KR101465596B1

KR101465596B1 - 후기내피전구세포와 혈관성장인자를 함유하는 주입식 마이크로젤 제조방법

Info

Publication number: KR101465596B1
Application number: KR1020140089521A
Authority: KR
Inventors: 조제열; 김평환
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2014-07-16
Filing date: 2014-07-16
Publication date: 2014-11-27

Abstract

본 발명은 후기내피전구세포를 RGD-알지네이트 용액에 혼합하여 현탁액을 제조하는 단계; 혈관내피성장인자(VEGF)와 간세포성장인자(HGF)를 상기 현탁액에 추가하는 단계; 상기 현탁액을 전기분무시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 치료용 주입식 마이크로젤의 제조방법이다.상기 주입식 마이크로젤은 후기내포전구세포등 혈관치료세포의 생존률을 높이고 마이크로젤 안에 함유된 혈관내피성장인자(VEGF)및 간세포성장인자(HGF)등의 혈관성장인자들을 지속적으로 방출하여 더욱 향상된 신혈관 생성효과를 발휘할 수 있다.

Description

후기내피전구세포와 혈관성장인자를 함유하는 주입식 마이크로젤 제조방법 {Method for producing injectable microgel containing outgrowth endothelial cell and growth factors}

본 발명은 나노기술을 줄기세포과 융합시켜 제조한 세포전달체에 관한 것으로 세포의 생존율이 향상되고 신혈관재생능력이 탁월한 허혈성 질환 치료용 주입식 마이크로젤에 관한 기술이다.

관상동맥질환 및 허혈성 혈관 질환 등에 대해 성체줄기세포를 적용하기 위한 전임상 및 연구가 국내/외적으로 매우 활발하게 진행되고 있음에도 불구하고 주입된 줄기세포의 생착률 및 생존률이 저조하며 줄기세포의 혈관 분화 효율이 낮아 결국에는 치료의 효율성이 기대에 크게 미치지 못하고 있다. 혈관생성인자와 줄기세포를 이용한 측부혈관(collateral blood vessel)의 발달 유도를 위해 치료적 혈광신생법(therapeutic angiogenesis) 등이 도입되었으나 (J. Folkman, Seminars in Medicine of the Beth Israel Hospital, Boston. Clinical applications of research on angiogenesis, N Engl J Med, 333 (1995) 1757-1763; F. Sedighiani, S. Nikol, Gene therapy in vascular disease, Surgeon, 9 (2011) 326-335) 세포치료를 위해 주입된 대부분의 치료용 세포들은 질환부위에 주사되었을때 여러가지 문제점이 발생한다. 특히 폐에서 발생되는 세포누적현상, 환부 고착화, 낮은 세포생존율및 주사시 발생하는 세포손상등이 문제된다.(T.J. Kean, P. Lin, A.I. Caplan, J.E. Dennis, MSCs: Delivery Routes and Engraftment, Cell-Targeting Strategies, and Immune Modulation, Stem Cells Int, 2013 (2013) 732742) 또한 세포치료의 효과를 증대시키기 위해 혈관생성을 촉진하기 위해 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor,VEGF), 간세포성장인자(hepatocyte growth factor,HGF), 혈소판유래성장인자-BB(plelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB), 염기성섬유모세포증식인자(basic fibroblast growth factor,bFGF)등을 추가적으로 도입하였고 이들은 줄기세포와 상호보완적으로 혈관생성을 유도하고 기능적으로 안정한 혈관생성에 도움을 주는 것으로 알려졌다.(T.P. Richardson, M.C. Peters, A.B. Ennett, D.J. Mooney, Polymeric system for dual growth factor delivery, Nat Biotechnol, 19 (2001) 1029-1034; R. Cao, E. Brakenhielm, R. Pawliuk, D. Wariaro, M.J. Post, E. Wahlberg, P. Leboulch, Y. Cao, Angiogenic synergism, vascular stability and improvement of hind-limb ischemia by a combination of PDGF-BB and FGF-2, Nat Med, 9 (2003) 604-613). 그러나 이러한 단백질을 이용한 방법의 경우 빠른 분해율 및 짧은 반감기, 그리고 최종적으로 낮은 치료효과등이 문제되고 있다.

성장인자 및 세포치료제의 효과적인 전달을 위해 치료용 세포가 함유된 하이드로겔을 제작하여 이식하는 방법을 통해 치료효과를 유도하였지만, 이는 수술적 방법이 동원되어야 하는 불편함을 초래하였다. 이렇듯 기존의 줄기세포 치료제는 혈관재생을 위한 효능 및 안정성에 한계가 있기 때문에 보다 효과적으로 혈관재생을 할 수 있는 새로운 치료기술 개발이 요구된다.

