KR101472745B1

KR101472745B1 - 표면개질된 하이드록시아파타이트를 함유하는 생체접착제 및 그의 용도

Info

Publication number: KR101472745B1
Application number: KR1020100114232A
Authority: KR
Inventors: 손영숙; 이은아; 남승우
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2010-11-17
Filing date: 2010-11-17
Publication date: 2014-12-15
Also published as: WO2012067375A9; US9107976B2; US20130078291A1; KR20120053136A; WO2012067375A2; WO2012067375A3

Abstract

본 발명은 표면개질된 하이드록시아파타이트를 포함하는 생체접착제 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 하이드록시아파타이트의 표면에 특정의 연결화합물이 공유결합을 통해 연결된 표면개질된 하이드록시아파타이트를 유효성분으로 함유하는 뼈-뼈간, 뼈-조직간, 뼈-연골간, 뼈-인대간, 뼈와 뼈 사이의 차폐막 또는 인공관절 부착용 생체접착제; 상기 표면개질된 하이드록시아파타이트를 이용하여 금속 보철물의 표면을 코팅하는 방법; 및 상기 방법에 따라 수득한 표면개질된 하이드록시아파타이트가 코팅된 금속 보철물에 관한 것이다.

Description

표면개질된 하이드록시아파타이트를 함유하는 생체접착제 및 그의 용도{Bio-adhesive agent comprising surface-modified hydroxyapatite and use thereof}

손상된 조직을 복구하는 조직공학적 방법으로는, 확장 배양된 세포로부터 조직을 형성시켜 조직을 이식하는 방법, 확장 배양된 세포를 스캐폴드에 심어 이식하는 방법 또는 세포 없이 스캐폴드만을 이식하는 방법이 있다.

연골 재생의 경우, 확장 배양된 세포를 연골분화배지에서 배양하여 연골을 형성시킨 후 이를 연골손상부위에 이식함으로써 연골 재생을 유도할 수 있다. 이 경우, 세포를 주입하는 방법에 비해 확실한 치료효과를 얻을 수 있다는 장점이 있으나, 이식한 연골조직이 기존의 생체조직과 연결을 이루지 못하면 온전한 치료효과를 기대할 수가 없다.

이러한 연결성을 얻기 위하여 봉합을 실시할 수도 있으나, 이러한 경우 봉합에 의해 결합을 이룰 수 있는 구조이어야 하고, 구조상 봉합을 할 수 없는 조직에는 적용하기가 불가능하다. 예를 들어, 연골이나 뼈를 이루는 조직은 봉합에 의해 조직을 연결하는 데에 한계가 있다. 특히, 관절연골이식술과 같이 뼈와 연골간의 연결을 이루고자 하는 경우에는 봉합에 의한 방법이 수월하지 않고, 봉합한 부위에 염증을 유발할 가능성이 있다는 단점이 존재한다. 또한 퇴행성관절염과 같이 광범위하게 일어나는 연골 손상의 경우에는 넓은 면적에 걸쳐 조직의 결합을 이룰 수 있는 방법을 찾기가 어렵다.

이러한 문제점을 해결하기 위하여, 풀의 형태로 사용하여 연골과 연골 사이에 접착효과를 나타내는 생체접착소재가 개발된바 있다. 그러나 이 소재는, 접착면에서 조직간 물질교환이나 소통이 불가능하여 접착면을 경계로 서로 다른 2개의 단절된 연골층을 형성한다는 단점이 있다. 또한 기존에 개발된 생체접착소재는 전층 손상(full-thickness wound)에서 뼈와 연골간의 결합을 이루는 데에 효과적이지 않다.

따라서 목표로 하는 조직재생에 알맞은 새로운 생체접착소재의 개발이 필요한 실정이다.

하이드록시아파타이트는 치아나 뼈 등의 생체내 석회화된 조직을 구성하는 무기물질이다. 하이드록시아파타이트는 칼슘인산화합물 중 가장 높은 결정성을 가지고 있으며, 따라서 분해되는 속도도 그만큼 느리나, 생체내에 존재하는 물질이므로 생체친화성이 높고 여러 뼈 대체제들 중에서 가장 뛰어난 뼈 재생효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.

본 발명자들은 선행 연구를 통하여 목적하는 작용기가 하이드록시아파타이트의 표면에 드러나게 하는 방법을 고안하였다. 구체적으로, 본 발명자들의 선행 출원인 국제특허공개번호 WO 2009/073068호는 하이드록시아파타이트의 표면에 알데히드와 같은 작용기가 드러나도록 유기합성 방법을 이용하여 표면개질을 한 후, 이를 키토산 수용액과 섞어서 겔화시키고 동결건조하여 인공뼈 스폰지를 제조한 것을 개시하고 있다. 그러나 국제특허공개번호 WO 2009/073068호는 키토산과 같은 제2의 성분과의 결합을 개시하고 있을 뿐, 표면개질된 하이드록시아파타이트 단독의 용도에 대해서는 개시하고 있지 않다.

