KR101472007B1 - 초오의 발효방법 및 이에 따라 수득된 초오 발효액 - Google Patents
초오의 발효방법 및 이에 따라 수득된 초오 발효액 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 초오의 발효방법 및 이에 따라 수득된 초오 발효액에 관한 것으로, (S1) 초오를 수확하여 건조 및 분쇄하는 단계; (S2) 분쇄된 초오를 증기 스팀 처리하는 단계; (S3) 증기 스팀 처리된 초오를 식히는 단계; (S4) 식힌 초오를 에바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주 및 바실러스 나토(Bacillus natto Sawamura) 균주를 1:2 내지 2:1의 중량비로 혼합하여 배양한 배양액을 초오의 총 부피에 대하여 1 내지 10%(w/v)의 양으로 첨가하여 발효시키는 단계; 및 (S5) 맥아 당화효소 및 유산균을 1:1의 중량비로 혼합하여 배양한 배양액을 발효된 초오 발효물의 총 부피를 기준으로 하여 1 내지 10%(w/v)의 양으로 첨가하여 당을 분해하는 단계를 포함하는 초오의 발효방법에 따라 발효된 초오 발효액은 초오의 유용한 성분의 감소없이 독성물질인 아코니틴의 함량이 유의적으로 감소되어 보다 안전하게 식용할 수 있어 당분야에서 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 초오의 발효방법 및 이에 따라 수득된 초오 발효액에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 특정한 균주를 이용하여 초오를 발효시키는 방법 및 이에 따라 수득된 초오내 독성 물질이 감소되어 보다 안전하게 식용할 수 있는 초오 발효액에 관한 것이다.
초오(草烏)는 식물 분류학상 쌍떡잎식물, 미나리아재비과, 초오속에 속하는 여러해살이 식물인 놋젓가락나물, 세잎돌쩌귀, 이삭바꽃, 지리바꽃, 키다리바꽃, 투구꽃 등의 모근과 자근으로 이루어진 덩이뿌리를 통틀어 지칭하며(Lee JH. et al., J. Korean Doc. Emerg. Med. 6:154~161, 1995), 역대 본처서나 한방 의학서에 주로 몸을 따뜻하게 해주는 약으로서 진통, 강심, 이뇨, 보온이나 해열 등에 사용된 것으로 기록되어 있다. 또한, 뇌혈관 질환에 의한 중풍, 실음(失音) 등의 치료에도 효과가 있다고 보고되어 있다.
그러나, 초오에는 아코니틴(aconitine), 하이파코니틴(hypaconitine), 메사코니틴(mesaconitine) 및 데옥시아코니틴(deoxyaconitine) 등의 맹독성 물질들이 포함되어 있어 잘못 사용할 경우 부작용이 일어날 수 있고(Isao K. et al., Chem. Pharm. Bull. 30(2):758~761, 1982), 아주 소량으로도 독성 작용을 나타낼 수 있다. 그럼에도 불구하고 이러한 독성을 갖는 초오의 조제에 있어서 특별한 규정이 없고, 초오의 부작용은 간과된 채 일반적인 약효만이 민간에 알려져 있어 초오의 오남용에 따른 급성 중독 사례가 많이 발생한다(문헌 [Choi DI. et al., J. Korean Soc. Emerg. Med. 13:175~180, 2002], [Fatorich DM., Ann. Emerg. Med. 21:309~311, 1992] 및 [Shi H. et al., Zhougguo Zhong Yao Za Zhi 15:174~177, 1990] 참고).
초오로 인한 중독 증상의 특징적인 임상 양상으로는 전신 및 입 주의의 감각 이상 등의 신경계 증상과 오심과 구토 등의 소화기계 증상, 다양한 심부정맥과 저혈압의 순환기계 증상 등이 알려져 있다. 심부정맥은 심실기외수축, 심실세동, 심실빈맥, 결합 이소성 박동 등으로 다양하게 나타나며, 대부분의 경우는 일시적인 것으로 자연 소실되나 드물게는 심실세동을 초래하여 치명적인 결과를 초래한다(Tai YT. et al., Cardiotoxicity after accidental herb induced aconite poisoning. Lancet 340:1254~1256, 1992).
