치료기간을 현저하게 연장하는 것이 바람직할 수 있고, 각 투여 사이에 수일(2, 3, 4, 5, 6, 또는 7) 내지 수주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8)가 경과한다.
miR-208의 억제제 또는 다른 물질의 1회 이상의 투여가 바람직하다고 생각된다. 이와 관련하여, 다양한 조합이 사용될 수 있다. 설명을 위해서, miR-208의 억제제는 "A"이고 다른 물질은 "B"이고, 3 및 4 전체 투여를 기초로 한 다음 치환이 전형적이다:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B
A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A
A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B
다른 조합도 마찬가지로 고려된다.
C. 약리학적 치료제들
약리학적 치료제들 및 투여, 복용 등의 방법은 당업자에게 주지되어 있고(예를 들어, 관련 부분이 참조로 포함된 the "Physicians Desk Reference", Klaassen's "The Pharmacological Basis of Therapeutics", "Remington's Pharmaceutical Sciences", and "The Merck Index, Eleventh Edition" 참조), 상기한 것을 고려하여 본 발명과 조합될 수 있다. 복용에서 일부 변화는 처리될 피험자의 상태에 따라 필수적으로 일어날 것이다. 투여에 책임이 있는 사람은, 어떤 경우에도, 개별 피험자에 대한 적절한 복용량을 결정할 것이고, 이런 개별적 결정은 당업자의 능력 내에 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 약리학적 치료제의 무 제한적인 예들은 항고지단백혈증제, 항동맥경화증제, 항혈전제/섬유소 용해제, 혈액 응고제, 항부정맥제, 항고혈압제, 혈관수축제, 울혈성 심부전 치료제, 항협심증제, 항균제 또는 이들의 조합을 포함한다.
또한, β-차단제들이 본 예들에서 사용되었기 때문에(아래 참조) 다음 중 어떤 것도 새로운 세트의 심장 치료 표적 유전자들을 개발하는데 사용될 수 있다. 많은 이런 유전자들이 겹칠 수 있지만, 새로운 유전자 표적들이 개발될 수 있다.
i. 항고지단백혈증제
특정 실시예들에서, "항고지단백혈증제"로 알려진 하나 이상의 혈액 지질 및/또는 지질 단백질의 농도를 낮추는 물질의 투여는 특히 죽상동맥경화증 및 심장 조직의 두꺼워짐 또는 봉쇄의 치료에서 본 발명에 따른 심혈관 치료와 병합될 수 있다. 특정 태양에서, 항고지단백혈증제는 아릴옥시알카논산/피브린산 유도체, 레진/담즙산 봉쇄제, HMG CoA 환원효소 억제제, 니코틴산 유도체, 갑상선 호르몬 또는 갑상선 호르몬 유사체, 기타 물질 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
a. 아릴옥시알카논산 / 피브린산 유도체
아릴옥시알카논산/피브린산 유도체의 비제한적인 예들은 베클로브레이트, 엔자피브레이트, 비니피브레이트, 시프로피브레이트, 클리노피브레이트, 클로피브레이트(아트로미드-S), 클로피브린산, 에토피브레이트, 페노피브레이트, 겜피브로질(로비드), 니코피브레이트, 피리피브레이트, 로니피브레이트, 심피브레이트 및 테오피브레이트를 포함한다.
b. 레진/ 담즙산 봉쇄제
레진/담즙산 봉쇄제의 비제한적인 예들은 콜레스티라민(초일바, 퀘스트란), 콜레스티폴(콜레스티드) 및 폴리덱시드를 포함한다.
c. HMG CoA 환원효소 억제제
HMG CoA 환원효소 억제제의 비제한적인 예들은 로바스타틴(메바코어), 프라바스타틴(프라보콜) 또는 심바스타틴(조코어)를 포함한다.
d. 니코틴산 유도체
니코틴산 유도체의 비제한적인 예들은 니코티네이트, 아세피목스, 니세리트롤, 니코클로네이트, 니코몰 및 옥시니악산을 포함한다.
e. 갑상선 호르몬 및 유사체
갑상선 호르몬 및 이의 유사체의 비제한적인 예들은 에토록세이트, 티로프로 픽산 및 티록신을 포함한다.
f. 기타 항고지단백혈증제
기타 항고지단백혈증제의 비제한적인 예들은 아시프란, 아자코스테롤, 벤플루오렉스, β-벤즈알부티르아마이드, 카니틴, 콘드로틴 설페이트, 클로메스트론, 덱스트란, 덱스트란 설페이트 소듐, 5, 8, 11, 14, 17-에코사펜타에논산, 에리트아데닌, 퓨라자볼, 메글루톨, 멜린아마이드, 미타트리엔다이올, 오르니틴, γ-오리자놀, 판테틴, 펜타에리트리톨 테트라아세테이트, α-페닐뷰티르아마이드, 파이로자딜, 프로뷰콜(로렐코), β-시토스테롤, 설토실산-파이퍼라진 염, 티아데놀, 트라이파라놀 및 젠뷰신을 포함한다.
ii . 항동맥경화증제
항동맥경화증제의 비제한적인 예들은 파이리디놀 카바메이트를 포함한다.
iii . 항혈전제/섬유소 용해제
특정 실시예들에서, 혈액 덩어리의 제거 또는 예방에 도움이 되는 물질의 투여는 특히, 죽상동맥경화증 및 맥관구조(예를 들어, 동맥) 봉쇄의 치료에서 조절제의 투여와 병합될 수 있다. 항혈전제/섬유소 용해제의 비제한적인 예들은 항응고제, 항응고제 길항제, 항혈소판제, 혈전용해제 길항제 또는 이의 조합을 포함한다.
특정 태양에서, 경구로 투여될 수 있는, 예를 들어, 아스프린 및 와파린(쿠마딘)과 같은 항혈전제들이 바람직하다.
a. 항응고제
항응고제의 비제한적인 예들은 아세노코우마롤, 안크로드, 아니신다이온, 브 로민다이온, 클로린다이온, 코우메타롤, 사이클로쿠마롤, 덱스트란 설페이트 소듐, 다이쿠마롤, 다이펜타다이온, 에틸 비스코움아세테이트, 에틸리덴 다이코우마롤, 플루인다이온, 헤파린, 히루딘, 리아폴레이트 소듐, 옥사지디온, 펜토산 폴리설페이트, 페닌다이온, 펜프로코우몬, 포스비틴, 피코타마이드, 티오클로마롤 및 와파린을 포함한다.
b. 항혈소판제
항혈소판제의 비제한적인 예들은 아스피린, 덱스트린, 다이파이리다몰(퍼산틴), 헤파린, 설핀파이라논(안튜란) 및 티클로피딘(티클리드)을 포함한다.
c. 혈전용해제
혈전용해제의 비제한적인 예들은 조직 플라미노겐 활성제(엑티바제), 플라스민, 프로-우로키나제, 우로키나제(아보키나제) 스트렙토키나제(스트렙타제), 아니스트렙라제/APSAC(에미나제)를 포함한다.
iv . 혈액 응고제
특정 실시예들에서, 환자가 출혈이 있거나 출혈 가능성이 큰 경우, 혈액 응고를 증가할 수 있는 물질이 사용될 수 있다. 혈액 응고 향상제의 비제한적인 예들은 혈전용해제 길항제 및 항응고제 길항제를 포함한다.
a. 항응고제 길항제
항응고제 길항제의 비제한적인 에들은 프로타민 및 바타민 K1을 포함한다.
b. 혈전용해제 길항제 및 항혈전응고제
혈전용해제 길항제의 비제한적인 예들은 아미오카프로산(아미카) 및 트라넥 사민산(암스타트)을 포함한다. 항혈전용해제의 비제한적인 예들은 아나그렐리드, 아그라트로반, 실스타졸, 달트로반, 데피브로티드, 에녹사파린, 프락시파린, 인도뷰펜, 라모파란, 오자그렐, 피코타마이드, 플라피브리드, 티델파린, 디클로피딘 및 트라이플루살을 포함한다.
v. 항부정맥제
항부정맥제의 비제한적인 예들은 클래스 I 항부정맥제(나트륨 채널 차단제), 클래스 III 항부정맥제(베타-아드레날린성 차단제), 클래스 II 항부정맥제(재분극화 연장제), 클래스 IV(칼슘 채널 차단제) 및 기타 항부정맥제를 포함한다.
a. 나트륨 채널 차단제
나트륨 채널 차단제의 비제한적인 예들은 클래스 IA, 클래스 IB 및 클래스 IC 항부정맥제를 포함한다. 클래스 IA 항부정맥제의 비제한적인 예들은 디스파이라미드(노르페이스), 프로카인아마이드(프로네스틸) 및 퀴니딘(퀴니덱스)을 포함한다. 클래스 IB 항부정맥제의 비제한적인 예들은 리도카인(자일로카인), 토카이니드(토노카드) 및 멕실레틴(멕시틸)을 포함한다. 클래스 IC 항부정맥제의 비제한적인 예들은 엔카이니드(엔카이드) 및 플레카이니드(탐보코르)를 포함한다.
b. 베타 차단제
β-아드레날린성 차단제, β-아드레날린성 길항제 또는 클래스 II 항부정맥제로 알려진 베타 차단제의 비제한적인 예들은 아세뷰톨올(섹트랄), 알프레놀올, 아모스라롤, 아로티놀올, 아테놀올, 베퓨놀올, 베탁졸올, 베반톨올, 비소프롤올, 보핀돌올, 부쿠몰올, 부페톨올, 부푸라놀, 부니트롤올, 부파라놀올, 뷰티드린 하이 드로클로라이드, 뷰토필롤올, 카라졸올, 카르테올롤, 카르베딜올, 셀리프롤올, 세타몰올, 클로라놀올, 딜레발올, 에파놀올, 에스몰올(브레비블록), 인데놀올, 라베탈올, 레보부놀올, 메핀돌올, 메티프라놀올, 메토프롤올, 모프롤올, 나돌올, 나독솔올, 니페날올, 니프라딜올, 옥스프레놀올, 펜뷰톨올, 핀돌올, 프락톨올, 프로네탈올, 프로파놀올(인데랄), 소탈올(베타페이스), 설파날올, 탈리놀올, 테르타톨올, 티몰올, 톨리프롤올 및 지비놀올을 포함한다. 특정 태양에서, 베타 차단제는 아릴옥시프로판올아민 유도체를 포함한다. 아릴옥시프로판올아민 유도체의 비제한적인 예들은 아세뷰톨올, 알프레놀올, 아로티놀올, 아테놀올, 베타솔올, 베바톨올, 비아이소프롤올, 보핀돌올, 뷰니트롤올, 뷰토필올올, 카라졸올, 카테올롤, 카베딜올, 셀리프롤올, 세타몰올, 에파놀올, 인데놀올, 메피돌올, 메티프란올올, 메타프롤올, 모르폴올, 나돌올, 니프라딜올, 옥스프레놀올, 펜뷰톨올, 핀돌올, 프로파놀올, 탈리놀올, 테르타톨올, 티몰올 및 톨리프롤올을 포함한다.
c. 재분극화 연장제
클래스 III 항부정맥제로도 알려진, 재분극화를 연장하는 물질의 비제한적인 예들은 아미오다론(코르다론) 및 소탈올(베타페이스)을 포함한다.
d. 칼슘 채널 차단제/ 효현제
클래스 IV 항부정맥제로 알려진 칼슘 채널 차단제의 비제한적인 예들은 아릴알킬아민(예를 들어, 베프리딜, 딜티아젬, 펜딜린, 갈로파밀, 프레닐아민, 테로딜린, 베라파밀), 다아하이드로파이리딘 유도체(펠로디핀, 이스라디핀, 나카디핀, 니페디핀, 니모디핀, 니솔디핀, 니트렌디핀) 파이퍼라진 유도체(예를 들어, 시나리 진, 플루나리진, 리도플라진) 또는 벤사이클란, 에타페논, 마그네슘, 미베프라딜 또는 퍼헥실린과 같은 기타 칼슘 채널 차단제를 포함한다. 특정 실시예에서 칼슘 채널 차단제는 지속성 다이하이드로파이리딘(니페디핀-형태)칼슘 길항제를 포함한다.
e. 기타 항부정맥제
기타 항부정맥제의 비제한적인 예들은 아데노신(아데노카드), 다이고신(라녹신), 아세카이니드, 아자말린, 아모프록산, 아프린딘, 브레틸륨 토실레이트, 뷰나프틴, 뉴토벤딘, 카포벤산, 시펜린, 다이아이소프라니드, 하이드로퀴놀리딘, 인데카이니드, 이파트로피움 브로마이드, 리도카인, 로라지민, 로카이니드, 메오벤틴, 모리시진, 피르멘톨, 프라지말린, 프로파페논, 파이리돌린, 퀴니딘 폴리갈락튜로네이트, 퀴니딘 설페이트 및 비퀴딜을 포함한다.
vi . 항고혈압제
항고혈압제의 비제한적인 예들은 교감신경차단제, 알파/베타 차단제, 알파 차단제, 항-안지오덴신제 II, 베타 차단제, 칼슘 채널 차단제, 혈관확장제 및 기타 항고혈압제를 포함한다.
a. 알파 차단제
α-아드레날린성 차단제 또는 α-아드레날린성 길항제로 알려진 알파 차단제는 아모술랄올, 아로티놀올, 다피프라졸, 독사조신, 에르골로이드 메실레이트, 펜스피리드, 인도라민, 라베탈올, 나세르골린, 프라조신, 테라조신, 톨라졸린, 트라이메조신 및 요임빈을 포함한다. 특정 실시예들에서, 알파 차단제는 퀴나졸린 유도 체를 포함할 수 있다. 퀴나졸린 유도체들의 비제한적인 예들은 알푸조신, 뷰나조신, 독사조신, 프라조신, 테라조신 및 트라이마조신을 포함한다.
b. 알파/베타 차단제
특정 실시예들에서, 항고혈압제는 알파 및 베타 아드레날린성 길항제이다. 알파/베타 차단제의 비제한적인 예들은 라베탈올(노르모딘, 트랜스데이트)을 포함한다.
c. 항- 안지오텐신 II 물질
항-안지오텐신 II 물질의 비제한적인 예들은 안지오텐신 변환 효소 억제제 및 안지오텐신 II 수용체 길항제를 포함한다. 안지오텐신 변환 효소 억제제(ACE 억제제)의 비제한적인 예들은 알라세프릴, 에날라프릴(바소테크), 캅토프릴, 실라자프릴, 델라프릴, 에날라프릴리트, 포시노프릴, 리시노프릴, 모벨토프릴, 페린도프릴, 퀴나프릴 및 라미프릴을 포함한다. 안지오텐신 II 수용체 길항제, ANG 수용체 차단제 또는 ANG-II 타입-1 수용체 차단제(ARBS)로 알려진 안지오텐신 II 수용체 차단제의 비제한적인 예는 안지오칸데사르탄, 에프로사르탄, 이루베사르탄, 로사르탄 및 발사르탄을 포함한다.
d. 교감신경차단제
교감신경차단제의 비제한적인 예들은 중추 작용성 교감신경차단제 또는 말초 작용성 교감신경차단제를 포함한다. 중추 신경계(CNS) 교감신경차단제로 알려진 중추 작용성 교감신경차단제의 비제한적인 예들은 클로니딘(카타프레스), 구아나벤즈(위텐신) 구안파신(테넥스) 및 메틸도파(알도메트)를 포함한다. 말초 작용성 교 감신경차단제의 비제한적인 예들은 강글리온 차단제, 아드레날린성 뉴론 차단제, β-아드레날린성 차단제 또는 알파-아드레날린성 차단제를 포함한다. 강글리온 차단제의 비제한적인 예들은 메카밀아민(인버신) 및 트라이메타판(아르포나드)을 포함한다. 아드레날린성 뉴론 차단제의 비제한적인 예들은 구아에티딘(이스멜린) 및 레서핀(세르파실)을 포함한다. β-아드레날린성 차단제의 비제한적인 예들은 아세니톨올(섹트랄), 아테놀올(테노르민), 베탁솔올(케를온), 카테올올(카르트롤), 라베탈올(노르모딘, 트랜데이트), 메토프롤올(로프레서), 나다놀(코르가드), 펜뷰톨올(레바톨), 핀돌올(비스켄), 프로파라놀올(인데랄) 및 티몰올(블로카드렌)을 포함한다. 알파-아드레날린성 차단제의 비제한적인 예들은 프라조신(미니프레스), 독사조신(카르듀라) 및 테라조신(히트린)을 포함한다.
e. 혈관확장제
특정 실시예들에서 심혈관 치료제는 혈관확장제(예를 들어, 대뇌 혈관확장제, 관상동맥 혈관확장제 또는 말초 혈관확장제)를 포함할 수 있다. 특정 바람직한 실시예에서, 혈관확장제는 관상동맥 혈관확장제를 포함한다. 관상동맥 혈관확장제의 비제한적인 예들은 아모트리펜, 벤다졸, 벤퓨로딜 헤미숙시네이트, 벤지오다론, 클로라시진, 클로모나르, 클로벤퓨롤, 클로나이트레이트, 다이라제프, 다이파이리다몰, 드로프레닐아민, 에플록세이트, 에리트리톨 테트라니트란, 에타페논, 펜딜리딘, 플로레딜, 강글레펜, 헤레스톨, 비스(β-다이에틸아미노에틸 에터), 헥소벤딘, 이트라민 토실레이트, 크헬린, 리도플라닌, 만니톨 헥사나이트레이트, 메디바진, 나코글리세린, 펜타에리트리톨 테트라나이트레이트, 펜트리니트롤, 퍼헥실린, 피메 필린, 트라피딜, 트라이크로밀, 트라이메타지딘, 트롤나이트레이트 포스페이트 및 비스나딘을 포함한다.
특정 태양들에서, 혈관확장제는 만성 치료 혈관확장제 또는 고혈압 응급 혈관확장제를 포함할 수 있다. 만성 치료 혈관확장제의 비제한적인 예들은 하이드라라진(아프레솔린) 및 미녹시딜(로니텐)을 포함한다. 고혈압 응급 혈관확장제의 비제한적인 예들은 나이트로프루시드(니프라이드), 다이아족시드(하이퍼스타트 IV), 하이드라라진(아프레솔린), 미녹시딜(로니텐) 및 베라파밀을 포함한다.
f. 기타 항고혈압제
기타 항고혈압제의 비제한적인 예들은 아자말린, γ-아미노뷰티르산, 뷰페니오드, 시클레타이닌, 시클로시도민, 크립텐아민 타네이트, 페놀도팜, 플로세퀴난, 케탄세르틴, 메뷰타메이트, 메카밀아민, 메틸도파, 메틸 4-파이리딜 케톤 티오세미카바존, 뮤졸리민, 파르글리신, 펨피딘, 피나시딜, 파이퍼록산, 프라마페론, 프로토베라트린, 라우바신, 레스시메톨, 릴메니덴, 사랄라신, 소듐 나이트로루시드, 티크릴나펜, 트라이메타판 캄실레이트, 트로시나제 및 우라피딜을 포함한다.