이에, 본 발명자들은 키토산과 같은 제2의 성분의 추가 없이, 표면개질된 하이드록시아파타이트 단독의 용도에 대하여 지속적인 연구를 수행하였으며, 그 결과 표면개질된 하이드록시아파타이트가 뼈와 연골 사이에서 충분한 접착력을 나타내는 것을 발견하고, 새로운 생체적찹소재로서의 가능성을 확인하여, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 표면개질된 하이드록시아파타이트의 새로운 생체접착소재로서의 용도를 제공하는 것이다.

상기한 과제를 해결하고자, 본 발명은 하이드록시아파타이트의 표면에 하기 화학식 (1) 내지 (5)로 구성된 그룹 중에서 선택되는 연결화합물이 공유결합을 통해 연결된 표면개질된 하이드록시아파타이트를 유효성분으로 함유하는 생체접착제를 제공한다.

R₃Si-L-A (1)

R₃Si-L-Y (2)

Y-L-Y (3)

Y-Y (4)

R₃Si-L (5)

상기 식에서

R은 할로겐, C₁ _- ₄알콕시 또는 C₁ _- ₄알킬을 나타내고, 단 3개의 R기 중 적어도 하나는 할로겐 또는 C₁ _- ₄알콕시이며;

L은 치환되거나 비치환된 C₁ _- ₁₇알킬, C₁ _- ₁₇아르알킬, 아릴, 또는 산소, 질소 또는 황으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 헤테로아릴을 나타내고;

A는 할로겐, 이소시아네이트, 토실 및 아지드로 구성된 그룹 중에서 선택되는 이탈기를 나타내며;

Y는 히드록시, 티올, 아민, 암모늄, 설폰 및 그의 염, 카르복실산 및 그의 염, 산무수물, 에폭시, 알데히드, 에스테르, 아크릴레이트, 이소시아네이트(-NCO), 당류(saccharides) 잔기, 이중결합, 삼중결합, 디엔(diene), 디인(diyne), 알킬 포스핀 및 알킬 아르신으로 구성된 그룹 중에서 선택되는, 리간드 교환이 가능한 배위 화합물(coordinate compound)의 반응성 작용기를 나타내며, 상기 반응성 작용기는 연결화합물 분자의 양 말단이 아닌 중간에 위치할 수도 있다.

또한 본 발명은 상기 표면개질된 하이드록시아파타이트를 이용하여 금속 보철물의 표면을 코팅하는 방법 및 상기 방법에 따라 수득한 표면개질된 하이드록시아파타이트가 코팅된 금속 보철물을 제공한다.

본 발명의 표면개질된 하이드록시아파타이트를 유효성분으로 함유하는 생체접착제는 기존의 소재와 달리 접착되는 조직간 단절이 되지 않고 연결성(integration) 있는 접착효과를 얻을 수 있다.

또한 본 발명의 생체접착제는 유효성분인 하이드록시아파타이트 자체가 뼈 형성능을 가지므로, 생체접착제를 뼈와 연골 또는 뼈와 조직 사이에 적용했을 때, 연골 또는 조직이 접착되는 부위에서 국소적으로 뼈의 재생을 촉진시켜 보다 우수한 뼈-연골간 또는 뼈-조직간 접착 효과를 얻을 수 있을 것으로 기대된다.

