KR101457310B1 - 국내 토마토황화잎말림바이러스의 ｄｎａ-ａ 유전자 및 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타 위성 ｄｎａ 유전자, 및 이를 이용한 식물체 감염시스템 - Google Patents
국내 토마토황화잎말림바이러스의 ｄｎａ-ａ 유전자 및 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타 위성 ｄｎａ 유전자, 및 이를 이용한 식물체 감염시스템 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 식물체에 잎말림(leaf curling) 등의 병증을 유발하는 토마토황화잎말림바이러스의 DNA-A 및 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타위성 DNA, 및 이를 포함하는 재조합 플라스미드 등에 관한 것으로, 이를 이용하여 다양한 식물체에 손쉽게 바이러스 감염을 유도할 수 있고, 상기 병증이 유발된 식물체를 다양한 연구에 사용하여 바이러스의 예방, 방제 등에 관련된 다양한 연구에 응용할 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 식물체에 잎말림(leaf curling) 등의 병증을 유도하는 토마토황화잎말림바이러스의 DNA-A 및 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타위성 DNA, 이를 포함하는 재조합 플라스미드, 및 이를 이용한 기주 식물체 인위적 감염시스템 등에 관한 것이다.
제미니바이러스(Geminivirus)는 전 세계적으로 주요한 경제작물에 피해를 주는 것으로 알려진 대표적인 식물 바이러스로서, 단일가닥 DNA를 게놈(genome)으로 갖고 있다. 주로 열대와 아열대 지역에서 보고되는 것으로 알려져 있으며, 최근에는 아시아 국가들에서도 급증하고 있는 바이러스이다. 국내에서도 최근 남부지역 토마토 농가를 중심으로 피해사례가 여러 차례 보고된 바 있으며, 토마토 등 작물 피해로 인한 경제적 손실이 커져가고 있다. 제미니바이러스는 게놈의 구조, 기주의 범위와 매개충의 종류에 따라 마스트레바이러스(Mastrevirus), 컬토바이러스(Curtovirus), 토포쿠바이러스(Topocuvirus), 베고모바이러스(Begomovirus)의 네 개 속(genus)으로 나뉜다. 이 중 베고모바이러스(Begomovirus)는 제미니바이러스 중 가장 잘 알려진 토마토황화잎말림바이러스(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)를 비롯한 다양한 바이러스들이 포함되어 있는 속으로서, 하나의 게놈(DNA-A) 또는 두 개의 게놈(DNA-A, DNA-B)을 갖고 있는 것으로 알려져 있다.
국내에서 최초로 토마토 재배시설에서 발견된 제미니바이러스는 2008년 통영지역에서 발견되어 본 발명자들에 의하여 보고된 베고모바이러스 속인 토마토황화잎말림바이러스로서 하나의 게놈을 갖고 있는 것으로 확인되었다(Lee et al ., 2010). 토마토황화잎말림바이러스는 베고모바이러스 중에서도 가장 많은 종류의 변이주(variant strain)들을 갖고 있는 것으로 보고되어 있으며, 담배가루이에 의하여 매개되는 것으로 알려져 있다. 담배가루이는 이미 국내에 토착화가 이루어진 상태로 방제가 매우 어려운 실정이기 때문에 토마토황화잎말림바이러스에 의한 감염의 근절은 매우 어려운 것으로 알려져 있다. 또한 담배가루이에 의해 매개되는 다양한 바이러스주들이 지속적으로 보고되고 있기 때문에 새로운 바이러스 변이주들의 출현, 및 복합감염에 대한 가능성도 배제할 수 없다. 토마토황화잎말림바이러스는 원래 토마토가 기주식물인 것으로 알려져 있었으나, 최근 박과, 콩과, 고추과, 담배 등의 작물에도 감염이 가능한 것으로 보고되고 있으며, 감염 시 잎말림(leaf curling) 질병을 유발하여 감염 식물체 잎이 말리면서 황색으로 변하고, 심하면 고사하여 국내에서 매우 심각한 농작물 피해를 야기하고 있어 국가관리 대상 병원체로 분류되고 있다.