따라서, 본 명세서 전체에 걸쳐 인용 삽입된 다수의 참조 논문 등은 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용을 명확하게 설명한다

본 발명자들은 줄기세포 특히 후기내피전구세포의 생존율 및 분화능을 확보하기 위한 세포전달체를 개발하고자 노력하였다. 그 결과 후기내피전구세포를 RGD-알지네이트 용액에 혼합하여 현탁액을 제조하고 혈관내피성장인자(VEGF)와 간세포성장인자(HGF)를 상기 현탁액에 첨가한 후 상기 현탁액을 전기분무시킬 경우 후기내피전구세포의 생존율 및 분화능이 탁월해지는 주입식 마이크로젤이 완성됨을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 후기내피전구세포의 활성,생존율 및 분화능이 탁월해지는 마이크로젤을 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 목적 및 이점은 하기의 설명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 후기내피전구세포를 RGD-알지네이트 용액에 혼합하여 현탁액을 제조하는 단계; 혈관내피성장인자(VEGF)와 간세포성장인자(HGF)를 상기 현탁액에 추가하는 단계; 상기 현탁액을 전기분무시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 치료용 주입식 마이크로젤 제조방법을 제공한다.

상기 RGD-알지네이트 용액의 농도는 0.5ug/ml 내지 1.5 ug/ml일 수 있다.

상기 전기분무는 현탁액의 유속이 2ml 내지4ml/h 이고, 전압조건은 9kV 내지 11kV일 수 있다.

상기 전기분무는 현탁액이 주사되는 용액이 80ml 내지 120ml 염화칼슘 용액일 수 있다.

상기 마이크로젤은 직경이 120um 내지 150um 인 비드(bead)형 일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 제조방법에 따라 제조된 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 치료용 주입식 마이크로젤을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 마이크로젤을 포함하는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 주입식 마이크로젤은 후기내포전구세포등 혈관치료세포의 생존률을 높이고 마이크로젤 안에 함유된 혈관내피성장인자(VEGF)및 간세포성장인자(HGF)등의 혈관성장인자들을 지속적으로 방출하여 더욱 향상된 신혈관 생성효과를 발휘할 수 있다.

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도 1은 RGD-알지네이트 마이크로젤의 전기분무시 유속에 따른 RGD-알지네이트 마이크로젤의 형태적 특성을 나타낸 사진으로 도1의 a는 유속이 2ml/H인 경우이고 도1의 B는 유속이 3ml/H인 경우이며, 도1의 C는 유속이 4ml/H인 경우, 도1의 D는 유속이 5ml/H인 경우이다.
도 2는 마이크로젤의 제조시 RGD-알지네이트 와 CaCl₂의 농도에 따른 마이크로젤의 지속적 방출효과를 나타낸 그래프이다.
도 3는 마이크로젤의 시간별 세포 증식 효과를 보여주는 이미지이다.
도 4은 전기분무후의 마이크로젤에 함유된 세포의 생존률을 LIVE/DAED 세포염색키트를 통해 나타낸 형광이미지이다.
도 5는 RGD-알지네이트 마이크로젤에 의해 포집된 후기내피전구세포 및 혈관성장인자의 혈관 유도 효과를 나타낸다.
도 6는 Ex vivo 대동맥 발아 분석실험(aortic sprouting assay)의 결과를 나타낸 것으로 도6(a)는 대동맥고리에서 발아된 혈관의 이미지이며 도6(b)는 발아된 혈관의 갯수 분석값을 나타낸 그래프이다.
도 7은 RGD-알지네이트 마이크로젤에 포집된 후기내피전구세포 및 성장인자의 조합을 통해 향상된 혈관생성효과를 실험한 사진이다.
도 8은 RGD-알지네이트 마이크로젤에 포집된 후기내피전구세포 및 성장인자의 조합을 통해 향상된 혈관생성효과의 실험결과이다.
도 9은 허혈성 하지 모델의 조직학적 분석실험 (Histological analysis of the ischemic limbs)결과이다. 도9(a)는 헤마톡시린-에오진-염색 이미지(hematoxylin-eosin-stained image)와 vWF-염색 이미지이고 도 9(b)는 vWF 면역염색법을 사용하여 모세혈관밀도 측정한 결과값을 나타낸 그래프이다.
도 10은 기존의 하이드로겔과 본 연구에서 발명된 주입식 다기능성 마이크로젤의 혈관유도능 비교실험결과를 보여준다.