한편, 아코니틴 등의 알칼로이드 조성은 사용된 아코니텀 속의 종류와 재배시간, 수치방법 등에 의해서 결정되며(Hsu HY. et al., California: Oriental Healing Arts Institute, 368~371, 1986), 초오의 양과 조성 뿐만 아니라, 환자의 중독증에도 영향을 미친다(Pharmacopocia Committee. Beijing: People's health publishing house and chemical technology press 26~28, 211~213, 1990).
아코니틴의 안정적인 사용량은 초기에는 8~12 g으로 알려져 있지만 잔류하는 독성 물질 때문에 많은 양을 사용할 수 없으며, 이로 인한 중독 현상으로 그 사용 권장량도 5~3.0 g으로 감소되었다(Pepper K. et al., Pfluggers Archiv 296: 328~336, 1976).
이와 같은 독성물질을 제거하기 위해 다양한 포제 방법들이 보고되었는데, 그 중 가장 보편적으로 사용되는 방법은 탕포 처리법이다. 그러나 이러한 탕포 처리법의 경우 수세 및 열처리 등으로 인하여 알칼로이드 등 유효성 물질이 다량으로 감소되는 문제점이 있다(Kim HK. et al., Kor. J. Pharmacogn. 33(4):296~300, 2002).
이에 본 발명자들은 이러한 효능을 가지는 초오를 독성의 문제없이 안전하게 식용할 수 있는 초오 발효액을 개발하고자 계속 연구를 진행하던 중 초오를 증기 스팀 처리한 후 초오의 발효에 적합한 바실러스 서브틸리스 균주와 바실러스 나토 균주를 일정한 비율로 혼합하여 배양한 배양액을 초오 발효에 이용하고, 당화효소 및 유산균을 이용하여 당을 분해하는 초오의 발효 방법에 따라 제조된 초오 발효액내에 독성물질의 함량이 대폭 감소되어 보다 안전하게 식용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 초오의 독성이 감소되어 보다 안전하게 식용할 수 있는 초오의 발효방법을 제공하기 위한 관한 것이다.
또한, 본 발명에서 해결하고자 하는 다른 기술적 과제는 상기 방법에 따라 발효된 초오 발효액을 제공하기 위한 것이다.
상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 초오의 발효방법을 제공한다:
(S1) 초오를 수확하여 건조 및 분쇄하는 단계;
(S2) 상기 분쇄된 초오를 증기 스팀 처리하는 단계;
(S3) 상기 증기 스팀 처리된 초오를 식히는 단계;
(S4) 상기 식힌 초오를 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주 및 바실러스 나토(Bacillus natto Sawamura) 균주를 1:2 내지 2:1의 중량비로 혼합하여 배양한 배양액을 상기 초오의 총 부피에 대하여 1 내지 10%(w/v)의 양으로 첨가하여 배양하는 단계; 및
(S5) 상기 배양된 맥아 당화효소 및 유산균을 1:1의 중량비로 혼합하여 배양한 배양액을 상기 발효된 초오 발효물의 총 부피를 기준으로 하여 1 내지 10%(w/v)의 양으로 첨가하여 당을 분해하는 단계.
상기한 다른 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 상기 방법에 따라 발효된 초오 발효액을 제공한다.
이상과 같이 본 발명에 따른 초오의 발효 방법에 따라 발효된 초오 발효액은 초오의 유용한 성분의 감소없이 독성물질인 아코니틴의 함량이 유의적으로 감소되어 보다 안전하게 식용할 수 있어 당분야에서 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
본 명세서에 첨부되는 다음의 도면들은 본 발명의 바람직한 실시예를 예시하는 것이며, 전술한 발명의 내용과 함께 본 발명의 기술사상을 더욱 이해시키는 역할을 하는 것이므로, 본 발명은 그러한 도면에 기재된 사항에만 한정되어 해석되어서는 아니 된다.
