KR101473467B1 - cRGD 양성 혈관내피전구세포에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 압타머 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 cRGD+ 혈관내피전구세포를 특이적으로 인지하여 결함하는 핵산 압타머 및 그 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 핵산 압타머는 혈관내피전구세포표면의 인테그린에 결합하는 cRGD를 특이적으로 인식하여 결합함으로써 혈관의 재협착을 억제하고 혈관내피세포를 강화시킬 수 있는 바, 관상동맥성 심장병 치료를 위한 스텐트의 조성물로서 유용하게 사용될 수 있어 심장병 환자의 생존율을 높이는데 기여할 수 있다.

Description

cRGD 양성 혈관내피전구세포에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 압타머 및 그 용도{Nucleic Acid Aptamer Capable of Specifically Binding to cRGD Positive Endothelial Progenitor Cell and Use Thereof}

본 발명은 cRGD양성 혈관내피전구세포를 특이적으로 인지하여 결합함으로써 관상동맥용 스텐트에 코팅되어 재협착을 방지하고, 혈관내피세포를 강화시키는데 이용될 수 있는 핵산 압타머 및 그 용도에 관한 것이다.

압타머(Aptamer)는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산 (DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 'fitting'의 의미를 가지는 라틴어 'aptus'에서 그 어원이 유래했다. 압타머는 1990년에 Colorado 대학의 Larry Gold 연구팀에 의해 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)라는 압타머 발굴 기술이 처음 개발된 이후(Ellington, AD and Szostak, JW. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands, Nature 346:818-822(1990)), 저분자 유기물, 펩타이드, 막 단백질까지 다양한 표적분자에 결합할 수 있는 많은 압타머들이 계속해서 발굴되어 왔다. 압타머는 고유의 높은 친화성 (보통 pM 수준)과 특이성으로 표적분자에 결합할 수 있다는 특성 때문에 자주 단일 항체와 비교가 되고, 특별히 'chemical antibody'라 불리는 만큼 대체항체로서의 가능성도 매우 높다. 먼저 압타머의 장점들을 살펴보면 다음과 같다.

1) 항체는 분자 구조가 크기 때문에 (~150 kDa) 생산하는데 어려움이 있고 변형 (modification)또한 용이하지 못한 반면, 압타머는 약 20~60 mer 정도 길이의 핵산으로 구성되어 있는 작은 분자 구조이고, 여러 필요한 변형이 용이한 장점을 가지고 있다.

2) 압타머는 항체에 비해 안정성이 매우 높다. 단백질이나 항체 의약품의 경우 실온에서 보관이나 운반이 불가능하지만 압타머는 가능하고, 심지어 멸균 후에도 기능을 유지할 수 있으며, 만약 변성 (denaturation)이 되더라도 다시 짧은 시간에 재생 (regeneration)이 가능하기 때문에 특히 장시간 또 반복사용이 요구되는 진단용으로의 응용이 매우 용이하다.

3) 항체의 경우 동물이나 세포를 이용하여 만들기 때문에 생산하는데 많은 시간과 비용이 요구되며, 또한 만든 시기에 따라 기능성이 달라질 가능성도 있다(batch to batch variation). 하지만 압타머는 화학적 합성방법을 이용하기 때문에 단시간에 적은 비용으로 생산이 가능하고, batch to batch variation이 거의 없으며 또한 고순도의 정제과정이 매우 용이하여 생산적인 측면에서 탁월한 장점을 갖고 있다.

4) 항체나 다른 의약용 단백질의 경우에 쉽게 나타나는 생체내 면역거부반응이 거의 일어나지 않는 것으로 알려져 있으며, 이는 치료용으로의 개발연구에 매우 중요한 장점이 될 수 있다.

5) 항체를 만들기 어려운 독소 (toxin), 복잡한 단백질 복합체 또는 당과 단백질 복합체에 대한 압타머를 만들 수 있으며, 또한 새로운 물질에 대한 결합 물질로의 변형이 용이하여 (flexibility) 새로운 압타머 발굴에 활발히 응용될 수 있다.

새로운 압타머 발굴 방법은 다음과 같다.

SELEX를 통해 새로운 압타머를 선별하는 과정을 살펴보면 먼저 (i) DNA 합성 및 in vitro transcription 방법(RNA인 경우) 을 이용하여 다양한 형태를 가지는 핵산 라이브러리를 만든다. (ii) 항체가 여러 종류의 항원과 결합하는 것처럼 핵산 구조체 라이브러리 안에 있는 다양한 핵산 구조체들 (압타머 후보 분자들)은 다양한 표적물질과 결합할 수 있는 능력을 가지고 있고 따라서 다음 과정으로 원하는 표적분자와 결합할 수 있는 핵산 구조체만을 선별하는 과정을 거치게 된다. (iii) Affinity chromatography 와 같은 방법을 통해 결합하지 않은 핵산 구조체는 제거되고(washing) 표적분자에 결합하는 것만을 선택적으로 얻을 수 있게 된다. (iv) 마지막으로 표적분자로부터 핵산 구조체를 분리(elution)하게 되고 그 핵산을 증폭시킨 후 얻은 핵산 구조체를 이용하여 다시 이 과정들을 5~15번 정도 더 반복함으로써 매우 우수한 결합력과 특이성을 보이는 압타머를 발굴할 수 있다.

위와 같이 SELEX를 통해 얻어진 초기의 압타머 들은 더 안정적이고 강력한 압타머로 개량하고자 하는 post-SELEX 과정을 수행하기도 한다. 대표적인 예로 RNA 압타머의 Ribose 2'-OH를 2'-F 나 2'-NH2, 2'-O-methyl group으로 치환하는 것이다. 이런 변화를 거치게 되면 핵산 분해효소에 대한 저항성이 우수하여 blood 내에서 안정성이 10,000배 이상 증가된 압타머를 얻을 수 있게 된다. 이 외에도 압타머를 polyethylene glycol (PEG)과 같은 고분자나 diacylglycerol 혹은 cholesterol 을 접합시켜 blood 내에서 빠르게 clearance되는 것을 줄일 수 있다. 그리고 5'말단이나 3'말단에 biotin을 결합시킨 압타머를 만들어 streptavidin support에 부착시켜 바이오 센서/칩 분야에서 사용될 수 있다(Dausse E. et al. Aptamers: a new class of oligonucleotides in the drug discovery pipeline, Curr. Opin. Pharmacol, 2009).