본 발명은 후기내피전구세포와 혈관성장인자를 함유하는 주입식 다기능 마이크로젤 제조방법 및 이로 인해 제조된 주입식 마이크로젤에 관한 것이다.

이하 본 발명의 후기내피전구세포와 혈관성장인자를 함유하는 주입식 다기능 마이크로젤 제조방법에 대해 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명인 허혈성 질환 치료용 주입식 마이크로젤 제조방법은 후기내피전구세포를 RGD-알지네이트 용액에 혼합하여 현탁액을 제조하는 단계; 혈관내피성장인자(VEGF)와 간세포성장인자(HGF)를 상기 현탁액에 추가하는 단계; 상기 현탁액을 전기분무시키는 단계를 포함한다.

허혈성 질환 치료용 주입식 마이크로젤을 제조하기 위하여 본 발명에서는 먼저 후기내피전구세포를 RGD-알지네이트 용액에 혼합하여 현탁액을 제조하는 단계를 거치게 된다.

주지된 바와 같이 RGD-알지네이트에서 알지네이트는 수용성의 생체적합성 중합체에 해당하며, 자연적으로 음이온성 폴리머로서, 2가 이온의 존재하에서 교차결합에 의해 젤상태가 된다. 알지네이트는 높은 생체적합성때문에 바이오의과학 분야에 적용될 수 있는 바이오소재이며, 약물,단백질 그리고 세포등의 전달을 위한 하이드로겔을 생산하기 위해 사용된다. 특히 최근에 나노기술을 접목하여 개발된 새로운 세포봉입기술로서 목적부위에서의 치료세포의 안정성 및 활성을 증가시키기 위해 사용가능하며, 숙주의 면역반응에 대해 우수한 보호효과가 탁월하여 세포의 안정성을 유지한다. RGD-알지네이트에서 RGD는 아르지닌-글리신-아스파트산으로 구성된 펩타이드이며 알지네이트에 콘쥬게이트된다.RGD 펩타이드는 세포 고정,효력,분해성등을 향상시키기는 역활을 수행한다.

내피전구세포(endothelial progenitor cells,EPCs)는 심근 족부허혈을 위한 측부혈관(collateral blood vessel)발달을 유도하는 것으로 알려져 있으며, 내피전구세포는 크게 전기내피전구세포와 후기내피전구세포로 분류된다. 둘다 줄기세포와 같은 효능을 보인다. 이들중에서 outgrowth endothelial progenitor cells(OECs)라고 지칭되는 후기내피전구세포는 전기 내피전구세포에 비해 보다 강한 내피세포성을 갖는다고 알려져 있다. 둘다 여러가지 신생혈관 사이토카인을 분비하며, 이로인해 후기내피전구세포는 혈관질환의 치료를 위한 약리적 효과를 유발한다.

후기내피전구세포와 RGD-알지네이트 용액을 서로 혼합하여 현탁액을 제조한다. 현탁액을 제조하기 위해 후기내피전구세포와 RGD-알지네이트는 균일하게 혼합되며, 전술한 바와 같이 후기내피전구세포를 RGD-알지네이트 용액에 혼합하여 현탁액을 제조한 다음 상기 현탁액에 혈관내피성장인자(VEGF)와 간세포성장인자(HGF)를 추가하는 단계를 거치게 된다. 바람직하게는 상기 혈관내피성장인자(VEGF)와 간세포성장인자(HGF)가 추가된 현탁액은 최종적으로 농도가 0.4 mg/mL~0.6mg/mL 가 되도록 한다.

주지된 바와 같이 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, vegf)는 세포사 감소 및 혈관재생촉진에 관여하며 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor,HGF)도 역시 세포사 감소 및 혈관 재생촉진에 관여한다. 또한 줄기세포와 상호보완적으로 혈관생성을 유도하고 기능적으로 안정한 혈관생성에 기여한다.

바람직한 실시예로서 상기 RGD-알지네이트 용액의 농도는 0.5ug/ml 내지 1.5 ug/ml 이다. 상기 농도에서 벗어나는 경우 방출 초기에 혈관성장인지의 대량방출이 발생하여 혈관성장인자의 방출시간이 짧아진다.

