KR101481041B1 - 글루코오스-6-인산 탈수소효소의 활성 억제제 및 이를포함하는 지방세포 분화 억제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1의 화합물을 활성성분으로 함유하는 지방세포 분화 억제용 조성물에 관한 것으로, 상기 화합물은 생체 내에서 지방 합성에 중요한 역할을 하는 글루코오스-6-인산 탈수소효소(glucose-6-phosphate dehydrogenase)의 활성을 억제함으로써 지방 합성 및 지방세포의 분화를 억제시키므로, 비만, 고지혈증 등의 지방대사 이상질환에 대한 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다:

화학식 1

상기 식에서,

X는 O 또는 S이고;

Y는

또는

이고;

R¹은 H 또는 C_1-6 알킬이고;

R² 및 R³는 각각 독립적으로 H 또는 OH이다.

Description

글루코오스-6-인산 탈수소효소의 활성 억제제 및 이를 포함하는 지방세포 분화 억제용 조성물{GLUCOSE-6-PHOSPHATE DEHYDROGENASE INHIBITOR AND A COMPOSITION FOR INHIBITING DIFFERENTIATION OF ADIPOCYTE COMPRISING SAME}

본 발명은 글루코오스-6-인산 탈수소효소(glucose-6-phosphate dehydrogenase)의 활성을 억제함으로써 지방세포 분화를 억제하는 화합물 및 이를 활성성분으로 함유하는 지방세포 분화 억제용 조성물에 관한 것이다.

지방산과 콜레스테롤 합성에 필수적으로 요구되는 디하이드로니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트(NADPH)는 지방 합성에 필요한 환원능(reducing power)을 제공하는 역할을 하며, 말산 효소(malic enzyme), 글루코오스-6-인산 탈수소효소(glucose-6-phosphate dehydrogenase), 6-인글루콘산염 탈수소효소(6-phosphogluconate dehydrogenase) 등에 의해 생성된다. 따라서, NADPH 생성에 관여하는 효소들을 조절하는 것은 지방대사과정의 이상으로 인해 유발되는 대사성 질환을 예방, 치료하는데 중요한 역할을 할 가능성이 매우 높다.

상기 효소들 중 글루코오스-6-인산 탈수소효소(이하, 'G6PDH'라 함)는 글루코오스-6-인산을 탈수소화시켜 니코틴아미드 아데닌 디누클레오티드 포스페이트(NADP+)를 NADPH로 환원시키는 반응에 관여하는 효소로서, G6PDH의 활성 억제제로 알려진 디하이드로에피안드로스테론[dehydroepiandrosterone(DHEA)]을 애비 생쥐(Avy mouse)에 투여했을 경우 지방 합성이 감소하며 트리아실글리세라이드(triacylglyceride)의 축적이 감소되어 체중이 감소함이 알려졌다 (문헌[Yen et al., Lipids., 12(5), 409-13, May, 1977] 참조). 또한, G6PDH는 백색 지방 조직에서 주로 발현되며 유전적인 결함으로 비만이 유도된 ob/ob 및 db/db 생쥐의 부고환 지방 조직에서 발현이 증가된다. 지방세포에서 G6PDH 발현을 억제시켰을 때 지방 합성과 관련된 효소들의 발현이 억제되며 지방 조직의 분화와 지방 축적이 억제된다(문헌[Park et al., Molecular and cellular biology, 25, 5146-5157, 2005] 참조).

이에, 본 발명자들은 G6PDH의 활성을 억제하면 지방 합성에 필요한 NADPH의 생성이 저해됨으로써 지방 합성이 억제되고, 결과적으로 지방세포의 분화가 억제되어 비만, 고지혈증과 같은 지방대사 이상 질환을 예방 및 치료할 수 있음에 착안하여, G6PDH의 활성을 효율적으로 억제시키는 화합물을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

[문헌 1] Yen et al., Lipids., 12(5), 409-13, May, 1977

[문헌 2] Park et al., Molecular and cellular biology, 25, 5146-5157, 2005

따라서, 본 발명의 목적은 G6PDH의 활성을 억제함으로써 지방세포의 분화를 억제하는 G6PDH의 활성 억제제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 G6PDH의 활성 억제제를 활성성분으로 포함하는, 지방세포 분화 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 글루코오스-6-인산 탈수소효소(G6PDH)의 활성 억제제를 제공한다:

상기 식에서,

X는 O 또는 S이고;

Y는

또는

이고;

R¹은 H 또는 C_1-6 알킬이고;

R² 및 R³는 각각 독립적으로 H 또는 OH이다.