한편, 혈관내피전구세포(Endothelial progenitor cell, EPC)는 골수에서 파생된 세포로서 혈관을 형성하는 내피세포(endothelial cell)로 성숙해질 수 있는 세포이다. 전체 혈액에서 특정한 마커(CD31, CD34, CD133, CD144 (vascular endothelial cadherin), 및 CD309 (vascular endothelial growth factor receptor-2)등)를 검출하는 것으로 EPC를 동정 할 수 있다. 또한 EPC는 혈관의 재생(reendothelialization)과 신혈관 형성(neovascularization)에 중요한 역할을 한다. 관상동맥성심장병에 대한 침습적 치료법은 인간의 수명이 길어짐에 따라 날이 갈수록 중요해지고 있다. 이식용으로 새롭게 등장한 소재가 바로 인조 혈관이며, 많은 수의 환자들에게 사용되고 있다. 하지만, 좁은 직경의 혈관붕괴나 나이-의존성 고나상동맥의 경직에 의한 관상동맥성 심장병에 대한 수술방법은 여전히 어려움을 야기하고 있다. 혈액과 인조 물질과의 접촉은 염증반을을 일으키게 되고 이는 나아가 이식부위 주위의 내막의 증식을 일으키며 결과적으로는 추가적인 혈관의 붕괴를 일으킨다. 최근 들어 인조 관상동맥용 혈관은 점점 더 중요해지고 있다. 특히 나이든 환자들에게는 혈관이 상대적으로 탄력과 유연성이 떨어지므로, 스텐트 이식의 대상이 되지 못한다. 그럼에도 불구하고, 인공 혈관을 통한 우회술을 사용한다면, 특히 좁은 직경의 혈관에서, 일반적으로 심각한 외상을 일으킨다. 그 증상은 혈액과 인공혈관의 표면 접촉지점에서 발생하는 많은 양의 혈전과 불특정한 염증반응이다. 일반적으로, 관상동맥혈관은 EPC를 끌어들이고 그들의 연이은 EC로의 분화로 인해 수리가 이루어진다. 이에 반해, 인조 혈관은 EPC를 끌어들일 수 있는 물질이 없고 그에 따라 혈소판, 호중성 백혈구 및 단핵백혈구를 불러들어 결국 혈관의 재봉쇄를 일으킨다. 많은 과학자들이 인조 혈관의 생물학적 호환성 향상과 혈관 재생을 향상시켜 손상된 혈관을 복구시키는 관점에서 인조 혈관의 개량에 힘쓰고 있다. 두 번째 방법은 기본적으로 EPC의 수리와 재생능력에 의존하는 것으로 이를 위하여 인조 혈관의 표면을 CD34에 대한 항체로 코팅하는 방법을 사용하기도 했다(Kalka C et al., (2000), PNAS, Kong D et al., (2004). Circulation, Kawamoto A et al., (2001). Circulation.). 하지만 항체의 경우 비용과 안정성의 문제로 상용화 되지 못한 단점이 있었다. 이에 2007년 일련의 과학자들이 새로운 EPC 유도 물질을 개발하였는데, 그것이 바로 핵산 압타머(Aptamer)이다(John Hoffmann, et al., (2007). Journal of Biomedical Materials Research Part A.).

상기 논문에서는 EPC의 대표적인 바이오 마커인 CD-34에 특이적으로 결합하는 압타머를 개발하고 FITC(Fluorescerin-5-isothiocyanat)로 표지된 압타머를 이용하여, 방사능 물질의 사용 없이 그 효능을 입증함으로써 인조혈관 문제를 해결함에 있어서 압타머의 개발 가능성을 확인하였다. 하지만 EPC의 바이오 마커는 CD34외에도 다양한 마커가 존재하여, CD34 하나로는 EPC만을 특정하기 어려운 문제점이 있었다.

이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, EPC의 또 다른 바이오 마커인 인테그린에 결합하는 cRGD(cyclic-Arginine-Glycine-

Aspartic acid)에 특이적으로 결합하는 압타머를 선별한 다음, cRGD 양성 EPC 세포에 특이적으로 결합하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 cRGD 양성 혈관내피전구세포(EPC)에 특이적으로 결합하는 핵산 압타머를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 핵산 압타머가 그 안쪽에 코팅되어 있는 관상동맥용 스텐트를 제공하는데 있다.

서열번호 3 내지 77로 구성된 군에서 선택되는 염기서열을 포함하고, cyclic RGD 양성 혈관내피전구세포에 특이적으로 결합할 수 있는 60~120nts의 핵산 압타머를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 핵산 압타머가 그 안쪽에 코팅되어 있는 관상동맥용 스텐트를 제공한다.

본 발명에 따른 핵산 압타머는 혈관내피전구세포의 바이오 마커인 인테그린을 인식하는 cRGD 펩타이드를 특이적으로 인식하여 결합함으로써 혈관의 재협착을 억제하고 혈관내피세포를 강화 할 수 있는 관상동맥용 스텐트로서 유용하게 사용될 수 있어 관상동맥성 심장병 환자의 생존율을 높이는데 기여할 수 있다.

도 1은 SELEX aptamer screening 방법의 개요에 대한 것이다.
도 2는 cyclic GPenGRGNSPCA(cRGD)의 구조식이다.
도 3은 cRGD+ 혈관내피전구세포에 결합한 압타머의 PCR 증폭 결과의 2% agarose 젤 전기영동 사진이다.
도4는 염기서열의 유사성 65% 이상 보이는 압타머를 서열 분석을 통하여 골라낸 것이다.
도5는 aptamer-FITC와 CD133 antibody를 2^nd antibody에 Alex594 tag된 혈관내피전구세포의 double immuno-staining 후, 형광현미경으로 관찰한 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본원에서 "핵산 압타머"란, 높은 친화성으로 타겟물질을 특이적으로 인지할 수 있는 작은 단일가닥 올리고핵산을 말한다.

본원에서 "90%이상 100%미만의 상동성을 가지는 핵산서열"이란 일 내지 수개의 뉴클레오티드가 추가, 결실 또는 치환되어 90%이상 100%미만의 서열에 공통성이 있는 것으로 유사한 cRGD positive EPCs 결합능을 보이는 핵산서열을 의미한다.