한편, 최근의 식물바이러스 관련 보고에 따르면, 하나의 게놈(DNA-A)을 갖는 베고모바이러스는 아프리카, 유라시아 대륙 등의 구대륙에서, 두 개의 게놈(DNA-A 및 DNA-B)을 갖는 베고모바이러스는 아메리카 대륙(신대륙)에 주로 분포하고 있는 것으로 알려져 있다. 학계에서는 이러한 현상을 하나의 게놈을 갖는 베고모바이러스가 두 개의 게놈을 갖는 바이러스로 진화 중인 것으로 추정하고 있다. 하나의 게놈(DNA-A)을 갖는 베고모바이러스의 경우 단일가닥의 DNA 분자인 베타위성 DNA(beta-satellite DNA)를 갖기도 하며, 이러한 단일가닥의 DNA는 기주 내 병증 유도와 관련되어있다고 보고된 바 있다. 최근 일본의 연구결과에서도 토마토와 담배에 토마토황화잎말림바이러스의 DNA-A가 단독적으로 감염되었을 때보다 베고모바이러스의 일종인 아게라툼황화잎맥바이러스의 베타위성 DNA(Ageratum yellow vein beta-satellite, AYVB)가 함께 감염되었을 때 잎말림(leaf curling), 스턴팅(stunting) 등에 있어서 더 심한 병증을 보임이 확인되었다(Shigenori Ueda et al., 2012). 또한 서로 다른 바이러스의 베타위성 DNA는 다른 바이러스의 DNA-A와 함께 감염될 수 있으며 숙주 내에서 DNA-A와의 유전자 재조합(recombination) 등을 통해 새로운 베타위성 DNA를 생산할 수도 있으며, 이러한 경우 DNA-A만 존재하는 바이러스가 감염되었을 때보다 감염 시 식물체에서의 병증 차이가 크게 나타날 수 있다. 따라서 서로 다른 바이러스 종의 DNA-A 및 베타위성 DNA에 감염된 식물체에 대한 연구가 절실히 필요하다.
그러나 제미니바이러스는 매개충(insect vector)들에 의해 전이가 되어 감염이 일어나는 것으로 알려져 있는데 각 바이러스들에 대해 감염된 곤충(보독충)들을 확보 및 유지하고 이를 이용하여 식물체에 감염을 유도하는 것은 매우 어렵다. 또한 곤충을 이용하지 않고 식물체에 병증을 유도하려고 하는 경우 다른 식물바이러스처럼 기계적인 감염이 용이하게 이루어지지 않기 때문에 어려움이 있다. 이에 제미니바이러스의 연구를 위해서는 해당 바이러스의 감염성 클론(재조합 플라스미드, infectious clone)의 제작이 필수적이다. 바이러스 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 아그로박테리움(Agrobacterium)에 형질전환시킨 다음, 형질전환된 아그로박테리움 배양액을 담배(Nicotiana benthamiana), 토마토(Lycopersicon esculentum) 등과 같은 식물체의 정단부에 핀을 이용해 찔러준 후 식물체 내로 주입시키는 방법(Agro-inoculation)을 통해 제미니바이러스를 식물체에 인위적으로 감염시킬 수 있다.
하지만 지금까지 국내에서 발견된 토마토황화잎말림바이러스의 DNA-A 및 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타위성 DNA의 유전자 서열, 그리고 이 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 개발 등에 대한 연구 및 이에 대한 보고는 전무하다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 국내에서 발견된 토마토황화잎말림바이러스의 DNA-A 및 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타위성 DNA의 유전자 서열을 제공하는 것을 그 목적으로 한다. 또한 상기 바이러스 DNA를 포함하는 재조합 플라스미드, 상기 재조합 플라스미드로 형질전환된 미생물 등을 제공하고, 이를 이용한 기주 식물체에 인위적으로 상기 바이러스를 감염시킬 수 있는 식물체 감염시스템을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는, 토마토황화잎말림바이러스(Tomato yellow leaf curl virus)의 DNA-A, 및 이를 포함하는 재조합 플라스미드를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 2의 염기서열을 포함하는, 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스(Honeysuckle yellow vein mosaic virus)의 베타위성 DNA, 및 이를 포함하는 재조합 플라스미드를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 플라스미드로 형질전환된 대장균(Escherichia coli) 및 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens)를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 형질전환된 아그로박테리움 균주들을 이용하여, 식물체에 병증을 유도시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 토마토황화잎말림바이러스의 DNA-A 및 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타위성 DNA, 이를 포함하는 재조합 플라스미드, 및 형질전환 균주를 이용하여 토마토, 담배 뿐만 아니라 토마토황화잎말림바이러스에 의해 감염되어진다고 알려져 있는 박과, 콩과, 고추과 등 다양한 식물체에 용이하게 질병을 유발시킬 수 있기 때문에, 이를 이용하여 DNA-A와 베타위성 DNA 간의 상호관계, 증상 유도 특징 등 다양한 연구에 응용할 수 있을 것으로 보이며, 이를 통해 바이러스 감염으로 인한 경제적 손실을 방지할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타위성 DNA의 경우 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 DNA-A가 아닌 토마토황화잎말림바이러스의 DNA-A와 함께 존재하는 특이한 경우로서 베타위성 DNA가 다른 바이러스의 DNA-A와 함께 존재하는 경우 어떤 현상이 일어나는지에 관한 다양한 관련 연구에 큰 도움을 줄 것이다.