본 발명에 따르면, 전술한 바와 같이 혼탁액에 혈관내피성장인자 및 간세포성장인자를 첨가한 다음 상기 현탁액을 전기분무하는 단계를 거치게 된다.

본 발명에서는 전기분무를 위해 RGD가 결합된 알지네이트 용액, 후기내피전구세포, 혈관성장인자로 이루어진 현탁액을 시린지에 넣고 이를 시린지 펌프에 넣는다. 이후 시린지 펌프의 주사속도를 일정하게 하여 염화칼슘 용액에 상기 현탁액을 떨어뜨린다. 이때 전기장을 형성시키면 염화칼슘 용액에 마이크로젤이 형성된다.

바람직하게는 RGD가 결합된 알지네이트 용액, 후기내피전구세포, 혈관성장인자로 이루어진 현탁액을 80mM~120mM 염화칼슘용액에 전기분무하여 후기내피전구세포 및 혈관성장인자가 포집된 마이크로젤을 제조한다. 염화칼슘용액의 농도가 상기 농도보다 낮은 경우에는 후기내피전구세포 및 혈관성장인자들이 충분히 포집되지 않고 마이크로젤 생성후 초기에 후기내피전구세포 및 혈관성장인자가 대량방출된다. 또한, 상기 염화칼슘의 농도보다 높은 경우에는 혈관성장인자의 방출이 이루어지지 않고 마이크로젤안에 머물게 되어 증가된 치료효과를 기대하기 어렵다.

또한 상기 현탁액은 염화칼슘 용액에 2ml/h 내지 4 ml/h의 속도로 분무되며 이때 9kV 내지 11kV 전압조건에서 수행된다. 상기 전기분무의 속도가 커지는 경우 마이크로젤의 직경이 커지는 경향이 있으며 상기 범위에서 벗어나 4ml/h 보다 커지는 경우 원하는 크기 및 원형 형태의 불균일(heterogeneous) 마이크로젤이 생성되지 않는다.

본 발명에서 바람직하게는 마이크로젤의 직경은 주사를 통해 환부에 주입이 가능한 120um~150um 이며, 비드(bead)형태를 갖는다. 마이크로젤의 직경이 증가할 수록 환부에 주사하기위한 주사바늘의 직경도 증가하며, 마이크로젤의 직경이 150um보다 큰 경우에는 두꺼운 주사바늘로 인하여 마이크로젤의 주사시 환자에게 큰 고통이 유발되고 마이크로젤의 직경이 120um보다 작은 경우에는 충분한 양의 세포 및 혈관성장인자의 포집이 어려워진다.

상기 허혈성 질환은 허혈성 뇌질환 또는 허혈성 심장질환 또는 허혈성 말초혈관질환일 수 있다. 허혈성 뇌질환과 허혈성 심장질환 및 말초혈관질환의 기전은 매우 유사하여 허혈성 뇌질환에 효과를 보이는 경우 허혈성 심장질환이나 말초혈관질환에서도 동일 또는 유사한 효과가 나타날 수 있다. 상기 허혈성 뇌질환은 혈전증, 색전증, 일과성 허혈발작, 뇌경색, 뇌출혈, 지주막하 출혈, 백질 이상증 및 소경색을 포함할 수 있으며, 상기 허혈성 심장질환은 심근경색 또는 협심증을 포함할 수 있다.

상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다. 아울러, 본 발명의 조성물은 허혈성 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하도록 한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

세포배양

후기내피전구세포는 인간 제대혈에서 분리된 것으로 37도, 5% CO₂조건에서 아스코빅산이 제거된 EGMtm-2 (sigle EQutos (LOnza)가 첨가된 내피세포 기본배지-2 (EBM-2; Lonza, Walkersville, MD)에서 유지되었다.

인간배아 신장세포주인 HEK293 는 Dulbecco사의 변형 배지인 Eagle's Medium (DMEM; Gibco-BRL, Grand Island, NY) 에 10% 태야 소혈청( fetal bovine serum,FBS; Gibco-BRL)과 페니실린/스트렙토마이신을 첨가하여 배양하였다.