본 발명에서는 돼지 혈액 중 cRGD positive EPC에 특이적으로 결합하는 압타머를 개발하고자 하였다.

본 발명에서는, SELEX 과정을 수행하였다. 그 결과 cRGD+ EPC에 특이적으로 결합하는 압타머를 확인하였다.

즉, 본 발명의 일 실시예에서는 상기 압타머가 cRGD+ 혈관내피전구세포에 특이적으로 결합하는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 서열번호 3 내지 77로 구성된 군에서 선택되는 염기서열을 포함하고, cyclic RGD 양성 혈관내피전구세포에 특이적으로 결합할 수 있는 60~120nts의 핵산 압타머에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 상기 핵산 압타머는 서열번호 3 또는 4의 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 압타머의 길이는 특별히 한정되지 않고, 통상 약 15∼약 200 뉴클레오티드일 수 있지만, 예컨대 약 100 뉴클레오티드 이하이고, 바람직하게는 약 80 뉴클레오티드 이하이며, 본 발명의 일 구체예에서 본 발명의 압타머의 길이는 특별히 한정되지 않으나, 대략 96 뉴클레오티드 내외로 개발될 수 있고, post-SELEX 과정을 통해 보다 효율적인 20-30 뉴클레오티드 크기로 modification 되어 사용될 수 있다. 총 뉴클레오티드수가 적으면, 화학합성 및 대량 생산이 보다 용이하고, 또한 비용면에서의 장점도 크다. 또한 화학수식도 용이하고, 생체내 안정성도 높으며, 독성도 낮다고 생각된다.

본 발명에 따른 핵산 압타머는 cd34+ EPC에 특이적으로 결합하는 압타머와 65%이상의 서열 동일성을 가지는 것으로 나타나는데, 이러한 서열 동일성은 상기 서열번호 3 내지 158로 표시되는 핵산서열 중 선택된 어느 하나의 핵산서열과 90%이상 100%미만의 상동성을 가지는 핵산서열은 cRGD+ EPC에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 압타머임을 의미한다. 본 발명에 따른 핵산 압타머 상호 간의 서열의 유사성을 볼 때, 상기 서열번호 3 내지 158로 표시되는 핵산서열 중 선택된 어느 하나의 핵산서열에 대하여 일 내지 수개의 뉴클레오티드가 추가, 결실 또는 치환되어 90%이상 100%미만의 서열에 공통성이있다면, 본 발명에 따른 핵산 압타머와 유사한 cRGD+ EPC 결합능을 보일 것임은 자명하다고 할 것이다.

본 발명의 압타머에 포함되는 각 뉴클레오티드는 각각, 동일 또는 상이하여, 리보오스(예, 피리미딘 뉴클레오티드의 리보오스)의 2'부위에서 히드록실기를 포함하는 뉴클레오티드(즉, 미치환인 뉴클레오티드)이거나, 또는 리보오스의 2'부위에서, 히드록실기가, 임의의 원자 또는 기로 치환되어 있는 뉴클레오티드일 수 있다. 이러한 임의의 원자 또는 기로서는, 예컨대 수소원자, 불소원자 또는 -O- 알킬기(예, -O-Me기), -O-아실기(예,-O-CHO기), 아미노기(예, -NH2기)로 치환되어 있는 뉴클레오티드를 들 수 있다. 본 발명의 압타머는 또한 적어도 1종(예, 1,2, 3 또는 4종)의 뉴클레오티드가, 리보오스의 2'부위에서, 히드록실기, 또는 전술한 임의의 원자 또는 기, 예컨대 수소원자, 불소원자, 히드록실기 및 -O-Me기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2종(예, 2, 3 또는 4종)의 기를 포함하는 뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 압타머는 또한, 모든 뉴클레오티드가, 리보오스의 2'부위에서, 히드록실기, 또는 전술한 임의의 원자 또는 기, 예컨대 수소원자, 불소원자, 히드록실기 및 -0-Me기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 동일한 기를 포함하는 뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명의 압타머는, 혈관내피전구세포에 대한 결합성, 안정성 등을 높이기 위해, 각 뉴클레오티드의 당 잔기(예,리보오스나 디옥시리보스)가 수식된 것이어도 좋다. 당잔기에서 수식되는 부위로서는, 예컨대 당잔기의 2'부위, 3'부위 및/또는 4'부위의 산소원자를 다른 원자로 치환한 것 등을 들 수 있다. 수식의 종류로서는, 예컨대 플루오로화,O-알킬화(예, O-메틸화, O-에틸화), O-알릴화, S-알킬화(예, S-메틸화, S-에틸화), S-알릴화, 아미노화(예,-NH)를 들 수 있다. 이러한 당잔기의 변형은, 자체 공지의 방법에 의해 행할 수 있다(예컨대 Sproat etal.,(1991) Nucle. Acid. Res. 19, 733-738; Cotton et al., (1991)Nucl. Acid. Res. 19, 2629-2635; Hobbs et al., (1973)Biochemistry 12, 5138-5145 참조).

본 발명의 압타머는 또한, cRGD+ 혈관내피전구세포에 대한 결합성 등을 높이기 위해, 핵산염기(예, 푸린, 피리미딘)가 변형(예, 화학적 치환)된 것이어도 좋다. 이러한 변형으로서는, 예컨대 5부위 피리미딘 변형, 6 및/또는 8부위 푸린 변형, 환외(環外) 아민에서의 변형, 4-티오우리딘으로의 치환, 5-브로모 또는 5-요오드-우리실으로의 치환을 들 수 있다. 또한 뉴클레아제 및 가수분해에 대하여 내성이도록, 본 발명의 압타머에 포함되는 인산기가 변형되어 있어도 좋다. 예컨대 P(0)0기가, P(0)S(티오에이트), P(S)S(디티오에이트), P(O)NR2(아미데이트), P(O)R, R(O)OR',CO 또는 CH2(포름아세탈) 또는 3'-아민(-NH-CH₂-CH₂-)으로 치환되어 있어도 좋다〔여기서 각각의 R 또는 R'은 독립적으로, H이거나, 또는 치환되어 있거나, 또는 치환되어 있지 않은 알킬(예, 메틸, 에틸)이다. 연결기로서는, -O-, -N- 또는 -S-가 예시되고, 이들의 연결기를 통하여 인접하는 뉴클레오티드에 결합할 수 있다.