도 1 은 토마토황화잎말림바이러스의 DNA-A 재조합 플라스미드의 제조 과정을 간략히 나타낸 모식도이다.
도 2 는 토마토황화잎말림바이러스의 DNA-A 재조합 플라스미드를 간략히 나타낸 모식도이다.
도 3 은 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타위성 DNA 재조합 플라스미드의 제조 과정을 간략히 나타낸 모식도이다.
도 4 는 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타위성 DNA 재조합 플라스미드를 간략히 나타낸 모식도이다.
도 5 는 토마토황화잎말림바이러스 DNA-A의 감염성 클론을 담배(A) 및 토마토(B)에 감염시킨 결과를 나타낸 도면이다.
도 6 은 토마토황화잎말림바이러스 DNA-A의 감염성 클론을 담배 및 토마토에 감염시킨 후 서던블롯으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다. 도 6에서, N은 Negative control, P는 Positive control, B는 Blank, U는 Uninoculation, Lane 1은 토마토황화잎말림바이러스 DNA-A 감염 샘플 1, Lane 2는 토마토황화잎말림바이러스 DNA-A 감염 샘플 2를 나타낸다.
도 7 은 토마토황화잎말림바이러스 DNA-A의 감염성 클론 및 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타위성 DNA의 감염성 클론을 담배 및 토마토에 감염시킨 후 서던블롯으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다. 도 7에서, P는 Positive control, N은 Negative control, B는 Blank, U는 Uninoculation, Lane 1은 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타위성 DNA 단독 감염 샘플, Lane 2는 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타위성 DNA + 토마토황화잎말림바이러스 DNA-A 감염 샘플 1, Lane 3은 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타위성 DNA + 토마토황화잎말림바이러스 DNA-A 감염 샘플 2를 나타낸다.
도 8 은 토마토황화잎말림바이러스 DNA-A의 감염성 클론 및 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스 베타위성 DNA의 감염성 클론을 담배에 감염시킨 결과를 나타낸 도면이다.
도 2 는 토마토황화잎말림바이러스의 DNA-A 재조합 플라스미드를 간략히 나타낸 모식도이다.
도 3 은 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타위성 DNA 재조합 플라스미드의 제조 과정을 간략히 나타낸 모식도이다.
도 4 는 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타위성 DNA 재조합 플라스미드를 간략히 나타낸 모식도이다.
도 5 는 토마토황화잎말림바이러스 DNA-A의 감염성 클론을 담배(A) 및 토마토(B)에 감염시킨 결과를 나타낸 도면이다.
도 6 은 토마토황화잎말림바이러스 DNA-A의 감염성 클론을 담배 및 토마토에 감염시킨 후 서던블롯으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다. 도 6에서, N은 Negative control, P는 Positive control, B는 Blank, U는 Uninoculation, Lane 1은 토마토황화잎말림바이러스 DNA-A 감염 샘플 1, Lane 2는 토마토황화잎말림바이러스 DNA-A 감염 샘플 2를 나타낸다.
도 7 은 토마토황화잎말림바이러스 DNA-A의 감염성 클론 및 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타위성 DNA의 감염성 클론을 담배 및 토마토에 감염시킨 후 서던블롯으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다. 도 7에서, P는 Positive control, N은 Negative control, B는 Blank, U는 Uninoculation, Lane 1은 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타위성 DNA 단독 감염 샘플, Lane 2는 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타위성 DNA + 토마토황화잎말림바이러스 DNA-A 감염 샘플 1, Lane 3은 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타위성 DNA + 토마토황화잎말림바이러스 DNA-A 감염 샘플 2를 나타낸다.