아울러, 본 발명의 생체접착제를 이용하여 티타늄 등을 소재로 하는 금속 보철물의 표면을 코팅할 경우, 금속 보철물의 표면에 표면개질된 하이드록시아파타이트가 부착되어, 기존 금속 보철물 사용시 문제가 되는 생체조직과의 연결성 문제를 해결할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 표면개질된 하이드록시아파타이트(HA)를 제조하는 과정을 도식화하여 나타낸 그림이다. A는 HA-GPMS(글리시딜옥시프로필트리메톡시실란)의 합성과정이고, B는 HA-EI(에틸이소시아네이트)의 합성과정이며, C는 HA-APS(아미노프로필트리에톡시실란)-TPDA(테레프탈디카르복스알데히드)의 합성과정이다.
도 2는 하이드록시아파타이트 표면의 알데히드 그룹과 아민 그룹간의 결합을 확인하기 위하여, 표면개질된 하이드록시아파타이드(HA-TPDA)와 일반 하이드록시아파타이트(bare-HA)의 키토산 수용액과의 반응과정 및 그 결과를 비교한 사진이다.
도 3은 HA-TPDA를 부착할 대상 조직의 표면에 HA-TPDA과 반응이 가능한 아민 그룹이 존재하는지의 여부를 닌히드린(ninhydrin) 반응으로 확인한 사진이다.
도 4는 표면개질된 하이드록시아파타이트의 접착효과를 확인하기 위하여, 시트(sheet) 형태의 세포를 HA-TPDA로 접착하여 1주 또는 3주 동안 배양 후 남아있는 세포층을 조직학적으로 확인한 사진이다. Bare-HA는 일반 하이드록시아파타이트 적용 그룹이고, HA-TPDA는 HA-TPDA 적용 그룹이다.
도 5는 표면개질된 하이드록시아파타이트의 접착효과를 확인하기 위하여, 덩어리 형태로 배양한 2종의 세포를 HA-TPDA로 접착한 후, 누드 마우스의 피하에 이식하여 8주 후에 조직학적으로 확인한 사진이다. A는 계략적인 실험과정을 나타낸 것으로, 2종의 세포는 칼돌기-유래 기질세포(Xiphoid Process-derived Stromal Cells, XDSCs)와 골수 기질세포(Bone Marrow Stromal Cells, BMSCs)이다. B는 조직학적 사진으로, 연골형성층(chondrogenic layer)은 칼돌기-유래 기질세포로부터 생성된 것이고, 골형성층(osteogenic layer)은 골수 기질세포로부터 생성된 것이다.
도 6은 표면개질된 하이드록시아파타이트의 접착 효과를 확인하기 위하여, 누드 마우스에 이식하여 얻은 ectopic 뼈 조각의 표면에 덩어리 형태로 배양한 골수 기질세포(BMSCs)를 접착한 후 누드 마우스 피하에 이식하는 실험과정을 계략적으로 나타낸 그림이다.
도 7은 도 6의 방법으로 이식한 이식물을 3주 후에 분리하여 확인한 사진이다(A는 육안사진이고, B는 조직학적 염색 결과이다).
도 8은 표면개질된 하이드록시아파타이트의 접착효과를 확인하기 위하여, 토끼의 관절연골 결손모델을 이용하여 HA-TPDA를 연골세포원 이식에 사용한 그림이다.
도 9는 도 8의 방법으로 이식한 이식물을 3주 후에 분리하여 조직학적 염색한 사진이다(연분홍: 연골조직, 진분홍: 뼈조직).
도 10은 티타늄 소재의 보철물 표면에 연결화합물을 적용한 후 HA-TPDA를 결합시킴으로써 보철물의 표면을 개질하는 방법을 도식화하여 나타낸 그림이다.

본 발명의 제1측면은 하이드록시아파타이트의 표면에 하기 화학식 (1) 내지 (5)로 구성된 그룹 중에서 선택되는 연결화합물이 공유결합을 통해 연결된 표면개질된 하이드록시아파타이트를 유효성분으로 함유하는 생체접착제에 관한 것이다.

R₃Si-L-A (1)

R₃Si-L-Y (2)

Y-L-Y (3)

Y-Y (4)

R₃Si-L (5)

상기 식에서

상기 L의 정의 중 C₁ _- ₁₇알킬, C₁ _- ₁₇아르알킬, 아릴 또는 헤테로아릴 상의 치환체는 바람직하게는, 히드록시, C₁ _- ₆알킬, C₁ _- ₆알콕시, 할로겐, 니트로, 아미노, 시아노, 할로C₁ _- ₆알킬, C₁ _- ₆알킬아미노, 디C₁ _- ₆알킬아미노, 아실 및 아실옥시로 구성된 그룹 중에서 선택된 1종 이상이다.

용어 "아릴"은 임의로 치환된 페닐 또는 나프틸을 포함한다.

용어 "헤테로아릴"은 5- 또는 6-원 모노사이클릭 헤테로아릴 또는 9- 내지 12-원 바이사이클릭 헤테로아릴을 포함하고, 이들은 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 1, 2 또는 3 개의 헤테로원자를 함유할 수 있다. 헤테로아릴의 비제한적인 예로는 티에닐, 푸라닐, 피롤릴, 이미다졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 벤조티에닐, 벤조푸라닐, 벤즈이미다졸릴, 벤조옥사졸릴, 벤조티아졸릴 등이 포함된다.

용어 "아실"은 수소원자에 부착되거나(즉, 포르밀 그룹) 임의로 치환된 알킬 또는 알케닐 사슬 또는 헤테로사이클릴에 부착된 카보닐 부분을 의미한다.

국제특허공개번호 WO 2009/073068호는 하이드록시아파타이트의 표면을 개질하는 예시적인 방법들을 개시하고 있다. 다만, WO 2009/073068호는 표면개질된 하이드록시아파타이트를 키토산 수용액과 섞어서 겔화시키고 동결건조하여 인공뼈 스폰지로 이용하는 것을 개시하고 있을 뿐, 표면개질된 하이드록시아파타이트 단독의 생체접착소재로서의 용도는 개시하고 있지 않다.