본 발명에서의 변형은 또한, 캡핑과 같은 3' 및 5'의 변형을 포함하여도 좋다. 변형은 또한, 폴리에틸렌글리콜, 아미노산, 펩티드, inverted dT, 핵산, 뉴클레오시드, Myristoyl,Lithocolic-oleyl, Docosanyl, Lauroyl, Stearoyl, Palmitoyl, Oleoyl, Linoleoyl, 그 외 지질, 스테로이드,콜레스테롤, 카페인, 비타민, 색소, 형광물질, 항암제, 독소, 효소, 방사성 물질, 비오틴 등을 말단에 부가함으로써 행해질 수 있다. 이러한 변형에 대해서는, 예컨대 미국특허 제5,660,985호, 미국특허 제5,756,703호를 참조.

본 발명의 압타머는, 본 명세서중의 개시 및 이 기술분야에서의 자체 공지의 방법에 의해 화학 합성할 수 있다.

압타머는, 인산기의 마이너스 전하를 이용한 이온결합, 리보오스를 이용한 소수결합 및 수소결합, 핵산염기를 이용한 수소결합이나 스태킹(stacking)결합 등 다양한 결합 양식에 의해 표적 물질과 결합한다. 특히, 구성 뉴클레오티드의 수만큼 존재하는 인산기의 마이너스 전하를 이용한 이온결합은 강하게, 단백질의 표면에 존재하는 리신이나 아르기닌의 플러스 전하와 결합한다. 이 때문에, 표적 물질과의 직접적인 결합에 관련되어 있지 않은 핵산염기는 치환할 수 있다. 특히, 스템 구조의 부분은 이미 염기쌍이 만들어져 있고, 또한 이중 나선 구조의 내측을 향하고 있기 때문에, 핵산 염기는, 표적 물질과 직접 결합하기 어렵다. 따라서, 염기쌍을 다른 염기쌍으로 치환하여도 압타머의 활성은 감소하지 않는 경우가 많다. 루프 구조 등 염기쌍을 만들지 않은 구조에서도,핵산 염기가 표적 분자와의 직접적인 결합에 관여하지 않는 경우에, 염기의 치환이 가능하다.

리보오스의 2'부위의 수식에 관해서는, 드물게 리보오스의 2'부위의 관능기가 표적 분자와 직접적으로 상호작용하고 있는 경우가 있지만, 대부분의 경우 무관계이고, 다른 수식 분자로 치환 가능하다. 이와 같이 압타머는, 표적 분자와의 직접적인 결합에 관련되어 있는 관능기를 치환 또는 삭제하지 않는 한, 그 활성을 유지하고 있는 경우가 많다.

또한, 전체의 입체 구조가 크게 변하지 않는 것도 중요하다. 압타머는, 통상적으로 SELEX법, 그 개량법[예컨대 Ellington et al., (1990) Nature, 346, 818-822; Tuerk etal.,(1990) Science, 249, 505-510]을 이용함으로써 제작할 수 있다. SELEX법으로는 라운드수를 늘리거나, 경합 물질을 사용함으로써, 표적 물질에 대하여 보다 결합력이 강한 압타머가 농축되고, 선별된다. 따라서, SELEX의 라운드수를 조절하거나, 및/또는 경합 상태를 변화시킴으로써, 결합력이 상이한 압타머, 결합 형태가 상이한 압타머, 결합력이나 결합 형태는 동일하지만 염기 서열이 상이한 압타머를 얻을 수 있는 경우가 있다.

또한, SELEX법에는 PCR에 의한 증폭 과정이 포함되지만, 그 과정에서 망간 이온을 사용하는 등으로 변이를 부여함으로써, 보다 다양성이 풍부한 SELEX를 행하는 것이 가능해진다. SELEX에서 얻어지는 압타머는 표적 물질에 대하여 친화성이 높은 핵산이고, 그것은 표적 물질의 활성 부위에 결합하는 것을 의미하지 않는다. 따라서, SELEX에서 얻어지는 압타머는 반드시 표적 물질의 기능에 작용하는 것으로는 한정하지 않는다. 압타머는 그 프라이머 설계에 의존하여, 그 후의 최소화 작업의 용이성이 변한다. 프라이머를 잘 설계하지 않으면, SELEX에 의해 활성이 있는 압타머를 선별할 수 있었다고 해도, 그 후의 개발이 불가능해진다.

또한, 압타머는 화학 합성이 가능하기 때문에 개변이 용이하다. 압타머는 mfold 프로그램을 이용하여 2차 구조를 쉽게 예측할 수 있으며 보다 정확한 입체 구조 분석을 위해서는 X선 해석이나 NMR 해석이 필요하다. 이러한 구조분석과 여러 압타머 시퀀스상에서 나타나는 동일 시퀀스 영역(conserved region) 분석을 바탕으로, 특정 염기가 치환 또는 결손된 압타머 연구 (truncation study)를 통해 어떤 뉴클레오티드를 치환 또는 결손하는 것이 가능한지, 또한 어디에 새로운 뉴클레오티드를 삽입 가능한지 어느 정도 예측할 수 있다. 이러한 연구를 통해 보다 안정적이고 강력한 압타머를 개발할 수 있으며 압타머의 전체 염기서열 중 결합과 관련된 중요한 부위 (binding motif)를 찾아낼 수 있다. 예측된 새로운 서열의 압타머는 용이하게 화학 합성할 수 있고, 그 압타머가 활성을 유지하고 있는지의 여부를 기존의 분석계에 의해 확인할 수 있다. 얻어진 압타머의 표적 물질과의 결합에 중요한 부분이, 상기와 같은 시행착오를 반복함으로써 특정할 수 있는 경우, 그 서열의 양단에 새로운 서열을 부가하여도, 대부분의 경우 활성은 변화하지 않는다. 새로운 서열 의 길이는 특별히 한정되는 것이 아니다. 변형에 관해서도 서열과 마찬가지로 고도로 설계 또는 개변이 가능하다. 이상과 같이, 압타머는 고도로 설계 또는 변형이 가능하다.