도 8 은 토마토황화잎말림바이러스 DNA-A의 감염성 클론 및 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스 베타위성 DNA의 감염성 클론을 담배에 감염시킨 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명자들은 바이러스의 예방 또는 방제와 관련된 바이러스 연구에 사용가능한, 바이러스에 의한 병증을 유도시킨 식물체를 용이하게 제조하기 위한 방법에 대하여 연구한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명에서 병증은 바이러스 감염에 의해 유발되는 병적인 증상, 즉, 잎말림(leaf curling), 스턴팅(stunting) 등 바이러스 감염에 의해 야기될 수 있는 모든 증상을 의미한다.
본 발명은 국내에서 분리된 서열번호 1의 염기서열을 포함하는, 토마토황화잎말림바이러스(Tomato yellow leaf curl virus)의 DNA-A, 및 이를 포함하는 재조합 플라스미드를 제공한다. 또한 본 발명은 국내에서 분리된 서열번호 2의 염기서열을 포함하는, 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스(Honeysuckle yellow vein mosaic virus)의 베타위성 DNA, 및 이를 포함하는 재조합 플라스미드를 제공한다.
본 발명자들은 잎말림(leaf curling) 등의 병증을 유발시킨 바이러스를 분리하고자, 감염증상이 나타나는 토마토 식물체로 부터 토마토황화잎말림바이러스의 DNA-A(서열번호 1) 및 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타위성 DNA(서열번호 2)를 분리 및 동정하였다.
그리고 상기 유전자들을 발현시킬 수 있는 재조합 플라스미드를 제조하고자, 회전환증폭반응(rolling circle amplification, RCA)을 수행하여 바이러스의 게놈 DNA를 증폭, 제한효소 처리, DNA 결합(ligation) 등 다양한 분자생물학 기법을 이용하여 식물 발현용 플라스미드에 바이러스 DNA를 삽입하였다. 상기 식물 발현용 플라스미드의 종류는 식물에서 단백질의 발현이 가능한 플라스미드라면 제한이 없다. 바람직하게는 pCAMBIA 발현 벡터군, pBI121 발현 벡터군을 이용하여 재조합 플라스미드를 제조할 수 있다. 이렇게 만들어진 재조합 플라스미드는 아그로박테리움에 형질전환시킨 후 액상배지 상에서 배양시켜 얻은 배양액을 식물의 정단부에 핀을 이용하여 찔러준 후 식물체 내로 주입시켜주는 방식으로 식물체에 감염을 시킬 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 상기 재조합 플라스미드로 형질전환된 아그로박테리움을 이용하여 식물체에 감염시켰을 때, 효과적으로 감염 증세가 나타나는 것을 확인하였으며, 토마토황화잎말림바이러스의 DNA-A 및 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스 베타위성 DNA를 함께 감염시키면 병증이 강화되는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).
상기 결과로부터, 본 발명의 재조합 플라스미드로 형질전환된 미생물(microorganism)을 이용하여 효과적으로 식물체에 병증을 유도시킬 수 있다는 것을 확인하였다. 이에 본 발명은 본 발명의 재조합 플라스미드로 형질전환된 미생물(microorganism)을 제공한다. 상기 미생물의 종류에는 제한이 없으나, 바람직하게는 대장균(Escherichia coli) 및 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens)이다. 또한 본 발명은 상기 형질전환된 미생물(아그로박테리움)을 이용하여, 식물체에 병증을 유도시키는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[
실시예
]
실시예
1. 신규 바이러스 동정 및 게놈
DNA
확보
고성 지역과 삼천포 지역에서 잎말림 등의 병증이 심한 토마토들을 각각 채집한 후, 채집된 검체의 잎 조직 1g에서 Dellaporta 방법을 이용하여 전체 게놈 DNA(genomic DNA)를 따로 추출하였다. 그리고 상기 추출된 게놈 DNA들을 주형으로 하여 회전환증폭반응(rolling circle amplification, RCA)을 수행하여 게놈 DNA를 증폭시킨 후, 토마토황화잎말림바이러스 DNA-A는 제한효소 SacI을 처리하여 1 mer를 확보하였고, 무늬인동황화잎맥모자이크 바이러스 베타위성 DNA는 제한효소 NheI을 처리하여 1 mer의 DNA을 확보하였다. 이후 잘려진 DNA들을 각각 pGEM-3Zf 벡터에 삽입하여 재조합 플라스미드(recombinant plasmid)를 제작하고, DNA 염기서열분석법(DNA sequencing)을 통하여 바이러스의 전체 게놈 DNA 서열을 확보하였다. 각각의 전체 게놈 DNA 서열을 확인한 결과, 각각 한국 내 존재하는 새로운 종의 토마토황화잎말림바이러스(Tomato yellow leaf curl virus)의 DNA-A와 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스(Honeysuckle yellow vein mosaic virus)의 베타위성 DNA인 것을 확인하였다. 잎말림 증상이 심한 토마토들에서 분리된 바이러스인 토마토황화잎말림바이러스의 DNA-A(서열번호 1)는 2,774bp의 크기를 가지고 있는 것을 확인하였고, 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타위성 DNA(서열번호 2)는 1,344bp의 크기를 가지고 있는 것을 확인하였다.