특정 태양에서, 항고혈압제는 아릴에탄올아민 유도체, 벤조티아다이아진 유도체, N-카복시알킬(펩타이드/락탐) 유도체, 다이하이드로파이리딘 유도체, 구아니딘 유도체, 하이드라진/프탈라진, 이미다졸 유도체, 4차 암모늄 화합물, 레서핀 유도체 또는 수플론아마이드 유도체를 포함할 수 있다.
아릴에탄올아민 유도체. 아릴에탄올아민 유도체의 비제한적인 예들은 아모설알올, 뷰퓨랄올, 딜레발올, 라베탈올, 프로네탈올, 소탈올 및 설피날올을 포함한 다.
벤조티아다이아진 유도체. 벤조티아다이아진 유도체의 비제한적인 예들은 알티지드, 벤드로플루메티아지드, 벤즈티아지드, 벤질하이드로클로로티아지드, 뷰티아지드, 클로로티아지드, 클로로티알리돈, 사이클로펜티아지드, 사이클로티아지드, 다이아족사이드, 에피티아지드, 에티아지드, 펜퀴존, 하이드로클로로티지드, 하이드로플루메티지드, 메틸클로티아지드, 메티크레인, 메톨라존, 파라플루티지드, 폴리티지드, 테트라클로메티아지드 및 트라이클로메티아지드를 포함한다.
N - 카복시알킬 ( 펩타이드 /락탐) 유도체. N-카복시알킬(펩타이드/락탐) 유도체의 비제한적인 예들은 알라세프릴, 캡토프릴, 클리아자프릴, 델라프릴, 에날라프릴, 에날라프릴라트, 포시노프릴, 리시노프릴, 모벨티프릴, 퍼인돌프릴, 퀴나프릴 및 라미프릴을 포함한다.
다이하이드로파이리딘 유도체. 다이하이드로파이리딘 유도체의 비제한적인 예들은 암로디핀, 페로디핀, 이스라디핀, 니카디핀, 니페디핀, 닐바디핀, 니솔디핀 및 니트렌디핀을 포함한다.
구아니딘 유도체. 구아니딘 유도체들의 비제한적인 예들은 베타니딘, 디브리소퀸, 구아나벤즈, 구아나클린, 구아나드렐, 구아나졸딘, 구안에티딘, 구안파신, 구아노클로어, 구아녹사벤즈 및 구아녹산을 포함한다.
하이드라진 / 프탈라진 . 하이드라진/프탈라진의 비제한적인 예들은 뷰드라라진, 카드라라진, 다이하이드라라진, 엔드라라진, 하이드라카바진, 하이드라라진, 페니프라진, 필드라라진 및 토드라라진을 포함한다.
이미다졸 유도체. 이미다졸 유도체의 비제한적인 예들은 클로니딘, 로펙시딘, 펜톨아민, 티아메니딘 및 톨로니딘을 포함한다.
4차 암모늄 화합물. 4차 암모늄 화합물의 비제한적인 예들은 아자메토늄 브로마이드, 클로리손다민 클로라이드, 헥사메토늄, 펜타사이늄 비스(메틸설페이트), 펜타메토늄 브로마이드, 펜톨리늄 타르트레이트, 페낙트로피늄 클로라이드 및 트라이메티디늄 메토설페이트를 포함한다.
레서핀 유도체. 레서핀 유도체의 비제한적인 예들은 바이에타세르핀, 데세르피딘, 레시나민, 레서핀 및 사이로신고핀을 포함한다.
수플론아마이드 유도체. 암뷰시드, 클로파미드, 퓨로세미드, 인다파미드, 퀸에타존, 트라이파미드 및 지파미드를 포함한다.
g. 혈관수축제
혈관수축제는 일반적으로 수술 과정에서 일어날 수 있는 쇼크 동안 혈압을 증가시키는데 사용된다. 항고혈압제로 알려진 혈관수축제의 비제한적인 예들은 아메지늄 메틸 설페이트, 안지오텐신 아마이드, 다이메토프린, 도파민, 에티펠민, 에티레프린, 게페프린, 메타라미놀, 미도드린, 노르에피네프린, 포레드린 및 시네프린을 포함한다.
vii . 울혈성 심부전 치료제
울혈성 심부전 치료제의 비제한적인 예들은 항-안지오텐신제 II, 후부하-전부하 감소 치료, 이뇨제 및 강심제를 포함한다.
a. 후부하-전부하 감소
특정 실시예들에서, 안지오텐신 길항제를 견딜 수 없는 동물 환자는 병합 치료로 치료할 수 있다. 이런 치료는 하이드라라진(아프레솔린) 및 아이소스르비드 다이나이트레이트(아이소르딜, 소르비트레이트)의 투여를 병합할 수 있다.
b. 이뇨제
이뇨제의 비제한적인 예들은 티아지드 또는 벤조티아다이아진 유도체(예를 들어, 알티아지드, 벤드로플루메타지드, 벤즈티아지드, 벤질하이드로클로로티아지드, 뷰티아지드, 클로로티아지드, 클로로티아지드, 클로로탈리돈, 사이클로펜티아지드, 에피티아지드, 에티아지드, 펜퀴존, 하이드로크로로티아지드, 하이드로플루메티아지드, 메틸클로티아지드, 메티크레인, 메톨라존, 파라플루티지드, 폴리티지드, 테트라클로로메티아지드, 트라이클로메티아지드), 오가노머큐리얼(예를 들어, 클로로메로드린, 머랄루리드, 머캠파미드, 머캡토메린 소듐, 머큠알리산, 머큠아틸린 도듐, 염화 수은, 머살일), 프테리딘(예를 들어, 퓨터렌, 트라이암테렌), 퓨리네스(예를 들어, 아세필린, 7-모폴리노메틸테오필린, 파모브롬, 프로테오브롬, 테오브롬), 알도스테론 길항제를 포함하는 스테로이드(예를 들어, 칸레논, 올레안드린, 스피로노락톤), 설폰아마이드 유도체(예를 들어, 아세타졸아마이드, 암뷰시드, 아조세미드, 뷰메타니드, 뷰타졸아마이드, 클로로아미노펜아마이드, 클로펜아마이드, 클로파마이드, 클로렉솔론, 다이페닐메테인-4,4'-다이설폰아마이드, 다이설파마이드, 에톡스졸아마이드, 퓨로세미드, 인다파미드, 메프루시드, 메타졸아마이드, 파이레타니드, 퀴네타존, 토라세미드, 트립아마이드, 집아마이드), 우라실(예를 들어, 아미노메ㅌ트라딘, 아미노메트라딘), 포타슘 보존성 길항제(예를 들어, 아밀로 라이드, 트라이암테렌) 또는 아미노진, 아르뷰틴, 크롤로라자닐, 에타크릴산, 에토졸린, 하이드라카바진, 아이소소르비드, 만니톨, 메토찰톤, 뮤졸리민, 페르헥실린, 티크리나펜 및 우레아와 같은 기타 이뇨제를 포함한다.
c. 강심제
양성 강심제의 비제한적인 예들은 아세플린, 아세틸디지톡신, 2-아미노-4-피콜린, 암리논, 벤퓨로딜 헤미숙시네이트, 뷰클라데신, 세르베로신, 캄포타마이드, 콘발라톡신, 사이마린, 데노파민, 데슬라노시드, 디기탈린, 디기탈리스, 디키톡신, 디곡신, 도뷰타민, 도파민, 도펙사민, 에녹시몬, 에리트로필레인, 페날코민, 기탈린, 기톡신, 글리코사민, 헵타미놀, 하이드라스티닌, 이보파민, 라나토시드, 마타미밤, 밀리논, 네리폴린, 올렌드린, 오우아바인, 옥시페드린, 프레날테롤, 프로실라리딘, 레시뷰포게닌, 실라렌, 실리레닌, 스트라파닌, 설마졸, 테오브로민 및 자모테롤을 포함한다.
특정 태양에서, 강심제는 강심 배당체, 베타-아드레날린성 효현제 또는 포스포다이에스테라제 억제제이다. 강심 배당체의 비제한적인 예들은 디곡신(라노신) 및 디기톡신(크리스토디긴)을 포함한다. β-아드레날린성 효현제의 비제한적인 예들은 알뷰테롤, 밤뷰테롤, 바이톨테롤, 카뷰테롤, 클렌뷰테롤, 클로프레날린, 데노마핀, 다이옥세테드린, 도뷰타민(도뷰트렉스), 도파민(인트로핀), 도펙사민, 에피드린, 에타페드린, 에틸노르에피네프린, 페노테롤, 포르모테롤, 헥소프레날린, 아보파민, 아이소에타린, 아이소프로테레놀, 마뷰테롤, 메타프로테레놀, 메톡시펜아민, 옥시페드린, 피르뷰테롤, 프로카테롤, 프로톡킬올, 레프로테롤, 리미테롤, 리 토드린, 소테레놀, 터뷰탈린, 트레토퀴놀, 튤로뷰테롤 및 자모테롤을 포함한다. 포스포다이에스테라제의 비제한적인 예들은 암리논(인도코어)을 포함한다.
d. 항협심증제
항협심증제는 오가노나이트레이트, 칼슘 채널 차단제, 베타 차단제 및 이의 조합을 포함할 수 있다.
나이트로혈관확장제로 알려진 오가노나이트레이트의 비제한적인 예들은 나이트로글리세린(나이트로-비드, 나이트로스타트), 아이소소르비드 다이나이트레이트(아이소르딜, 소르비트레이트) 및 아밀 나이트레이트(아스피롤, 바포롤)를 포함한다.
viii . 엔도텔린 수용체 길항제
엔도텔린(ET)은 심부전의 발달에 관여하는 것으로 보이는 강력한 생리학적 및 병리학적 효과를 가진 21-아미노산 펩타이드이다. ET의 효과들은 두 종류의 세포 표면 수용체들과의 상호작용을 통해 매개된다. 타입 A 수용체(ET-A)는 혈관수축과 세포 성장에 관여하는 반면 타입 B 수용체(ET-B)는 내피세포 매개 혈관확장 및 알도스테론과 같은 신경호르몬의 방출과 관련이 있다. ET의 생산 또는 관련 세포들을 자극하는 능력을 억제할 수 있는 약리학적 물질들이 당업계에 공지되어 있다. ET의 생산을 억제하는 것은 전구체로부터 활성 펩타이드의 처리에 관여하는 엔도텔린-변환 효소로 불리는 효소를 차단하는 물질들의 사용을 포함한다. 세포들을 자극하는 ET의 능력을 억제하는 것은 ET와 이의 수용체의 상호작용을 차단하는 물질들의 사용을 포함한다. 엔도텔린 수용체 길항제(ERA)의 비제한적인 예들은 보센탄, 엔라센탄, 암브리센탄, 다루센탄, 테조센탄, 아트라센탄, 아보센탄, 클라조센탄, 에도넨탄, 시탁센탄, TBC 3711, BQ 123 및 BQ 788을 포함한다.
D. 수술 치료제
특정 태양에서, 보조 치료제는 일정 형태의 수술을 포함할 수 있고, 예를 들어, 예방, 진단 또는 스테이징(staging), 치료 및 완화 수술을 포함한다. 수술, 특히 치료 수술은 다른 치료들, 예를 들어, 본 발명 및 하나 이상의 다른 치료제들과 함께 사용될 수 있다.
혈관 및 심혈관 질병 및 질환들을 위한 이런 수술 치료제들은 당업자에게 주지되어 있고, 유기체에 수술을 수행하고, 심혈관 기계적 삽입물, 혈관 형성술, 관상 동맥 재관류, 전극도자 절제술을 제공하고, 피험자에게 삽입형 제세동기를 제공하고, 기계적 순환 보조 또는 이의 조합을 제공하는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 사용될 수 있는 기계적 순환 보조의 비제한적인 예들은 대동맥내 풍선 펌프, 좌심실 보조 장치 또는 이의 조합을 포함한다.
E. 환자들에게 투여하기 위한 제형 및 경로
치료 용도를 고려하면, 약학적 조성물들은 의도된 용도에 적합한 형태로 제조될 것이다. 일반적으로, 인간 또는 동물에 해로울 수 있는 다른 불순물들뿐만 아니라 발열성 물질이 필수적으로 제거된 조성물들을 제조하는 것을 포함할 것이다.
일반적으로 운반 벡터들을 안정하게 하고 표적 세로들에 의해 흡수되도록 하기 위해 적절한 염들과 버퍼들을 사용할 것이다. 또한 버퍼들은 재조합 세포들이 환자에게 주입될 때 사용될 것이다. 본 발명의 수성 조성물들은 약학적으로 허용가 능한 담체 또는 수성 매질에 용해되거나 분산된 유효량의 벡터 또는 세포를 포함한다. "약학적으로 허용가능한" 또는 "약리학적으로 허용가능한"이란 용어는 동물 또는 인간에게 투여되었을 때 나쁜 반응, 알레르기 반응 또는 기타 불리한 반응을 일으키지 않는 분자 물질 및 조성물을 의미한다. 본 발명에서 사용된 대로, "약학적으로 허용가능한 담체"는 인간 투여에 적합한 약물과 같은 약물을 제제화하는데 사용하기 적합한 용매, 버퍼, 용액, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항곰파이제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적으로 활성인 물질들을 위한 이런 매질 및 물질의 사용은 당업계에 주지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 물질이 본 발명의 활성 성분들과 혼용될 수 없다는 것을 제외하고, 치료 조성물들에서 이의 용도가 고려된다. 또한 보충 활성 성분들은 조성물들의 벡터 또는 셀을 불활성화시키지 않는 경우, 조성물들에 포함될 수 있다.
본 발명의 활성 조성물들은 전형적인 약학적 제제를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 이런 조성물들의 투여는 표적 조직이 그 경로를 통해 사용할 수 있는 한 임의의 통상적인 경로를 통할 수 있다. 선택적으로, 투여는 내피, 피하, 근육내, 복강내 또는 정맥 주사 또는 심장 조직 속으로의 직접 주사에 의해 투여될 수 있다. 이런 조성물들은, 상기한 대로, 보통 약학적으로 허용가능한 조성물들로 투여될 수 있다.
또한 활성 화합물들은 비경구 또는 복강으로 투여될 수 있다. 설명을 위해서, 자유 염기 또는 약리학적으로 허용가능한 염들로서 활성 화합물들의 용액은 하이드록시프로필셀룰로오스와 같은 계면활성제와 적절하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 또한 분산액은 글리세롤, 지질 폴리에틸렌 글리콜, 및 이의 혼합물에서 및 오일에서 제조될 수 있다. 보통의 저장 및 사용 상태하에서, 이런 제제들은 일반적으로 미생물들의 성장을 억제하기 위해 방부제를 포함한다.
주사용으로 적절한 약학적 형태는, 예를 들어, 살균 수용액 또는 분산액 및 살균 수성 용액 또는 분산액 및 살균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 살균 분말을 포함한다. 일반적으로, 이런 제제들은 살균되며 쉽게 주사할 수 있을 정도로 유동성이 있다. 제제들은 제조 및 저장의 상태하에서 안정해야 하며 박테리아와 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 적절한 용매 또는 분산 매질은, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 지질 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적절한 혼합물, 및 식물유를 포함할 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 루시틴과 같은 코팅제의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 예방은, 파라벤, 클로로뷰탄올, 페놀, 소르브산, 티머로살 등과 같은 다양한 항균 및 항곰팡이제에 의해 이루어질 수 있다. 많은 경우, 등장화제, 예를 들어, 설탕 또는 염화 나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물들의 지속적 흡수는 조성물에 흡수 지연제, 예를 들어, 알루미늄 모노스트레이트 및 젤라틴을 사용하여 이루질 수 있다.
살균 주사 용액은 용매 속에 적절한 양으로 활성 화합물과 다른 성분들(예를 들어, 상기한 것)을 혼합시키고, 여과 살균하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 살균 활성 성분을 기본 분산액 매지와 상기한 다른 성분들을 포함하는 살균 부형제 속에 혼합시킴으로써 제조된다. 살균 주사 용액의 제조를 위한 살균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 미리 살균-여과된 용액으로부터 활성 성분(들) 및 임의의 추가의 원하는 성분들을 얻는 진공-건조 및 동결-건조 기술을 포함한다.
경구 투여를 위해 본 발명의 폴리펩타이드는 부형제들과 함께 혼합되고 비섭취성 구강세척제 및 치약 형태로 사용될 수 있다. 구강세척제는 붕산나트륨 용액(도벨스 용액)과 같은 적절한 용매에서 필요한 양의 활성 성분을 혼합하여 제조될 수 있다. 선택적으로, 활성 성분은 붕산나트륨, 글리세린 및 중탄산 칼륨을 포함하는 살균액 속에 혼합될 수 있다. 활성 성분은 겔, 페이스트, 분말 및 슬러리를 포함하는 치약에 분산될 수 있다. 활성 성분은 물, 접합제, 연마제, 향료, 발포제 및 습윤제를 포함할 수 있는 연고 치약에 치료적 유효량으로 첨가될 수 있다.
본 발명의 조성물들은 일반적으로 천연 또는 염 형태로 제제화될 수 있다. 약학적으로-허용가능한 염들은, 예를 들어, 무기산(예를 들어, 염산 또는 인산) 또는 유기산(예를 들어, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등)으로부터 유도된 산 첨가 염들(단백질의 유리 아미노기로부터 형성)을 포함한다. 단백질의 유리 카복실기로 형성된 염들은 무기 염기(예를 들어, 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 암모늄, 수산화 칼슘 또는 수산화 제이철) 또는 유기 염기(예를 들어, 아이소프로필아민, 트라이메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등)로부터 유도될 수 있다.
제제화 후, 용액들은 복용 제형과 혼용가능한 방식과 치료적으로 효과적인 양으로 투여되는 것이 바람직하다. 제형들은 주사 용액, 약물 방출 캡슐 등과 같은 다양한 복용 형태로 쉽게 투여될 수 있다. 수용액으로 비경구 투여를 위해, 용액은 일반적으로 적절하게 완충용액으로 처리되고 액체 희석제는 먼저 충분한 염수 또는 글루코스로 등장성이 제공된다. 이런 수용액은, 예를 들어, 정맥, 근육내, 피하 및 복강 투여에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 살균 수용 매질은 당업자에게 공지된 대로, 특히 본 발명의 설명을 고려하여 사용된다. 설명을 위해서, 단일 복용은 1ml의 등장성 NaCl 용액에 용해하고 1000ml의 대량피하주사 액체에 첨가되거나 제안된 주입 위치에 주사될 수 있다(예를 들어, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580 참조). 복용의 일부 변화는 치료될 피험자의 상태에 따라 반드시 일어날 것이다. 투여하는 사람은, 어떤 경우에도, 개별 피험자에 대한 적절한 복용량을 결정할 것이다. 또한, 인간 투여의 경우, 제제는 FDA의 생물학적 표준이 요구하는 살균성, 발열원성 검사, 일반적인 안전 및 순도 기준을 충족시켜야 한다.