본 발명의 엡타머를 제조하는 방법은 실시예 2에 잘 기재되어 있고 프라이머용 서열은 서열번호 1 및 2인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명 과정을 좀 더 자세히 설명하면 다음과 같다.

1) CD34+ 혹은 cRGD+ 혈관내피전구세포 분리

anti-human CD34 antibody Magentic bead isolation kit를 이용하여 돼지 혈액내에서 CD34+ 혈관내피전구세포를 분리하고, Cyclic RGD peptide에 결합시킨 자성비드를 이용하여 돼지혈액에서 cRGD+ 혈관내피전구세포를 분리하였다.

2) CD34+ 혹은 cRGD+ 혈관내피전구세포 결합 특이적 DNA 압타머 개발

일반적으로 표적 물질에 특이적인 압타머 개발을 위해 SELEX (Systamatic Evolution of Ligand byExponential Enrichment) 방법을 이용하여 CD34+ 혹은 cRGD+ 혈관내피전구세포 결합 특이적인 DNA 압타머를 개발하였다. 프라이머 결합 부위로서 18개의 염기로 이루어진 지역을 양끝으로 하여 가운데 40개의 임의의 염기로 구성된 Random DNA library를 CD34+ 혹은 cRGD+ 혈관내피전구세포가 고정되어 있는 자성 비드와 함께 버퍼용액에 넣고 혼합하여 반응시킨 후 자석을 이용하여 CD34+ 혹은 cRGD+ 혈관내피전구세포와 결합하지 못한 DNA를 제거한다. 이 후 자성비드 표면에 고정된 CD34+ 혹은 cRGD+ 혈관내피전구세포와 결합한 DNA는 고온처리를 통해 자성비드로부터 분리시키고, 분리된 단일가닥 DNA는 에탄올 침전법을 시행하여 정제, 농축한다. 이 과정을 통해 얻어진 CD34+ 혹은 cRGD+ 혈관내피전구세포 결합 특이적인 DNA는 PCR과정을 통해 증폭되고, 증폭된 PCR 산물은 정제한 후 고농도의 urea가 들어있는 폴리아크릴아마이드 젤로 전기영동하여 이중나선 구조의 PCR반응물을 두 개의 단일가닥 DNA로 분리한다. 두 개의 ssDNA 밴드 중 원래의 단일가닥 DNA 밴드를 gel extraction과 에탄올침전법을 통해 농축, 정제하여 단일가닥 DNA를 확보한다. 이 DNA pool을 확보하여 TOPOcloning kit를 이용하여 클로닝을 시행한다. 얻어진 콜로니에서부터 플라스미드 DNA를 추출하여 염기분석을 시행하였으며 그 결과 최종적으로 78개의 서로 다른 염기서열을 가진 ssDNA를 확보하였다.

3)CD34+ 혹은 cRGD+ 혈관내피전구세포 결합 특이적 DNA 압타머 분석

CD34+ 혹은 cRGD+ 혈관내피전구세포에 특이적으로 결합하는 압타머의 혈관내피세포 결합능력을 확인하기 위한 방법으로 이중형광염색법을 이용하였다.이를 위해, CD133 antibody에 대한 2차항체는 Alex-594를 사용하였으며, FITC labelled 압타머에 대한 형광분석은 499nm의 laser로 수행하였다.

본 발명은 또한, 본 발명의 압타머가 그 안쪽에 코팅되어 있는 관상동맥용 스텐트에 관한 것이다. 본 발명의 압타머와 관상동맥용 스텐트 사이의 결합은 공유 결합, 또는 비공유 결합일 수 있다.

본 명세서 중에 기재된 특허 및 특허 출원 명세서를 포함하는 모든 간행물에 기재된 내용은, 본 명세서에서의 인용에 의해, 그 모두가 명시된 것과 같은 정도로 본 명세서에 삽입되는 것이다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. CD34+ 혹은 cRGD+ 혈관내피전구세포 분리

(1) CD34+ 혈관내피전구세포의 분리

자성비드에 결합한 CD34+ 혈관내피전구세포를 분리하는 과정은 다음과 같다. 미니 돼지로부터 혈액 50mL을 heparin이 코팅된 15mL test tube에 담은 후, 이를 limphoprep solution에 섞은 후, 2500rpm에서 15분간 원심분리한 후, 분리된 중간의 분홍색 세포층을 분리함. 이 분리된 세포층을 PBS 완충용액으로 세척한 뒤, 이를 혈관내피전구세포의 초기 분리 세포로 사용하였다. Lymphoprep (Axis-Shield제품 Density:1.077ㅁ0.001g/mL)을 이용한 mononuclear cells 분리 방법으로, 15mL tube에 Lymphoprep 4mL을 먼저 분주하고, 돼지혈액은 Isolation buffer(2mM EDTA in PBS) 와 1:1 비율로 희석하여 Lymphoprep 위에 8mL 천천히 첨가한 후 원심분리(4℃ 500xg, 30분)를 실행하였다.

Miltenyi Biotech 으로부터 구입한 anti-human CD34 antibody Magentic bead isolation kit를 사용하여 초기 혈관내피전구세포에서 CD34+ 세포를 분리하였다. 즉, 초기 혈관내피전구세포 1 ㅧ 10⁸개를 MACS buffer (0.5% BSA, 2mM EDTA in PBS) 300μl 에 resuspend 하고 여기에 추가로 Blocking Reagent 100μl + CD34 Microbeads 100μl 혼합한 500μl cell을 1시간 동안 상온에서 360˚회전하여 일정하게 유지하여 1시간이 지나면 MACS column(magnetic bead가 붙어있는)과 magnetic separator을 준비 후 MACS buffer 500μl를 column 위에 분주하여 사용 전 1회 세척 한 후, 1시간동안 incubation 하였던 cell 500μl을 column에 통과시켰다. MACS buffer 500μl를 이용하여 세척 3회 실행. 세척이 끝나면 Binding buffer (per liter/ 4.5g Glucose, 100mg tRNA, 1g BSA, 1M Mgcl2 5mL : 4℃보관) 1mL 을 column 위에 떨어뜨리고 Plunger로 밀어냄으로써 CD34+ 혈관내피전구세포를 분리하였다..