RGD-alginate 합성

RGD-알지네이트에서 1.0wt% 알지네이트 용액은 1.0g 소디움 알지네이트(FMC Biopolymer, Philadelphia, PA)를 100mL 0.1M 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES)으로 버퍼화된 살린(ThermoScientific, Rockford, IL)에 용해시켜 제조된다. 계속하여 젓다가, 18.1mg N-하이드록시설포숙신이미드(N-hydroxysulfosuccinimide,sulfo-NHS; 시그마 알드리치, St. Louis, MO) 과 16.0mg N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카보디이미드(N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide,EDC; 시그마 알드리치)을 알지네이트 수용액에 첨가한다 .5분후 9.6mg YRGDS(Tyr-Arg-Gly-Asp-Ser) 펩타이드를 수용액에 첨가한다. 몰비율은 NHS : EDC : RGD = 3 : 3 : 1 이다. 펩타이드는 고체형상합성에 의해 제조된다. 혼합물은 반응이 완성되기까지 24시간 젓어준다. RGD-콘쥬게이트 알지네이트는 이틀동안 증류수를 통해 투석에 의해 분리되며 여과하고 보관을 위해 감압 동결건조된다.

마이크로젤 합성

마이크로젤을 합성하기 위해 고전압 공급장치, 시린지 펌프, 스텐인리스-스틸 노즐, 28게이지 시린지 노즐을 포함하는 전기분무장치(NNC-ESP 200, Seoul, South Korea)를 사용하였다. 후기내피전구세포(2 x 10⁶/mL)를 RGD-alginate 용액(1% wt)에 현탁시키고 이를 시린지로 옮긴다. 상기 시린지는 다시 시린지 펌프에 로딩시킨다. 추가로 혈관내피성장인자(VEGF) (R&D 시스템즈, Inc., Minneapolis, MN) 및 간세포성장인자(HGF) (페프로테크, Rocky Hill, NJ)를 세포/RGD-알지네이트 현탁액에 첨가하여 최종 농도가 0.5mg/mL가 되게 한다. 상기 혼합액은 100mM 염화칼슘(CaCl₂) 수용액에 2mL/h~5 mL/h의 속도로 전기분무되며 이때 10kV의 전기장을 걸어주면 염화칼슘 수용액에 마이크로젤이 형성된다. 이후, 포집되지 않은 세포, 성장인자, 겔화되지 않은 알지네이트, 잔여 CaCl₂ 수용액은 팔콘 세포스테레이너 (BD, Franklin Lakes, NJ)을 통해 제거되며, 마이크로젤은 HEPES를 통해 세척된다.

<시험예1>

1.전기분무에 의한 제조된 후기내피세포 포집 마이크로젤

본 연구에서는 최적의 형태, 크기, 세포 포집을 위한 마이크로젤 형성조건을 테스트기 하기위해 서로 다른 조건에서 1% RGD-알지네이트 용액과 후기내피세포를 포함하고 있는 현탁액을 염화칼슘 수용액에 전기분무하였다. 서로 다른 유속조건(2mL/h,3mL/h,4mL/h,5mL/h)에서 전기분무 하였으며 전압은 일정하게 10kV로 고정하였다. 2ml/l~3ml/l 유속으로 분무한 경우 대략 직경 120um 내지 150um의 마이크로젤이 생성되었으며, 유속이 증가할 수록 마이크로젤의 직경은 증가하였다. 게다가 4ml/h 보다 빠른 유속으로 분무되는 경우 원형형태의 마이크로젤이 생성되지 않았다. 결과적으로 유속이 느려질수록 원형 형태의 RGD-마이크로젤을 제조하기에 유리하다. RGD-알지네이트 마이크로젤의 전기분무시 유속에 따른 RGD-알지네이트 마이크로젤의 형태적 특성은 도1에 나타나있다.

2. 마이크로젤 조성에 따른 함유된 단백체의 지속적 방출 및 마이크로젤안에 함유된 세포의 증식 및 생존률 평가

본 연구에서는 마이크로젤 안에 함유된 물질의 장기간 지속적 방출을 보이는 최적의 조성을 확인하고 방출 시간을 측정하였다. 또한, 마이크로젤 안에 함유된 후기내피전구세포가 실질적으로 살아서 증식을 유도하는지와 전기분무에 의해 함유된 세포들의 생존률을 평가하였다.