IV . 근골격계 질환 및 섬유화 질환의 치료 방법
여러 빠른 골격근 수축 단백질 유전자들의 상승 조절은 miR-208 돌연변이 생쥐의 심장에서 관찰되었다. miR-208 돌연변이 생쥐의 심장에서 빠른 골격근 수축 단백질 유전자들의 상승 조절은 miR-208이 빠른 골격근 유전자 프로그램을 억제한다는 것을 나타낸다. 골격근에서, 느린 섬유 유전자들의 억제 및 빠른 섬유 유전자들의 활성화는 불용성 위축, 무중력에 반응한 근육 손실 및 탈신경을 포함하는 여러 근골격계 질환과 관련이 있다. 따라서, 골격근 세포들에서 miR-208의 발현은 빠른 섬유 유전자들을 억제하는데 효과적이라서 느린 섬유 유전자들의 상호 발현을 활성화에 효과적일 수 있다. 따라서, 특정 실시예들에서, 본 발명은 근골격계 질환 을 가지고 있거나 발생할 위험이 있는 피험자의 골격근에 miR-208을 투여하여 근골격계 질환들을 치료하는 방법을 제공한다.
성인 골격 근 섬유들은 특수화된 수축 및 신진대사 특성들을 기초로 하여 속근과 지근으로 분류될 수 있다. 이런 특성들은 마이소신 중사슬 및 경사슬, 트로포마이오신, 및 트로포닌뿐만 아니라 마이오글로빈의 빠른 및 느린 수축 단백질 동질체의 특이적 세트의 발현을 나타낸다(Naya et al., 2000). 지근들은 동작 유지 및 지속적인 운동 활동과 같은 장기간의 활동들에 주로 사용된다. 속근들은 큰 힘을 내는 활동들에 주로 사용된다. 성인 골격근 표현형은 정적이지 않고 대신 하중 지지력과 수축 용도 패턴에서의 변화에 적응하는 능력을 보유하여, 형태, 표현형, 및 수축 특성에 적응을 일으킨다. 예를 들어, 우주 비행의 무중력 환경에서 신체 하중의 제거는 현저한 정도의 근육 위축과 설치류와 인간에 대한 수축성의 느리고 빠른 변화와 신진대사 특성과 관련이 있는 변형된 단백질 표현형을 초래한다(Tsika et al, 2002; Baldwin and Haddad, 2001; Edgerton and Roy, (2000); Fitts et al, 2000). 따라서, 특정 실시예들에서, 본 발명은 골격근에 miR-208을 투여함으로써 감소된 중력 환경에 반응한 근육 손실을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
불용성 위축은 근육 사용의 부족에 의한 근육성 위축이다. 조직 위축은 누워만 있는 사람, 팔 다리에 깁스한 사람, 또는 다른 이유로 활동적이지 않은 사람들에게서 통상적으로 나타난다. 또한, 탈신경을 포함하는 근원섬유 전기 활동의 붕괴가 근육 위축을 일으킨다. 짧은 기간의 불사용 후, 근육 위축은 원상으로 되돌릴 수 있다. 그러나, 근육의 과도한 불사용은 골격근 섬유의 영구적인 손실과 결합 조 직에 의한 골격근 섬유의 대체가 일어날 수 있다. 골격근에서 빠른 섬유 유전자를 억제하고 느린 섬유 유전자의 상호 발현을 활성화함으로써, 근육 위축의 증상들을 감소하거나 예방할 수 있다는 것이 고려된다. 따라서, 특정 실시예들에서, 본 발명은 골격근에 miR-208을 투여함으로써 근육 위축을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
또한, 심장에서 섬유증을 제어하는데 중요한 역할을 하기 위해서, 분자들의 miR-29 집단의 편재하는 발현은 신장, 간 및 폐가 관련된 것과 같은 다른 섬유증 증상에 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 의미한다. 또한 섬유증은 당뇨병에 부차적인 것으로 관찰되었다. 1형 및 2 형 당뇨병 환자들은 심근병증의 위험이 증가한다. 당뇨병에서 심근병증은 감소된 심이완 순응성, 간질성 섬유증 및 근세포 비대를 포함하는 여러 특징과 관련이 있다. miR-208은 miR-29를 억제하기 때문에, miR-208의 억제는 비-심장 섬유증뿐만 아니라 심장 섬유증을 차단하는데 사용될 수 있다.
선천성 간섬유증(CHF)은 간과 신장에 영향을 주는 희귀병이다. 환자는 염색체 열성 소질로서 유전된다. 간 이상은 간비대, 다른 기관들로부터 간으로 혈액을 전달하는 정맥계에서 압력 증가(문맥 고혈압), 및 종종 간 병변으로 불리는 간 위 및 전체에 퍼진 섬유 유사 결합 조직(간 섬유증)이다. 감염된 환자들은 신장 기능이 손상되며, 주로 상염색체 열성 다낭성 신장질환(ARPKD)에 의해 일어난다. 성인에서 CHF와 관련된 손상된 신장 기능은 상염색체 우성 다낭성 신장질환(ADPKD)에 의해 일어난다.
신장 기능의 진행성 손실은 사구체 경화증의 발달뿐만 아니라 간질성 섬유증의 발달과도 관련이 있다. 간질성 섬유증은 세뇨관과 간극모관의 파괴뿐만 아니라 세포외 기질 단백질들의 축적을 특징으로 한다. 세뇨관간질성 섬유증의 심각성은 인간 및 실험 사구체신염에서 진행성 신장 손상의 중요한 요인으로 생각되어 왔다.
폐 섬유증 또는 폐 손상은 섬유성 조직에 의한 정상 폐 공기 주머니의 점진적인 대체에 의해 일어난다. 상처가 생기면, 조직은 두꺼워져서, 산소를 혈류 속으로 운반하는 조직의 능력을 완전히 손실시킨다. 증상들은 숨가쁨(특히, 격렬한 활동), 만성 건조, 헛기침, 피로 및 허약, 흉부 불쾌감, 식욕 손실 및 빠른 체중 손실을 포함한다.
일부는 폐 섬유증은 자가면역 질환 또는 바이러스 감염의 부작용일 수 있다고 가정하였다. 그러나, 유전자 소인이 중요 인자라는 믿음이 증가하고 있다. SP-C 단백질의 돌연변이는 폐 섬유증의 병력을 가진 집단들에 존재한다는 것을 발견되었다. 가장 최근의 생각은 섬유성 진행은 폐에 대한 미세 손상에 대한 반응(유전학에 의해 처리됨)이라는 것이다. 정확한 원인이 알려지지 않았지만, 흡입 환경 및 직업 오염물질, 흡연, 공피증, 류마티즈 관절염, 낭창 및 사르코이드증과 같은 질환, 특정 약물 및 치료 방사능이 관련이 있다.
환자들의 당뇨성 심근병증은 심근 비대, 간질성 섬유증, 모세혈관 내피세포 변화 및 모세혈관 기저판 비후를 특징으로 하며 콜라겐 구조에서의 변화들에 대해 부차적이다. 콜라겐의 증가된 축적은 심장바깥 및 혈관주위 영역에서 주로 발견되며, 여기서 종종 심부전으로 유도하는 LV 심이완 기능의 손상을 일으킨다.
V. 키트
개시한 조성물들 중 어떤 것도 키트에 포함될 수 있다. 비제한적인 예에서, 개별 miRNA가 키트에 포함된다. 키트는 miRNAs의 두 가닥의 혼성화를 촉진하기 위해 물과 혼성화 버퍼를 더 포함할 수 있다. 또한 키트는 miRNA의 세포로의 전달을 촉진하기 위해 하나 이상의 트랜스펙션 물질(들)을 포함할 수 있다.
키트의 성분들은 수성 매질 또는 지질 형태로 포장될 수 있다. 키트의 용기 수단은 일반적으로 적어도 하나의 작은 병, 테스트 튜브, 플라스크, 병, 주사기 또는 다른 용기 수단을 포함할 것이고, 성분은 그 안에 놓이며, 바람직하게는 적절하게 배치된다. 키트에 하나 이상의 성분(레이블링 시약 및 레이블은 함께 포장될 수 있다)가 있는 경우, 키트는 일반적으로 제 2, 제 3 또는 다른 추가 용기를 포함할 것이고 이곳에 다른 성분들이 분리되어 놓일 수 있다. 그러나, 성분들의 다양한 조합이 한 병에 포함될 수 있다. 본 발명의 키트는 핵산을 수용하기 위한 수단과 상업용 판매를 위해 단단히 밀폐된 임의의 다른 시약 용기를 포함할 것이다. 이런 용기들은 주사 또는 중공성형 플라스틱 용기들을 포함할 수 있고 이 속에 원하는 병들이 유지된다.
키트의 성분들이 하나 및/또는 그 이상의 용액에 제공되는 경우, 용액은 수용액이고, 살균 용액이 특히 바람직하다.
그러나, 키트의 성분들은 건조 분말(들)로 제공될 수 있다. 시약들 및/또는 성분들이 건조 분말로 제공되는 경우, 분말은 적절한 용매의 첨가로 재구성될 수 있다. 용매는 다른 용기 수단에 제공될 수 있다고 생각된다.
용기 수단은 일반적으로 적어도 하나의 작은 병, 테스트 튜브, 플라스크, 병, 주사기 또는 다른 용기 수단을 포함할 것이고, 이 속에 핵산 제제가 놓이며, 바람직하게는 적절하게 배치된다. 키트는 살균된, 약학적으로 허용가능한 버퍼 및/또는 다른 희석제를 수용하기 위한 제 2 용기 수단을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 상업용 판매를 위해 단단히 밀폐된 병을 수용하기 위한 수단을 포함할 수 있는데, 예를 들어, 주사 및/또는 중공성형 플라스틱 용기들이며 이 속에 원하는 병들이 유지된다.
이런 키트는 miRNA를 보존 또는 유지하거나 이의 열화를 막는 성분들을 포함할 수 있다. 이런 성분들은 RNAse-제거일 수 있거나 RNAses를 보호한다. 이런 키트는 일반적으로, 적절한 수단에, 각 개별 시약 또는 용액을 위한 구별된 용기들을 포함할 것이다.
키트는 키트에 포함되지 않은 다른 시약들의 용도뿐만 아니라 키트 성분을 사용하기 위한 지침들이 들어있다. 지침들은 수행될 수 있는 변화들이 들어있다.
이런 시약들은 본 발명의 키트의 실시예라고 생각된다. 그러나, 이런 키트는 상기한 특정 항목에 제한되지 않으며 miRNA의 조작 또는 묘사를 위해 사용된 임의의 시약을 포함할 수 있다.
VI . 스크리닝 방법
본 발명은 심장 비대 또는 심부전의 예방 또는 치료 또는 역전에 효과적인 miR-208의 억제제들을 동정하는 방법들을 더 포함한다. 이런 분석법은 후보 물질들의 대형 라이브러리를 랜덤 스크리닝하는 것을 포함할 수 있고; 선택적으로, 분석 법은 miR-208의 발현 및/또는 기능을 억제하게 하는 것으로 생각되는 구조적 특성들에 대해 눈으로 선택한 화합물들의 특정 집단에 집중하는데 사용될 수 있다.
miR-208의 조절제를 동정하기 위해서, 일반적으로 후보 물질의 존재 및 부존재하에서 miR-208의 기능을 확인할 것이다. 예를 들어, 한 방법은 일반적으로:
(a) 후보 조절제를 제공하는 단계;
(b) 상기 후보 조절제와 miR-208을 혼합하는 단계;
(c) miR-208 활성을 측정하는 단계; 및
(d) 단계(c)에서의 활성과 후보 조절제의 부존재하에서 활성을 비교하는 단계를 포함하며, 측정된 활성들을 차이는 후보 조절제가 miR-208의 조절제라는 것을 나타낸다.
또한 분석법은 분리된 세포, 기관 또는 생물에서 수행될 수 있다.
물론 본 발명의 모든 스크리닝 방법은 효과적인 후보들을 발견하지 못할지라도 그 자체로 유용하다고 생각된다. 본 발명은 단지 이런 후보들을 찾기 위한 방법이 아니라 이런 후보들을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
A. 조절제
본 발명에서 사용된 용어 "후보 물질"은 miR-208의 β-MHC 유도 기능을 조절할 수 있는 임의의 분자를 의미한다. 다양한 상업적 자료들로부터, 유용한 화합물들을 동정하려는 노력으로 유용한 약물들에 대한 기본 기준을 충족하는 것으로 생각되는 분자 라이브러리들을 얻을 것이다. 조합해서 생성된 라이브러리(예를 들어, 안타고미르 라이브러리)를 포함하는 이런 라이브러리들의 스크리닝은 활성에 대한 여러 관련(및 미관련) 화합물을 스크리닝하는 빠르고 효과적인 방법이다. 조합 방법은 활성적이나 바람직하지 않은 화합물들에 대해 모델화한 제 2, 제 3 및 제 4 발생 화합물의 생성에 의해 잠재 약물들의 빠른 발전을 유도한다.
B. 인비트로 분석법
실행하는데 빠르고, 저렴하고 쉬운 분석법은 인비트로 분석법이다. 이런 분석법은 일반적으로 분리된 분자들을 사용하고, 빠르고 많은 수로 실행되어, 짧은 기간에 얻을 수 있는 정보의 양을 증가시킨다. 테스트 튜브, 판, 접시 및 막대기 또는 비드와 같은 다른 표면을 포함하는 다양한 용기가 분석법을 수행하는데 사용될 수 있다.
화합물들의 고효율 스크리닝을 위한 기술은 WO 84/03564에 개시된다. 다수의 작은 안타고마르 화합물들은 플라스틱 핀 또는 다른 표면과 같은 고체 표면상에서 합성될 수 있다. 이런 분자들은 miR-208로 혼성화하기 위해 이들의 능력에 대해 빠르게 스크리닝될 수 있다.
C. 인사이토 분석법
본 발명은 세포들에서 miR-208 발현과 기능을 조절하는 이들의 능력에 대한 화합물들의 스크리닝을 고려한다. 골격근 세포들로부터 유도된 것들을 포함하는 다양한 세포주들은 이런 스크리닝 분석법을 위해 사용될 수 있다. 제 1 심장 세포들은 H9C2 세로주로 사용될 수 있다.
D. 인비보 분석법
인비보 분석법은 심장 질환 또는 근골격 질환의 다양한 동물 모델의 사용을 포함하는데, 다양한 동물 모델은 특정 결함을 갖도록 처리되거나 생물 내에서 다른 세포들에 도달하여 작용하는 후보 물질의 능력을 측정하기 위해 사용될 수 있는 마커들을 가질 있도록 처리된 형질전환 동물들을 포함한다. 이들의 크기, 처리의 간편함, 이들의 생물학적 및 유전 구성에 대한 정보 때문에, 생쥐가, 특히 형질전환을 위한 바람직한 대상이다. 그러나, 쥐, 토끼, 햄스터, 기니피그, 게르빌루스쥐, 우드척, 고양이 ,개, 양, 염소, 돼지, 소, 말 및 원숭이(침팬지, 긴팔원숭이 및 비비 포함)를 포함하는 다른 동물들도 역시 적합하다. 억제제들에 대한 분석법은 이런 종들 중 임의의 것으로부터 유도된 동물 모델을 사용하여 수행할 수 있다.
검사 화합물들에 의한 동물들의 치료는 적절한 형태로 화합물을 동물에게 투여하는 것을 포함할 것이다. 투여는 치료 목적을 위해 사용될 수 있는 임의의 경로에 의할 수 있다. 화합물의 인비보 효과를 결정하는 것은 비대 신호 경로 및 비대의 신체 증상에 대한 변형을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 다른 기준들을 포함할 수 있다. 또한 독성과 복용량 반응을 측정하는 것은 인비트로 또는 인사이토 분석법보다 더욱 의미 있는 방식으로 동물에서 수행될 수 있다.
VII . 클로닝 , 유전자 전달 및 발현을 위한 벡터
특정 실시예들에서, 발현 벡터들은 miR-208 또는 이의 억제제를 발현하기 위해 사용된다. 발현은 적절한 신호들이 벡터에 제공될 것을 요하며 벡터들은 숙주 세포들에서 관심 유전자들의 발현을 유도하는 바이러스 및 포유류 소스로부터의 인핸서/프로모터와 같은 다양한 제어 요소를 포함한다. 숙주 세포들에서 메신저 RNA 안정성과 번역가능성을 최적화하도록 설계된 요소들이 정의된다. 생성물들을 발현 하는 영구적이고, 안정한 세포 클론을 위한 여러 지배적 약물 선택 마커들의 사용을 위한 조건들이 제공되며, 약물 선택 마커들의 발현과 폴리펩타이드의 발현을 연결하는 것은 요소들도 마찬가지이다.
A. 제어 요소
본 출원 전체에서, 용어 "발현 구조물"은 유전자 생성물을 암호화하는 핵산을 함유하는 유전자 구조물의 임의의 형태를 의미하고 여기서 서열을 암호화하는 핵산의 일부 또는 전부가 전사될 수 있다. 전사물은 단백질로 번역될 수 있으나, 그럴 필요가 없다. 특정 실시예들에서, 발현은 유전자의 전사와 miRNA의 유전자 생성물로의 번역을 포함한다. 한 실시예들에서, 발현은 단지 관심 유전자를 암호화하는 핵산의 전사를 포함한다.
특정 실시예들에서, 유전자 생성물을 암호화하는 핵산은 프로모터의 전사 제어하에 있다. "프로모터"는 세포의 합성 장치에 의해 인식되거나 합성 장치에 제공된 DNA 서열을 의미하며, 유전자의 특정 전사를 개시하는데 필요하다. "전사 제어하에 있다"라는 문장은 프로모터가 RNA 중합효소 개시 및 유전자의 발현을 제어하기 위해 핵산에 대해 정확한 위치와 방향에 있다는 것을 의미한다.