도 1은 초오의 발효 방법을 도식화한 것이다.
도 2는 발효 전 초오의 HEK293에 대한 세포 독성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 초오 발효액의 HEK293에 대한 세포 독성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 발효 전 초오의 HepG2에 대한 세포 독성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 초오 발효액의 HepG2에 대한 세포 독성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 초오 발효액의 고성능액체크로마토그래피(HPLC) 정량 분석결과를 나타낸 것이다.
도 1은 초오의 발효 방법을 도식화한 것이다.
도 2는 발효 전 초오의 HEK293에 대한 세포 독성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 초오 발효액의 HEK293에 대한 세포 독성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 발효 전 초오의 HepG2에 대한 세포 독성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 초오 발효액의 HepG2에 대한 세포 독성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 초오 발효액의 고성능액체크로마토그래피(HPLC) 정량 분석결과를 나타낸 것이다.
본 발명에 따른 초오의 발효방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:
(S1) 초오를 수확하여 건조 및 분쇄하는 단계;
(S2) 분쇄된 초오를 증기 스팀 처리하는 단계;
(S3) 증기 스팀 처리된 초오를 식히는 단계;
(S4) 식힌 초오에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주 및 바실러스 나토(Bacillus natto Sawamura) 균주를 1:2 내지 2:1의 중량비로 혼합하여 배양한 배양액을 초오의 총 부피에 대하여 1 내지 10%(w/v)의 양으로 첨가하여 발효시키는 단계; 및
(S5) 맥아 당화효소 및 유산균을 1:1의 중량비로 혼합하여 배양한 배양액을 발효된 초오 발효물의 총 부피를 기준으로 하여 1 내지 10%(w/v)의 양으로 첨가하여 당을 분해하는 단계.
본 발명은 초오를 증기 스팀 처리한 후 초오의 발효에 적합한 바실러스 서브틸리스 균주와 바실러스 나토 균주를 일정한 비율로 혼합하여 배양한 배양액을 초오에 접종하여 초오를 발효시키고 당화효소 및 유산균을 일정한 비율로 혼합한 배양한 배양액을 사용하여 당분해시킴으로써 초오 내에 함유된 독성물질의 함량이 감소되어 보다 안전하게 식용할 수 있다는 사실을 발견하여 완성하였다.
본 발명의 초오의 발효방법에 있어서, 단계 (S2)에서 초오를 증기 스팀 처리하는 공정은 당 기술 분야에 알려져 있는 통상의 방법을 이용할 수 있으며, 이러한 방법은 특별히 한정되지는 않는다. 예컨대, 본 발명에서는 분쇄된 초오를 80 내지 90℃의 온도, 바람직하게는 85℃의 온도에서 30 내지 60분 동안 증기 스팀 처리를 수행하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용되는 초오는 분쇄하여 사용함으로써 증기 스팀 효과를 극대화할 수 있으며, 이러한 스팀 처리를 통하여 이후 발효 공정에서 독성 제거에 보다 효과적일 수 있다.
본 발명의 단계 (S3)에서는 증기 스팀 처리된 초오를 식히는 공정으로서 30 내지 40 ℃의 온도에서 초오를 식히는 것이 바람직하다.
본 발명의 단계 (S4)에서는 상기 식힌 초오를 적합한 발효 균주, 예를 들어 바실러스 균주로서 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주 및 바실러스 나토(Bacillus natto Sawamura) 균주를 혼합하여 배양한 배양액을 첨가함으로써 초오를 발효시키는데, 이 때 바실러스 서브틸리스 균주와 바실러스 나토 균주는 1:2 내지 2:1의 중량비, 바람직하게는 1:1의 중량비로 혼합하는 것이 바람직하다. 상기 혼합 균주는 초오의 총 부피에 대하여 1 내지 10%(w/v)의 양으로 접종하여 초오를 발효시킬 수 있다.