실시예
2. 감염성 클론의 제조
2-1. 토마토황화잎말림바이러스 DNA -A의 재조합 플라스미드 및 감염성 클론 제조
토마토황화잎말림바이러스 DNA-A의 재조합 플라스미드를 제조하기 위하여, 실시예 1에서 제조된 pGEM-3Zf 내에 삽입된 토마토황화잎말림바이러스 DNA-A 1mer를 주형으로 하여, 1 mer의 말단 부위에는 제한효소 EcoO65I 및 SacI 인식부위(restriction site), 0.7 mer의 말단 부위에는 제한효소 EcoO65I 및 SacI 인식부위(restriction site)가 포함되어 있는 프라이머(서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6)를 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 1 mer 및 0.7 mer에 제한효소 인식부위가 추가된 DNA들을 습득하였다. 상기 DNA들을 pGEM-T easy vector에 삽입한 후, 각각의 제한효소로 처리하여 제한효소에 의해 잘려진 1 mer DNA 및 0.7 mer DNA를 습득하였다. 1 mer DNA의 경우에는 pGEM-T easy vector와 크기가 유사하기 때문에, 순수하게 DNA를 분리하기 위하여 제한효소 SacI을 추가적으로 처리하여 1 mer DNA를 잘랐다. 잘려진 DNA들은 1% 아가로스겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)을 수행하여, 크기를 확인하고 겔로부터 각각의 DNA들을 분리(gel elution)하였다. 획득한 DNA를 식물 발현 벡터인 pCAMBIA1303에 클로닝하기 위하여, pCAMBIA1303을 제한효소 EcoO65I 및 BglII를 이용하여 자른 후, 아가로스겔 전기영동을 수행하고 겔로부터 잘려진 벡터를 습득하였다. 그리고 잘려진 pCAMBIA1303, DNA-A 1 mer, 및 DNA-A 0.7 mer를 혼합하고 T4 DNA 연결효소(ligase)를 이용하여 결합시켜 1.7 mer의 토마토황화잎말림바이러스 DNA-A의 재조합 플라스미드를 제조하였다. 재조합 플라스미드 제조 방법은 도 1 및 2에 간략히 나타내었다.
상기 제조된 재조합 플라스미드를 대장균 DH5α에 heat-shock 방법을 이용하여 형질전환(transformation)하고, 형질전환된 콜로니를 선별하여 LB 액상 배지에서 12시간 동안 배양한 후에 키트를 이용하여 플라스미드를 추출(mini-prep)하였다. 추출된 플라스미드는 제한효소 EcoO65I 및 BglII를 처리하여, 토마토황화잎말림바이러스 DNA-A가 제대로 삽입되어 있는지 1차 확인 후, DNA-A 서열 중 ORF C1 및 V2 영역의 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머(서열번호 7, 서열번호 8)를 이용하여 중합효소연쇄반응방법을 수행하여 재확인하였다. 상기 방법으로 DNA-A가 제대로 삽입되어 있는지 확인된 플라스미드를 동결-해동 형질전환법(freezing and thawing transformation)을 이용하여 아그로박테리움(Agrobacterium, strain GV3101) 내로 형질전환시켰다. 그리고 형질전환된 아그로박테리움으로부터 플라스미드를 분리하고 상기와 동일한 방법으로 제한효소 EcoO65I 및 BglII를 처리하여, 토마토황화잎말림바이러스 DNA-A가 제대로 삽입되어 있는지 1차 확인 후, DNA-A 서열 중 ORF C1 및 V2 영역의 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머(서열번호 7, 서열번호 8)를 이용하여 중합효소연쇄반응방법을 수행하여 재확인하여, 토마토황화잎말림바이러스 DNA-A 재조합 플라스미드가 아그로박테리움에 제대로 형질전환되어 감염성 클론이 제조되었다는 것을 확인하였다. 형질전환된 아그로박테리움은 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하였다(수탁번호 KACC95109P).