프로모터라는 용어는 RNA 중합효소 II에 대한 개시 부위 주위에 집중된 전사 제어 모듈의 그룹을 의미한다. 어떻게 프로모터들이 구성되는 지를 곰곰이 생각하면 HSV 티미딘 카나아제(tk) 및 SV40 초기 전사 단위에 대한 것을 포함하는 여러 바이러스 프로모터들의 분석으로부터 유추된다. 더욱 최근의 노력에 의해 증가된 이런 연구들은 프로모터들은 구별된 기능성 모듈로 구성되며, 각각은 대략 7-20bp 의 DNA로 구성되고, 전사 활성자 또는 억제 단백질에 대한 하나 이상의 인식 부위를 가진다는 것을 보여주었다.
각 프로모터에서 적어도 하나의 모듈은 RNA 합성을 위한 시작 부위를 정하는 작용을 한다. 이것의 가장 잘 알려진 예는 TATA 박스이나, 포유류 터미널 데옥시뉴클레오티딜 트랜스페라제 유전자에 대한 프로모터 및 SV40 말기 유전자에 대한 ㅍ프로모터와 같이, TA 박스가 없는 일부 프로모터들에서, 시작 부위 자체를 덮고 있는 구별된 요소가 개시 장소를 고정하는 것을 돕는다.
다른 프로모터 요소들은 전사 개시의 주기를 제어한다. 통상적으로, 여러 프로모터가 시작 부위의 하부에 기능성 요소들을 함유하는 것으로 나타났지만, 이들은 시작 부위의 영역 30-110bp 상부에 위치한다. 프로모터 요소들 사이의 공간은 주로 유연하여서, 프로모터 기능은 요소들이 역전되거나 서로에 대해 이동하는 경우에도 보존된다. tk 프로모터에서, 프로모터 요소들 사이의 공간은 활성이 감소하기 시작하기 전에 50bp 떨어지게 증가할 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소들은 전사를 활성화하기 위해 공동으로 또는 독립적으로 작용할 수 있다.
다른 실시예들에서, 사람세포거대바이러스(CMV) 극초기 유전자 프로모터, SV40 초기 프로모터, 로우스 육종 바이러스 긴 말단 반복배열, 쥐 인슐린 프로모터 및 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제는 관심 암호화 서열의 고 레벨 발현을 얻기 위해 사용될 수 있다. 발현의 레벨이 소정의 목적에 충분한 경우에, 관심 암호화 서열의 발현을 성취하기 위한 다른 바이러스 또는 포유류 세포 또는 박테리아 파아지 프로모터의 사용이 고려도 고려된다.
주지된 특성들을 가진 프로모터를 사용함으로써, 트랜스펙션과 트랜스포메이션에 따른 관심 단백질의 발현 레벨 및 패턴은 최적화될 수 있다. 또한, 특정 생리 신호들에 반응하여 제어되는 프로모터들의 선택은 유전자 생성물의 유도성 발현을 가능하게 한다. 표 1 및 2는 본 발명의 내용에서, 관심 유전자의 발현을 제어하기 위해 사용될 수 있는 여러 제어 요소들을 나열한다. 이 목록은 유전자 발현의 증가에 관여하는 모든 가능한 요소들을 포괄하는 것이 아니고, 단지 이를 예시한다.
인핸서들은 DNA의 동일한 분자들에 대한 먼 위치에 위치한 프로모터로부터 전사를 증가시키는 유전 요소들이다. 인핸서들은 프로머터들과 유사하게 구성된다. 즉, 인핸서들은 많은 개별 요소들로 구성되며, 이의 각각은 하나 이상의 전사 단백질과 결합한다.
인핸서들과 프로모터들 사이의 기본 차이는 사용가능성이다. 전체로서 인핸서 영역은 거리를 두고 전사를 자극할 수 있어야 한다; 이것이 프로모터 영역 또는 이의 성분 요소들에게 해당할 필요가 없다. 한편, 프로모터는 특정 부위와 특정 방향에서 RNA 합성의 개시에 영향을 주는 하나 이상의 요소들을 가져야 하는 반면, 인핸서들은 이런 특이성이 부족하다. 프로모터들 및 인핸서들은 종종 겹치고 인접하여서, 종종 매우 유사한 모듈 구조를 갖는 것으로 보인다.
이하는 발현 구조물에서 관심 유전자를 암호화하는 핵산과 조합해서 사용될 수 있는 바이러스 프로모터, 세포 프로모터/인핸서 및 유도가능한 프로모터/인핸서의 목록이다(표 1 및 표 2). 또한, 임의의 프로모터/인핸서 조합(진핵 프로모터 데이터 베이스 EPDB에 따름)은 유전자의 발현을 일으키는데 사용될 수 있다. 진핵 세 포들은 적절한 박테리아 폴리머라제가 전달 복합체의 일부 또는 추가 유전자 발현 구조물로서 제공되는 경우, 특정 박테리아 프로모터들로부터 세포질 전사를 지원할 수 있다.
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근육 특이적 프로모터, 더욱 구체적으로, 심장 특이적 프로모터가 특히 관심대상이다. 이들은 마이소신 경사슬-2 프로모터((Franz et al, 1994; Kelly et al, 1995), 알파 액틴 프로모터(Moss et al, 1996), 트로포닌 I 프로모터(Bhavsar et al, 1996); Na+/Ca2+ 익스체인져 프로모터(Barnes et al, 1997), 디스트로핀 프로모터(Kimura et al, 1997), 알파7 인티그린 프로모터(Ziober and Kramer, 1996), 심장나트륨이뇨펩티드 프로모터(LaPointe et al, 1996) 및 알파 B-크리스탈린/소형 열 충격 단백질 프로모터(Gopal-Srivastava, 1995), 알파 마이오신 중사슬 프로모터(Yamauchi-Takihara et al, 1989) 및 ANF 프로모터(LaPointe et al, 1988)를 포함한다.
cDNA 삽입물이 사용되는 경우, 통상적으로 유전자 전사물의 적절한 폴리아데닐화를 일으키기 위해 폴리아데닐화 신호를 포함하는 것을 원할 것이다. 폴리아데닐화 신호의 특성은 본 발명의 성공적인 실시에 중요한 것으로 생각되지 않으며 임의의 이런 서열은 인간 성장 호르몬 및 SV40 폴리아데닐화 신호로서 사용될 수 있다. 또한 발현 카세트의 요소로서 종결자가 고려된다. 이런 요소들은 메세지 레벨을 증가시키고 카세트로부터 다른 서열들 속으로의 리드 스루(read through)를 감소하는 역할을 할 수 있다.
B. 선택가능한 마커
본 발명의 특정 실시예들에서, 세포들은 본 발명의 핵산 구조물을 포함하며, 세포는 발현 구조물에 마커를 포함함으로써 인비트로 또는 인비보로 동정될 수 있다. 이런 마커들은 동정가능한 변화를 세포에 일으켜서 발현 구조물을 포함하는 세포들을 쉽게 동정하게 한다. 약물 선택 마커의 삽입은 클로닝과 형질전환체의 선택에 도움을 주는데, 예를 들어, 네오마이신, 푸로마이신, 하이그로마이신, DHFR, GPT, 제오신 및 히스티디놀에 저항력을 제공하는 유전자들이 효과적인 선택가능한 마커들이다. 선택적으로, 단순포진 바이러스 티미닌 키나제(tk) 또는 클로로페니콜 아세틸트랜스페라제(CAT)와 같은 효소들이 사용될 수 있다. 또한 면역 마커들이 사용될 수 있다. 사용된 선택가능한 마커는 유전자 생성물을 암호화하는 핵산과 동시에 발현될 수 있는 한 중요하지 않은 것으로 생각된다. 선택가능한 마커들의 다른 예는 당업자에게 주지되어 있다.
C. 다유전자 구조물 및 IRES
본 발명의 특정 실시예들에서, 내부 리보솜 결합 부위(IRES) 요소들의 사용은 다유전자, 또는 다시스트론성 메세지를 생성하는데 사용된다. IRES 요소들은 5'메틸화 캡 의존 번역의 리보솜 스캐닝 모델을 바이패스할 수 있고 내부 부위에서 번역을 시작할 수 있다(Pelletier and Sonenberg, 1988). 피나코바이러스 과의 2 구성원으로부터 IRES 요소들(폴리오 및 뇌척수 심근염)뿐만 아니라 포유류 메세지로부터의 IRES(Macejak and Sarnow, 1991)가 개시되어 있다(Pelletier and Sonenberg, 1988). IRES 요소들은 이형 오픈 리딩 프레임(ORF)에 연결될 수 있다. 다중 오픈 리딩 프레임이 함께 전사될 수 있고, 각각은 IRES에 의해 분리되어, 다시스트론성 메세지를 만들어 낸다. IRES 요소에 의해, 각 오픈 리딩 프레임은 효과적인 번역을 위한 리보솜에 접근할 수 있다. 다유전자는 단일 메세지를 전사하기 위해 단일 프로모터/인핸서를 사용하여 효과적으로 발현될 수 있다.
임의의 이형 오픈 리딩 프레임은 IRES 요소들에 연결될 수 있다. 이것은 분비된 단백질, 독립 유전자들에 의해 암호화된 멀티-서브유닛 단백질, 세포내 또는 막-결합 단백질 및 선택가능한 마커에 대한 유전자들을 포함한다. 이런 방식으로, 여러 단백질의 발현은 단일 구조물과 단일 선택가능한 마커를 가진 세포 속으로 동시에 처리될 수 있다.
D. 발현 벡터의 전달
발현 벡터들이 세포들 속으로 주입되는 여러 방식이 있다. 본 발명의 특정 실시예들에서, 발현 구조물은 바이러스 또는 바이러스 게놈으로부터 유도된 처리된 구조물을 포함한다. 수용체-매개 내포작용을 통해 세포들에 들어가고, 숙주 세포 게놈 속에 결합하고, 바이러스 유전자들을 안전하고 효과적으로 발현하는 특정 바이러스들의 능력이 자신들을 포유류 세포들 속으로 외래 유전자들의 전달을 위한 매력있는 후보들로 만들었다(Ridgeway, 1988; Nicolas and Rubenstein, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Temin, 1986). 유전자 벡터들로 사용된 제 1 바이러스들은 파포바바이러스(유인원 바이러스 40, 소 파필로마 바이러스 및 폴리오마)(Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986) 및 아데노바이러스(Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986)를 포함하는 DNA 바이러스들이었다. 이들은 외래 DNA 서열들에 대해 비교적 낮은 능력을 가지며 제한된 숙주 스펙트럼을 가진다. 게다가, 증식허용세포에서 이들의 발암 잠재성과 세포 병변 효과는 안전 문제를 일으킨다. 이들은 외래 유전자 물질의 8kB 까지만 수용할 수 있으나 다양한 세포주와 실험 동물들에 쉽게 주입될 수 있다(Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986).
인비보 전달을 위한 바람직한 방법들 중 하나는 아데노바이러스 발현 벡터의 사용을 포함한다. "아데노바이러스 발현 벡터"는 (a) 구조물의 포장을 지원하고 (b) 구조물 내에 복제된 안티센스 폴리뉴클레오티드를 발현하는데 충분한 아데노바이러스 서열들을 포함하는 구조물들을 포함하는 것을 의미한다. 이 내용에서, 발현은 유전자 생성물이 합성될 것을 필요로 하지 않는다.
발현 벡터는 아데노바이러스의 유전적으로 처리된 형태를 포함한다. 아데노바이러스, 36kB, 선형, 이중가닥 DNA 바이러스의 유전적 구조의 지식은 아데노바이러스 DNA의 큰 조각의 외래 서열들과의 치환을 7kB까지 허용한다(Grunhaus and Horwitz, 1992). 레트로바이러스와 반대로, 숙주 세포들의 아데노바이러스 감염은 염색체 통합을 일으키지 않는데 이는 아데노바이러스 DNA는 잠재적인 유전독성 없이 에피소멀 방식(episomal manner)으로 복제될 수 있기 때문이다. 또한, 아데노바이러스는 구조적으로 안정하고 막대한 증폭 후 유전자 재배열이 발견되지 않았다. 아데노바이러스는 이들의 세포 순환 단계와 상관없이 실제로 모든 내피 세포들을 감염시킬 수 있다. 지금까지로는, 아데노바이러스 감염은 인간의 급성 호흡기 질환과 같은 가벼운 질환에만 관련이 있는 것으로 보인다.
아데노바이러스는 중간 크기 게놈, 조작 간편성, 높은 역가, 넓은 표적 세포 범위 및 높은 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로 사용하기에 특히 적합하다. 바이러스 게놈의 양 말단은 바이러스 DNA 복제와 포장에 필수적인 cis 요소들인 100-200 염기쌍 역위 반복서열을 포함한다. 게놈의 초기(E) 및 말기(L) 영역은 바이러스 DNA 복제의 개시에 의해 나뉘는 다른 전사 단위를 함유한다. E1 영역(E1A 및 E1B)는 바이러스 게놈과 약간의 세포 유전자의 전사의 제어에 원인이 있다. E2 영역(E2A 및 E2B)의 발현은 바이러스 DNA 복제를 위한 단백질들의 합성을 초래한다. 이런 단백질들은 DNA 복제, 말기 유전자 발현 및 숙주 세포 셧오프(shut-off)에 관여한다(Renan, 1990). 대다수의 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 말기 유전자들의 생성물은 주요 말기 프로모터(MLP)에 의해 생산되는 단일 주요 전사물의 상당한 가공 후에만 발현된다. MLP(16.8 m.u.에 위치)는 감염의 말기 단계 동안 특히 효과적이고 이런 프로모터로부터 생산된 모든 mRNA's는 번역을 위해 바람직한 mRNA's가 되게 하는 5'-트라이파티드 리더(TPL) 서열을 소유한다.
현재 시스템에서, 재조합 아데노바이러스는 셔틀 벡터와 프로바이러스 벡터 사이의 상동 재조합으로부터 생성된다. 프로바이러스 벡터들 사이의 가능한 재조합 때문에, 야생형 아데노바이러스가 이 과정으로부터 생성될 수 있다. 따라서, 개별 플라크(individual plaque)로부터 바이러스의 단클론을 분리하고 이의 게놈 구조를 조사하는 것이 중요하다.
복제 결함인 현재의 아데노바이러스 벡터의 생성과 증식은 Ad5 DAN 절편에 의해 인간 배아 신장 세포들로부터 변형되고 항상적으로 E1 단백질을 발현하는 293으로 지정된 독특한 헬퍼 세포주에 의존한다(Graham et ah, 1977). E3 영역이 아데노바이러스 게놈으로부터 필요 없기 때문에(Jones and Shenk, 1978), 현재의 아데노바이러스 벡터는 293 세포들의 도움으로, E1, D3 또는 두 영역에 외래 DNA를 운반한다(Graham and Prevec, 1991). 본래, 아데노바이러스는 야생형 게놈의 대략 105%를 포장할 수 있어서(Ghosh-Choudhury et ah, 1987), DNA의 약 2 추가 kb에 대한 용량을 제공한다. E1 및 E3 영역에서 교체할 수 있는 대략 5.5kb의 DNA와 결합되면, 현재 아데노바이러스 벡터의 최대 용량은 7.5kb 이하 또는 벡터의 전체 길이의 약 15%이다. 아데노바이러스 바이러스 게놈의 80% 이상이 벡터 백본에 남아있고 벡터-매개 세포독성의 원인이다. 또한, E1-결실 바이러스의 복제 결함도 불완전하다.
헬퍼 세포주들은 인간 배아 신장 세포들, 근육 세포들, 조혈 세포들 또는 다른 인간 배아 간엽세포 또는 상피세포와 같은 인간 세포들로부터 유도될 수 있다. 선택적으로, 헬퍼 세포들은 인간 아데노바이러스에 관대한 다른 포유류 종들의 세포들로부터 유도될 수 있다. 이런 세포들은, 예를 들어, 베로 세포 또는 다른 원숭이 배아 간엽 또는 상피 세포들을 포함한다. 상기한 대로, 바람직한 헬퍼 세포주는 293이다.
라쳐 등(1995)은 293 세포를 배양하고 아데노바이러스를 증식하는 개량된 방법을 개시하였다. 한 포맷에서, 천연 세포 덩어리들은 개별 세포들을 100-200ml의 배지를 함유하는 1 리터 실리콘화된 스피너 플라스크(영국, 캠브리지, 테크닉) 속에 주입함으로써 성장한다. 40 rpm에서 교반한 후, 세포 생존가능성을 트립판 블루로 측정한다. 다른 포맷에서, 피브라-셀 마이크로캐리어(영국, 스톤, 비비 스털린)을 다음과 같이 사용한다. 5ml의 배지에 재현탁된 세포접종체를 250ml 엘른메이어 플라스크에 있는 캐리어(50ml)에 첨가하고 1 내지 4시간 동안 이따금 교반하면서 움직이지 않게 두었다. 그런 후에 배지를 50ml의 새로운 배지로 교환하고 흔들었다. 바이러스 생산을 위해서, 세포들을 약 80% 모일 때까지 성장시키고, 그 후 배지를 교체하고(25%의 최종 부피까지) 0.05의 MOI에서 아데노바이러스를 첨가하였다. 배양액을 하루 동안 방치하고, 그 후 부피가 100%로 증가하였고 72시간 동안 흔들었다.
아데노바이러스 벡터는 복제 결함이어야 하거나 적어도 조건부로 결함이어야 한다는 조건 이외에, 아데노바이러스 벡터의 특성은 본 발명의 성공적인 실시에 중요하다고 생각되지 않는다. 아데노바이러스는 42 다른 공지된 혈청형 또는 서브그룹 A-F 중 임의의 것일 수 있다. 서브그룹 C의 아데노바이러스 5형은 본 발명에서 사용하기 위한 조건부 복제-결함 아데노바이러스 벡터를 얻기 위한 바람직한 출발 물질이다. 이것은 아데노바이러스 5형은 인간 아데노바이러스이고, 이에 대한 많은 양의 생물학적 및 유전학적 정보가 알려져 있고 벡터로서 아데노바이러스를 사용하는 대부분의 구조를 위해 사용되고 있다.
상기한 대로, 본 발명에 따른 전형적인 벡터는 복제 결함이고 아데노바이러스 E1 영역을 갖지 않을 것이다. 따라서, E1-암호화 서열들이 제거된 위치에서 관심 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하는 것이 가장 편할 것이다. 그러나, 아데노바이러스 서열들 내에 구조물을 삽입하는 위치는 본 발명에서 중요하지 않다. 관심 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 칼슨 등(1986)에 개시된 대로, E3 치환 벡터에서 결실된 E3 영역 또는 헬퍼 세포주 또는 헬퍼 바이러스가 E4 결함을 보충하는 E4 영역 대신에 삽입될 수 있다.