a) 마이크로젤의 제조시 RGD-알지네이트 와 CaCl ₂ 의 농도에 따른 마이크로젤의 지속적 방출효과

RGD-알지네이트 마이크로젤에 포집된 단백질의 방출을 테스트하기 위해 FITC-컨쥬게이트된 BSA가 포집된 RGD-알지네이트 마이크로젤을 제조하였다. 방출되는 FITC-BSA를 측정하기 위해 FITC-컨쥬게이트 BSA를 탐지하였다. (도2) 도2(A)에서 50mM 염화칼슘 용액에서 바로 방출되는 BSA-FITC의 양은 100mM 염화칼슘용액에서 방출되는 양보다 실질적으로 더 많았다. 이 결과는 50mM 염화칼슘용액에서는 BSA-FITC가 충분히 포집되지 않았음을 의미한다.또한 체내(in vivo) 전달 시스템을 위한 치료 단백질은 불필요한 손실을 막기 위해 100mM 염화칼슘용액에서 포집되어야 함을 의미한다.알지네이트의 농도가 증가하는 경우 포집된 BSA-FITC가 보다 늦게 방출된다. 알지네이트 0.5%/100mM 염화칼슘 조건에서 단백질 샘플의 방출이 완료되기까지 7일이 소모되는 반면 알제네이트 1.0%/100mM 염화칼슘 조건과 알제네이트 2.0%/100mM 염화칼슘 조건에서는 단백질 샘플의 방출이 완료되기까지 10일이 소모된다. 10일후 2.0%/100mM 염화칼슘 조건에서 평균적으로 BSA-FITC 8.3ug이 남았지만, 1.0%/100mM 염화칼슘 조건에서는 BSA-FITC가 100% 방출되었다. 여러 조건의 마이크로젤 조성 성분 조합에 대해 최적의 방출효율을 보이는 조건을 비교한 결과, 1% RGD-알지네이트와 100mM CaCl₂ 조건에서 형성된 마이크로젤이 초반 시간대에 대량 방출없이 지속적인 방출을 보이는 것으로 확인되었다. (도2)

b) 마이크로젤의 시간별 세포 증식 효과

마이크로젤에 포집된 세포가 실질적으로 증식하는지를 알아보기 위해 상기에서 언급된 전기분무를 이용하여 293T 세포 또는 OECs 세포가 포집된 RGD-알지네이트 마이크로젤을 제조하였다. 293T가 포집된 RGD-알지네이트 마이크로젤을 10 % FBS 처리한 DMEM 에서 21일간 유지하였고, 3일 또는 4일 마다 배지가 교환되었다. 마이크로젤에 포집된 세포들은 형상 대비 이미지 (phase contrast image)를 사용하여 0,3,7,10,14,21일에 각각 관찰되었다. 마이크로젤에 포집된 세포가 실질적으로 시간이 지남에 따라 증식을 유도하는지를 평가한 결과 시간별로 세포증식이 잘 유도되는 것을 확인하였다.(도3) 도3에서 관찰되는 바와 같이 검은색 점이 관찰되는 바와 같이 초기에는 포집된 세포가 상대적으로 적었으나, 시간이 흐름에 따라 점차적으로 세포가 증식하여 세포의 양이 증가하였다.

c) 전기분무후의 마이크로젤에 함유된 세포의 생존률

GFP-플라즈미드로 형질전환된 세포를 포집한 마이크로젤을 이용하여 높은 전압을 이용한 전기분무후 실질적으로 마이크로젤 안에 함유된 세포들의 생존률을 형광라벨링 방법을 통해 분석하였다(도4). GFP 플라즈미드로 형질전환된 293T 세포를 24시간 배양하고, 전기분무를 통해 상기 세포를 마이크로젤 내부에 포집하였다. 세포생존율은 LIVE/DAED 염색키트로 염색된 세포를 직접 카운팅하여 분석하였다. 그 결과 도4에서 전체 257 개의 세포중 226개가 살아있었으며 (녹색), 31개의 죽어있는 세포 (적색)를 확인할 수 있어서 87.9%의 생존률을 보였다. 이는 마이크로젤을 제작하기 위해 사용된 전기분무에 의해서는 심각한 세포독성이 유도되지 않음을 증명한다.

<시험예2>

3. 후기내피전구세포와 혈관성장인자가 함유된 마이크로젤에 의한 혈관유도 기능성 검증

본 연구에서는 실질적으로 후기내피전구세포와 혈관성장인자들에 의해서 혈관유도능을 보일 수 있는지를 평가하였다.

