WO2018030871A1 - 후기내피전구세포의 포획 및 증식을 위한 hip 스텐트 코팅 조성물 및 이를 이용한 스텐트 - Google Patents

후기내피전구세포의 포획 및 증식을 위한 hip 스텐트 코팅 조성물 및 이를 이용한 스텐트 Download PDF

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WO2018030871A1
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medical device
hip
antibody
progenitor cells
endothelial progenitor
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PCT/KR2017/008810
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조제열
이봄내린
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서울대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a stent coating composition and stent using the same for the capture and proliferation of late endothelial progenitor cells (late EPC).
  • Coronary artery disease refers to a case in which the coronary arteries that supply blood to the heart muscle are narrowed by arteriosclerosis and blood clots, thereby preventing sufficient blood supply to the heart muscle.
  • Coronary artery disease includes angina and myocardial infarction. Treatments for this include medication, coronary balloon dilatation or coronary stent implantation.
  • stent insertion neovascularization and proliferation occur in the stent and blood vessel restenosis still occurs. Damage to the coronary endothelium inevitably occurs during stent insertion, and neointimal hyperplasia occurs, resulting in stent restenosis and stent thrombosis.
  • drug-release stents have been developed, but due to the antiproliferative substance coated on the surface of the drug-release stent, the stent is not well covered with vascular endothelial cells.
  • vascular endothelial cells As a result, a method that can promote re-endothelialization of the stent surface after stent insertion has been studied as an important alternative to prevent stenosis.
  • EPCs Endothelial progenitor cells
  • Late endothelial progenitor cells show significant potential for promoting proliferation and angiogenesis.
  • Another sub-concept of EPC unlike early endothelial progenitor cells (early EPCs), which occur early in the culture of monocytes and exhibit heterogeneous non-proliferative properties, late endothelial progenitor cells are derived from the initial culture of monocytes. Occurs after one day and is homogenous.
  • late endothelial progenitor cells have greater migration potential and capillary tube-producing ability than electric endothelial progenitor cells. For these reasons, endothelial progenitor cells have led to a new paradigm for the treatment of neovascularization in the field of cardiovascular regeneration.
  • HIP Hedgehog-Interacting Protein
  • the antibody was attached to a medical apparatus such as a stent by using an antibody against HIP to induce the capture and proliferation of late endothelial progenitor cells, and consequently, Preventing restenosis, increasing the cell survival rate to resist oxidative stress, and excellent neovascular regeneration ability, can promote re-endothelialization.
  • Patent Document 1 KR2006-0091028 A
  • An object of the present invention is a medical device coating composition which induces the capture and proliferation of late endothelial progenitor cells, wherein the coating composition comprises at least one antibody or fragment thereof in an amount effective for treatment with HIP.
  • the coating composition comprises at least one antibody or fragment thereof in an amount effective for treatment with HIP.
  • Another object of the present invention is a medical device comprising a coating that induces the capture and proliferation of epithelial endothelial progenitor cells on the surface of the medical device, wherein the coating is at least one antibody or an amount thereof effective for treatment with HIP It is to provide a coated medical device comprising a fragment.
  • Still another object of the present invention is to form a matrix coating layer comprising one or more matrices comprising synthetic or natural materials on the surface of a medical device; And (b) adding an effective amount of at least one antibody or fragment thereof to the matrix layer in response to treatment with HIP to form a coating layer on the surface of the medical device to induce capture and proliferation of late endothelial progenitor cells. It is to provide a method of manufacturing a medical device.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for preparing an amine group on a surface of a medical device; (b) activating the carboxyl group of the HIP antibody and (c) adding a carboxyl-activated HIP antibody to the surface of the medical device from which the amine group is derived, thereby binding the HIP antibody to the surface of the medical device.
  • Method of manufacturing a medical device with a coating layer is formed in the induction of capture and proliferation of late endothelial progenitor cells.
  • the coating composition provides a medical device coating composition comprising at least one antibody or fragment thereof in an amount effective for treatment with HIP.
  • the antibody may be a monoclonal antibody.
  • the monoclonal antibody may comprise a Fab or F (ab ′) 2 fragment.
  • the medical device may be a stent.
  • a medical device comprising a coating that induces the capture and proliferation of late endothelial progenitor cells on the surface of the medical device
  • the coating provides a coated medical device comprising at least one antibody or fragment thereof in an amount effective for treatment with the HIP.
  • the coating may further comprise a matrix layer coating the surface of the medical device.
  • the matrix layer may bind to the antibody.
  • the antibody may be a monoclonal antibody.
  • the monoclonal antibody may comprise a Fab or F (ab ′) 2 fragment.
  • the matrix layer comprises polyurethane, fragmented polyurethane-urea / heparin, poly-L-lactic acid, poly-D, L-lactide, cellulose esters, polyethylene glycols, collagen, laminin, heparin, fibrin, elastin, cellulose and carbon It may include any one or more in the group consisting of.
  • the medical device may be a stent.
  • a matrix coating layer of at least one matrix comprising a synthetic or natural material of the medical device; and (b) adding to the matrix layer an amount of at least one antibody or fragment thereof effective in treating the HIP, wherein a coating layer is formed on the surface of the medical device to induce capture and proliferation of late endothelial progenitor cells.
  • a method of manufacturing a medical device is provided.
  • the present invention provides a method for manufacturing a medical device, the coating layer is formed to induce the capture and proliferation of late endothelial progenitor cells.
  • Antibodies to HIP a novel marker of late endothelial progenitor cells, are attached to medical devices and stents to capture HIP positive late endothelial progenitor cells in the blood, promote proliferation of the captured late endothelial progenitor cells, and promote vascular restenosis. Prevent and promote re-endothelialization of blood vessels.