아데노바이러스는 성장하고 조작하기 쉬우며 인비트로 및 인비보에서 넓은 숙주 범위를 나타낸다. 이런 그룹의 바이러스들은 높은 역가, 예를 들어, ml 당 109-1012 플래크-형성 단위(plaque-forming units)로 얻을 수 있고 이 바이러스들은 감염성이 높다. 아데노바이러스의 생명 주기는 숙주 세포 게놈 속에 통합되는 것을 필요로 하지 않는다. 아데노바이러스 벡터들에 의해 전달된 외래 유전자들은 에피소멀이고, 따라서, 숙주 세포들에 대해 낮은 유전독성을 가진다. 야생형 아데노바이러스에 의한 백신의 연구에서 부작용이 보고되지 않았고(Couch et al, 1963; Top et al, 1971), 인비보 유전자 전달 벡터들로서 이들의 안전성과 치료 효능을 나타내었다.
아데노바이러스 벡터들은 진핵 유전자 발현(Levrero et al,1991; Gomez-Foix et al, 1992) 및 백신 개발(Grunhaus and Horwitz, 1992; Graham and Prevec, 1991)에 사용되어 왔다. 최근에, 동물 연구들은 재조합 아데노바이러스는 유전자 치료에 사용될 수 있다는 것을 보여주었다(Stratford-Perricaudet and Perricaudet, 1991; Stratford-Perricaudet et al, 1990; Rich et al, 1993). 다른 조직들에 재조합 아데노바이러스를 투여하는 연구들은 기관 삽입(Rosenfeld et al, 1991 ; Rosenfeld et al, 1992), 근육 주사(Ragot et al, 1993), 말초 정맥 주사() 및 뇌 속으로의 정위 접종(Le GaI La Salle et al., 1993)을 포함한다.
레트로바이러스들은 역전사의 과정에 의해 감염된 세포들에서 이들의 RNA를이중 가닥 DNA로 변환하는 능력을 특징으로 한다(Coffin, 1990). 그런 후에 결과로 얻은 DNA는 프로바이러스로서 세포 염색체 속에 안정하게 통합되고 바이러스 단백질들의 합성을 유도한다. 통합은 수혜 세포와 이의 후손들에서 바이러스 유전자 서열들의 유지를 일으킨다. 레트로바이러스 게놈은 각각 캡시드 단백질, 폴리머라제 효소 및 외피 구성요소를 암호화하는 3개 유전자, gag, pol 및 env를 포함한다. gag 유전자의 상부에서 발견된 서열은 게놈을 비리온들 속으로 포장하기 위한 신호를 포함한다. 2개의 긴 말단 반복체(LTR) 서열들은 바이러스 게놈의 5' 및 3' 말단에 존재한다. 이들은 강한 프로모터와 인핸서 서열을 포함하며 숙주 세포 게놈에 통합될 것을 필요로 한다(Coffin, 1990).
레트로바이러스 벡터를 만들기 위해서, 관심 유전자를 암호화하는 핵산이 특정 바이러스 서열들의 위치에서 바이러스 게놈 속에 삽입되어 복제-결함인 바이러스를 생산한다. 비리온들을 생산하기 위해서, gag, pol 및 env 유전자들을 포함하나 LTR과 포장 성분들이 없는 포장 세포주를 만들었다(Mann et al, 1983). 레트로바이러스 LTR과 포장 서열들과 함께 cDNA를 포함하는 재조합 플라스미드가 이 세포주 속에 삽입될 때(예를 들어, 인산칼슘 침전화), 포장 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사물이 바이러스 입자들 속에 포장되게 하고, 그런 후에 바이러스 입자들은 배양 배지 속으로 분비된다(Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al, 1983). 그런 후에 재조합 레트로바이러스를 포함하는 배지를 수집하고, 선택적으로 농축하고 유전자 전달을 위해 사용한다. 그러나, 통합과 안정한 발현은 숙주 세포들의 분리를 필요로 한다(Paskind et al, 1975).
레트로바이러스 벡터들의 특이적 표적화를 일으키도록 설계된 새로운 방법이 락토오스 잔류물을 바이러스 외피에 화학 첨가에 의한 레트로바이러스의 화학적 변형을 기반으로 하여 최근에 개발되었다. 이런 변형이 시알로당단백질 수용체들 통한 간세포들의 특이적 감염을 일으킬 수 있다.
재조합 레트로바이러스들의 표적화에 대한 다른 방법이 설계되었고 여기서 레트로바이러스 외피 단백질과 특이적 세포 수용체들에 대항하는 바이오티닐화된 항체들이 사용되었다. 항체들은 스트렙타비딘을 사용하여 바이오틴 성분들을 통해 결합되었다(Roux et al, 1989). 주조직적합복합체 클래스 I 및 II 항원에 대항하는 항체들을 사용하면, 항체들은 인비트로에서 이코트로픽 바이러스를 가진 표면 항원들을 가진 다양한 인간 세포들의 감염을 증명하였다(Roux et al, 1989).
본 발명의 모든 태양들에서 레트로바이러스 벡터들에 특정 제한들이 있다. 예를 들어, 레트로바이러스 벡터들은 주로 세포 게놈에서 무작위 부위 속에 통합된다. 이것은 숙주 유전자들의 간섭 또는 양끝 유전자들의 기능을 방해할 수 있는 바이러스 제어 서열들의 삽입을 통해 삽입 돌연변이를 유도할 수 있다(Varmus et al, 1981). 결함 레트로바이러스 벡터들의 사용에 대한 다른 문제는 포장 세포들에서 야생형 복제-가능 바이러스의 잠재적인 출연이다. 이것은 재조합 사건으로부터 유발될 수 있고 재조합 바이러스의 손상되지 않은 서열은 숙주 세포 게놈에 통합된 gag, pol, env 서열로부터 상부에 삽입된다. 그러나, 재조합의 가능성을 크게 감소시켜야 하는 새로운 포장 세포주들을 구입할 수 있다(Markowitz et al, 1988; Hersdorffer et al, 1990).
다른 바이러스 벡터들은 본 발명에서 발현 구조물들로서 사용될 수 있다. 우두 바이러스(Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al, 1988), 아데노-관련 바이러스(AAV)(Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Hermonat and Muzycska, 1984) 및 헤르페스 바이러스와 같은 바이러스들로부터 유도된 벡터들이 사용될 수 있다. 이들은 다양한 포유류 세포들을 위한 여러 매력적인 특징들을 제공한다(Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al, 1988; Horwich et al, 1990).
결함 B형 간염 바이러스들을 인식함에 따라, 다른 바이러스 서열들의 구조-기능 관계에 새로운 시각이 도입되었다. 인비트로 연구들은 바이러스는 이의 게놈의 80%까지 결실됨에도 불구하고 헬퍼-의존성 포장 및 역전사에 대한 능력을 유지할 수 있다는 것을 보여주었다(Horwich et al, 1990). 이것은 게놈의 많은 부분들이 외래 유전 물질로 교체될 수 있다는 것을 나타내었다. 간 친화성 및 지속성(통합)은 간-유도 유전자 전달을 위해 특히 매력적인 특성들이다. 창 등은 폴리머라제, 표면 및 서열들을 암호화하는 프리-표면의 위치에 있는 오리 B 형 간염 게놈 속에 클로람페니콜 아세틸트랜스페라제(CAT) 유전자를 삽입하였다. 조류 간세포암 세포주 속에 야생형 바이러스와 공동으로 트랜스펙트되었다. 높은 역가의 재조합 바이러스를 포함하는 배양 배지는 제 1 오리 간세포를 감염시키는데 사용되었다. 안정한 CAT 유전자 발현은 트랜스펙션 후 적어도 24시간 동안 탐지하였다(Chang et al, 1991).
센스 또는 안티센스 유전자 구조물의 발현을 일으키기 위해서, 발현 구조물은 세포 속에 전달되어야 한다. 이런 전달은 세포주들을 변형시키기 위해 실험 방법으로 인비트로에서 또는 특정 질환 상태의 치료에서 인비보 또는 엑스 비보에서 수행되었다. 전달을 위한 한 메커니즘은 바이러스 감염을 통하는 것이고 발현 구조물은 감염성 바이러스 입자에서 이입된다.
발현 구조물들을 배양된 포유류 세포들 속으로 운반하기 위한 여러 비-바이러스 방법들이 본 발명에 의해 고려된다. 이 방법들은 인산칼슘 침전화법(Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al, 1990), DEAE-덱스트란(Gopal, 1985), 전기충격법(Tur-Kaspa et al, 1986; Potter et al, 1984), 직접 미세 주입법(Harland and Weintraub, 1985), DNA-충전 리포솜(Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al, 1979) 및 리포펙타민-DNA 복합체, 세포 초음파처리법(Fechheimer et al, 1987), 고속 미세 발사체를 사용하는 유전자 충돌(Yang et al, 1990), 및 수용체-매게 트랜스펙션(Wu and Wu, 1987; Wu and Wu, 1988)을 포함한다. 이런 기술들의 일부는 인비보 또는 엑스 비보 용도로 성공적으로 적용될 수 있다.
발현 구조물이 세포 속에 전달되면, 관심 유전자를 암호화하는 핵산은 다른 위치들에 위치하고 발현될 수 있다. 특정 실시예들에서, 유전자를 암호화하는 핵산은 세포의 게놈 속에 안정하게 통합될 수 있다. 이런 통합은 상동 재조합(유전자 치환)을 통해 같은 위치와 방향에서 일어날 수 있거나 무작위, 비-특이적인 위치(유전자 증식)에 통합될 수 있다. 또 다른 실시예들에서, 핵산은 DNA의 분리된 에피소멀 단편으로 세포에 안정하게 유지될 수 있다. 이런 핵산 단편 또는 "에피솜"은 숙주 세포 주기와 독립적으로 또는 동시에 유지와 복제를 허용하는데 충분한 서열들을 암호화한다. 발현 구조물이 어떻게 세포에 전달되고 세포에서 어디에 핵산이 남아있는지는 사용된 발현 구조물의 형태에 의존한다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 발현 구조물은 나상 재조합 DNA 또는 플라스미드로 간단히 이루어질 수 있다. 구조물의 전달은 물리적 또는 화학적으로 세포막을 투과할 수 있는 상기한 방법들 중 임의의 것으로 수행될 수 있다. 이것은 특히 인비트로 전달에 적용할 수 있으나 인비보 용도로도 적용될 수 있다. 듀벤스키 등(1984)은 인산 칼슘 침전물의 형태로 폴리오마바이러스 DNA를 성인 및 신생 생쥐의 간과 이자에 성공적으로 주입하여 활성적인 바이러스 복제와 급성 감염을 증명하였다. 또한 빈벤니스티 및 네시프(1986)는 인산 칼슘-침전화된 플라스미드의 직접 복강내 주입은 트랜스펙트된 유전자들의 발현을 일으킨다는 것을 증명하였다. 관심 유전자를 암호화하는 DNA는 유사한 방식으로 인비보로 전달되고 유전자 생성물을 발현할 수 있다고 생각된다.
본 발명의 또 다른 실시예들에서 나상 DNA 발현 구조물을 세포들 속으로 전달하기 위해서는 입자 충돌을 포함할 수 있다. 이 방법은 DNA-코팅 미세 발사체를 고속으로 가속하여 세포막들을 뚫어서 세포들을 죽이지 않고 세포에 들어가는 능력에 의존한다(Klein et al, 1987). 소형 입자들을 가속하기 위한 여러 장치가 개발되었다. 이런 장치는 전류을 발생시키기 위해 고전압 방전에 의지하여, 원동력을 제공한다(Yang et al, 1990). 사용된 미세 발사체들은 텅스텐 또는 금 구슬과 같은 생물학적으로 불활성인 물질들로 구성하였다.
쥐와 생쥐의 간, 피부 및 근조직과 같은 선택된 기관들은 인비보로 충돌되었다(Yang et al, 1990; Zelenin et al, 1991). 총과 표적 기관 사이에 있는 임의의 조직을 제거하기 위해서, 조직 또는 세포의 외과적 노출, 즉, 엑스비보 처리가 필요하다. 다시, 특정 유전자를 암호화하는 DNA는 이 방법을 통해 전달될 수 있고 여전히 본 발명에 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, 발현 구조물은 리포솜에 갇힐 것이다. 리포솜들은 인지질 이중층막과 내부 수성 매질을 특징으로 하는 소낭 구조물들이다. 다중라멜라 리포솜들은 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질층들을 가진다. 다중지질층은 인지질이 과량의 수용액에 현탁될 때 자연스럽게 형성된다. 지질 성분들은 밀폐된 구조들의 형성 전에 자가-재배열이 일어나서 물과 지질 이중층들 사이에 용해된 용질을 가둔다(Ghosh and Bachhawat, 1991). 또한 리포펙타민-DNA 복합체들이 고려된다.
인비트로에서 외래 DNA의 리포솜-매개 핵산 전달 및 발현은 매우 성공적이었다. 왕 등(1980)은 배양된 병아리 배아, HeLa 및 간세포암 세포에서 외래 DNA의 리포솜-매개 전달 및 발현의 가능성을 증명하였다. 니콜라우 등(1987)은 정맥 주사 후 쥐에서 성공적인 리포솜-매개 유전자 전달을 수행하였다.
본 발명의 특정 실시예들에서, 리포솜은 적혈구 응집 바이러스(HVJ)와 복합체를 형성할 수 있다. 이것이 세포막과의 융합을 용이하게 하고 리포솜-캡슐화된 DNA의 세포 출입을 향상시키는 것으로 나타났다(Kaneda et al, 1989). 다른 실시예에서, 리포솜은 복합체화되거나 핵 비-히스톤 염색체 단백질(HMG-1)과 함께 사용될 수 있다(Kato et al, 1991). 이런 발현 구조물들이 인비트로 및 인비보 핵산의 전달과 발현에 성공적으로 사용되었다는 점에서, 이들은 본 발명에 사용될 수 있다. 박테리아 프로모터가 DNA 구조물에 사용되는 경우, 리포솜 내에 적절한 박테리아 폴리머라제를 포함하는 것이 바람직할 것이다.
특정 유전자를 암호화하는 핵산을 세포들 속에 전달하기 위해 사용될 수 있는 다른 발현 구조물들은 수용체-매개 전달 운반체들이다. 이들은 거의 모든 진핵 세포들에서 수용체-매개 내포작용에 의해 거대분자들을 선택적으로 섭취하는 장점을 가진다. 다양한 바이러스들의 세포 형태-특이적 분포 때문에, 전달은 매우 특이적일 수 있다(Wu and Wu, 1993).
수용체-매개 유전자 표적 운반체들은 일반적으로 두 성분으로 이루어진다: 세포 수용체-특이적 리간드 및 DNA-결합 물질. 여러 리간드가 수용체-매개 유전자 전달에 사용되었다. 가장 광범위하게 특징화된 리간드들은 아시알루로소뮤코이드(ASOR)(Wu and Wu, 1987) 및 트랜스페린(Wagner et al, 1990)이다. 최근에, ASOR와 같은 동일한 수용체를 인식하는 합성 네오글리콜프로틴은 유전자 전달 운반체로 사용되었고(Ferkol et al, 1993; Perales et al, 1994) 표피 성장 인자(EGF)는 유전자들을 편평세포암종에 전달하는데 사용되었다(Myers, EPO 0273085).
다른 실시예들에서, 전달 운반체는 리간드와 리포솜을 포함할 수 있다. 예를 들어, 니콜라우 등(1987)은 리포솜 속에 포함된 락토실-세라마이드, 갈락토스-말단 아시알간글리오시드(galactose-terminal asialganglioside)를 사용하였고 간세포들에 의한 인슐린 유전자의 섭취의 증가를 관찰하였다. 따라서, 특정 유전자를 암호화하는 핵산은 리포솜이 있거나 없는 많은 수용체-리간드 시스템에 의해 세포 타입 속에 특이적으로 전달될 수 있다는 것이 가능하다. 예를 들어, 내피 성장 인자(EGF)는 EGF 수용체의 상승조절을 나타내는 세포들 속으로 핵산의 매개 전달을 위한 수용체로 사용될 수 있다. 만노스는 간 세포들에 대해 만노스 수용체를 표적화하는데 사용될 수 있다. 또한, CD5(CLL), CD22(림프종), CD25(T-세포 백혈병) 및 MAA(흑색종)에 대한 항체들은 표적화제들(targeting moieties)로 유사하게 사용될 수 있다.
특정 예들에서, 올리고뉴클레오티드는 양이온 지질과 함께 투여될 수 있다. 양이온 지질들의 예들은 리포펙틴, DOTMA, DOPE 및 DOTAP를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 참조로 본 발명에 포함된 WO0071096의 공보는 DOTAP와 같은 다른 제제: 유전자 치료에 효과적으로 사용될 수 있는 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체 제제를 개시한다. 또한 다른 공개공보는 나노입자들을 포함하는 다른 지질 또는 리포솜 제제 및 투여 방법을 논의한다; 다른 공개공보들은 미국특허공보 20040203865, 20020150626 및 20040048787을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 제제와 핵산들의 투여와 전달의 다른 태양을 개시한다. 입자들을 형성하기 위해 사용된 방법들은 미국특허 5,844,107, 5,877,302, 6,008,336, 6,077,835, 5,972,901, 6,200,801 및 5,972,900에 개시되며, 이런 태양들을 위한 참조로 포함된다.
특정 실시예들에서, 유전자 전달은 엑스비보 조건하에서 더욱 쉽게 수행될 수 있다. 엑스비보 유전자 치료는 동물로부터 세포들을 분리하고, 핵산을 인비트로 세포들에 전달하고 변형된 세포들을 다시 동물에 되돌려주는 것을 의미한다. 이것은 동물의 조직/기관의 외과적 제거 또는 세포 및 조직의 초대 배양을 포함한다.
VIII . 형질전환 생쥐 제조 방법
본 발명의 특정 실시예는 하나 또는 두 기능성 miR-208 대립 유전자가 없는 형질전환 동물들을 제공한다. 또한, 유도가능한, 조직 선택성 또는 구성 프로모터의 제어하에서 miR-208을 발현하는 형질전환 동물들, 이런 동물들로부터 유도된 재조합 세포주들, 및 형질전환 배아들은 miR-208이 심근 세포들의 발달과 분화 및 병적 심장 비대와 심부전의 발달에 관여하는 정확한 역할을 판단하는데 효과적일 수 있다. 또한, 이런 형질전환 동물들은 심장 발달에 통찰력을 제공할 수 있다. 항상적으로 발현된(constitutively expressed) miR-208 암호화 핵산의 사용은 오버 또는 비제어 발현에 대한 모델을 제공한다. 또한, 한 또는 두 대립유전자에 대해 "녹아웃"된 형질전환 동물들이 고려된다.
일반적인 태양에서, 형질전환 동물은 변형유전자의 발현을 허용하는 방식으로 소정의 변형유전자를 게놈에 통합함으로써 생산된다. 형질전환 동물들을 생산하는 방법들은 일반적으로 와그너 및 호페(미국특허 4,873,191; 참조로 본 발명에 포함) 및 브린스터 등(1985; 참조로 본 발명에 포함)에 의해 개시된다.