a) RGD-알지네이트 마이크로젤에 의해 포집된 후기내피전구세포 및 혈관성장인자의 혈관 유도 효과

마이크로젤에 함유된 후기내피전구세포및 혈관성장인자들의 방출에 의해서 세포메디아로 방출된 물질들이 혈관을 유도할 수 있는지를 확인하고자 우선 PBS, RGD-알지네이트 마이크로젤, 후기내피전구세포, 후기내피전구세포를 포집하고 있는 마이크로젤, 후기내피전구세포와 혈관성장인자를 모두 포집하고 있는 마이크로젤로 각각 condtioned media를 수득한 다음, 마트리겔(matrigel)에 분주된 인간 제대혈 내피세포(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)에 상기 conditioned media를 처리하였다. 그 결과 도 5에서 보는 것처럼 후기내피전구세포 및 혈관성장인자를 포함하는 마이크로젤 그룹이 다른 그룹들에 비해 혈관튜브-유사 구조가 형성되는 것을 확인할 수 있었고 (도 5(A)) 이를 정량적으로 환산하였을 때 도 5(B)에서 보는 것처럼 높은 튜브 형성 능력을 보였다.

b) Ex vivo 대동맥 발아 분석실험 (aortic sprouting assay)

실질적인 혈관세포 유도능을 확인해 보고자 쥐에서 추출된 대동맥에 후기내피전구세포 및 혈관성장인자들이 함유된 마이크로젤로부터 분비된 물질들이 미세혈관세포들을 유도하는지를 평가해 보았다. 쥐로부터 추출된 대동맥 고리를 트랜스웰(transwell) 시스템의 바닥 패널에 코팅된 매트리겔상에 배양되었고 상부 패널에는 PBS, RGD-알지네이트 마이크로젤, 혈관성장인자, 후기내피전구세포, 후기내피전구세포를 포집하고 있는 마이크로젤, 후기내피전구세포와 혈관성장인자를 모두 포집하고 있는 마이크로젤로 각각 처리하였다.3일간 상기 처리를 실시한 결과, 후기내피전구세포와 혈관성장인자가 함유된 마이크로젤이 처리된 대동맥 고리에서 양성대조군인 혈관성장인자만을 처리한 대동맥 고리만큼 미세혈관이 활발히 유도되는 것을 확인하였다(도6). 도6(a)는 대동맥고리에서 발아된 혈관의 이미지이며 도6(b)는 발아된 혈관의 갯수 분석값 이다. 결국 후기내피전구세포와 혈관성장인자를 포집하고 있는 RGD-알지네이트 마이크로젤에 의한 신혈관생성능을 입증하였다.

c) RGD-알지네이트 마이크로젤에 포집된 후기내피전구세포 및 성장인자의 조합을 통해 향상된 혈관생성효과 실험(in vivo)

위 두 연구에서 확인된 결과를 바탕으로 실질적으로 생체 내 에서 혈관을 유도할 수 있는지를 평가해 보고자 쥐의 피하에 PBS, RGD-알지네이트 마이크로젤, 혈관성장인자, 후기내피전구세포, 후기내피전구세포를 포집하고 있는 마이크로젤, 후기내피전구세포와 혈관성장인자를 모두 포집하고 있는 마이크로젤들을 각각 주사하였다. 주사 후 1주일 뒤, 쥐의 피하에 생성된 혈관을 평가해 보았다. 그 결과, 위 데이터의 결과와 유사하게 후기내피전구세포 및 혈관성장인자가 함유된 마이크로젤에서 가장 두껍고 많은 혈관이 관찰되었다. 또한, 후기내피전구세포만 함유된 마이크로젤의 경우에도 다른 그룹들 (PBS 그룹, 마이크로젤만 처리한 그룹)에 비해 뛰어난 혈관 유도능력이 증명되어 본 연구에 사용된 후기내피전구세포가 좋은 혈관유도물질이라는 것이 다시 한번 입증되었다.(도7)

<시험예3>

4.쥐의 허혈성 하지모델에서 최종 검증된 마이크로젤에 의한 치료효과

본 연구에서는 실질적으로 혈관질환이 유도된 쥐에서의 마이크로젤의 생체 내 평가를 실시하였다.

a) 허혈성 하지 모델의 혈액관류 극복 (The recovery of blood flow perfusion of the ischemic hindlimb, post-surgery)

허혈성 하지모델이 유도된 쥐의 하지(hindlimb)에 PBS, RGD-알지네이트 마이크로젤, 혈관성장인자, 후기내피전구세포, 후기내피전구세포를 포집하고 있는 마이크로젤, 후기내피전구세포와 혈관성장인자를 모두 포집하고 있는 마이크로젤을 근육주사하였다. 주사 후 매주 혈류의 흐름을 측정한 결과, 후기내피전구세포와 혈관성장인자가 함유된 마이크로젤에서 시간이 지날수록 왼쪽다리의 혈류가 증가하는 것을 빨강색이 진해지는 것을 통해 혈관이 잘 생성되었다는 것을 확인할 수 있었다(도 8(a)). 또한, 두 물질이 함유된 마이크로젤보다는 효과가 조금 못하지만 후내기피전구세포만 함유한 마이크로젤에서도 질환이 극복된 것을 확인할 수 있었다. 이를 다시 정량적으로 비교한 결과, 이미지에서 보듯이 시간에 따른 혈류량이 증가하는 것을 도 8(b)에서도 확인할 수 있어서 후기내피전구세포와 혈관성장인자들에 의해 허혈성 하지 모델이 극복되는 것을 최종 확인하였다.