  • FIG. 1 is a schematic diagram for selecting a marker candidate group specific for late endothelial progenitor cells.
  • Figure 2 is to derive a marker specific for the endothelial progenitor cells
  • Figure 2a is the RNA sequencing results
  • Figure 2b is a proteomics analysis results
  • Figure 2c is a marker analysis results derived by RNA sequencing and proteomics analysis.
  • Figure 3 shows the HIP strongly expressed in late endothelial progenitor cells
  • Figure 2a is the result of comparing the HIP mRNA expression level with the housekeeping marker
  • Figure 2b is a Western blot results using anti-human HIP antibody.
  • FIG. 4 is an experiment for proliferation of late endothelial progenitor cells by HIP knockdown
  • FIG. 4a shows quantitative RT-PCR of HIP mRNA expression levels of late endothelial progenitor cells transformed with scramble shRNA or HIP shRNA.
  • Analytical results Figure 4b is an angiogenic Western blot results for HIP protein expression
  • Figure 4c is a comparison of tube production (tube production number) for scramble and HIP shRNA in late endothelial progenitor cells.
  • 4D and 4E show vascular persistence in late endothelial progenitor cells transformed with scramble shRNA (FIG. 4D) or HIP shRNA (FIG. 4E)
  • FIG. 4F shows HIP knockdown in the aorta of mice. This is a result of comparative observation of aortic formation ability.
  • Figures 4g and 4h is a result of comparing the number of blood vessels and the branching performance of the tube.
  • FIG. 5 is a result of analysis of the endothelial progenitor cells of the endothelial progenitor cells when oxidative stress is given after knockdown
  • Figure 5a is a result of viewing the viability of late endothelial progenitor cells transformed with scramble shRNA or HIP shRNA through DAPI (nuclear staining)
  • 5B and 5C show cell proliferation count analysis results and MTT assay results
  • FIG. 5D shows Western blot results of measuring endothelial progenitor cells leading to cell death by activating caspase3.
  • Figure 6 shows the results of EPC capture by the anti-HIP antibody immobilized specimen.
  • Hedgehog-Interacting protein (see SEQ ID NO: 1) refers to a protein that binds to the product of the hedgehog gene family, and corresponds to a regulatory element of the Hedgehog signaling pathway.
  • the hedgehog gene family is an evolutionarily conserved protein and is involved in the fundamental processes in embryonic development, including the control of joint forward and backward patterns and symmetry.
  • Hedgehog signaling pathway is a signaling mechanism that delivers information to embryonic cells that are required for proper development. Different parts of the embryo have different concentrations of Hedgehog signaling protein.
  • 'Medical device' means a device that is temporarily or permanently introduced into a mammal for the prevention or treatment of a medical condition.
  • Such instruments include anything that is introduced subcutaneously, transdermally or surgically and left in the organ, tissue or lumen.
  • Medical devices may include circulating blood vessels such as stents, coated stents such as polytetrafluoroethylene (PTFE) or expanded polytetrafluoroethylene (ePTFE), synthetic grafts, artificial heart valves, artificial heart and prosthetic organs.
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • ePTFE expanded polytetrafluoroethylene
  • Fixtures venous valves, abdominal aortic aneurysm (AAA) grafts, inferior venal caval filters, permanent drug infusion catheters, embolic coils, embolic materials and blood vessels used for vascularization Sutures may be included.
  • AAA abdominal aortic aneurysm
  • Coating the medical device with the compositions and methods of the present invention stimulates the production of endothelial cell layers on the surface of the medical device, thereby preventing restenosis and other thromboembolic complications associated with medical device implantation.
  • 'stent' refers to any medical device that expands the cross-sectional lumen of a blood vessel when inserted into the vessel lumen.
  • the medical device coating composition comprising the HIP antibody is a composition for coating the HIP antibody on the surface of the medical device, it may further comprise a matrix layer.
  • the 'matrix' coating medical devices includes polyurethanes, fragmented polyurethane-urea / heparin, poly-L-lactic acid, poly-D, L-lactide, cellulose esters, polyethylene glycols, collagen, laminin, heparin, fibrin, It may be composed of synthetic or natural materials such as elastin, cellulose and carbon.
  • the matrix may comprise several layers having a first layer composed of synthetic or natural material and a second layer composed of antibody. These layers can be arranged sequentially, with the first layer in direct contact with the stent or synthetic graft surface, one surface of the second layer in contact with the first layer, and the opposite surface in contact with the vascular lumen.
  • the matrix can be noncovalently or covalently attached to the medical device.
  • Antibodies may be covalently attached to the matrix using hetero- or homobifunctional crosslinkers.
  • the medical device coating composition containing the HIP antibody is for coating the HIP antibody on the surface of the medical device, inducing an amine group on the surface of the medical device, activating the carboxyl group of the HIP antibody, and connecting the HIP antibody to the amine group of the medical device.
  • the surface of the medical device can be coated with an antibody.
  • a plasma coating method may be used, and APTES (3-aminopropyltriethoxysilane 10 mM in anhydrous toluene) may be used, but is not limited thereto.
  • Antibody' means a monoclonal or polyclonal antibody that binds to one antigen or functional equivalent of the antigen.
  • the term antibody includes antibody fragments such as Fab, F (ab ') 2 or Fc fragments.
  • Antibodies include a number of individual antibody molecules, corresponding to 6.022x1023 molecules per mole of antibody.
  • HIP antibody' of the present invention means an antibody that specifically binds to HIP, and includes fragments of the antibody.
  • Antibodies of HIP can capture HIP through binding to HIP and block the function of HIP.
  • HIP antibodies can selectively capture late endothelial progenitor cells.