또한, 본 발명은 활성성분으로서 상기 화합물을 포함하는, 지방세포 분화 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 G6PDH 활성 억제제 및 이를 포함하는 조성물은 글루코오스-6-인산 탈수소효소의 활성을 억제함으로써 지방세포의 분화를 억제시켜, 비만, 고지혈증 등의 지방대사 이상질환에 대한 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 생체 내에서 G6PDH의 활성을 억제함으로써 지방세포의 분화를 억제하여 지방대사 이상질환인 비만 또는 고지혈증을 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 조성물의 활성성분인 화학식 1의 화합물로서 바람직한 화합물로는 하기 화학식 1a의 1,3-디-(E)-N'-(2,3-디하이드록시벤질리덴)티오하이드라지드 및 하기 화학식 1b의 (E)-3-(3-에톡시페닐)-N'-(2-하이드록시벤질리덴)-1H-피라졸-5-카보하이드라지드를 예시할 수 있다:

본 발명의 조성물의 활성성분인 화학식 1의 화합물은 공지의 합성방법에 의해 합성하거나 시판되는 것을 구입하여 사용할 수 있다.

본 발명의 화합물을 통상적인 방법에 따라 약제학적으로 허용되는 적절한 담체 또는 부형제와 혼합하거나 희석제로 희석하여 상기한 기능을 갖는 약학 조성물을 제조할 수 있다. 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 상기 약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제, 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 정제, 알약, 분말, 새세이(sachet), 엘릭서(elixir), 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 본 발명의 활성 화합물의 통상적인 1일 투여량은 0.1 내지 100㎎/㎏ 체중의 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 활성성분의 실제 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: G6PDH 활성의 억제 효능

G6PDH의 활성 측정에 필요한 시약은 모두 시그마 알드리치[Sigma Aldrich(St. Louis, USA)]에서 구입하였다. 먼저, 글루코오스-6-인산 100mM, NADP+ 50mM, NaCl 200mM 및 MgCl₂ 6mM이 용해된 0.1M 트리스(Tris) 완충용액(pH 7.5)을 제조한 후, 시험 화합물들(화학식 1a 및 1b의 화합물)을 각각 0.064mM, 0.32mM, 1.6mM, 8.0mM, 40mM, 200mM 및 1000mM의 농도가 되도록 반응 용액에 첨가하였다. 그 다음, G6PDH를 3.2M (NH₄)₂SO₄(pH 7.0)에 용해한 후 최종적으로 0.002 단위(unit)가 되도록 각 반응 용액에 첨가하였다. 반응이 진행되는 동안 340nm 파장에서 흡광도를 측정함으로써 각 화합물 첨가에 따른 NADPH의 생성량을 정량하였으며, 시험 화합물을 첨가한 경우(시험군)와 첨가하지 않은 경우(대조군)의 NADPH 생성량을 비교함으로써 G6PDH 활성의 억제 정도를 확인하였다. 또한, 첨가된 각 화합물의 농도변화에 따른 NADPH 생성 반응 속도를 측정한 후, 시그마 플롯 프로그램(sigma plot program)을 이용하여 각 화합물의 IC₅₀ 값을 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 각각 표시하였다.

상기 표 1의 결과로부터, 본 발명의 화학식 1a 및 1b의 화합물 둘 다가 G6PDH가 촉매로 작용하는 반응, 즉 글루코오스-6-인산을 탈수소화시켜 NADP+를 NADPH로 환원시키는 반응의 반응 속도를 효율적으로 저하시킴을 확인하였다.

실시예 2 : G6PDH 억제제에 의한 지방 전구 세포(3T3-L1)의 지방 분화 억제

로리글리타존은 케이만 케미칼[Cayman Chemical(Ann Arbor, USA)]에서 구입하였다. 로리글리타존 외에 지방 전구 세포(3T3-L1)의 지방 분화 억제 측정에 필요한 시약은 모두 시그마 알드리치[Sigma Aldrich(St. Louis, USA)]에서 구입하였다.

[1 단계] 세포주와 세포 배양

생쥐의 지방 전구세포인 3T3-L1을 10% 우혈청(Bovine calf serum)을 함유한 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco 1210-0038)에서 배양하였고, 배양은 모두 37 ℃, 10% CO₂ 배양기에서 수행하였다.