또한 WO 2009/073068호는 하이드록시아파타이트와 연결화합물이 반드시 -O-Si- 부위 또는 이소시아네이트 부위를 통해 공유결합되어야 한다고 기재하고 있으나, 본 발명의 유효성분인 표면개질된 하이드록시아파타이트는 하이드록시아파타이트와 연결화합물이 반드시 -O-Si- 부위 또는 이소시아네이트 부위를 통해 공유결합되어야 할 필요는 없다. 본 발명의 표면개질된 하이드록시아파타이트는 상기 화학식 (1) 내지 (5)로 구성된 그룹 중에서 선택되는 연결화합물이 공유결합을 통해 표면에 연결되면 충분하다.

본 명세서에서, 다르게 언급하지 않는 한, 용어 "연결화합물"은 상기 화학식 (1) 내지 (5)로 구성된 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 의미한다.

하이드록시아파타이트 표면의 하이드록시 그룹을 이용하여 적용할 수 있는 연결화합물은 매우 다양하며, 대표적인 예는 도 1에 나타난 바와 같이, 글리시딜옥시프로필트리메톡시실란(GPMS), 에틸이소시아네이트(EI) 또는 아미노프로필트리에톡시실란(APS)-테레프탈디카르복스알데히드(TPDA)를 포함한다.

WO 2009/073068호에 기재된 하이드록시아파타이트의 표면을 개질하는 방법 중 하이드록시아파타이트-테레프탈디카르복스알데히드(HA-TPDA)를 제조하는 방법은 다음과 같다. 하이드록시아파타이트(HA)를 하소(calcine)한 후, 아르곤 대기 하에서 아미노프로필트리에톡시실란(APS)(57.3mM, 100ml)과 110℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 수득한 APS가 연결된 하이드록시아파타이트를 톨루엔, 에탄올, 메탄올의 순으로 여러 번 세척한 뒤 건조시켜 HA-APS를 얻는다.

HA-APS를 톨루엔에 분산시킨 뒤, 세게 교반된 TPDA(3g)가 용해된 톨루엔에 마이크로피펫을 이용하여 천천히 첨가한다. 이렇게 얻은 혼합물을 아르곤 대기 하에서 120℃에서 2시간 동안 환류(reflux)하여 APS-TPDA가 표면에 연결된 하이드록시 아파타이트를 얻고, 이를 HA-TPDA라 칭한다. 수득한 HA-TPDA를 톨루엔, 에탄올, 메탄올의 순으로 여러 번 세척한 뒤 진공 건조시켜 HA-TPDA의 분말을 얻는다.

일 구체예에서, 본 발명의 표면개질된 하이드록시아파타이트는 부착된 연결화합물의 말단이 카보닐, 카복시 및 에폭시로부터 선택되는 작용기를 가지며, 이러한 작용기가 뼈, 조직, 연골, 인대 등의 조직에 존재하는 아민기와 반응하게 된다.

본 발명에 있어서, 표면개질된 하이드록시아파타이트의 원료로서 하이드록시아파타이트는 하기로 구성된 그룹 중에서 선택될 수 있다.

1) 천연 및 합성 하이드록시아파타이트;

2) 뼈 또는 치아에서 유래된 생체 아파타이트(biological apatite);

3) M₁₀(ZO₄)₆X₂의 화학식에서 M이 Ca² ⁺, Cd² ⁺, Sr² ⁺, Ba² ⁺, Pb² ⁺, Zn² ⁺, Mg² ⁺, Mn² ⁺, Fe²⁺, Ra² ⁺, H⁺, HaO⁺, Na⁺, K⁺, Al³ ⁺, Y³ ⁺, Ce³ ⁺, Nd³ ⁺, La³ ⁺ 및 C⁴ ⁺로 구성된 그룹 중에서 선택된 치환체로 치환된 아파타이트;

4) M₁₀(ZO₄)₆X₂의 화학식에서 Z가 PO₄ ³ ^-, CO₃ ³ ^-, CrO₄ ³ ^-, AsO₄ ³ ^-, VO₄ ³ ^-, UO₄ ² ⁺, SO₄ ^3-, SiO₄ ⁴ ^- 및 GeO₄ ⁴ ^-로 구성된 그룹 중에서 선택된 치환체로 치환된 아파타이트;

5) M₁₀(ZO₄)₆X₂의 화학식에서 X가 OH^-, OD^-, F^-, Cl^-, Br^-, BO₂ ^-, CO₃ ² ^- 및 O² ^-로 구성된 그룹 중에서 선택된 치환체로 치환된 아파타이트;