  • Conventional CD34 antibody coated stents are difficult to selectively capture late endothelial progenitor cells present in blood vessels.
  • the HIP antibody which is a surface marker of late endothelial progenitor cells
  • the late endothelial progenitor cells which are just prior to differentiation into endothelial cells, are captured to promote re-endothelialization of the inner surface of the stent and effectively prevent vascular restenosis.
  • the HIP antibody coated on the medical device can selectively trap late endothelial cells and inhibit HIP function of late endothelial cells. When the function of HIP is inhibited, proliferation of late endothelial cells becomes active and tube formation by late endothelial progenitor cells can be promoted.
  • the 'amount of antibody effective for treatment' refers to the amount of antibody that promotes adhesion of late endothelial progenitor cells to a medical device.
  • the amount of antibody necessary for the practice of the present invention will depend on the nature of the antibody used, for example the amount of antibody used will depend on the binding constant between the antibody and the antigen reacting with it. Methods for determining the amount of antibody effective for treatment for use with a particular antigen are well known to those of skill in the art.
  • Example 1 In late endothelial progenitor cells Highly expressed HIP
  • HIP HIP in monocytes
  • eEPC early endothelial progenitor cells
  • LEPC late endothelial progenitor cells
  • HUVEC HUVEC cells
  • Example 2 Late endothelial progenitor cells Tube forming ability Restraining HIP
  • shRNA sequence specific short hairpin RNA
  • Late endothelial progenitor cells have tube structure forming ability in EGM-2 medium treated with VEGF.
  • Late endothelial progenitor cells (LEPC shHIP) treated with HIP knockdown shRNA showed improved peripheral vascular formation compared to SCR shRNA-transformed late endothelial progenitor cell lines (LEPC shSCR) (Fig. 4g and Fig. 4h) and tube expression after VEGF treatment. Time and number of tubes were also measurable (Figs. 4c-4f). As a result, inhibiting the expression of HIP promoted angiogenesis and confirmed that the formed blood vessels lasted long.
  • Example 3 Late endothelial progenitor cells HIP inhibits proliferation
  • cobalt chromium metal specimen (CoCr plate, 10 ⁇ 10 ⁇ 1 mm) was mechanically polished using a 0.3 ⁇ m aluminum oxide suspension.
  • the polished specimen was subjected to plasma treatment for 5 minutes under oxygen flow of 50 sccm and voltage of 50 W using an oxygen plasma equipment (Femto Science, Korea) to induce hydroxyl groups on the surface.
  • 200 ml of anhydrous toluene (Toluene anhydrous, Sigma-Aldrich, USA) was filled in a Teflon reactor, and then a metal specimen was placed in a Teflon holder and completely submerged in anhydrous toluene solution.
  • the fabricated silicon nanofiber specimens were subjected to oxygen plasma treatment under the same conditions as above and reacted with 10 mM APTES (3-aminopropyltriethoxysilane 10 mM in anhydrous toluene) for 2 hours to induce amine groups on the surface.
  • EDC NHS (N- (3-Dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide hydrochloride, N-hydroxysulfosuccinimide, Sigma-Aldrich, USA) was dissolved in MES buffer (2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid buffer) at the same mass ratio. After the antibody (anti-Human HIP antibody) was added to the container containing the specimen and reacted for 2 hours to fix the antibody on the surface.
  • MES buffer 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid buffer
  • Example 4 HIP Antibody Immobilized on Silicon Nanofiber Surfaces Late endothelial progenitor cells Capture and multiplication
  • Endothelial progenitor cells were added to 5% fetal bovine serum, recombinant human vascular endothelial growth factor, and recombinant human fibroblast growth factor-B.
  • growth factor-B recombinant human epidermal growth factor, ascorbic acid, recombinant long R insulin-like growth factor-1, gentamycin sulfate ampo EBM-2 (endothelial basal medium-2, Lonza, USA) containing teramicin sulfate amphotericin-B was incubated in a cell incubator equipped with 37 ° C. and 5% carbon dioxide conditions. The medium was changed every other day and subcultured when 70% to 80% of the culture vessel was full of cells.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the tubes were connected to create conditions under which the medium could flow over the specimen.
  • a medium containing 10,000 EPCs per unit volume was flown using a pump and fluid regulator (ibidi pump, fluidic unit, Ibidi®, Germany) to receive a shear stress of 15 dyne / cm 2 in a constant direction at the bottom. sent.
  • the medium was circulated for 1 hour while the microfluidic chip and the fluid regulator were placed in a 37 ° C. incubator.

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Abstract

본 발명은 후기내피전구세포의 포획 및 증식을 유도하는 의료기구 코팅 조성물에 있어서, 상기 코팅 조성물은 HIP와 반응하는 치료에 유효한 양의 일종 이상의 항체 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 의료기구 코팅조성물 및 이를 이용한 의료기구에 대한 것이며, 상기 코팅조성물을 통해 혈관의 재협착을 방지하고, 혈관의 재내피화를 촉진할 수 있다.

Description

후기내피전구세포의 포획 및 증식을 위한 HIP 스텐트 코팅 조성물 및 이를 이용한 스텐트
본 발명은 후기내피전구세포(late endothelial progenitor cell, late EPC)의 포획 및 증식을 위한 스텐트 코팅 조성물 및 이를 이용한 스텐트에 관한 것이다.
관상동맥질환은 심장 근육에 혈액을 공급하는 관상동맥이 동맥경화와 혈전에 의해 좁아져 심장근육에 충분한 혈액공급이 이루어지지 못하는 경우를 말한다. 관상동맥질환의 종류에는 대표적으로 협심증과 심근경색이 있다. 이를 치료하기 위한 치료법은 약물치료, 관상동맥 풍선확장술 또는 관상동맥 스텐트 삽입술이 있다.