(2) cRGD+ 혈관내피전구세포의 분리

cRGD 펩타이드(cyclic Arginine-Glycine-Aspatate)를 도 1에서 보는바와 같이 합성하였다(총 10mg, 애니젠). 이 합성된 cRGD 펩타이드를 Bioclone 회사의 Magentic bead conjugation kit를 사용하여 공유결합 시켜 cRGD-magnetic bead를 제조했는데, 과정은 다음과 같다. MagneticBeads(20mg/ml)는 Coupling Buffer (10 mM potassium phosphate, 0.15 M NaCl, pH 5.5)를 첨가하여 준비하고, Cyclic-RGD peptide (0.5-1mg/ml)는 증류수에 녹여 준비했다. 여기에 Coupling agent solution (57mg EDC [1-ethyl-3 (3-dimethyaminopropyl) carbodiimide] in 100 ml 증류수)를 혼합하여 일정한 조건을 유지하면서 24시간 동안 360˚ 회전시켜 24시간이 경과하면 Wash/Storage Buffer (10 mM Tris base, 0.15 M NaCl, 0.1% (w/v) BSA, 1mM EDTA, 0.1% sodium azide, pH 7.5)를 이용하여 3회 세척한 후 Blocking buffer (1 M Glycine, pH 8.0)를 첨가하여 1-2시간 상온에서 일정하게 유지했다. Wash/Storage Buffer로 3회 세척한 후 완료되면 Wash/Storage Buffer로 혼합하여 4℃에 보관하였다.

앞서 제조된 cRGD-magnetic bead를 사용하여 초기 limpoprep gradient로 분리한 혈관내피전구세포에서 cRGD+ 세포를 상기 CD34+ 혈관내피전구세포를 분리한 방법과 같은 방법을 사용하여 분리하였다.

실시예 2. 혈관내피전구세포(endothelial progenitor cell; EPC)에 특이적으로 결합하는 압타머(aptamer) 선별

혈관내피전구세포(endothelial progenitor cell; EPC)에 특정적으로 결합하는 압타머(aptamer)를 탐색하기 위한 방법으로 SELEX 방법(도2)를 사용하였다. 여기에 사용되는 압타머 라이브러리는 앞뒤에 18bp의 프라이머 결합 서열을 제외하고 중간에 60개의 무작위적 염기서열을 배열한 라이브러리를 합성 (제노텍)하였다.

ATCGTAACGTCGATCGAT(SEQ#1)-(N)60-TCGAACGTAGTACATGCA(SEQ#2)

합성된 라이브러리의 경우 정제과정 없이 본 실험에 사용하였다(15nmol, 5nmol use/each experiment). 실시예 1에서 분리한 CD34+ 혈관내피전구세포와 cRGD+ 혈관내피전구세포에 대하여 각각 제조된 압타머 라이브러리를 사용하여 결합시킨 후, magnetic separation 컬럼을 이용하여 분리 정제한 뒤, PCR의 template로 사용하기 위하여 95℃에서 10분간 가열한 뒤 급속도로 얼음에서 냉각시킨 뒤 원심분리하여 그 상층액들을 PCR의 template들로 사용하였다.

PCR의 template, binding buffer(per liter/ 4.5g Glucose, 100mg tRNA, 1g BSA, 1M Mgcl2 5ml), 혈관내피전구세포를 혼합하여 상온에서 1시간 일정하게 유지한 다음 MS Columns(Miltenyi Biotec)으로 분리 정제하여 하였다. 분리한 상측액중, 일부를 CD34+ 혹은 cRGD+ 혈관내피전구세포에 결합한 압타머의 PCR 증폭을 위한 template로 사용하여 증폭한 뒤(도3), Topo TA cloning vector에 ligation 시켰다

Subcloning 된 cRGD+ EPC에 결합했던 aptamer들 96개, CD34+ EPC에 결합했던 aptame들 96개, 모두 plasmid DNA preparation kit(코스모진텍)를 사용하여 분리 정제하여, 이 들 192개 aptamer 염기서열을 결정하기 위하여, Topo TA vector MuLti cloning site 내에 존재하는 M13fw primer를 이용하여 DNA 서열을 분석(제노텍)하였다.

실시예 3. 혈관내피전구세포(endothelial progenitor cell; EPC)에 특정적으로 결합하는 압타머(aptamer) 서열 분석

실시예 2에서 분석된 염기 서열간의 유사성을 비교 분석하기 위하여, DNA 염기서열 중 최초의 압타머 라이브러리를 제조 시, 양옆의 프라이머 site는 제거하고 가운데 60 nucleotide의 염기서열 만의 추출은 Gene Runner Software(free ware)를 이용하여 추출하였다. 또한 염기서열의 reverse complementary 서열을 제작하여 총 384개의 염기서열을 윈도우의 notepad 소프트웨어를 사용하여, FASTA format으로 저장하고, 한 개의 파일로 저장한 뒤, ClustralX software(free ware)를 이용하여 염기서열을 배열하였다. 이를 Genedoc software(free ware)를 이용하여 import하고 이렇게 배열된 염기서열을 비교 분석하여 유사성(60% 이상)을 보이는 염기서열 3 ~ 77로 표시되는 75개의 cRGD+ EPC에 특이적으로 결합할 것으로 예상되는 압타머를 선별하였다(도4).

실시예 4. 혈관내피전구세포(endothelial progenitor cell; EPC)에 특이적으로 결합하는 압타머(aptamer)의 결합능력 분석

상기 압타머 75개의 염기 서열이 3차원 구조를 지녀 cRGD 양성 혈관내피전구세포에 특이적으로 결합하는 지를 확인하기 위하여, CD34+ 혈관내피전구세포를 anti-human CD133 Antibody(porcine reactive)로 immuno-staining(anti- mouse IgG Alex594 2^nd antibody: red fluorescent, 594nm emission) 하여 확인하고, 이렇게 염색된 EPC세포에 동시에 78개의 압타머의 5'- 끝에 fluorescein이 붙어 있는 압타머들을 제조(FITC labelled primer: 499nm emission)하여 결합시켜 표지된 형광을 관찰하였다(도 5)