상기 균주를 이용한 발효는 30 내지 40℃, 바람직하게는 35 내지 37℃의 온도에서 4 내지 9일, 바람직하게는 2 내지 5일 동안 pH 6 내지 7에서 수행하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 초오의 발효방법은 상기 단계 (S4) 이후, 맥아 당화효소 및 유산균을 1:1의 중량비로 혼합하여 배양한 배양액을 상기 발효된 초오 발효물의 총 부피를 기준으로 하여 1 내지 10%(w/v)의 양으로 첨가하여 당을 분해하는 것을 특징으로 한다.
이러한 균주의 발효에 의해 수득된 초오 발효액은 독성물질의 함량이 대폭 감소되며, 안전하면서도 다른 다양한 기능성 성분들을 내포하고 있어 취식이 가능하여 매우 유익하다.
이상과 같이 본 발명에 따른 초오의 발효 방법에 따라 발효된 초오 발효액은 초오의 유용한 성분의 감소없이 독성물질인 아코니틴의 함량이 유의적으로 감소되어 보다 안전하게 식용할 수 있어 당분야에서 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
또한, 본 발명에서는 상기 방법에 따라 발효된 초오내 독성성분이 감소되어 안전하게 식용할 수 있는 초오 발효액을 제공한다.
본 발명에 따라 수득된 초오 발효액으로부터 원심분리, 막분리 장치 또는 여과법으로 침전물을 제거하고, 상등액을 회수한 후 회수한 상등액은 그 자체로도 액제로 제조하여 사용하며, 또는 이를 농축 및 동결건조하여 고상, 분말, 과립 등을 제조한 후 통상적인 방법에 따라 통상의 제제 형태, 예를 들어 액체형, 수화성 산제, 유화성 농축물, 정제, 현탁제, 산제 및 수분산성 과립제로 제제화할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1>
초오를 수확하여 건조한 다음 분쇄하고 85℃의 온도에서 40분동안 증기 스팀 처리하였다.
이어서, 증기 스팀 처리된 초오를 35℃의 온도에서 식힌 다음 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주 및 바실러스 나토(Bacillus natto Sawamura) 균주를 입수하여 1:1의 중량비로 혼합하여 배양한 배양액을 상기 스팀 처리된 초오의 총 부피에 대하여 5%(w/v)의 양으로 첨가한 다음 35℃의 온도에서 3일 동안 발효시켰다.
이어서, 맥아 당화효소 및 유산균을 1:1의 중량비로 혼합하여 배양한 배양액을 상기 발효된 초오 발효액의 총 부피를 기준으로 하여 5%(w/v)의 양으로 첨가하여 당을 분해하여 초오 발효액을 제조하였다.
<비교예 1>
수확한 초오에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주 배양액을 초오의 총 부피에 대하여 5%(w/v)의 양으로 접종한 다음 35℃의 온도에서 3일 동안 발효시켜 초오 발효액을 수득하였다.
<비교예 2>
초오를 수확하여 건조한 다음 분쇄하고 85℃의 온도에서 40분동안 증기 스팀 처리하였다.
이어서, 증기 스팀 처리된 초오를 35℃의 온도에서 식힌 다음 바실러스 서브틸리스 균주 배양액을 초오의 총 부피에 대하여 5%(w/v)의 양으로 접종한 다음 35℃의 온도에서 3일 동안 발효시켰다.
<비교예 3>
수확한 초오에 바실러스 서브틸리스 균주 및 바실러스 나토 균주를 입수하여 1:1의 중량비로 혼합하여 배양한 배양액을 초오의 총 부피에 대하여 5%(w/v)의 양으로 접종한 다음 35℃의 온도에서 3일 동안 발효시켰다.
<비교예 4>
수확한 초오에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주 배양액을 초오의 총 부피에 대하여 5%(w/v)의 양으로 접종한 다음 35℃의 온도에서 3일 동안 발효시켜 초오 발효물을 수득하였다.
이어서, 맥아 당화효소 및 유산균을 1:1의 중량비로 혼합하여 배양한 배양액을 상기 발효된 초오 발효물의 총 부피를 기준으로 하여 5%(w/v)의 양으로 첨가하여 당을 분해하여 초오 발효액을 제조하였다.