그러나 스텐트 삽입의 부작용중 하나는 스텐트내에 신생내막과증식이 발생하여 혈관의 재협착이 여전히 발생한다는 것이다. 스텐트 삽입중에 필연적으로 발생하는 관상동맥 내피에 손상이 발생하고,이때 신생내막 증식이 발생하게 되어 스텐트 재협착과 스텐트 혈전증이 발병하게 되는 것이다. 이를 방지하기 위해, 약물방출 스텐트가 개발되었으나, 약물방출 스텐트 표면에 입혀진 항증식 물질로 인하여 스텐트가 혈관내피세포로 잘 덮여지지 않는 문제가 발생하였다. 결국 스텐트 삽입후 스텐트 표면의 재내피화(re-endothelialization)를 촉진시킬 수 있는 방법이 혈관의 재협착을 막는 중요한 대안으로 연구되었다.
한편 내피전구세포(Endothelial progenitor cell, EPC)는 내피손상 복구에 중요한 역활을 수행하는 것으로 발견되었으며, 말초혈액으로부터 CD34+ 세포를 분리하면서 발표하였다. 최초 발표 이후, 수많은 연구자들이 말초혈액, 골수, 태아의 간, 제대로부터 EPC를 분리하였다. 이전 연구에서 CD34, CD133, KDR/FLK-1/VEGFR2, VE-cadherin/CD144, Tie-2 또는 이들의 조합과 같은 세포 표면 단백질이 사용되었다.
이 중에서 CD34 항체를 코팅한 스텐트로 재내피화를 촉진시키는 기술이 개발되었으나, 골수조혈모세포의 표면에서 공통적으로 발현되기 때문에 CD34 항체 코팅 스텐트는 혈중 EPC를 선택적으로 붙잡기 어려운 문제가 발생하였고, 결과적으로 재협착을 효과적으로 개선하기 위해서는 다른 방법이 요구되는 실정이었다.
이러한 문제들을 개선하고자, 계속된 연구끝에 EPC의 하위개념으로서, 후기내피전구세포(outgrowth endothelial cells (OECs) , circulating or late EPCs, endothelial colony-forming cells (ECFCs))가 확인되었다. 후기내피전구세포는 증식 및 혈관생성 (angiogenesis) 촉진에 대한 상당한 잠재력을 보여준다. EPC의 또 다른 하위개념이며, 단핵세포의 배양중 초기에 발생하며 이질성(heterogenous) 비-증식성을 보이는 초기내피전구세포(early EPC)와는 달리, 후기내피전구세포는 단핵세포의 최초배양으로부터 14일 경과후 발생하고, 동질성(homogenous)을 보인다. 게다가 후기내피전구세포는 전기내피전구세포보다 더 큰 이동 잠재력 및 모세혈관 튜브-생성능을 갖는다. 이러한 이유 때문에, 후기내피전구세포는 심혈관재생분야에서 신혈관형성 치료법을 위한 새로운 패러다임을 이끌고 있다.
그러나, 후기내피전구세포에 대한 수많은 연구에도 불구하고, 후기내피전구세포를 이용한 세포치료제는 많은 어려움을 겪고 있다. 명확한 후기내피전구세포의 명확한 마커가 존재하지 않기 때문이다. 많은 연구자들이 치료제 개발 성공은 타겟 세포의 분리 및 평가에 달려있다고 지적한다. 아직까지 소수의 단백질이 후기내피전구세포의 분리 및 평가를 위해 사용되고 있다. 예를 들면, Flk-1, VE-cadherin, PECAM-1 및 CD34가 후기내피전구세포의 마커로서 사용되고 있다. 그러나 이것중 어느 무엇도 후기내피전구세포의 마커로서 유용성을 입증하지 못하고 있다. 그러므로, 후기내피전구세포의 분리를 위해, 특이적인 표면 마커를 확인하는 것이 중요하다. 본 발명자들은 질량분석기반의 프로테오믹스 분석을 통해 후기내피전구세포의 고유한 표면마커로서 Hedgehog-Interacting Protein (HIP)를 확인하였고, HIP은 미성숙한 단핵구세포에서 발현되지 않으며 또한 조기내피전구세포에서도 발현하지 않지만 후기내피전구세포에서만 특이적으로 발현함을 확인하였다.또한 HIP에 대한 항체를 이용하여 스텐트등의 의료기구에 상기 항체를 부착하여 후기내피전구세포의 포획 및 증식을 유발하고, 결과적으로 혈관의 재협착을 방지하고,산화적 스트레스에 저항하는 세포 생존율이 높아지며, 신생혈관재생능력이 우수해져, 재내피화를 촉진할 수 있을 것으로 판단된다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 1) KR2006-0091028 A
본 발명의 목적은 후기내피전구세포의 포획 및 증식을 유도하는 의료기기 코팅 조성물에 있어서, 상기 코팅 조성물은 HIP와 반응하는 치료에 유효한 양의 일종 이상의 항체 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 의료기구 코팅조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 의료 기구의 표면상에 후기내피전구세포의 포획 및 증식을 유도하는 코팅을 포함하는 의료기구에 있어서, 상기 코팅은 HIP와 반응하는 치료에 유효한 양의 일종 이상의 항체 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 코팅된 의료기구을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 의료기구 표면상에 합성 또는 천연 물질을 포함하는 한층 이상의 매트릭스로 이루어진 매트릭스 코팅층을 형성하는 단계; 및 (b) HIP와 반응하는 치료에 유효한 양의 일종 이상의 항체 또는 이의 단편을 상기 매트릭스층에 첨가하는 단계를 포함하는 의료기구의 표면상에 후기내피전구세포의 포획 및 증식을 유도하는 코팅층이 형성된 의료 기구의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 a) 의료기구 표면상에 아민기를 유도하는 단계; (b) HIP 항체의 카르복시기를 활성화하는 단계 및 (c) 아민기가 유도된 의료기구 표면에 카르복시기가 활성화된 HIP 항체를 가하여, 의료기구 표면에 HIP 항체를 결합시키는 단계를 포함하는 의료기구의 표면상에 후기내피전구세포의 포획 및 증식을 유도하는 코팅층이 형성된 의료 기구의 제조방법.