즉, Fixative solution (4% formaldehyde in PBS) 으로 30분동안 세포를 고정시킨 다음 PBS로 세척한 후Permeabilization Solution (0.1% Triton X-100 in PBS)을 첨가하여 10분 유지하고 원심분리를 통하여 불순물을 제거하고, Blocking buffer (3% BSA in PBS) 200 μl 첨가하여 상온에서 1시간 유지하고 Primary Antibody, Secondary Antibody 단계적으로 붙인 후 PBS로 세척한 뒤, 마지막으로 Vector shield 10μl 혼합하여 coverslip에 접착하여 고정시켜 형광현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 양성 컨트롤(CD34+ 혈관내피전구세포에 결합하는 압타머, pcd4_21, pcd4_45, pcd5_15)과 상기 75개의 염기서열 중, 서열번호 3 또는 4로 표시되는 압타머들(pR3_21, pR3_24)이 서로 동일한 EPC에 염색되는 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Jeonnam Bioindustry Foundation <120> Nucleic Acid Aptamer Capable of Specifically Binding to cRGD Positive Endothelial Progenitor Cell and Use Thereof <130> P13-B130 <160> 77 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer #1 <400> 1 atcgtaacgt cgatcgat 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer #2 <400> 2 tcgaacgtag tacatgca 18 <210> 3 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_21 <400> 3 cagtaggctg tgccccgctc ggtgtcgtat tctcttcttt gttctgatga ctagttgttg 60 c 61 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_24 <400> 4 ggcaccagat ggagtttgcc accatatgtg tgggtgcaaa tttttaccag tttttgctgt 60 60 <210> 5 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR2_01 <400> 5 atagatcgga aatcatcaat gaaaagtaaa ataaacgcag actagcaaat aagtatcgcg 60 60 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR2_02 <400> 6 cctccatgta cgtggcgtat cttgcagtcc tgtcccctcg tggtggcttt gtttttctcg 60 60 <210> 7 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR2_04 <400> 7 gaacacaaat acaataacgc catttaggac ataattaacg ctgtgccgcc ggccctccca 60 60 <210> 8 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR2_05 <400> 8 gggaactgat ctagtaagcg aaacgcctag tctcatggga gttttggaga ctatattca 59 <210> 9 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR2_06 <400> 9 tcaggtgact tggcctctac gcnaaactnc atgctgncta aaacggnagg atgatgnatg 60 nagngcaga 69 <210> 10 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR2_07 <400> 10 tgggcccggg tctatataat caggaatatg ttgctgcata ggacaaaagc gcgcgtgggt 60 60 <210> 11 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR2_08 <400> 11 caacagacta ccccctgact caaaaacagt agaaagtagc tcggacaatg agacgggcag 60 60 <210> 12 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR2_09 <400> 12 ccggacgatt ctgtgcctta tcagtacttc tgtatttctg gttggtaacg cgggttttgt 60 60 <210> 13 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR2_10 <400> 13 cgtctgtggg tgctgagcct gcgcggatcg ttcgtcagga acgggctgat ggaggttgcg 60 60 <210> 14 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR2_12 <400> 14 cgcaagtggg tgttagaata aatcggtacg tgttgctcct gaagattttc ctataggcgg 60 60 <210> 15 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR2_13 <400> 15 tcgtcgcaag ggaagatggc aaaacaccaa ggtacggtag cccaagtgcc acgacgcgcc 60 60 <210> 16 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR2_14 <400> 16 caccactgca ataatatctt atccactgtt gtgcaattga ataagctggt ataagggcg 59 <210> 17 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR2_16 <400> 17 gaataattcg gaccccacga gtgcatcagt gtcgaaatcc ggcttttagt ggtttcctgc 60 60 <210> 18 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR2_17 <400> 18 gcgaacttgc cttgaccgtt aagacgagca ggcacagtgc taatccatat tctaggcttg 60 60 <210> 19 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR2_18 <400> 19 ggaacccaga cgtataatcc tcgacggact aaaggactag ggcgaaagac ttcactgtcg 60 60 <210> 20 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR2_19 <400> 20 gcgcaaagcc atgcgggcct tactcctcca tctttttttg tgcccgacat ggcaagtagg 60 60 <210> 21 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR2_20 <400> 21 ctcgtagcgt ttagcccgca gctgattgcg atggggatcg cttgtgtgca aggggtttcg 60 60 <210> 22 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR2_22 <400> 22 cgcaacaaga gggcatggca ctgacggttt actagcaaaa cattattata tggttagttc 60 60 <210> 23 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR2_24 <400> 23 gcccatacat cctggattat ttcactggca tctgtctttg ttcagctgca gcccacaagc 60 60 <210> 24 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR2_26 <400> 24 ggaaacagaa cctctgcgag cccctggtcc acgttgtccg agtttttcct aggcccgtcg 60 60 <210> 25 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR2_29 <400> 25 accacgccag gattccagat caagggctta acgcctgaag cgttggcgca cggagttgc 59 <210> 26 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR2_30 <400> 26 gttagtaatt aactatctat gtgcccttat ggctcctgcg tatatggaag tgttgtgtgc 60 60 <210> 27 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR2_32 <400> 27 cgcaccacac agaaggcaac cttatttacg ctgtacaatt actatggggc ctcattcccg 60 60 <210> 28 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR2_33 <400> 28 acggtacgat acgggggggg ggtggtttca tcgcgggtgg atctatcggt tgtccaagc 59 <210> 29 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR2_34 <400> 29 cgcccctcgn ttcgcaatcg gacgcactgg aaccggttgt ttgaccttac attgtgctc 59 <210> 30 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR2_35 <400> 30 gcaagagaac cagctcccac ggcaaggagg gctggccgcc cactatcggc tagctggggc 60 60 <210> 31 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR2_36 <400> 31 cacgatggnc gatcttggac ggantttgac tcttagctca atgttcaggt tgctggttgg 60 60 <210> 32 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR2_37 <400> 32 agtcctggca agcactcaga tgaccacact ttaaggtttt 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<223> pR2_48 <400> 39 atgaatcaag cataacacag actggctgcn nanatnngng nncattacng aaattgcggt 60 gc 62 <210> 40 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_02 <400> 40 aacaatggaa aaggggttga atttctagaa aatctctgag taatacgaga gggaggttgc 60 60 <210> 41 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_03 <400> 41 gtcctattag