통상적으로, 게놈 서열들에 인접한 유전자는 수정 난자 속으로 미세 주사에 의해 운반된다. 미세 주사된 난자들은 숙주 암컷에게 이식되고 자손들은 변형유전자의 발현에 대해 스크리닝된다. 형질전환 동물들은 파충류, 양서류, 조류, 포유류 및 어류를 포함하나 이에 제한되지 않는 여러 동물의 수정 난자로부터 생산될 수 있다.
미세 주사를 위한 DNA 클론들은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 미세 주사를 위한 DNA 클론들은 박테리아 플라스미드 서열들을 제거하는데 적합한 효소들로 절단될 수 있고, DNA 단편들은 표준 기술을 사용하여 TBE 버퍼 속에서 1% 아가로스겔 상에서 전기이동되었다. DNA 밴드들은 브롬 에티듐으로 염색하여 가시화되고 발현 서열들을 포함하는 밴드는 절단된다. 절단된 밴드를 0.3M 아세트산 나트륨, pH 7.0을 함유하는 투석 가방에 놓는다. DNA는 투석 가방 속으로 전기 용출되고, 1:1 페놀:클로로폼 용액으로 추출하고 2 부피의 에탄올로 침전한다. DNA를 1ml의 낮은 염 버퍼(0.2M NaCl, 20mM Tris, pH 7.4 및 1mM EDTA)에 재용해하고 Elutip-DTM 컬럼 위에서 정제하였다. 컬럼을 먼저 3ml의 고 염 버퍼(1M NaCl, 20 mM Tris, pH 7.4, 및 1 mM EDTA)로 채우고 5ml의 저 염 버퍼로 세척한다. DNA 용액들을 컬럼을 3회 통과시켜 DNA를 컬럼 매트릭스에 결합시킨다. 3ml의 저 염 버퍼로 한 번 세척한 후, DNA를 0.4ml 고 염 버퍼로 용출하고 2 부피의 에탄올로 침전시켰다. DNA 농도는 UV 분광광도계에서 260nm에서 흡수하여 측정하였다. 미세 주사를 위해서, DNA 농도는 5mM Tris에서 3㎍/ml, pH 7.4 및 0.1mM EDTA로 조절한다. 미세 주사를 위한 DNA의 정제를 위한 다른 방법들은 팔미터 등(1982) 및 샘브룩 등(2001)에 개시된다.
예시적 미세 주사 방법에서, 6주 된 암컷 생쥐들에 임신한 암말 혈청 고나도트로핀(PMASG; 시그마)의 5 IU 주사(0.1 cc, ip)하고 48시간 후 인간 융모성 성선자극호르몬(hCG; 시그마)의 5 IU 주사(0.1 cc, ip)하여 과잉배란을 유도하였다. 암컷들을 hCG 주사 직후 수컷들과 놓았다. hCG 주사 21 시간 후, 짝짓기한 암컷들을 CO2 질식 또는 경추 탈골로 죽이고 배아들을 절단된 난관에서 회수하고 0.5% 소 혈청 알부민(BSA; 시그마)를 가진 듈베코 인산 버퍼 함염물에 놓았다. 주위 난구세포들을 히알루론산 분해효소(1mg/ml)로 제거하였다. 그런 후에 전핵 배아들을 세척하고 37.5℃ 배양기에서 0.5% BSA 함유하는 어렐스 평형염액에 놓고 주입 때까지 습도 분위기를 5% CO2, 95% 공기로 하였다. 배아들은 두-세포 단계에서 이식될 수 있다.
무작위로 순환시킨 어른 암컷 생쥐를 정관절제된 수컷들과 짝을 지었다. C57BL/6 또는 스위스 생쥐 또는 다른 필적할만한 품종들이 이 목적을 위해 사용될 수 있다. 수취 암컷들을 도너 암컷들과 동시에 짝짓기하였다. 배아 전달시에, 수취 암컷들은 체중의 그램당 2.5% 아버틴의 0.015ml의 복강 주사로 마취시켰다. 난관들을 단일 중심 배면 절개로 노출시켰다. 그런 후에 난관 바로 위 체벽을 통해 절개하였다. 난소낭을 외과용 핀셋으로 찢었다. 운반될 배아들을 DPBS(듈베코 인산 버퍼 함염물) 및 전달 피펫(약 10 내지 12 배아들)의 선단에 놓았다. 피펫 선단을 누두부 속에 삽입하고 배아들을 운반하였다. 운반 후에, 벤 자국은 2번 봉합으로 봉했다.
IX . 정의
본 발명에서 사용된, "심부전"이란 용어는 심장이 혈액을 내보내는 능력을 감소시키는 어떠한 상태를 의미하는데 넓게 사용된다. 그 결과, 울혈과 부종이 조직에 생긴다. 가장 빈번하게, 심부전은 관상 동맥 혈류가 감소함으로써 심근의 수축성이 감소하기 때문에 일어난다; 그러나, 심장 판막 손상, 비타민 결핍 및원발성 심근 질환을 포함하는 많은 다른 인자들이 심부전을 일으킬 수 있다. 심부전의 정확한 생리적 메커니즘이 완전히 이해되지 않았지만, 심부전은 일반적으로, 교감신경, 부교감신경 및 압수용기 반응을 포함하는 여러 심장 자율 신경특성의 이상을 포함한다고 생각된다. "심부전의 징후"라는 문장은 숨가쁨, 함몰수종, 커진 약한 간(enlarged tender liver), 경정맥 울혈, 폐 수포음 및 심부전과 관련된 실험 발견들을 포함하는 것들과 같은 심부전과 관련된 모든 후유증을 포함하는데 넓게 사용된다.
"치료" 또는 동의어는 심부전의 증상의 개선 및/또는 역전을 포함한다(즉, 혈액을 내보내는 심장의 능력). 심장의 "생리 기능의 개선"은 본 발명에 개시된 측정들(예를 들어, 심박출계수의, 분획단축율, 좌심실 내용적, 심장 박동 등의 측정) 중 임의의 것뿐만 아니라 동물의 생존에 대한 임의의 효과를 사용하여 평가될 수 있다. 동물 모델의 사용시에, 치료된 형질전환 동물들과 치료되지 않은 형질전환 동물들의 반응은 본 발명에서 개시한 분석법들 중 임의의 것을 사용하여 비교한다(또한, 치료된 및 치료되지 않은 비-형질전환 동물들은 대조군들로서 포함된다). 본 발명의 스크리닝 방법에서 사용된 심부전과 관련된 임의의 변수를 개선하는 화합물은 치료 화합물로 동정할 수 있다.
"확장성 심근병증"은 약한 심장 수축 작용을 가진 대칭적으로 팽창된 좌심실의 존재를 특징으로 하는 심부전의 종류를 의미하고 자주 우심실과 관련된다.
"화합물"이란 용어는 질환, 불쾌, 병, 신체 기능의 이상을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있는 임의의 화학 물질, 약품, 약물 등을 의미한다. 화합물들은 공지된 치료 화합물들과 잠재적인 치료 화합물들 포함한다. 화합물들은 본 발명의 스크리닝 방법들을 사용하여 스크리닝함으로써 치료효과가 있는 것을 판단할 수 있다. "공지된 치료 화합물"은 (동물 실험 또는 인간에 대한 투여에 의한 이전 경험)이런 치료에 효과가 있는 것으로 증명된 치료 화합물을 의미한다. 다시 말하면, 공지된 치료 화합물은 심부전의 치료에 효과적인 화합물에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용된, "효현제"라는 용어는 "고유" 또는 "천연" 화합물의 작용을 모방하는 분자들 또는 화합물들을 의미한다. 효현제들은 형태, 전하 또는 다른 특성들에 대해 이런 천연 화합물들과 유사할 수 있다. 따라서, 효현제들은 세포 표면들 상에 발현된 수용체들에 의해 인식될 수 있다. 이런 인식은 세포에서 생리적 및/또는 생화학적 변화를 일으킬 수 있고, 그 결과 세포는 천연 화합물이 존재하는 것과 동일한 방식으로 효현제의 존재에 대해 반응한다. 효현제들은 단백질, 핵산, 탄수화물 또는 관심 분자, 수용체 및/또는 경로와 상호작용하는 임의의 다른 분자들을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된, "심장 비대"라는 용어는 성인 심근세포가 비대성 성장을 통한 압력에 반응하는 반응을 의미한다. 이런 성장은 세포 분할 없는 세포 크기 증가, 힘 발생을 최대화하기 위한 세포 내의 추가 근절들의 결합 및 태아 심장 유전자 프로그램의 활성화를 특징으로 한다. 심장 비대는 종종 발병과 사망의 위험 증가와 관련이 있어서 심장 비대의 분자 메커니즘들을 이해하기 위한 연구들은 인간 건강에 중대한 영향을 미칠 수 있다.
본 발명에서 사용된. "길항제" 및 "억제제"라는 용어는 심장 비대에 관여할 수 있는 세포 인자의 작용을 억제하는 분자, 화합물 또는 핵산을 의미한다. 길항제들은 형태, 전하 또는 다른 특성들에 대해 이런 천연 화합물들과 유사하거나 유사하지 않을 수 있다. 따라서, 길항제들은 효현제에 의해 인식되는 동일하거나 다른 수용체들에 의해 인식될 수 있다. 길항제들은 효현제의 작용을 막는 알로스테릭 효과를 가질 수 있다. 선택적으로, 길항제들은 효현제의 기능을 막을 수 있다. 효현제들과 반대로, 길항 화합물들은 세포에서 생리적 및/또는 생화학적 변화를 일으킬 수 없어서, 그 결과 세포는 세포 인자가 존재하는 것과 동일한 방식으로 길항제의 존재에 대해 반응한다. 효현제들과 억제제들은 단백질, 핵산, 탄수화물 또는 관심 분자, 수용체 및/또는 경로와 결합하거나 상호작용하는 임의의 다른 분자들을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된, "조절하다"라는 문장은 생물학적 활성의 변화 또는 변형을 의미한다. 조절은 단백질 활성의 증가 또는 감소, 키나제 활성의 변화, 결합 특성들의 변화 또는 관심 단백질 또는 다른 구조의 활성과 관련된 생물학적, 기능적, 또는 면역학적 특성들의 임의의 다른 변화일 수 있다. "조절제"라는 용어는 상기한 생물학적 활성을 변화 또는 변경할 수 있는 임의의 분자 또는 화합물을 의미한다.
"β-아드레날린성 수용체 길항제"라는 용어는 아드레노 수용체들(즉, 카테촐아민, 특히 노르에피네프린에 반응하는 아드레날린성 시스템의 수용체)의 베타(β) 형태를 부분적으로 또는 완전히 차단할 수 있는 화합물 또는 물질을 의미한다. 일부 β-아드레날린성 수용체 길항제들은 한 수용체 아형(일반적으로 β1)에 대한 특이도를 나타낸다; 이런 길항제들은 "β1-특이적 아드레날린성 수용체 길항제들" 및 "β2-특이적 아드레날린성 수용체 길항제들"로 불린다. "β-아드레날린성 수용체 길항제"라는 용어는 선택적 및 비선택적 길항제들인 화합물들을 의미한다. β-아드레날린성 수용체 길항제의 예들은 아세뷰탄올, 아테놀올, 뷰톡사민, 카테올올, 에스몰올, 라베톨올, 메토프롤올, 나돌올, 펜뷰톨올, 프로파놀올 및 티몰올을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 공지된 β-아드레날린성 수용체 길항제들의 유도체들의 용도는 본 발명의 방법들에 포함된다. β-아드레날린성 수용체 길항제로서 기능적으로 행동하는 임의의 화합물은 본 발명의 방법들에 포함된다.
"안지오텐신-변환 효소 억제제" 또는 "ACE 억제제"라는 용어는 레닌-안지오텐신 시스템에서 상대적으로 불활성인 안지오텐신 I의 활성 안지오텐신 II로의 변한에 관여하는 효소들을 부분적으로 또는 완전히 억제할 수 있는 화합물 또는 물질을 의미한다. 또한, ACE 억제제들은 ACE 억제제들의 고혈압 방지 효과를 현저하게 향상시키는 브래디키닌의 열화를 동시에 억제한다. ACE 억제제의 예들은 베나제프릴, 캡토프릴, 에날로프릴, 포시노프릴, 리시노프릴, 퀴아프릴 및 라미프릴을 포함하나 이에 제한되지 않는다 공지된 ACE 억제제들의 유도체들의 용도는 본 발명의 방법들에 포함된다. ACE 억제제로서 기능적으로 행동하는 임의의 화합물은 본 발명의 방법들에 포함된다.
본 발명에서 사용된 "유전자형"은 유기체의 실제 유전 구성을 의미하고, "표현형"은 개체에 의해 표현된 신체적 특징을 의미한다. 또한, "표현형"은 게놈의 선택적 발현의 결과이다(즉, 이것은 세포 역사의 발현 및 세포외 환경에 대한 반응이다). 인간 게놈은 약 30,000-35,000 유전자들을 함유한다. 각 세포 타입에서, 이런 유전자들의 적은 비율(즉, 10-15%)만 발현된다.
X. 실시예들
다음 실시예들은 본 발명의 다양한 태양들을 추가로 설명하기 위해 포함된다. 당업자는 본 발명자가 발견한 기술들 및/또는 조성물들을 나타내는 실시예들에 개시된 기술들은 본 발명을 실시하는데 잘 작용하며, 따라서 발명의 실시를 위한 바람직한 형태를 구성한다고 생각한다. 그러나, 당업자는 본 발명의 내용의 면에서, 본 발명의 취지와 범위를 벗어나지 않으며 개시된 특정 실시예들에 변화를 줄 수 있고 여전히 유사하거나 같은 결과를 얻을 수 있다는 것을 알아야 한다.
실시예 1 - 물질 및 방법
노던 블럿 분석. 심부전이 없거나 있는 것으로 진단된 익명의 사람들의 좌심실의 심장 조직 샘플들을 길리드 콜로라도(콜로라도, 웨스트미니스터)로부터 얻었다. 트리졸 시약(Gibco/BRL)을 사용하여 생쥐, 쥐 및 인간 심장 조직 샘플들로부터 전체 RNA를 분리하였다. 마이크로RNAs를 탐지하는 노던 블럿은 상기한 대로 수행하였다(1). U6 프로브는 로딩 컨트롤(U6 포워드: 5-GTGCTCGCTTCGGCAGC-3 (SEQ ID NO: 18), U6 리버스: 5- AAAATATGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3 (SEQ ID NO: 19))로 사용된다. αMHC 발현을 탐지하기 위해서, 어른 야생형 및 miR-208 돌연변이 동물의 심장 조직의 10㎍의 RNA를 포함하는 노던 블럿은 5'UTR 영역과 첫 번째 엑손의 일부를 덮는 αMHC의 cDNA 단편으로 탐침하였다.
PTU 치료. 갑상선 호르몬 결핍은 할란 테크라드사(TD 97061)(WI, 메디슨)로부터 구입한 0.15% PTU로 보충한 아이오딘-제거 식사로 지정한 기간 동안 동물들에게 먹임으로써 유도하였다.
마이크로어레이 및 실시간 PCR 분석. 심장 조직의 전체 RNA는 트리졸(인비트로겐)을 사용하여 분리하였다. 마이크로어레이 분석은 쥐 게놈 430 2.0 어레이(아피메트릭)을 사용하여 수행하였다. 랜덤 헥사머 프라이머들(인비트로겐)에 의한 RT-PCR은 RNA 샘플들에 대해 수행하였고, 그 후 유전자들의 서브세트의 발현은 ABI로부터 구입한 태그만 프로브들을 사용하여 정량적 실시간 PCR로 분석하였다.
miR -208 돌연변이 생쥐의 생산. miR-208 표적 벡터를 생산하기 위해서, miR-208 암호화 영역의 상부와 연장된 0.4kb 단편(5'arm)을 SacII와 NotI로 분해하고 loxP 부위 및 Frt-플랭크 네오마이신 카세트의 플라스미드 상부를 표적화하는 pGKneoF2L2dta 속에 결합하였다. 3.3kb 단편(3'arm)을 SalI 및 HindIII로 분해하고 메오마이신 저항 및 Dta 음성 선택 카세트 사이에 벡터를 결합하였다. 분열된 대립유전자를 가진 표적화된 ES-세포들은 5' 및 3' 프로브에 의해 서든 블럿 분석으로 동정하였다. 3개 miR-208 표적화된 ES 클론들을 동정하고 배반포 주입에 사용하였다. 결과로 얻은 키메릭 생쥐들은 돌연변이 대립유전자의 생식선 전달을 위해 C57BL/6로 번식시켰다. PCR 프라이머 서열들은 신청하는 대로 구입할 수 있다.
웨스턴 블러팅 . 마이오신을 상기한 대로 심장 조직으로부터 추출하였다(모르킨, 2000). MHC 동질체를 SDS PAGE로 분리하고 생쥐 단클론 αMHC(BA-G5)(ATCC, MD, 록빌)와 βMHC에 매우 특이적인 생쥐 단클론 안티마이오신(느린, 골격 M8421)(MO, 시그마)으로 웨스턴 블러팅을 수행하였다. 모든 횡 마이오신을 탐지하기 위해 팬 특이적 항체(생쥐 단클론 3-48; Accurate Chemical & Scientific Corporation, NY)를 사용하였다. THRAP1을 400㎍의 심장 단백질 용해물로 면역침전에 의해 탐지하였다. 샘플들을 1시간 동안 4℃에서 선-세척 후, 상청액을 1㎕ 토끼 다클론 항-THRAP1(a kind gift of R. Roeder, Rockefeller University)과 15㎕의 단백질 A 비드들로 4℃에서 하루 동안 배양하였다. 비드들을 용해 버퍼로 3회 세척하고 SDS 샘플 버퍼에서 끓였다. 면역침전된 THRAP1 단백질을 SDS-PAGE로 분해하고 1:3000의 희석으로 토끼 다클론 항-THRAP1 및 루미놀 시약(산타 크루즈)에 의한 탐지로 1:5000의 희석에서 호오스레디쉬 퍼록시다아제에 접합된 항-토끼 IgG를 사용하여 분석하였다.
해부학적 분석 및 RNA 원위치 잡종화. 해부학에 사용된 조직들을 크렙-헨셀에이트 용액에 배양하고, 4% 파라포름알데하이드에 고정하고, 절단하고, 표준기술로 헤마톡실린과 에오신(H&E) 및 마슨 트라이크롬 염색 또는 원위치 잡종화를 수행하였다(Krenz and Robbins, 2004). 35S-레이블드 RNA 프로브를 맥시스크립트 키트(아머샴)를 사용하여 만들었다. 신호들을 아도브 포토샵을 사용하여 빨간색으로 가상채색하였다.