상기 목적을 달성하기 위해, 후기내피전구세포의 포획 및 증식을 유도하는 의료기구 코팅 조성물에 있어서,
상기 코팅 조성물은 HIP와 반응하는 치료에 유효한 양의 일종 이상의 항체 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 의료기구 코팅조성물을 제공한다.
상기 항체는 모노클로날 항체일 수 있다.
상기 모노클로날 항체는 Fab 또는 F(ab')2 단편을 포함할 수 있다.
상기 의료기구는 스텐트일 수 있다.
또한, 의료 기구의 표면상에 후기내피전구세포의 포획 및 증식을 유도하는 코팅을 포함하는 의료기구에 있어서,
상기 코팅은 HIP와 반응하는 치료에 유효한 양의 일종 이상의 항체 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 코팅된 의료기구를 제공한다.
상기 코팅은 의료 기구의 표면을 코팅하는 매트릭스층을 더 포함할 수 있다.
상기 매트릭스층은 상기 항체와 결합할 수 있다.
상기 항체는 모노클로날 항체일 수 있다.
상기 모노클로날 항체는 Fab 또는 F(ab')2 단편을 포함할 수 있다.
상기 매트릭스층은 폴리우레탄, 단편화된 폴리우레탄-우레아/헤파린, 폴리-L-락트산, 폴리-D,L-락티드, 셀룰로오스 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 콜라겐, 라미닌, 헤파린, 피브린, 엘라스틴, 셀룰로오스 및 탄소로 이루어진 그룹에서 어느 하나이상을 포함할 수 있다.
상기 의료기구는 스텐트일 수 있다.
또한, (a) 의료 기구를 합성 또는 천연 물질을 포함하여 이루어지는 한층 이상의 매트릭스로 매트릭스 코팅층을 형성하는 단계; 및 (b) HIP와 반응하는 치료에 유효한 양의 일종 이상의 항체 또는 이의 단편을 상기 매트릭스층에 첨가하는 단계를 포함하는 의료 기구의 표면상에 후기내피전구세포의 포획 및 증식을 유도하는 코팅층이 형성된 의료 기구의 제조방법을 제공한다.
또한, (a) 의료기구 표면상에 아민기를 유도하는 단계; (b) HIP 항체의 카르복시기를 활성화하는 단계 및 (c) 아민기가 유도된 의료기구 표면에 카르복시기가 활성화된 HIP 항체를 가하여, 의료기구 표면에 HIP 항체를 결합시키는 단계를 포함하는 의료기구의 표면상에 후기내피전구세포의 포획 및 증식을 유도하는 코팅층이 형성된 의료 기구의 제조방법을 제공한다.
후기내피전구세포의 신규한 마커인 HIP에 대한 항체를 의료기구 및 스텐트에 부착하여, 혈액내의 HIP 양성 후기내피전구세포를 포획하고, 포획된 후기내피전구세포의 증식을 촉진하여, 혈관재협착을 방지하고 혈관의 재내피화를 촉진할 수 있다.
도1은 후기내피전구세포에 특이적인 마커 후보군을 선별하기 위한 모식도이다.
도2는 후기내피전구세포에 특이적인 마커를 도출하기 것으로, 도2a는 RNA 시퀀싱 결과이며, 도2b는 프로테오믹스 분석 결과이며, 도2c는 RNA 시퀀싱과 프로테오믹스 분석에 의한 도출된 마커분석 결과이다.
도3은 후기내피전구세포에서 강하게 발현되는 HIP에 대한 것으로, 도2a는 HIP mRNA 발현수준을 하우스 키핑 마커와 비교한 결과이며, 도2b는 항-인간 HIP 항체를 이용한 웨스턴 블롯 결과이다.
도4은 HIP 녹다운(knock down)에 의한 후기내피전구세포의 증식 여부에 대한 실험으로써, 도 4a는 scramble shRNA 또는 HIP shRNA로 형질전환된 후기내피전구세포의 HIP mRNA 발현수준에 대한 정량 RT-PCR 분석 결과이며, 도4b는 HIP 단백질 발현에 대한 혈관생성능 웨스턴 블롯 결과이며, 도4c는 후기내피전구세포에서 scramble 및 HIP shRNA에 대한 튜브생성능(튜브생성갯수) 비교결과이다. 도4d 및 도4e는 scramble shRNA(도4d) 또는 HIP shRNA(도4e)로 형질전환된 후기내피전구세포에서의 혈관지속능을 관찰한 결과이며, 도4f는 마우스의 대동맥에 HIP 녹다운을 시킨 후 대동맥 형성능을 비교관찰한 결과이다. 도4g 및 도4h는 혈관의 갯수 및 튜브의 가지생성능을 비교한 결과이다.
도5는 녹다운후 산화적 스트레스를 주었을 때 후기내피전구세포의 생존력 분석결과로서, 도5a는 scramble shRNA 또는 HIP shRNA로 형질전환된 후기내피전구세포의 생존력을 DAPI(핵염색)을 통해 본 결과이며, 도5b 및 도5c는 세포증식 카운트 분석결과 및 MTT 어세이 결과이며, 도 5d는 caspase3의 활성화로 세포사멸로 가는 후기내피전구세포를 측정한 웨스턴 블롯 결과이다.