6) 분말, 과립, 박막, 다공체, 치밀체, 막대 또는 판의 형태를 지닌 상기 1)의 천연 및 합성 하이드록시아파타이트;

7) 분말, 과립, 박막, 다공체, 치밀체, 막대 또는 판의 형태를 지닌 상기 2)의 생체 아파타이트;

8) 상기 1) 또는 6)의 천연 또는 합성 하이드록시아파타이트를 수용액에 분산시켜 얻은 졸상 또는 겔상의 하이드록시아파타이트;

9) 제1인산칼슘[monocalcium phosphate monohydrate: Ca(H₂PO₄)₂·H₂O], 메타인산칼슘[Ca(PO₃)₂], 제2인산칼슘[dicalcium phosphoate dihydrate: CaHPO₄·H₂O], 제3인산칼슘[tricalcium phosphate: Ca₃(PO₄)₂], 인산4칼슘[tetracalcium phosphate: Ca₄P₂O₉], 인산8칼슘[octacalcium phosphate: Ca₈H₂(PO₄)₆] 및 무정형 인산칼슘 (amorphous calcium phosphate)으로 구성된 그룹 중에서 1종; 및

10) 제1인산칼슘[monocalcium phosphate monohydrate: Ca(H₂PO₄)₂·H₂O], 메타인산칼슘[Ca(PO₃)₂], 제2인산칼슘[dicalcium phosphoate dihydrate: CaHPO₄·H₂O], 제3인산칼슘[tricalcium phosphate: Ca₃(PO₄)₂], 인산4칼슘[tetracalcium phosphate: Ca₄P₂O₉], 인산8칼슘[octacalcium phosphate: Ca₈H₂(PO₄)₆] 및 무정형 인산칼슘 (amorphous calcium phosphate)으로 구성된 그룹 중에서 선택된 1종과 하이드록시아파타이트의 혼합물.

상기 기재된 바와 같이, 하이드록시아파타이트는 분말, 과립, 박막, 다공체, 치밀체, 막대 또는 판의 형태를 지닐 수 있으나, 바람직하게는 분말 형태로 이용한다. 기존의 풀 형태의 생체접착소재와 달리, 본 발명의 분말 형태의 생체접착제는 접착되는 조직간 단절이 되지 않고 연결성 있는 접착효과를 얻는데 보다 바람직하다.

구체적으로, 본 발명자들은 하이드록시아파타이트 결정 분말의 표면에 연결화합물을 부착한 뒤, 연결화합물의 말단에 존재하는 작용기가 수용액 환경에서 아민기와 공유결합을 이룰 수 있다는 것을 확인하였다. 또한 닌히드린(ninhydrin) 반응을 통하여 결합을 이루고자 하는 뼈, 연골, 건 등의 조직들의 표면에 아민기가 존재하고 있음을 확인하여, 알데히드 그룹을 표면에 가지고 있는 하이드록시아파타이트와 이들 조직과의 결합이 가능함을 확인하였다.

또한 본 발명자들은 알데히드 그룹을 표면에 가지고 있는 하이드록시아파타이트를 이용하여 연골 표면에 시트(sheet) 형태의 세포를 여러 층을 부착하고 배양한 결과 일반 하이드록시아파타이트를 적용한 그룹에 비해 시트 형태가 오랫동안 남아있음을 확인하였다. 나아가 골수 기질세포(BMSCs)를 덩어리 형태로 배양한 후 누드 마우스의 피하에서 형성된 ectopic 뼈 조각에 결합시켰을 때 우수한 결합력을 가지고 있음을 확인하였다.

따라서 본 발명의 생체접착제는 뼈와 이식물 간의 접착에 유용하게 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 생체접착제는 뼈-뼈간, 뼈-조직간, 뼈-연골간 또는 뼈-인대간 접착에 유용하게 사용될 수 있으며, 뼈와 뼈 사이의 차폐막 및 인공관절 부착시에도 사용될 수 있다.

본 발명의 제2측면은 상기 표면개질된 하이드록시아파타이트를 이용하여 금속 보철물의 표면을 코팅하는 방법에 관한 것이다. 도 10을 참조하여 설명하면, 금속 보철물 표면에 연결화합물을 적용한 후 표면개질된 하이드록시아파타이트(예를 들어, HA-TPDA)를 결합시킴으로써 보철물의 표면을 개질할 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 금속 보철물의 표면을 코딩하는 방법은 a) 티타늄 소재의 보철물 표면에 아미노프로필트리에톡시실란(APS)을 연결시키는 단계; 및 b) HA-TPDA를 가하여 상기 APS와 HA-TPDA를 결합시키는 단계를 포함한다. 그 결과로, 보철물 표면에 HA-TPDA가 코팅된다.