[2 단계] 지방세포 분화와 분화 억제 실험

1 단계에서 배양된 세포주를 각각 트립신 처리하여 단일세포 현탁액을 만들고 6-웰 플레이트 (6-well plate)에 균등하게 분주하고 배양하였다. 그 후, 세포가 90% 이상 자란 것을 확인한 후, FBS(송아지혈청) 10%, 데사메타손(dexamethasone) 1uM, 인슐린(insulin) 10mg/mL, 아이비엠엑스(3-이소부틸-1-메틸잔틴) 0.5mM이 포함된 분화배지로 바꾸어 주었다. 배지를 바꾸어 준 후, 각 웰마다 G6PDH 억제제(또는 촉진제)를 첨가하였다. 무처리 대조군에는 디메틸설폭시드(DMSO)만을 첨가하였다. 시험군으로는 화학식 1a 및 1b의 화합물을, 지방세포 분화 억제 대조군으로는 카페인(caffeine) 5mM을, 지방세포 분화 촉진 대조군으로는 로지글리타존(rosiglitazone) 10uM을 사용하였다. 분화배지로 교환한지 48시간 후에 FBS 10%에 인슐린 10mg/mL이 포함된 배지로 교환해 주었다. 그 후, 다시 DMSO 및 G6PDH 억제제(또는 촉진제)를 각각 첨가하였다. 배지를 갈아준지 48시간 후에 FBS 10%가 포함된 배지로 교환해 주었다. 그리고, DMSO 및 G6PDH 억제제(또는 촉진제)를 각각 첨가하고, 48시간 후에 다시 배지 교환 및 해당 화합물의 첨가를 반복해 주었다.

[3 단계] 분화된 지방세포의 지방 함량 측정 및 광학 현미경 사진 촬영

2 단계에서 분화 유도된 세포들의 분화 정도(지방 함량)를 측정해 보기 위하여 수단2(Sudan2) 염색법을 사용하였다. 8일 동안 분화가 유도된 지방세포를 10% 포름알데하이드(formaldehyde)로 20분간 얼음 위에 고정시킨 후, PBS로 5분간 3회 세척하였다. 그 후, 60% 이소프로판올에 0.5% 수단2 염료를 넣어 충분히 녹인 후, 0.2um 공극 여과기(pore filter)로 2회 여과하였다. 준비된 수단2 염료 용액을 6-웰 플레이트에 웰 당 1mL 씩 넣고, 1시간 동안 상온에 방치하였다. 수단2 염료 용액을 제거한 후 70% 에탄올 1mL를 각 웰에 넣고 세척하여 잔존 염료를 제거하였다. 다음, PBS로 5분씩 3회 세척한 다음, 4% NP40 이소프로판올 1mL를 넣고 상온에서 20분간 추출한 후 지방세포-함유층을 회수하였다.

회수된 시료의 광학밀도 값(optical density value)을 490nm 파장에서 측정하여 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1의 결과에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 화학식 1a 및 1b의 화합물이 공지된 지방세포 분화 억제제인 카페인에 비해 훨씬 적은 양으로도 우수한 지방세포 분화 억제 효능을 제공함을 알 수 있다.

또한, 8일 동안 분화가 유도된 지방세포를 광학 현미경으로 관찰하여, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2의 사진으로부터, DMSO를 사용한 무처리 대조군에 비해, 본 발명의 화학식 1a 및 1b의 화합물이 지방세포의 분화를 효율적으로 억제함을 확인하였다.

도 1은 실시예 2에서, 분화 후 특정 화합물로 처리된 지방세포의 지방 함량을 보여주는 염색 후 광학밀도 그래프이고,

도 2는 실시예 2에서, 분화 후 특정 화합물로 처리된 지방세포의 광학 현미경 사진이다.

Claims (9)

1. 활성성분으로서 하기 화학식 1a의 1,3-디-(E)-N'-(2,3-디하이드록시벤질리덴)티오하이드라지드 또는 하기 화학식 1b의 (E)-3-(3-에톡시페닐)-N'-(2-하이드록시벤질리덴)-1H-피라졸-5-카보하이드라지드를 포함하는, 비만 또는 고지혈증의 예방 또는 치료용 약학 조성물:

   화학식 1a

   

   화학식 1b

   
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