도6은 항-HIP 항체가 고정된 시편에 의한 EPC 포획정도를 나타낸 결과이다.
Hedgehog-Interacting protein (HIP)(서열번호 1참조)은 hedgehog gene family의 산물에 결합하는 단백질을 의미하며, Hedgehog signaling pathway의 조절요소에 해당한다. hedgehog gene family는 진화론적으로 보전된 단백질이며, 관절의 전후방향 패턴 및 좌우 대칭의 조절을 포함하는 배아 발생에 있어서의 기초적인 프로세스와 연관되어 있다. Hedgehog signaling pathway는 적절한 발생에 요구되는 배야세포에 정보를 전달하는 신호전달기작이다. 배아의 서로 다른 부분은 상이한 농도의 Hedgehog 신호전달 단백질을 갖는다.
그러나 HIP에 대한 많은 연구에도 불구하고, 후기내피전구세포에서의 발현 및 역할에 대해서는 연구된 바 없다. 본 발명에서는 후기내피전구세포의 HIP의 생물학적 역활을 발견하였으며, HIP이 후기내피전구세포의 고유한 세포 표면 마커로서 후기내피전구세포의 증식, 혈관생성을 조절할 수 있음을 발견하였다.
'의료기구'는 의학적 상태의 예방 또는 치료를 위하여 포유류에 일시적 또는 영구적으로 도입되는 기구를 의미한다. 이러한 기구에는, 피하, 경피 또는 수술로 도입되어 장기, 조직 또는 관강에 남겨지는 모든 것이 포함된다. 의료기구에는, 스텐트, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 또는 팽창된 폴리테트라플루오로에틸렌(ePTFE)으로 도포된 스텐트와 같은 도포 스텐트, 합성 이식편, 인공 심장 밸브, 인공 심장 및 인공삽입 장기를 혈관 순환에 연결하는 고정장치, 정맥 밸브, 복강 대동맥 동맥류(abdominal aortic aneurysm)(AAA) 이식편, 하방 정맥 대정맥 필터(inferior venal caval filters), 영구 약물 주입 카테터, 색전 코일, 혈관 전색에 사용되는 색전 물질 및 혈관 봉합선이 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법으로 의료 기구를 코팅하면, 의료 기구 표면에 내피 세포층의 생성이 자극되어, 재발협착증 및 의료 기구 이식에 따른 다른 혈전색전증 합병증을 막을 수 있다.
'스텐트'라는 용어는, 혈관 관강 내에 삽입되는 경우에 혈관의 단면 관강을 팽창시키는 모든 의료 기구를 의미한다.
HIP 항체를 포함하는 의료기구 코팅조성물은 의료기구의 표면에 HIP 항체를 코팅하기 위한 조성물로서, 매트릭스층을 추가로 포함할 수 있다.
의료 기구를 코팅하는 '매트릭스'는 폴리우레탄, 단편화된 폴리우레탄-우레아/헤파린, 폴리-L-락트산, 폴리-D,L-락티드, 셀룰로오스 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 콜라겐, 라미닌, 헤파린, 피브린, 엘라스틴, 셀룰로오스 및 탄소등 합성 또는 자연물질로 구성될 수 있다. 매트릭스는 합성 또는 천연 물질로 구성되는 제 1층과 항체로 구성되는 제 2층을 갖는 수개의 층을 포함하여 이루어질 수 있다. 이 층들은, 제 1층이 스텐트 또는 합성 이식편 표면과 직접 접촉하고, 제 2층의 한쪽 표면이 제 1층과 접촉하며, 반대쪽 표면이 혈관 관강과 접촉하면서, 순차적으로 정렬될 수 있다. 매트릭스는 의료 기구에 비공유 또는 공유결합으로 부착시킬 수 있다. 항체는 이종- 또는 동종 이작용성 가교결합제를 사용하여 매트릭스에 공유 결합으로 부착될 수 있다.
HIP 항체를 포함하는 의료기구 코팅조성물은 의료기구의 표면에 HIP 항체를 코팅하기 위한 것으로, 의료기구의 표면에 아민기를 유도하고, HIP 항체의 카르복실기를 활성화하여, 의료기구의 아민기에 HIP 항체를 연결시켜 의료기구의 표면을 항체로 코팅할 수 있다.
의료기구 표면에 아민기를 유도하기 위한 방법으로, 플라즈마 코팅방법을 사용할 수 있으며, APTES(3-aminopropyltriethoxysilane 10mM in anhydrous toluene)를 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
'항체'는 하나의 항원 또는 이 항원의 기능적 등가물에 결합하는 일종의 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 의미한다. 항체라는 용어는, Fab, F(ab')2 또는 Fc 단편과 같은 항체 단편을 포함한다. 항체는, 항체 몰당 6.022x1023 분자에 상당하는 다수의 개별 항체 분자를 포함한다.
본 발명의 'HIP 항체'는 HIP에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 항체의 절편을 포함한다. HIP의 항체는 HIP과의 결합을 통해 HIP을 포획할 수 있고, HIP의 기능을 블로킹할 수 있다.
HIP 항체가 코팅된 의료기구는 후기내피전구세포를 선택적으로 포획할 수 있다. 기존의 CD34항체 코팅 스텐트는 혈관중에 존재하는 후기내피전구세포를 선택적으로 포획하기 어렵다. 후기내피전구세포의 표면 마커인 HIP 항체를 스텐트에 코팅함으로써 내피세포로 분화되기 바로 전단계인 후기 내피전구세포를 포획하여 스텐트내면의 재내피화를 촉진하고, 혈관의 재협착을 효과적으로 막을 수 있다.