본 발명의 제3측면은 상기의 방법으로 수득된 표면개질된 하이드록시아파타이트가 코팅된 금속 보철물에 관한 것이다. 표면개질된 하이드록시아파타이트의 하나의 말단은 금속 보철물의 연결화합물(예를 들어, APS)과 결합하고 있고, 자유로운 다른 쪽 말단의 작용기가 뼈, 조직, 연골, 인대 등의 조직에 존재하는 아민기와 반응하게 된다.

따라서 본 발명의 금속 보철물은 표면에 표면개질된 하이드록시아파타이트가 부착되어, 골모세포(osteoblast)가 보철물(implant) 표면에 뼈를 형성할 수 있도록 함으로써 기존 금속 보철물 사용 시 문제가 되는 생체조직과의 연결성 문제를 해결할 수 있을 것으로 기재된다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예

실시예 1: 하이드록시아파타이트 표면개질 및 확인

실란(silane)계 연결화합물로서 글리시딜옥시프로필트리메톡시실란(GPMS) 또는 아미노프로필트리에톡시실란(APS)-테레프탈디카르복스알데히드(TPDA)를 사용하고, 이소시아네이트계 연결화합물로서 에틸이소시아네이트(EI)를 사용하였다. 이들 연결화합물과 하이드록시아파타이트 결정 분말을 톨루엔에 넣고 1시간 동안 110℃로 환류하여 연결화합물이 실란 그룹 또는 이소시아네이트 그룹을 통해 하이드록시아파타이트 표면에 부착되도록 하였다. 이 과정을 도 1에 나타내었다. A는 HA-GPMS의 합성과정이고, B는 HA-EI의 합성과정이며, C는 HA-TPDA의 합성과정이다.

이들 표면개질된 하이드록시아파타이트의 표면의 알데히드 그룹과 아민 그룹간의 결합을 확인하기 위하여, HA-TPDA 및 일반 하이드록시아파타이트(bare-HA)를 각각 키토산 수용액과 혼합하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, HA-TPDA의 경우 5분이 지나기 전에 화학결합이 일어나기 시작하여, 혼합된 용액이 대략 10분 후에는 흐르지 않은 겔 형태로 바뀌었음을 확인할 수 있었다. 반면, 일반 하이드록시아파타이트는 겔 형태로 전환되지 않았다. 이를 통해 HA-TPDA 표면의 알데히드 그룹과 키토산의 아민 그룹간 결합이 일어났음을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 생체조직 표면에 아민 그룹의 존재여부 확인

HA-TPDA와 반응을 이루기 위해서는 연결하고자 하는 조직의 표면에 아민 그룹이 존재해야 하므로, 연결을 이루고자 하는 대상 조직 표면에 아민그룹이 존재하는지의 여부를 확인하였다.

마우스로부터 연골, 뼈, 건(tendon) 조직을 결합조직이 포함되지 않도록 조심스럽게 분리하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, 분리한 조직을 6% 닌히드린 용액 (6% ninhydrin in 98% ethanol)에 넣고 96℃에서 10분간 가열하여 발색 여부를 확인한 결과, 연골, 뼈, 건 조직이 아민기를 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 3: HA - TPDA 의 결합력 확인을 위한 in vitro 배양 실험

토끼의 귀에서 얻은 연골 조직에 HA-TPDA를 뿌리고, 결합되지 않은 HA-TPDA 분말을 털어내었다. 그 위에 시트 형태로 배양한 랫트에서 얻은 골수 기질세포(BMSCs)를 여러 겹으로 붙이고 20% 우태아혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 2mM L-글루타민, 10^-8M 덱사메타손, 10^-4M 아스코브산을 포함하는 알파-MEM배지에서 1주 내지 3주 동안 배양한 뒤, PBS 중의 4% 파라포름알데히드를 이용하여 고정하였다. 고정된 조직을 파라핀 포매한 뒤, 절단하여 조직이 붙어있는 정도를 조직학적 염색을 통하여 확인하고 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 일반 하이드록시아파타이트를 적용한 그룹에 비해 HA-TPDA를 적용한 그룹에서 시트 형태가 오랫동안 남아있음을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 세포 덩어리( clump ) 사이 HA - TPDA 의 결합력 확인을 위한 누드 마우스 이식 실험