b) 허혈성 하지 모델의 조직학적 분석실험 (Histological analysis of the ischemic limbs)

도 8의 결과에서 향상된 치료효과에 대해 실질적으로 기능성 마이크로젤이 주입된 부위에서 혈관이 많이 유도되었는지를 확인하고자 조직학적 분석실험을 진행하였다. 마이크로젤이 주사된 부위에 새로운 혈관의 생성정도를 알아보기위해 추출된 쥐넓적다리 근육에 vWF IHC를 실시하였다. 그 결과, 혈액관류에서의 결과와 마찬가지로 후기내피전구세포와 혈관성장인자가 함유된 마이크로젤을 투여한 쥐의 하지에서 증가된 혈관 생성을 관찰할 수 있었다(도9).도9(a)에서 상위 패널은 헤마톡시린-에오진-염색 이미지(hematoxylin-eosin-stained image)이며,하위 패널은 vWF-염색 이미지이다.도 9(b)에서는 vWF 면역염색법을 사용하여 모세혈관밀도를 측정한 결과값을 나타낸 그래프이다.

<시험예4>

5. 주입식 다기능성 마이크로젤의 우수성

대부분의 세포치료에 사용 되어지는 하이드로겔과 본 연구에서 발명된 주입식 다기능성 마이크로젤의 혈관유도능을 비교해보고자 각각의 물질 제작 후 쥐의 피하에 처리하여 혈관유도를 관찰하였다. 이를 위해 같은 농도의 물질을 이용하여 하이드로겔과 마이크로젤을 제조하였으며, 쥐의 피하 처리시 하이드로겔은 이식을 하였고, 마이크로젤은 주사를 하였다. 그 결과 도 10에서 보듯이, 주입식 마이크로젤의 경우(도 10(a)), 오른쪽의 두꺼운 혈관이 유도되고 또한 주사 부위에는 적은 양의 마이크로젤이 남아 있는 것을 확인 할 수 있었는데 반해, 도10 (b)의 경우에는 같은 기간 상당히 큰 하이드로겔이 남아 있고 이식 부위에서는 면역반응에 의한 흉터(scar)와 같은 부작용이 유도된 것을 확인할 수 있었다. 같은 생분해성 재료임에서 불구하고 마이크로젤의 경우 같은 기간 분해능이 더 뛰어나고 부작용 없이 혈관신생 및 재생능력이 하이드로겔 시스템에 비해 월등히 뛰어남을 증명하였다.

Claims

후기내피전구세포를 RGD-알지네이트 용액에 혼합하여 현탁액을 제조하는 단계; 혈관내피성장인자(VEGF)와 간세포성장인자(HGF)를 상기 현탁액에 추가하는 단계; 상기 현탁액을 전기분무시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 치료용 주입식 마이크로젤 제조방법.
청구항 1에 있어서, 상기 RGD-알지네이트 용액의 농도는 0.5ug/ml 내지 1.5 ug/ml 인 것을 특징으로 하는 허혈성 질환치료용 주입식 마이크로젤 제조방법.
청구항 1에 있어서, 상기 전기분무에서 현탁액의 유속은 2ml/h내지 4ml/h이고, 전압조건은 9kV 내지 11kV 인 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 치료용 주입식 마이크로젤 제조방법.
청구항 3에 있어서, 상기 전기분무에서 현탁액이 주사되는 용액은 염화칼슘이며 상기 염화칼슘의 농도는 80ml내지 120ml인 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 치료용 주입식 마이크로젤 제조방법.
청구항 1에 있어서, 상기 마이크로젤은 직경이 120um내지 150um인 비드(bead)형인 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 치료용 주입식 마이크로젤 제조방법.
청구항 1 내지 청구항 5중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 치료용 주입식 마이크로젤.
청구항 6의 허혈성 질환 치료용 주입식 마이크로젤을 포함하는 허혈성 질환 용 치료용 약학적 조성물.