경흉부 심초음파 검사. 심장 기능과 심장 크기는 빙메드 시스템(노르웨이, 호르텐, GE 빙메드 울트라사운드)과 11.5-MHz 선형 배열 변환기를 사용하여 의식 있는 생쥐에서 2차원 심장초음파검사로 측정하였다. M-형 조영은 말기 심이완 및 말기 심수축에서 앞면 및 뒷면 두께를 측정하는데 사용하였다. 좌심실(LV) 내부 지름(LVID)은 심이완(LVIDd) 또는 심수축(LVIDs)에서 최대 전후 직경으로 측정하였다. 데이터를 생쥐 유전자형을 모르는 한 관찰자가 분석하였다. 좌심실분획단축(FS)는 다음 식: FS (%) = [(LVIDd - LVIDs)/LVIDd] x 100에 따라 계산하였다.
형질전환 생쥐들의 생산. 관심 miRNA에 인접한 생쥐 게놈 단편을 α-MHC 및 인간 GH 폴리(A)+시그널을 포함하는 심장 특이적 발현 플라스미드 속에 하위복제하였다(Kiriazis and Kranias, 2000). 게놈 DNA는 생쥐 꼬리 생체 검사로 분리하였고 인간 GH 폴리(A)+시그널에 대해 특이적인 프라이머들을 사용하는 PCR에 의해 분석하였다.
플라스미드 및 트랜스펙션 분석법. miR-208 암호화 영역을 포함하는 305bp 게놈 단편을 PCR로 증폭하고 pCMV6 속에 결합시켰다. 전체 설치류 THRAP-1UTR을 포함하는 1kb 단편은 PCR-증폭되고 HA-태그 pCMV6 발현 구조물 및 개똥벌레 루시페라제(f-luc) 리포터 구조물(pMIR-REPORTTM, Ambion) 속에 결합하였다. UCGUCUUA miR-208 씨드 결합 서열의 돌연변이는 PCR-기반 돌연변이를 통해 만들었다.
실시예 2 - 결과
miR -208은 심장 수축 기능에서 중심 조절자이다. 인트론 마이크로RNAs들은 숙주 유전자 전사물의 일부로 전사되고, 연결되어 성숙한 miRNA 속으로 처리된다. MiR-208은 α-MHC의 27번째 인트론 내에 위치한다. 도 1. α-MHC와 같이, miR-208은 단지 심장에서만 발현된다. 산후 갑상선 호르몬은 α-MHC의 합성을 자극하고 β-MHC의 발현을 억제함으로써 심실 마이오신 이소엔자임의 발현을 제어한다. 갑상선 호르몬 신호의 차단이 miRNA 208 발현에 영향을 미치는 지를 실험하기 위해, 본 발명자들은 정해진 시간 동안 프로필티오우라실(PTU)에 노출된 심장 쥐 샘플을 사용하였다. PTU는 요오드의 "유기화" - 요오드의 T3 및 T4 속의 포함을 억제함으로써 갑상선 호르몬 생합성을 차단하여 α-MHC의 발현을 억제하고 β-MHC 발현을 증가시킨다. 노던 블럿 분석은 α-MHC의 발현 레벨과 pre-miRNA, 소위 "스템루프(stemloop)"의 레벨 사이의 완전한 상관관계를 나타내는 반면, 성숙한 miRNA는 그 이후 수주 동안 존재하여 남아있었다. 도 3. 3a-c 및 도. 4a-c.
miR-208의 역할을 연구하기 위해서, 본 발명자는 miR-208 결손 생쥐(null mice)를 가공하였다. 도. 5. 비록 이것이 α-MHC 전사 또는 번역을 방해하지 않을지라도, 2달 된 야생형 및 miR-208 KO 생쥐의 심장 조직에 대한 마이크로어레이 분석은 miR-208의 제거는 빠른 골격근 유전자들의 강한 유도를 일으킨다는 것을 나타내었다. 도 6a-b, 도 7.
심장 동안 miR-208 제거의 효과를 검사하기 위해, 본 발명자들은 야생형 및 miR-208 KO 동물들을 횡 대동맥 밴드 수축(TAB)시켰다. TAB는 심징 비대 및 부수하는 비대 유전자 발현의 잠재적 유발자이다. 야생형 동물들이 β-MHC 발현에 증가를 보이는 반면, KO 동물들은 이런 유도를 나타내지 못했다. 도 8.
TAB 3주 후 KO vs WT
유전자 TAB후 야생형과
비교된 폴드 변경
심장 트로포닌 I, 빠른 골격 194.0X 상승조절
심장 트로포닌 T3, 빠른 골격 194.0X 상승조절
MLC, 빠른 골격 3.7X 상승조절
α 골격 액틴 2.8X 상승조절
βMHC 29.8S 하강조절
이런 데이터는 α-MHC 유전자의 발현은 빠른 골격근 유전자 프로그램의 발현을 하강조절하는 miRNA의 발현을 추가로 유도한다. miR-208은 α-MHC 유전자 속에 삽입되고, α-MHC 유전자는 발달, 생리, 및 발달 신호에 의해 제어된다. α-MHC는 빠른 수축의 결정 요인이다. miR-208은 심장에서 빠른 골격근 유전자들을 억제하여, 이의 결실이 빠른 골격근 유전자 발현에 현저한 증가를 일으킨다(도 13). miR-208은 심장에서 β-MHC를 상승조절하는데 필요하다. 마이크로RNAs가 억제제로서 작용하기 때문에, miR-208은 도 9에 도시된 대로 β-MHC 발현의 억제제를 억제한다고 주장된다. 심장 부하 동안, miRNA는 RNA와 단백질의 레벨 모두에서, β-MHC 발현의 유도에 원인이 되며, miR-208의 부존재 시, 이런 유도는 완전히 일어나지 않고 α-MHC은 유일한 마이오신 중사슬 동질체로 존재한다. 심부전 및 심부전이 아닌 인간 심장 샘플들에서 α-MHC 발현을 분석하면 심부전 심장에서 α-MHC 발현은 심부전이 아닌 심장에서 α-MHC 발현과 비교해서 감소한다(도 10). 이런 데이터는 miR-208이 심장 수축 기능에서 중요 제어자이고 심장 질환이 있는 동안 불량한 마이오신 교환에 관여하는 것으로 보인다.
miRNA 표적들의 동정을 위해서 (메모리얼 슬로안-케터링 암 센터에 있는 컴퓨테이셔널 바이올러지 센터에서 구입가능한) miRanda 소프트웨어와 PicTar 알고리즘을 사용하면(Krek et al, 2005), 갑상선 호르몬 수용체 관련 단백질 1(THRAP 1)은 miR-208을 위한 예상 표적으로 동정된다. 도 12는 인간, 침팬지, 생쥐, 쥐, 개, 닭, 복어 및 제브라피쉬의 THARP1 3'UTR 서열들을 가진 miR-208의 배열을 나타낸다.
miR-208은 병적 심장 재형성을 조절한다. miR-208 결실에 동형접합적인 생쥐들은 생존가능성이 있고 20주까지 심장의 크기, 모양 또는 구조에 눈에 띄는 이상이 나타나지 않는다. miR-208의 잠재적 기능들을 더 연구하기 위해서, 본 발명자들은 심장에 후부하(afterload)를 증가시켜 심장 비대를 오도하고 α-MHC의 하강 조절과 β-MHC의 상승 조절을 동반하는 흉부 대동맥 밴딩(TAB)에 대한 야생형 및 miR-208 돌연변이 생쥐의 반응을 비교하였다(Hill et al, 2000). α-MHC mRNA 발현은 TAB 이후에 예상한 대로 감소하였으나(도 14a), miR-208은 이의 비교적 긴 반감기와 일치하게 TAB 21일 후(도 14b) 여전히 충분히 발현되었다.
TAB에 반응해서, 야생형 생쥐는 심근 세포들의 비대 성장과 좌심실 섬유증에 의해 수반된 심장 중량의 현저한 증가를 보여주었다(도 15a). 반대로, miR-208 돌연변이 동물들은 TAB에 반응해서 심근 세포들의 비대 또는 섬유증을 실질적으로 나타내지 않았다(도 15a). 심초음파검사는 miR-208-/- 동물들은 무딘 비대 반응과 수축성의 감소를 나타내었다(도 14c). 가장 현저한 것은 βMHC를 상승 조절하는 돌연변이 동물들의 불활성화였다. 대신에, αMHC 단백질 발현은 TAB에 반응해서 miR-208 돌연변이 심장들에서 증가하였고, 이것은 βMHC 상승 조절의 비존재하에서 MHC 발현을 유지하는 보상 기전을 나타낼 수 있다. 나트륨 배설촉진 펩티드 ANF 및 BNP와 같은 다른 부하 반응 유전자들은 miR-208 돌연변이 동물들에서 강하게 유도되었다(도 15b-c). 야생형 및 miR-208-/- 동물들의 심장들에 대한 마이크로어레이 분석은 miR-208의 부존재는 βMHC 발현에 대한 매우 특이적인 방해를 일으킨다는 것을 확인하였다(표 4-5).
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miR-208-/- 생쥐들은 심장 비대와 심부전에 대한 특히 강한 자극물질인 활성화된 칼시네우린의 형질전환 발현에 반응하는 섬유증 및 심근 세포 비대에 저항력이 잇었다(도 15d). 유사하게, β MHC mRNA와 단백질은 miR-208-/-; 6주된 CnA-Tg 생쥐는 의 심장들에 상승조절되는 것이 실패한 반면에, ANF 및 BNP는 강하게 유도되었다(도 15e-f). 따라서, miR-208은 β MHC의 상승 조절과 세포 재형성에 필수적이나 심장 부하의 다른 마커들의 발현을 위해서는 필수적이지 않다.
miR-208이 β MHC 발현의 상승 조절에 충분한 지를 검사하기 위해서, 본 발명자들은 α MHC 프로모터의 제어하에서 miR-208을 과-발현하는 형질전환 생쥐들을 만들었다. α MHC - miR -208 형질전환 생쥐들은 생존가능하였고 야생형 심장들의 레벨보다 ~ 3배 레벨에서 miR-208을 발현하였다(도 14d). 형질전환의 평균 과발현을 나타내는 형질전환 라인의 심장들은 2달 후 병리학적 재형성의 명백한 신호를 보이지 않았으나, β MHC 발현의 급격한 상승 조절을 현저하게 나타내었다(도 15g 및 도 14e). miR-208의 이런 활성은 특이적인데, 이는 심장 비대 동안 유도되는 miR-214의 형질전환 과발현이 β MHC 발현에 대한 효과가 없기 때문이다. 어른 생쥐 심장에서 miR-208의 내인성 레벨(endogenous level)이 β MHC 발현을 상승 조절하는데 불충분하다는 것을 고려했을 때, 이런 형질전환 생쥐에서 miR-208 발현의 3배 증가가 βMHC 발현의 상승 조절을 일으킨다는 사실은 이런 마이크로RNA에 의한 β MHC 발현의 제어를 위한 급격한 경계가 있다는 것을 나타낸다.
MiR-208은 βMHC 의 T3-의존형 억제를 조절한다. T3 시그널링은 T3 반응 요소(TRE)를 통해 αMHC 전사를 유도하는 반면, βMHC 유전자의 프로모터에서 음성 TRE는 전사 억제를 매개한다(Ojamaa et al, 2000). miR-208이 β MHC의 T3-의존 제어에 필요한 지를 검사하기 위해서, 돌연변이 및 야생형 한배 새끼들에 2주 동안 PTU-함유 식사를 먹여 T3 시그널링을 차단하였다. 노던 블럿 분석으로 miR-208은 PTU 처리의 2주 후 현저하게 존재한다는 것을 확인하였다(도 16a). 예상대로, PTU는 심장 속도와 수축성을 감소시키고 팽창을 증가시켰고, 야생형과 돌연변이 동물들 사이에 큰 차이들이 없었다(도 16b). 그러나, 야생형 동물들은 PTU에 반응하여 α- MHC에서 예상된 감소 및 β MHC에서 예상된 증가를 보여주었고, 비록 β MHC 발현의 흔적을 탐지하였더라도, miR-208-/- 동물들은 β MHC의 상승 조절에 저항력이 있는 것으로 보였다(도 17a-b). ANF 및 BNP는 miR-208-/- 동물들에서 PTU에 의해 상승 조절되었고, β MHC 발현에서 miR-208의 특이적 역할을 확인하였다(도 16c). PTU가 갑상성 호르몬 수용체(TR) 시그널링만을 방해함으로써 α- 내지 βMHC 동질체 교환을 유도하기 때문에, 이런 발견들은 miR-208은 TR을 포함하는 메커니즘을 통해 βMHC 발현을 가능하게 한다는 것을 나타낸다.
MiR -208은 TR 관련 단백질 1을 표적화 한다. miR-208의 비교적 적은 예상 표적들 중에서, TRAP240으로 알려진 갑상선 호르몬 수용체 관련 단백질 1(THRAP1)을 암호화하는 mRNA는 PicTar 표적 예상 프로그램으로 가장 강한 예상 표적으로 점수를 얻었다(Krek et al, 2005). THRAP1, TR-관련된 TRAP 복합체의 성분은 RNA 폴라머라제 II의 보충과 일반적 개시 인자들에 의해 TR의 활성을 조절한다(Ito and Roeder, 2001). TNRAP1 mRNA의 3'UTR에서 추정 miR-208 결합 부위는 진화적 보존뿐만 아니라 miRNA 표적화의 가장 중요한 결정인자인 miR-208의 5'arm과 높은 상보성을 보여주었다(도 18a). miR-208과 THRAP1 3'-UTR 서열의 불완전한 상보성을 기초로 하면, miR-208은 THRAP1의 번역을 억제하는 것으로 예상될 수 있다.
THRAP1 3'-UTR 서열에서 추정 miR-208 표적 서열이 전사 억제를 매개할 수 있는 지를 검사하기 위해서, 본 발명자들은 THRAP1 전사물의 전장 3'-UTR을 루시페라제 발현 플라스미드 속에 삽입하였고, 플라스미드를 COS1 세포들 속에 트랜스펙트하였다. CMV-유도 miR-208의 증가한 양은 루시페라제 활성의 복용량-의존성 감소를 일으키는 반면, 대조군으로서, miR-216의 필적할 양은 효과가 없었다(도 18b). CMV-miR 208은 THRAP1 3'UTR 결합 서열에 연결된 HA-태그 말론일 CoA 데카복실라제(MCD) 발현 카세트의 번역을 복용량 의존적으로 폐기하였으나, 돌연변이 miR-208 표적 서열은 아니었다(도 18c). 또한, THRAP1 단백질 발현은 야생형 한배 새끼와 비교한 miR-208-/-로부터 심장 단백질 용해물들에서 증가한 반면, THRAP1 mRNA는 2개 유전자형의 심장에서 필적하였고(도 19), miR-208은 인비보 THRAP1 번역의 음성 조절자로서 작용한다는 결론과 일치하였다. 부하의 상황하에서, THRAP1 단백질 발현에 대한 miR-208의 부정적 영향은 부하는 아르고나트에 의해 miRNAs의 관련성을 향상시킴으로써 miRNAs의 억제 작용을 증가시킨다는 최근 연구들에 비추어서, 더욱 커질 수 있다(Leung et al, 2006).
miR-208은 miR-499의 발현에 필요하다. 심장에서 miR-208의 작용의 메커니즘을 더 연구하기 위해서, 본 발명자들은 야생형 및 miR-208 널 생쥐의 심장들에서 마이크로RNA 발현 패턴을 마이크로어레이 분석으로 정했다. 돌연변이 심장들에서 상승 및 하강 조절된 여러 마이크로RNAs 중에서, 본 발명자들은 miR-499가 정상 심장들에서 매우 풍부하였으나, miR-208 돌연변이들에서 백그라운드 레벨(background level) 이상으로 발현되지 않았다는 것을 발견하였다. 이런 발견들은 노던 블럿으로 확인하였다(도 21).
miR-499 유전자의 게놈 위치의 분석은 Myh7b 유전자, 알파-Mhc 유전자의 동족체의 20th 인트론 내에 포함되는 것을 보여주었다. Myh7b 유전자는 척추 동물에서 보존되고 단지 심장과 느린 골격근(가자미근)에서만 발현된다(도 23). 또한, miR-499는 심장 비대 동안 하강 조절된다(도 24).
MEF2 는 심장과 골격근에서 miR -499 발현을 조절한다. Myh7 유전자의 5' 플랭킹 여역 내에서, 본 발명자들은 종들에 걸쳐 보존된 잠재적인 MEF2 보존 서열을 동정하였다. 이 서열은 겔 이동성 변화 분석법에서 MEF2와 열심히 결합하였고, 이런 서열의 돌연변이는 형질전환 생쥐에서 lacZ 리포터의 발현을 폐지하였다. MEF2 부위는 MEF2에 의한 골격근 유전자 발현을 일으키는 bHLH 단백질들의 MyoD 집단의 일원들을 위한 결합 부위로 작용하는 보존된 E-박스 서열(CANNTG)에 나란히 놓였다. 편재하는 bHLH 단백질 E12와 함께 MyoD는 프로모터로부터 E-박스를 결합하였다. 이런 서열의 돌연변이는 골격근에서 lacZ 변형유전자의 발현을 예방하나 심장에서의 발현에 영향을 미치지 않았다.
표적 ID . 이곳에 보고된 데이터는 Mhy7b 유전자의 MEF2-조절 발현은 느린 근육과 빠른 골격근 유전자 프로그램의 발현을 하강 조절하는 심장 특이적 miRNA의 발현을 부가적으로 유도한다는 것을 나타내었다. 이런 데이터는 골격근 섬유 타입에서 중심 조절자로서 miRNA 499에 대한 증거를 제공한다.
MiR-208은 miR-499와 매우 상동적이고, 두 마이크로RNAs은 Mhc 유전자들의 인트론들에 의해 암호화된다는 주목할 만한 사실은 이들이 공통의 조절 메커니즘을 공유한다는 것을 나타낸다. miRNAs는 서열 특이적 방식으로 유전자 발현에 영향을 미치기 때문에, 높은 정도의 상동 관계는 miR-208과 miR-499가 표적 유전자들에서 오버랩에 의해 필적할 만한 기능들을 나타낼 수 있게 한다. 본 발명자들은 miR-499의 표적들로서 작용하는 것으로 보이는 Mhc 발현의 전사 조절자를 동정하였다. 이들은 miR-499 발현은 심장에서 miR-208에 의해 제어되어, miR-208의 녹다운이 miR-499 발현을 제거한다는 것을 보여주었다.