<시험예 1> 세포 독성 실험
(1) HEK293 및 HepG2의 증식효과 측정
상기 실시예 1에서 제조된 초오 발효액에 대한 세포 독성 실험을 수행하기 위하여, 인간 신장 세포주인 HEK293 및 인간 간 세포주인 HepG2를 ATCC(American Type Culture Collection, USA)에서 분양받아 사용하였다. 배양배지로 10% 소태아 혈청(Fetal bovine serum, FBS, Gibco BRL., Grand Island, NY, U.S.A.), 항생제(anti-biotics)로 페니실린-스테렙토마이신(penicillin-streptomycin) 혼합제(Gibco BRL., Grand Island, NY, U.S.A.)를 포함하는 둘베코 개질된 이글 배지(Dubecco's modified Eagle Medium, DMEM, Grand Island, NY, U.S.A.)를 사용하였으며, 37℃, 5% CO2의 환경에서 배양하였다.
본 발명의 초오 발효액이 대식세포주의 증식에 미치는 효과를 검색하기 위하여 96-웰 플레이트에 HEK293 세포를 4 X 103 cells/well로 분주하고 약재 추출물을 DMSO에 용해하여 농도별로 첨가하였다. 1일간 배양한 후 테트라졸리움 염인 CCK-8 키트 (Cell Counting Kit-8, Dojindo Laboratories, Tokyo, Japan) 용액을 첨가하여 4시간 더 배양한 다음 ELISA 판독기 (Benchmark Plus, BIORAD, U.S.A.)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 초오에 발효처리를 하지 않는 생초오를 사용하였다.
하기 수학식 1에 나타낸 바와 같이 대조군 well의 흡광도에 대한 실험군의 흡광도 비를 %로 산술하였으며, 모든 well의 평균값을 사용하였다.
그 결과는 도 2 내지 도 5에 나타내었으며, 여기에서 도 2는 발효 전 초오의 HEK293에 대한 세포 독성 결과를 나타낸 그래프이고, 도 3은 본 발명의 초오 발효액의 HEK293에 대한 세포 독성 결과를 나타낸 그래프이다. 또한, 도 4는 발효 전 초오의 HepG2에 대한 세포 독성 결과를 나타낸 그래프이고, 도 5는 본 발명의 초오 발효액의 HepG2에 대한 세포 독성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2 및 3에서 보듯이, 초오와 초오 발효액 모두 독성이 나타나지 않은 것을 볼 수 있으나, 특히 초오 발효액 1000 ㎍/㎖에서 발효전 초오보다 독성이 매우 저하되었음을 알 수 있었다.
또한, 도 4 및 5에서 보듯이, 초오와 초오 발효액 모두 독성이 나타나지 않은 것을 알 수 있다.
(2) 고성능액체크로마토그래피(HPLC) 정량 측정
초오의 독성 지표물질인 아코니틴(aconitine)에 대한 정량 분석을 수행하였다. 상기 실시예 1에서 수득한 시료 1g에 메탄올 25ml를 넣고 60분 동안 초음파 추출하였다. 이 과정을 2회 반복한 후 농축하여 메탄올 6 ml에 녹여서 분석을 진행하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에서 보듯이, 초오 발효액의 독성 지표물질인 아코니틴의 함유량은 발효전 초오에 비하여 약 120배 정도 감소된 것을 볼 수 있다.