래트의 칼돌기(xiphoid process) 연골에서 분리한 세포(rtXDSCs)와 골수에서분리한 세포(rtBMSCs)를 각각 20% 우태아혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 2mM L-글루타민, 10^-8M 덱사메타손, 10^-4M 아스코브산을 포함하는 알파-MEM배지에서 덩어리 형태로 배양한 뒤, 경계면에 HA-TPDA를 적용하여 2개의 세포 덩어리가 서로 결합하도록 하였다. 결합된 세포 덩어리를 누드 마우스의 피하에 이식한 후 8주 후에 이식한 조직을 분리하여 PBS 중의 4% 파라포름알데히드를 이용하여 고정하였다. 고정된 조직을 파라핀 포매한 뒤, 절단하여 조직이 붙어있는 정도를 조직학적 염색을 통하여 확인하고 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5B에 나타난 바와 같이, 연골형성층(chondrogenic layer)은 칼돌기-유래 기질세포로부터 생성되었고, 골형성층(osteogenic layer)은 골수 기질세포로부터 생성되었으며, 두 종류의 세포 덩어리 간의 결합이 밀접하게 이루어진 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 세포 덩어리와 ectopic 뼈 조각 사이 HA - TPDA 의 결합력 확인을 위한 누드 마우스 이식 실험

래트의 골수에서 분리한 세포를 20% 우태아혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 2mM L-글루타민, 10^-8M 덱사메타손, 10^-4M 아스코브산을 포함하는 알파-MEM배지에서 배양한 뒤, 2 x 10⁶개의 세포를 40 mg의 HA/TCP와 1시간 배양하여 세포가 HA/TCP 표면에 결합하도록 하였다. 배양된 세포와 HA/TCP를 누드 마우스의 피하에 이식한 후 15주 이상 두어 ectopic 뼈가 형성되도록 하였다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 형성된 ectopic 뼈 조각을 채취하여 수술용 칼로 표면을 긁어내어 뼈 조직이 드러나도록 한 뒤, HA-TPDA를 적용하여 ectopic 뼈 조각 표면에 래트의 골수 기질세포(rtBMSCs) 유래의 세포 덩어리와 결합이 이루어지도록 하였다. 결합이 이루어진 조직을 다시 누드 마우스의 피하에 이식한 후 3주 후에 이식물을 채취하여 PBS 중의 4% 파라포름알데히드를 이용하여 고정하였다. 고정된 조직을 0.25M EDTA를 이용하여 3주 동안 탈회(decalcification)한 뒤, 파라핀 포매 후 절단하여 조직이 붙어있는 정도를 조직학적 염색을 통하여 확인하고 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타난 바와 같이, 대조군에서는 골수 기질세포 유래의 세포 덩어리가 뼈 조각 표면에 결합되지 않고 측면으로 밀려나 있었으나, HA-TPDA 처리군에서는 부착된 형태를 잘 유지하였고, 결합면이 밀접하게 형성되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 토끼의 자가연골세포이식 ( ACT ) 모델을 이용한 HA - TPDA 의 연골-뼈 간 결합효과 확인

토끼를 마취 후 복부를 포비돈과 알코올로 소독한 후 절개하여 칼돌기를 채취한 뒤 봉합하였다. 수술용 칼을 이용하여 채취한 칼돌기 표면의 결합조직들을 깨끗하게 떼어내고, 잘게 잘라 0.5% 콜라게나제 II를 하룻밤 동안 처리하여 XDSCs 세포를 얻었다. XDSCs를 20% 우태아혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 2mM L-글루타민, 10^-8M 덱사메타손, 10^-4M 아스코브산을 포함하는 알파-MEM배지에서 고농도로 배양하여 덩어리의 형태가 이루어지도록 하였다.

도 8의 사진과 같이, 토끼를 마취 후 무릎관절의 피부를 측면에서 절개하여 관절 표면의 연골이 드러나도록 한 뒤 5 mm 생검 펀치로 연골 손상범위를 표시한 후에 치과용 드릴을 이용하여 연골하 뼈(subchondral bone)가 드러나도록 전층 손상(full-thickness wound)을 형성하였다. 형성된 상처의 표면을 멸균한 거즈로 깨끗이 닦아내고 HA-TPDA를 얇게 뿌렸다. 연골하 뼈 표면에 결합을 이루지 못한 HA-TPDA는 스포이드로 바람을 불어 털어내고, 덩어리 형태로 배양한 자가 세포 유래 XDSCs를 HA-TPDA 위에 덮어 결합이 이루어지도록 한 뒤, 관절낭, 피하층, 피부를 각각 순서대로 봉합하였다.

3주 후에 토끼를 안락사 한 뒤 수술 부위를 절개하여 이식 부위의 뼈를 톱으로 잘라 채취하고 PBS 중의 4% 파라포름알데히드를 이용하여 고정하였다. 고정된 조직을 0.25M EDTA를 이용하여 3주 동안 탈회한 뒤 파라핀 포매 후 절단하여 뼈-연골간 결합 정도를 조직학적 염색을 통하여 확인하고 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에 나타난 바와 같이, 대조군에서는 이식물이 연골 손상 부위와 밀접한 연결을 이루지 못하였으나, HA-TPDA 처리군에서는 이식물이 손상 부위에 우수한 결합력으로 붙어 있음을 확인할 수 있었다.