본 발명자들의 이전 데이터가 miR-208의 유전적 파괴는 심장에서 특이적으로 빠른 골격근 유전자들의 강한 유도를 일으킨다는 것을 나타내기 때문에, miR-499는 골격근에서 필적할 만한 기능을 가지고 섬유 타입의 지배적 조절자로서 작용할 수 있다. 이런 가정과 일치해서, 이 전사물의 프로모터 분석은 miR-499의 발현과 이의 숙주 전사물은 근육성 전사 인자 MEF2, 골격근 섬유 타입의 중심 조절자 및 느린 섬유 유전자 발현에 의해 조절된다는 것을 나타낸다. 본 발명자들은 MEF2 활성이 근 지구력을 향상시키고 장기간 운동 후 근육 피로를 예방한다는 것을 증명하였다. 따라서, 본 발명자들은 MEF2의 작용들은 적어도 부분적으로 miR-499 발현의 직접 활성화에 의존한다고 주장한다(도 25).
이런 데이터는 Mhy7b 유전자의 MEF2-조절 발현은 느린 근육과 빠른 골격근 유전자 프로그램의 발현을 하강 조절하는 심장 특이적 miRNA의 발현을 부가적으로 유도한다는 것을 나타내었다. 상기 데이터는 골격근 섬유 타입에서 중심 조절자로서 miRNA 499에 대한 증거를 제공한다. miR-208 및-499는 매우 상동적이고 Mhc 유전자들의 인트론에 의해 암호화된다는 주목할 만한 사실은 이들이 공통의 조절 메커니즘을 공유한다는 것을 나타낸다. miRNAs가 서열 특이적 방식으로 유전자 발현에 부정적인 영향을 미치기 때문에, 높은 정도의 상동 관계는 miR-208과 miR-499가 표적 유전자들에서 오버랩에 의해 필적할 만한 기능들을 나타낼 수 있게 한다. 본 발명자들은 miR-499의 표적들로서 작용하는 것으로 보이는 Mhc 발현의 전사 조절자를 동정하였다. 이들은 miR-499 발현은 심장에서 miR-208에 의해 제어되어, miR-208의 녹다운이 miR-499 발현을 제거한다는 것을 보여주었다.
부하-반응성 miRNAs 에 의한 심장 비대와 심부전의 조절. 세포성 유전형을 조절하는데 있어서 이들의 관여 면에서, miRNAs는 유전자 발현에 전사적 및 번역적 변화를 유도한다고 알려진 심장부하에 대한 심장의 반응을 조절하는데 중요한 역할을 한다고 가정하였다. 심장 비대에 miRNAs의 잠재적인 관여를 조사하기 위해서, 본 발명자들은, 186개 다른 miRNAs를 나타낸 마이크로어레이를 사용하여, 심장 비대의 2개의 설정된 생쥐 모델에서 사이드-바이-사이드 miRNA 마이크로어레이 분석을 수행하였다(Babak et al, 2004). 심장에 대한 증가된 후 부하에 의한 비대를 유도하는(Hill et al, 2000) 흉부 대동맥 밴딩(TAB)을 받은 생쥐들을 모조 수술된 동물들과 비교하였다. 두 번째 모델에서, 심각하고, 잘 특징화된 형태의 비대를 일으키는(Molkentin et ah, 1998) 심장에서 활성화된 칼시네우린(CnA)을 발현하는 형질전환 생쥐들을 야생형 한배 새끼들과 비교하였다(도 26a). TAB를 받은 생쥐들의 심장들로부터 분리한 RAN는 모조 수술 대조군과 비교된 27 miRANs의 증가된 발현을 보여주었고, CnA Tg 생쥐들은 비-형질전환 한배 새끼 대조군과 비교된 33 miRNAs의 증가된 발현을 보여주었고, 이중 21은 두 모델에서 상승 조절되었다. 유사하게는, TAB와 CnA-유도 비대는 각각 15 및 14 miRNAs의 감소된 발현에 의해 수행되었고, 이의 7 miRNAs는 공통으로 하강 조절되었다(도 26b). 이런 miRNAs의 노던 분석(미공개된 데이터)과 이전의 마이크로어레이 분석((Barad et al, 2004; Sempere et al, 2004; Shingara et al, 2005; Liu et al, 2004)은 이들은 넓은 범위의 조직들에서 발현된다는 것을 나타낸다. 이런 상대적 발현 레벨들, 인간, 쥐 및 생쥐 서열들의 보존, 및 비대 동안 발현의 레벨들을 기초로 하여, 본 발명자들은 11 상승 및 5 하강 조절된 miRNA에 주목하였다(도 26c).
WT 및 CnA Tg 동물들로부터의 심장 RNA의 노던 블럿 분석은 miRs-21, -23, -24, -125b, -195, -199a의 증가된 발현 및 miRs-29, -93, -150 및 -181b의 감소된 발현을 확인하였다(도 26c 및 27). 종합적으로, 이런 데이터는 구별된 miRNAs는 심장 비대 동안 조절되어, 이들이 본 발명의 조절제로서 기능할 수 있다는 가능성을 제공한다.
miR -208에 의한 조절을 위한 하강 조절 표적들로서 miR -29 집단. 본 발명자들은 mirR-208의 작용들을 매개할 수 있는 하부 miRNAs를 동정하기 위해서 야생형 및 miR-208 널 생쥐의 심장들에 대한 miRNA 마이크로어레이를 수행하였다(도 28). 이들은 miR-29 집단의 여러 일원들이 miR-208 널 생쥐에서 상승 조절되었다는 것을 발견하였다(도 29). 표적 예상은 miR-29 집단 일원들은 여러 교원질과 세포외 기질의 다른 성분들을 암호화하는 mRNAs를 표적화하였다는 것을 나타내었다. 따라서, miR-2-8 널 생쥐들에서 miR-29 집단 일원들의 상승조절은 이런 동무들에서 나타난 섬유증에 대한 차단의 원인이 된다(도 31).
요약. miR-29는 병 있는 심장에서 하강 조절되고 교원질과 세포외 기질 단백질을 암호화하는 mRNAs를 표적화한다는 발견은 miR-29의 발현 또는 표적 mRNAs에 대한 이의 관련을 향상시키는 전략들은 병적 심장 재형성과 섬유증의 상태에서 심장에 대해 유익한 효과들을 가질 것이라는 것을 나타낸다. 또한, miR-29 발현 또는 기능의 상승은 간, 폐, 신장 및 기타와 같은 조직들에서 여러 질환들과 관련된 섬유증을 예장할 수 있다. 또한, miR-208이 miR-29 발현을 억제하며 miR-208의 손실이 miR-29 발현을 상승조절한다는 발견은 miR-29가 심장에 대한 miR-208의 작용들의 하부 조절자라는 것을 나타낸다.
실시예 3 - 검토
이런 결과들은 α MHC 유전자의 인트론에 의해 암호화되는 miR-208은 부하-의존성 심장세포 성장과 유전자 발현을 조절한다는 것을 증명한다. miR-208의 부존재하에서, β MHC의 발현은 압력 과부하, 활성화된 칼시네우린 또는 갑상선기능저하증에 반응하여 어른 심장에서 매우 약해지며, 이런 자극들이 β MHC 전사를 유도하는 경로들은 공통의 miR-208-민감 성분을 공유한다는 것을 나타낸다(도 9). 반대로, βMHC 발현은 신생 miR-208-/- 생쥐의 심장들에서 변하지 않아서, miR-208은 β MHC 발현의 부하-의존성 조절을 위한 메커니즘에 특이적으로 관여한다는 것을 나타내었다.
miR-208의 작용의 메커니즘에 대한 근거는 miR-208-/- 심장들과 갑상선기능항진 심장들이 유사하다는 것으로부터 발생하며, 이 둘은 β MHC 발현에 대한 차단, 부하-반응 유전자들의 상승 조절(Wei et al, 2005; Pantos et al, 2006) 및 병리학적 비대 및 섬유증에 대한 보호(Yao and Eghbali, 1992; Chen et al, 2000)를 나타낸다. miR-208-/- 심장들에서 빠른 골격근 유전자들의 상승 조절은 갑상선기능항진 상태에서 빠른 골격근 섬유들의 유도를 모방한다(Vadaszova et al, 2004). T3 시그너링은 산후 심장에서 β MHC 발현을 억제하고, 갑상선기능항진을 일으키는 PTU는 βMHC를 유도한다(Morkin, 2000; Schuyler and Yarbrough, 1990). miR-208-/- 심장들에서 β MHC 발현을 유도하는 PTU의 불활성은 T3 시그널링 경로에서 miR-208와 더 관련이 있다.
이런 결과들은 miR-208은, 적어도 부분적으로, 전사에 긍정적 및 부정적 영향을 미칠 수 있는 TR 보조-조절자 THRAP1의 발현을 억제함으로써 작용한다는 것을 나타낸다(Pavri et al, 2005; Park et al, 2005). TR은 어른 심장에서 β MHC 발현을 억제하기 위해 부정적 TRE를 통해 작용한다(Morkin, 2000). 따라서, miR-208의 부존재하에서 THRAP1 발현의 증가는 miR-208-/- 심장들에서 β MHC 발현에 대한 차단과 일치하는, β MHC 발현에 대한 TR의 억제 활성을 강화시키는 것을 예상될 수 있다. 반대로, 발달하는 동안 α- 및 β MHC 발현의 조절은 T3 시그널링(Morkin, 2000)에 의존하고 miR-208에 영향을 받지 않는다. 포스포람단(PLB) 및 사르코(엔도)플라스믹 레티쿨럼 칼슘((sarco(endo)plasmic reticulum calcium))ATPase(SERAC) 2a 및 글루코스 트랜스포터(GLUT) 4와 같은 다른 TR 표적 유전자들은 miR-208-/- 생쥐들에서 정상적으로 발현되었다는 것을 주목할 만하다(도 20). β MHC 유전자는 특이적 TR 동질체에 반응할 수 있다고 제안되었다(Kinugawa et al., 2001; Mansen et al, 2001; Kinugawa et al, 2001). 아마 THRAP1은 프로모터-특이적 인자들과의 상호작용에 의해 특이적 TR 동질체 또는 선택적으로 TR-의존성 유전자들의 서브세트에 작용한다. miRNAs는 일반적으로 이들의 효과를 나타내기 위해 여러 하부 표적들을 통해 작동하기 때문에, 추가 표적들은 심장 성장과 유전자 발현에 대한 miR-208의 효과들에 영향을 준다.
심장 비대와 심부전 동안 발생하는 것처럼, βMHC 조성물에서 상대적으로 적은 증가는 근원섬유 ATPase 활성과 수축 기능을 감소시킬 수 있다(Abraham et al, 2002). 따라서, miR-208 발현 또는 이의 mRNA 표적들과의 상호작용의 치료적 조작은 βMHC 발현을 억제함으로써 심장 기능을 잠재적으로 향상시킬 수 있다. 심장 부하 반응에 대한 miR-208의 난해한 영향 및 병이 있는 심장에서 여러 miRNAs의 조절을 기초로 하여(van Rooij et al, 2006), 본 발명자들은 miRNAs는 어른 심장 및 다른 기관들의 질환에 대한 기능들과 반응들의 주요 조절자로 증명될 것이라고 예상하였다.
본 발명에서 개시되고 청구된 모든 조성물 및 방법은 본 발명의 내용에 비추어 과도한 실험 없이 실시되고 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물들과 방법들은 바람직한 실시예들로 기술되었지만, 당업자는 본 발명의 개념, 취지 및 범위를 벗어나지 않고 본 발명의 조성물 및 방법, 및 방법들의 단계 또는 단계들의 연속에 변형을 가할 수 있다는 것을 명백히 알 것이다. 더욱 구체적으로, 화학적 및 물리적으로 관련되어 있는 특정 물질들이 동일하거나 유사한 결과들을 얻으면서 본 발며에서 개시된 물질들을 대체할 수 있다는 것은 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 모든 이런 유사한 대체와 변형은 청구항들에서 정의한 대로 본 발명의 취지, 범위 및 개념 내에 있다고 생각된다.
XI . 참조문헌
본 발명에 개시된 내용에 대한 예시적 절차 또는 다른 보충적 상세내용을 제공하는 다음 참조문헌들은 참고로 본 발명에 구체적으로 포함된다.
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본 발명의 내용 중에 포함되어 있음
SEQUENCE LISTING <110> OLSON, ERIC van ROOIJ, EVA <120> IDENTIFICATION OF A MICRO-RNA THAT ACTIVATES EXPRESSION OF BETA-MYOSIN HEAVY CHAIN <130> MIRG-001/01KR <140> PCT/US2007/074866 <141> 2007-07-31 <150> US 60/952,911 <151> 2007-08-31 <150> US 60/952,917 <151> 2007-08-31 <150> US 60/834,667 <151> 2006-08-01 <160> 19 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 89 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ttacttcctt tgacgggcga gcttttggcc cgggttatac ctgatgctca cgtataagac 60 gagcaaaaag cttgttggtc agaggagct 89 <210> 2 <211> 89 <212> DNA <213> Murine <400> 2 ccacttcctg tgacgggtga gcttttggcc cgggttatac ctgactctca cgtataagac 60 gagcaaaaag cttgttggtc agaggagct 89 <210> 3 <211> 89 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 3 ttacttcctt tgacgggtga gcttttggcc cgggttatac ctgactctca cgtataagac 60 gagcaaaaag cttgttggtc agaggagct 89 <210> 4 <211> 89 <212> DNA <213> Canis fami1iaris <400> 4 tcacttcctg tgacgcatga gcttttggct cgggttatac ctgatgctca cgtataagac 60 gagcaaaaag cttgttggtc agaggagct 89 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 5 auaagacgag caaaaagcuu gu 22 <210> 6 <211> 69 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 6 uucuugcuuu aaagcaauug gucuaaaaua uauguaaucg ucuuaauuaa aaaguugcag 60 uaggguugc 69 <210> 7 <211> 69 <212> RNA <213> Pan troglodytes <400> 7 uucuugcuuu aaagcaauug gucuaaaaua uauguaaucg ucuuaauuaa aacguugcag 60 uaggguugc 69 <210> 8 <211> 69 <212> RNA <213> Murine <400> 8 uucuugcuuu aaagcaauug gucuaaaaua uauguaaucg ucuuaauuaa aacguugcag 60 uaggguugc 69 <210> 9 <211> 69 <212> RNA <213> Rattus norvegicus <400> 9 uucuugcuuu aaagcaauug gucuaaaaua uauguaaucg ucuuaauuaa aacguugcag 60 uaggguugc 69 <210> 10 <211> 69 <212> RNA <213> Canis fami1iaris <400> 10 uucuugcuuu aaagcaauug gucuaaaaua uauguaaucg ucuuaauuaa aacguugcag 60 uaggguugc 69 <210> 11 <211> 69 <212> RNA <213> Gallus gallus <400> 11 uucuugcuuu aaagcaauug gucuaaaaua uauguaaucg ucuuaauuaa aacguugcag 60 uaggguugc 69 <210> 12 <211> 72 <212> RNA <213> Takifugu <400> 12 uuccugcuuu aagcaauugg uugaaaauau auguauguaa uggucuuaau uaaaaaaaca 60 aacuaagaca aa 72 <210> 13 <211> 69 <212> RNA <213> Danio rerio <400> 13 uuccugcuuu aaagcaauug gucuaaaaua uauguaaucg ucuucauuac aaaaacgaac 60 caucaaacg 69 <210> 14 <211> 71 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 acgggcgagc ttttggcccg ggttatacct gatgctcacg tataagacga gcaaaaagct 60 tgttggtcag a 71 <210> 15 <211> 71 <212> DNA <213> Murine <400> 15 acgggtgagc ttttggcccg ggttatacct gactctcacg tataagacga gcaaaaagct 60 tgttggtcag a 71 <210> 16 <211> 71 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 16 acgggtgagc ttttggcccg ggttatacct gactctcacg tataagacga gcaaaaagct 60 tgttggtcag a 71 <210> 17 <211> 71 <212> DNA <213> Canis fami1iaris <400> 17 acgcatgagc ttttggctcg ggttatacct gatgctcacg tataagacga gcaaaaagct 60 tgttggtcag a 71 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 18 gtgctcgctt cggcagc 17 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Primer <400> 19 aaaatatgga acgcttcacg aatttgcg 28

Claims (65)

  1. 병적 심장 비대, 심부전 또는 심근 경색을 예방 또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 miR-208의 억제제로서, miR-208의 억제제는 miR-208 서열에 상보적인 서열로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드인 miR-208의 억제제.
  2. 제 1 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 2'-O-메틸-변형 뉴클레오티드를 포함하는 것인 억제제.
  3. 제 1 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 5'-AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU (SEQ ID NO: 5)에 상보적인 서열로 이루어진 것인 억제제.
  4. 제 1 항에 있어서,
    억제제는 이를 필요로 하는 대상에게 정맥, 피하, 내피, 근육내, 복강내, 경구, 경피, 서방형 방출, 제어형 방출, 지연형 방출, 좌약 또는 설하 투여 또는 심장 조직으로의 직접 주사에 의해 투여되는 것인 억제제.
  5. 제 1 항에 있어서,
    억제제는 이를 필요로 하는 대상에게 보조 심장 치료제와 함께 투여되는 것인 억제제.
  6. 제 5 항에 있어서,
    보조 심장 치료제는 베타차단제, 아이오노트로페, 이뇨제, 안지오텐신 전환 효소 억제제(ACE-I), 안지오텐신 II 길항제(AII 길항제), 베타 나트륨이뇨펩타이드(BNP), Ca++-차단제, 엔도텔린 수용체 길항제 및 히스톤 탈아세틸화효소(HDAC) 억제제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 억제제.
  7. 제 1 항에 있어서,
    억제제의 투여는 대상에서 병적 심장 비대, 심부전 또는 심근 경색 중 하나 이상의 증상을 개선하며, 상기 개선된 하나 이상의 증상은 증가된 운동 능력, 증가된 심장 분출 부피, 감소된 좌심실이완말기압, 감소된 폐모세혈관쐐기압, 증가된 심박출량 또는 심박출계수, 낮은 폐동맥압, 감소된 좌심실수축 및 이완말 크기, 감소된 좌심실 및 우심실 벽 긴장, 감소된 벽 장력, 증가된 삶의 질, 및 감소된 질환 관련 질병률 또는 사망률로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 억제제.
  8. 제 1 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 발현 벡터에 의해 암호화되며, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오티드는 프로모터의 전사 제어하에 있는 것인 억제제.
  9. 제 8 항에 있어서,
    프로모터는 심장 특이적 프로모터인 억제제.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 miR-208 기능 또는 발현의 억제제를 포함하는 병리학적 심장 비대, 심부전, 또는 심근경색 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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