상기 시험에 이어, 상기 실시예 1에서 수득된 본 발명의 초오 발효액과 비교예 1 내지 4에서 제조된 초오 발효액의 독성 감소 성능을 비교하기 위하여 독성물질 아코니틴의 분해율을 HPLC를 사용하여 측정하였다. HPLC 시스템의 분석조건은 다음과 같다. 캅셀 팩(Capcell Pak) C18 MG(460 x 250 nm I.D., 5 ㎛) 칼럼 및 이동상으로 아세토니트릴(acetonitrile, CH3CN: pH 3.0, 50 mM 포스포릭에시드(phosphoric acid, 6:4, v/w)를 사용하여 일정용매 조성법(isocratic elution)으로 제조하였으며, 유속은 1.0 ㎖/분, 검출기는 UV3001 UV 검출기를 사용하였으며 235 nm에서 검출하였다. 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
| 아코니틴 함량(ppm) | 아코니틴 분해율(%) | |
| 실시예 1 | 12 | 88 |
| 비교예 1 | 67 | 33 |
| 비교예 2 | 54 | 46 |
| 비교예 3 | 73 | 27 |
| 비교예 4 | 50 | 50 |
상기 표 1에서 보듯이, 본 발명에 따른 방법에 따라 제조된 초오 발효액의 경우 아코니틴 분해율이 88%로서 제조된 초오 발효액 내에 독성물질 함량이 대폭 감소된 것을 알 수 있다. 한편, 비교예 1 내지 4에서 제조된 초오 발효액의 경우 아코니틴 분해율이 최대 50%에 머무는 것을 알 수 있었다.
<시험예 2> 초오 발효액 내 성분 분석
상기 실시예 1에서 제조된 초오 발효액 내에 함유된 유용성분의 변화를 측정하기 위하여, 고성능액체크로마토그래피 시스템 상의 상대적 면적 비율을 측정하였다.
고성능액체크로마토그래피 시스템 상의 상대적 면적 비율은, 시료 중 생초오군(대조군)의 상대적 면적 비율을 100%라고 가정하여 이에 따른 상대적인 비율로서 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
| 상대적 면적 비율(%) | |
| 대조군 | 100 |
| 실시예 1 | 96.4 |
| 비교예 1 | 54 |
| 비교예 2 | 66 |
| 비교예 3 | 72 |
| 비교예 4 | 71 |
상기 표 2에서 보듯이, 크로마토그래피상에 나타나는 성분들은 주로 알칼로이드 성분이며, 표 2에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 제조된 본 발명의 초오 발효액의 경우 96.4%로 성분의 감소가 거의 없음을 알 수 있었다. 한편, 비교예 1 내지 4의 경우에는 54 내지 71%까지 크게 감소되는 것으로 보아 독성물질 뿐만 아니라 알칼로이드 등의 유용물질까지 함량이 크게 줄어든다는 것을 알 수 있었다.
이상과 같이 본 발명에 따른 초오의 발효방법에 따라 발효된 초오 발효액은 초오의 유용한 성분의 감소없이 독성물질인 아코니틴의 함량이 유의적으로 감소되어 보다 안전하게 식용할 수 있어 당분야에서 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
Claims (6)
- 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 초오의 발효방법:
(S1) 초오를 수확하여 건조 및 분쇄하는 단계;
(S2) 분쇄된 초오를 증기 스팀 처리하는 단계;
(S3) 증기 스팀 처리된 초오를 식히는 단계;
(S4) 식힌 초오에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주 및 바실러스 나토(Bacillus natto Sawamura) 균주를 1:2 내지 2:1의 중량비로 혼합하여 배양한 배양액을 초오의 총 부피에 대하여 1 내지 10%(w/v)의 양으로 첨가하여 발효시키는 단계; 및
(S5) 맥아 당화효소 및 유산균을 1:1의 중량비로 혼합하여 배양한 배양액을 발효된 초오 발효물의 총 부피를 기준으로 하여 1 내지 10%(w/v)의 양으로 첨가하여 당을 분해하는 단계. - 제 1 항에 있어서,
상기 단계 (S2)에서 초오를 80 내지 90℃의 온도에서 30 내지 60분 동안 스팀 처리하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 단계 (S3)에서 증기 스팀 처리된 초오를 30 내지 40 ℃의 온도에서 식히는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 단계 (S4)에서 바실러스 서브틸리스 균주 및 바실러스 나토(Bacillus natto Sawamura) 균주를 1:1의 중량비로 혼합하여 배양하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 단계 (S4)에서 발효가 30 내지 40 ℃의 온도에서 6 내지 7의 pH에서 4 내지 9일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따라 발효된 독성 성분이 감소되어 안전하게 식용할 수 있는 초오 발효액.
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