의료기구에 코팅된 HIP 항체는 후기내피세포를 선택적으로 포획함과 동시에 후기내피세포의 HIP의 기능을 억제할 수 있다. HIP의 기능이 억제되는 경우, 후기내피세포의 증식이 활발해지고, 후기내피전구세포에 의한 튜브형성을 촉진할 수 있다.
본 명세서의 '치료에 유효한 항체의 양'은, 의료 기구에 대한 후기내피전구세포의 부착을 촉진하는 항체의 양을 의미한다. 본 발명의 실시에 필요한 항체의 양은, 사용되는 항체의 성질에 따라, 예를 들어, 사용되는 항체의 양은, 항체 및 이와 반응하는 항원 간의 결합 상수에 따라 결정될 것이다. 특정 항원에 사용하기 위한, 치료에 유효한 항체의 양을 결정하는 방법은, 당업자에게 주지되어 있다.
실시예1 . 후기내피전구세포에서 고발현되는 HIP
본 발명자들은 단핵세포(MNCs),초기내피전구세포(eEPC), 후기내피전구세포(LEPC) 및 HUVEC세포에서 HIP의 발현을 비교하였다. 4종의 세포 타입중에서, 후기내피전구세포 및 HUVEC세포의 HIP가 전사수준 (도3a)및 단백질 수준(도3b)이 가장 높았다. 반면, 단핵세포에서 HIP의 전사수준 및 단백질 발현수준이 매우 낮은 것을 확인하였다(도3a, 도3b).
실시예2 . 후기내피전구세포의 튜브형성능을 억제하는 HIP
본 발명자들은 HIP 녹다운 후기내피전구세포주를 제조하여 HIP 다운-조절의 효과를 실험하였다. 렌티바이러스(lentivirus)-매개 형질도입 및 서열 특이적 short hairpin RNA(shRNA)의 발현을 사용하여 HIP 발현의 특이적 감소가 수행되었다. HIP shRNA 렌티바이러스의 감염은 두개의 후기내피전구세포주(LEPC shSCR, LEPC shHIP)에서 HIP mRNA의 발현수준을 상당히 감소시켰다(도4a). HIP 단백질 발현 수준은 대조군인 SCR shRNA-형질전이된 후기내피전구세포주(LEPC shSCR)에 비해, HIP shRNA-형질전이된 후기내피전구세포(LEPC shHIP)에서 상당히 다운조절되었다(도4b). 후기내피전구세포는 VEGF로 처리한 EGM-2 배지에서 튜브구조 형성능을 갖는다. HIP 녹다운 shRNA로 처리된 후기내피전구세포(LEPC shHIP)는 SCR shRNA-형질전이된 후기내피전구세포주(LEPC shSCR)에 비해 향상된 말초혈관 형성능을 보이고(도4g 및 도4h), VEGF 처리후 튜브출현시간 및 튜브 갯수도 측정가능하였으며(도4c~도4f), 그 결과 HIP의 발현을 억제하면 혈관생성능이 촉진되고 형성된 혈관이 오래 지속됨을 확인할 수 있었다.
실시예3 . 후기내피전구세포의 증식을 억제하는 HIP
다음으로, 본 발명자들은 HIP가 후기내피전구세포 증식에 미치는 영향을 조사하였다. 분열지수(mitotic index)는 bromodeoxyuridine(BrudU) incorporation 에 의해 측정된 바와 같이, 대조군 세포주(LEPC shSCR)에 비해서 HIP 녹다운 세포주(LEPC shHIP)에서 상당히 증가한다(도5a). 세포 생존성은, MTT 에세이에 의해 측정된 바와 같이, HIP 녹다운 후기내피전구세포주(LEPC shHIP)에서 상당히 향상되었다(도5b 및 도5c). 이러한 결과는 HIP가 후기내피전구세포의 증식을 억제함을 의미한다. 또한 caspase3 활성도를 통해 후기내피전구세포의 세포사멸억제효과를 살펴본 결과, 대조군 세포주(LEPC shSCR)에 비해서 HIP 녹다운 세포주(LEPC shHIP)에서 caspase3의 활성도가 감소하여 세포사멸억제효과가 더 뛰어남을 의미한다.
실시예4 . HIP 항체가 고정된 실리콘 나노 섬유 표면의 제조
코발트 크롬 금속 시편(CoCr plate, 10×10×1mm)의 한 쪽 표면을 0.3μm 산화 알루미늄 현탁액(alumina suspension)을 이용하여 기계 연마하였다. 상기 연마한 시편은 산소 플라즈마 장비(Femto Science, Korea)를 사용하여 50 sccm 의 산소유량, 50W의 전압 조건에서 5분간 플라즈마 처리하여 표면에 수산기(hydroxyl group)를 유도하였다. 무수 톨루엔(Toluene anhydrous, Sigma-Aldrich, USA) 200 ml를 테플론 반응조에 채운 뒤 테플론 홀더에 금속 시편을 세워놓고 무수 톨루엔 용액에 완전히 잠기게 하였다. 반응조를 밀봉하고 200 RPM으로 용액을 교반하면서 33% 습도의 질소기체를 반응조로 30분간 주입한 뒤 TCMS(trichloro(methyl)silane, Sigma-Aldrich, USA) 200μl를 넣고 상온에서 90분간 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤 시편을 톨루엔, 에틸 알코올, 50% 에틸 알코올로 각각 세 번씩 세척하고 120℃ 오븐에서 2시간 동안 어닐링(annealing)하였다. 제작된 실리콘 나노 섬유 시편은 상기 조건과 동일한 산소 플라즈마 처리를 한 뒤 10mM APTES(3-aminopropyltriethoxysilane 10mM in anhydrous toluene)와 2시간 동안 반응시켜 표면에 아민기를 유도하였다. EDC, NHS(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride, N-hydroxysulfosuccinimide, Sigma-Aldrich, USA)를 동 질량 비로 MES완충액(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid buffer)에 녹인 용액에 항체(anti-Human HIP antibody)를 첨가한 뒤 시편이 담긴 용기에 넣고 2시간 동안 반응시켜 표면에 항체를 고정시켰다.