cgcagtttgc catggccaac ggctgtctgg tggggcatca cctgctcgca 60 60 <210> 42 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_04 <400> 42 ctgagtacta agctgcgcac ccgtggattg ctgtatcaca gtcgacccgt gagtcctta 59 <210> 43 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_06 <400> 43 agcagattac agacctatac tgaacttggc aagctggtcc attgtcttcc cacgcagca 59 <210> 44 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_07 <400> 44 tgtccgaggt gttgtgatac ggttagtata tagacgtgcc gtctagacgc ggacatcgg 59 <210> 45 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_08 <400> 45 acgacatcgc agtgtacgcc actactcagc tctgctcttc actattgctg gtcgtgtacg 60 60 <210> 46 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_11 <400> 46 cgggatatgg acgtagtact catttagaac ttggtattct gaaagctcac tgggtaaact 60 60 <210> 47 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_12 <400> 47 cgttcgagtg gcggcatgtt gctatcagca gcatttaaca tacgatcggc tcgttaaacg 60 60 <210> 48 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_13 <400> 48 gtgaagactt gcacaccggc acctgcggaa gctgaccacg ccacgccgtc accagtatac 60 60 <210> 49 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_14 <400> 49 ggggctgtct gattttttta gagctttgtc gtgatgtgtt ctctattgct atggggtatg 60 60 <210> 50 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_15 <400> 50 aagcagcaga taatcacaag caataggtta agcgtcgacg tcctcaatca aactgggaga 60 60 <210> 51 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_16 <400> 51 ctgcaaagta aactggatgg ctttcttgcc gccaaggatc tgatggcgca ggggatcaag 60 60 <210> 52 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_17 <400> 52 gaggcgaact ggacagaggg accagaatca cagcggccgc ttggtaccac gagtgatttc 60 60 <210> 53 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_18 <400> 53 ggggaatgaa atcactgggg ataggtggaa gcgagtagga atttcctatt acccgcgagg 60 60 <210> 54 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_19 <400> 54 cgactcagct aggaccagct atgccgtctt catgtacaat cctcgaccat gggtcacgca 60 t 61 <210> 55 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_22 <400> 55 gggggcatga gtcaccaaag cgccctgtat atctttaaac tatatccgcg aatctctga 59 <210> 56 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_23 <400> 56 cagtaggctg tgccccgctc ggtgtcgtat tctcttcttt gttctgatga ctagttgttg 60 c 61 <210> 57 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_26 <400> 57 aacatcttcc tcacactaaa tttcctacaa ccctgaaaga atactcaaca taccccggca 60 60 <210> 58 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_27 <400> 58 cgtactggga ctcttttttc ctttgtccta ctgatgtcaa ttcttcactg ttgggctgtt 60 60 <210> 59 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_28 <400> 59 ggagcctata ttgttatggt ccttttcctc cgtggcggcg cagttgctaa gtccgggtac 60 60 <210> 60 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_29 <400> 60 ccctcatctg ggtcgaattt cgtccctgtc ccaccccaac acagcaatgc ccaaagtcgt 60 60 <210> 61 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_30 <400> 61 ggtaattgtt gccctagaga cctcttgtgc aacctccttc gcttataaac ggttaggcca 60 60 <210> 62 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_31 <400> 62 ggggggatca cgtccatgta ggtttggtta attattctgt taactttgag caggatgcgg 60 60 <210> 63 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_33 <400> 63 aacactcatg tattgaacga ccttacggtc cgggtaagtc cccgaagctg gcagccattc 60 60 <210> 64 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_34 <400> 64 gaagctgggg gccggttcga tggcgtgtcc gctgaattag gttatgctcc gttggcgttg 60 60 <210> 65 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_35 <400> 65 agatcacaac agtggagcag acaccagagg gtaggctcta acacagtcgc gcgacgggtt 60 60 <210> 66 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_36 <400> 66 ccagttatct ttttgcgggt ttatttcaga ggatgatttt ggccagattc gtatgtccgt 60 60 <210> 67 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_37 <400> 67 accaggagca tcgcaccctt tcatggagaa tgcttattgc aactagggtt gtgtggtcgg 60 60 <210> 68 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_38 <400> 68 taacacacta aaaataagag acaaaacaaa agaacaaatc aactggaaag tcgcaatagt 60 60 <210> 69 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_39 <400> 69 cgtggcgctt ccgcagctct ggcatggtac tgtgctgtat gtgctaaggc tctattagtt 60 60 <210> 70 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_40 <400> 70 ggataaaacc gggccactga ggagaaaaga aagccaggtt ggtaggcaaa agcgcgccg 59 <210> 71 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_42 <400> 71 tatgcccaaa gggaccggcg aatagtgacc atcctcaatc cttactcaag acccgccaac 60 g 61 <210> 72 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_43 <400> 72 cctccgtagt ggaaagcaag aacaaacgat acaaatcagc taaaatccat cactcaccg 59 <210> 73 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_44 <400> 73 ctgcaaagta aactggatgg ctttcttgcc gccaaggatc tgatggcgca ggggatcaag 60 60 <210> 74 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_45 <400> 74 cgcagatata gaatcagcag aataatttga cggcaagacc acactacccg agttcacgag 60 g 61 <210> 75 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_46 <400> 75 tatcggatgt ctggtatggc ctcttgtgtc attagtttgt taatttagtg cccatagtg 59 <210> 76 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_47 <400> 76 cggcaaacgg agtgtgtggc gtggccttgg tcctggttac ttaagtgtat ctacatagcc 60 60 <210> 77 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pR3_48 <400> 77 cttagaatag cgtacatttc gtgaggcgag tgtaaaaaga aagtgtctta gactagtgcg 60 60

Claims (5)

1. 서열번호 3의 염기서열로 표시되는, cyclic RGD 양성 혈관내피전구세포에 특이적으로 결합할 수 있는 60~120nts의 핵산 압타머.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 핵산 압타머에 포함되는 적어도 1종의 뉴클레오티드의 리보스의 2' 위치의 히드록실기가 수소원자, 불소원자, -O-알킬기, -O-아실기, 및 아미노기 중 어느 하나로 치환된 것임을 특징으로 하는 핵산 압타머.
4. 삭제
5. 제1항 또는 제3항의 핵산 압타머가 그 안쪽에 코팅되어 있는 관상동맥용 스텐트.
   

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