Claims

하이드록시아파타이트의 표면에 하기 화학식 (2) 내지 (5)로 구성된 그룹 중에서 선택되는 연결화합물이 공유결합을 통해 연결된 표면개질된 하이드록시아파타이트(surface-modified hydroxyapatite)를 단독 유효성분으로 함유하는, 뼈-뼈간, 뼈-조직간, 뼈-연골간, 뼈-인대간, 뼈와 뼈 사이의 차폐막 또는 인공관절 부착용 생체접착제:
R₃Si-L-Y (2)
Y-L-Y (3)
Y-Y (4)
R₃Si-L (5)
상기 식에서
R은 할로겐, C_1-4알콕시 또는 C_1-4알킬을 나타내고, 단 3개의 R기 중 적어도 하나는 할로겐 또는 C_1-4알콕시이며;
L은 치환되거나 비치환된 C_1-17알킬, C_1-17아르알킬, 아릴, 또는 산소, 질소 또는 황으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 헤테로아릴을 나타내고;
Y는 티올, 아민, 설폰 및 그의 염, 카르복실산 및 그의 염, 산무수물, 에폭시, 알데히드, 에스테르, 아크릴레이트, 이소시아네이트(-NCO) 및 당류(saccharides) 잔기로 구성된 그룹 중에서 선택되는, 리간드 교환이 가능한 배위 화합물(coordinate compound)의 반응성 작용기를 나타내며, 상기 반응성 작용기는 연결화합물 분자의 양 말단이 아닌 중간에 위치할 수도 있다.
제1항에 있어서, 하이드록시아파타이트가 하기로 구성된 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 생체접착제:
1) 천연 또는 합성 하이드록시아파타이트;
2) 뼈 또는 치아에서 유래된 생체 하이드록시아파타이트(biological hydroxyapatite);
3) M₁₀(ZO₄)₆X₂의 화학식을 갖는 하이드록시아파타이트:
상기 식에서,
M은 Ca²⁺, Cd²⁺, Sr²⁺, Ba²⁺, Pb²⁺, Zn²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Fe²⁺, Ra²⁺, H⁺, HaO⁺, Na⁺, K⁺, Al³⁺, Y³⁺, Ce³⁺, Nd³⁺, La³⁺ 및 C⁴⁺로 구성된 그룹 중에서 선택되고;
Z는 PO₄ ^3-, CO₃ ^3-, CrO₄ ^3-, AsO₄ ^3-, VO₄ ^3-, UO₄ ²⁺, SO₄ ^3-, SiO₄ ^4- 및 GeO₄ ^4-로 구성된 그룹 중에서 선택되고;
X는 OH^-이다;
4) 분말, 과립, 박막, 다공체, 치밀체, 막대 또는 판의 형태를 지닌 상기 1)의 천연 또는 합성 하이드록시아파타이트;
5) 분말, 과립, 박막, 다공체, 치밀체, 막대 또는 판의 형태를 지닌 상기 2)의 생체 하이드록시아파타이트;
6) 상기 1) 또는 4)의 천연 또는 합성 하이드록시아파타이트를 수용액에 분산시켜 얻은 졸상 또는 겔상의 하이드록시아파타이트;
7) 제1인산칼슘[monocalcium phosphate monohydrate: Ca(H₂PO₄)₂·H₂O], 메타인산칼슘[Ca(PO₃)₂], 제2인산칼슘[dicalcium phosphoate dihydrate: CaHPO₄·H₂O], 제3인산칼슘[tricalcium phosphate: Ca₃(PO₄)₂], 인산4칼슘[tetracalcium phosphate: Ca₄P₂O₉], 인산8칼슘[octacalcium phosphate: Ca₈H₂(PO₄)₆] 및 무정형 인산칼슘(amorphous calcium phosphate)으로 구성된 그룹 중에서 선택된 1종; 및
8) 제1인산칼슘[monocalcium phosphate monohydrate: Ca(H₂PO₄)₂·H₂O], 메타인산칼슘[Ca(PO₃)₂], 제2인산칼슘[dicalcium phosphoate dihydrate: CaHPO₄·H₂O], 제3인산칼슘[tricalcium phosphate: Ca₃(PO₄)₂], 인산4칼슘[tetracalcium phosphate: Ca₄P₂O₉], 인산8칼슘[octacalcium phosphate: Ca₈H₂(PO₄)₆] 및 무정형 인산칼슘(amorphous calcium phosphate)으로 구성된 그룹 중에서 선택된 1종과 하이드록시아파타이트의 혼합물.
제1항에 있어서, 표면개질된 하이드록시아파타이트가 분말 형태인 것을 특징으로 하는 생체접착제.
제1항에 있어서, 뼈-연골간 부착용인 것을 특징으로 하는 생체접착제.
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