실시예4 . HIP 항체가 고정된 실리콘 나노 섬유 표면에 대한 후기내피전구세포 포획 및 증식
후기내피전구세포(endothelial progenitor cells; EPCs)를5% 소태아혈청(fetal bovine serum), 재조합 인간 혈관내피 성장인자(recombinant human vascular endothelial growth factor), 재조합 인간 섬유아세포 성장인자-B(recombinant human fibroblast growth factor-B), 재조합 인간 상피 성장인자(recombinant human epidermal growth factor), 아스코르브산(ascorbic acid), 재조합 인슐린유사 성장인자-1(recombinant long R insulin-like growth factor-1), 겐타마이신황산염 암포테리신-B(gentamicin sulfate amphotericin-B)를 포함하는EBM-2(endothelial basal medium-2, Lonza, USA)배지에 37℃, 5% 농도의 이산화탄소 조건이 갖춰진 세포배양기에서 배양하였다. 이틀에 한 번씩 배지를 교환하였으며 배양 용기의 70%내지 80%가 세포로 찼을 때 계대배양 하였다.
금속시편을 끼울 수 있는 구멍이 나있는 형태로 제작된 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane; PDMS)형판에 항체가 고정된 금속시편을 끼운 뒤 Stick-Slide I0.6 Luer (Ibidi®, Germany) 미세유체칩을 덮고 튜브를 연결해 시편위로 배지가 흐를 수 있는 조건을 만들었다. 단위 체적당 10,000개의 EPCs가 들어있는 배지를 바닥 면이 일정한 방향으로15 dyne/cm2의 전단응력(shear stress)를 받도록 펌프와 유체 조절기(ibidi pump, fluidic unit, Ibidi®, Germany)를 이용해 흘려 보냈다. 37℃ 배양기에 미세유체칩과 유체 조절기를 넣은 상태로 1시간 동안 배지를 순환시켰으며 1시간 뒤 칩 을 꺼내 내부에 순수한 배지를 세 번 흘려 보내 포획되지 않은 EPCs를 제거하였다. 포획된 EPCs는 Hoechst 33342(Thermo Fisher, USA) 5μg/ml로 20분간 처리하여 세포핵을 염색했으며 부착된 세포의 총 개수를 Image J 프로그램을 이용해 계산하였다(도6참조). 실험한 결과, HIP 항체가 코팅되지 않은 시편(bare)보다 HIP 항체가 코팅된 시편에서 보다 많은 후기내피전구세포가 포획되었으며, 결국 HIP 항체가 후기내피전구세포의 포획에 매우 효과적임이 확인되었다.

Claims (13)

  1. 후기내피전구세포의 포획 및 증식을 유도하는 의료기구 코팅 조성물에 있어서,
    상기 코팅 조성물은 HIP와 반응하는 치료에 유효한 양의 일종 이상의 항체 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 의료기구 코팅조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 의료기구 코팅조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 모노클로날 항체는 Fab 또는 F(ab')2 단편을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 의료기구 코팅조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 의료기구는 스텐트인 것을 특징으로 하는 의료기구 코팅조성물.
  5. 의료기구의 표면상에 후기내피전구세포의 포획 및 증식을 유도하는 코팅을 포함하는 의료기구에 있어서,
    상기 코팅은 HIP와 반응하는 치료에 유효한 양의 일종 이상의 항체 또는 이의 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 코팅된 의료기구.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 코팅은 의료 기구의 표면을 코팅하는 매트릭스층을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 의료기구.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 매트릭스층은 상기 항체와 결합하는 것을 특징으로 하는 의료기구.
  8. 제 5항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 의료기구.
  9. 제 5항에 있어서, 상기 모노클로날 항체는 Fab 또는 F(ab')2 단편을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 의료기구.
  10. 제 6항에 있어서, 상기 매트릭스층은 폴리우레탄, 단편화된 폴리우레탄-우레아/헤파린, 폴리-L-락트산, 폴리-D,L-락티드, 셀룰로오스 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 콜라겐, 라미닌, 헤파린, 피브린, 엘라스틴, 셀룰로오스 및 탄소로 이루어진 그룹에서 어느 하나이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 의료기구.
  11. 제 5항에 있어서, 상기 의료기구는 스텐트인 것을 특징으로 하는 의료기구.
  12. (a) 의료기구 표면상에 합성 또는 천연 물질을 포함하는 한층 이상의 매트릭스로 이루어진 매트릭스 코팅층을 형성하는 단계; 및
    (b) HIP와 반응하는 치료에 유효한 양의 일종 이상의 항체 또는 이의 단편을 상기 매트릭스층에 첨가하는 단계를 포함하는 의료기구의 표면상에 후기내피전구세포의 포획 및 증식을 유도하는 코팅층이 형성된 의료 기구의 제조방법.
  13. (a) 의료기구 표면상에 아민기를 유도하는 단계;
    (b) HIP 항체의 카르복시기를 활성화하는 단계 및
    (c) 아민기가 유도된 의료기구 표면에 카르복시기가 활성화된 HIP 항체를 가하여, 의료기구 표면에 HIP 항체를 결합시키는 단계를 포함하는 의료기구의 표면상에 후기내피전구세포의 포획 및 증식을 유도하는 코팅층이 형성된 의료 기구의 제조방법.
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