2-2. 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타위성 DNA 의 재조합 플라스미드 및 감염성 클론 제조
무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타위성 DNA의 재조합 플라스미드를 제조하기 위하여, 실시예 1에서 제조된 pGEM-3Zf 내에 삽입된 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타위성 DNA 1 mer들을 주형으로 하여, 하나의 1 mer 말단 부위에는 제한효소 EcoO65I 및 NheI 인식부위(restriction site), 다른 1 mer에는 제한효소 BglII, NheI 및 EcoO65I 인식부위(restriction site)가 포함되어 있는 프라이머(서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12)를 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 각각의 1 mer에 제한효소 인식부위가 추가된 DNA를 습득하고, 얻은 DNA들을 pGEM-T easy vector에 삽입하였다. 그 중에서 제한효소 BglII, NheI 및 EcoO65I 인식부위를 갖는 1 mer를 NheI, EcoO65I 제한효소를 처리하여 잘라낸 후에, 이 DNA를 다시 NheI, EcoO65I 제한효소가 처리된 BglII, NheI 및 EcoO65I 인식부위가 포함된 1mer를 갖는 pGEM-T easy vector에 삽입하여 2 mer의 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타위성 DNA를 갖는 재조합 플라스미드를 제조하였다. 획득한 2 mer의 베타위성 DNA를 식물 발현 벡터인 pCAMBIA1303에 클로닝하기 위하여, pCAMBIA1303 및 2 mer의 DNA를 제한효소 EcoO65I 및 BglII를 이용하여 각각 자른 후, 아가로스겔 전기영동을 수행하고 겔로부터 잘려진 벡터를 습득하였다. 그리고 잘려진 pCAMBIA1303 및 2 mer의 베타위성 DNA를 혼합하고 T4 DNA 연결효소(ligase)를 이용하여 결합시켜 2 mer의 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타위성 DNA의 재조합 플라스미드를 제조하였다. 재조합 플라스미드 제조 방법은 도 3 및 4에 간략히 나타내었다.
상기 제조된 재조합 플라스미드를 대장균 DH5α에 heat-shock 방법을 이용하여 형질전환(transformation)하고, 형질전환된 콜로니를 선별하여 LB 액상 배지에서 12시간 동안 배양한 후에 키트를 이용하여 플라스미드를 추출(mini-prep)하였다. 추출된 플라스미드는 제한효소 EcoO65I 및 BglII를 처리하여, 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타위성 DNA가 제대로 삽입되어 있는지 확인하였다. 그리고 DNA가 제대로 삽입되어 있는지 확인된 플라스미드를 동결-해동 형질전환법(freezing and thawing transformation)을 이용하여 아그로박테리움 내로 형질전환시켰다. 그리고 형질전환된 아그로박테리움으로부터 플라스미드를 분리하고 상기와 동일한 방법으로 제한효소 EcoO65I 및 BglII를 처리하여, 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타위성 DNA가 제대로 삽입되어 있는지 확인하여, 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타위성 DNA 재조합 플라스미드가 아그로박테리움에 제대로 형질전환되어 감염성 클론이 제조되었다는 것을 확인하였다. 형질전환된 아그로박테리움은 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하였다(수탁번호 KACC95114P).
실시예
3. 감염성 클론에 의한 병증 유도 확인
3-1.
토마토황화잎말림바이러스
DNA
-A의 감염성 확인
실시예 2-1의 방법으로 제조된 토마토황화잎말림바이러스 DNA-A 감염성 클론의 감염성을 확인하기 위하여, 토마토황화잎말림바이러스 DNA-A 감염성 클론을 포함하는 아그로박테리움 배양액을 담배(Nicotiana benthamiana) 또는 토마토(Lycopersicon esculentum)의 정단부에 핀을 이용해 찔러준 후 식물체 내로 주입시키는 방법으로 감염시킨 후, 감염된 식물들을 배양하여 식물에서의 감염성 여부를 확인하였다. 3주 배양 후에는 식물의 게놈 DNA를 추출하여 서던블롯(southern blot)을 수행하여 바이러스가 식물 체내에 제대로 감염되었는지 확인하였다. 그 결과는 도 5 및 6에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 감염된 식물들은 2주 후부터 잎이 말리면서 황색으로 변하는 감염 증상이 뚜렷하게 나타나기 시작하였다. 또한 도 6에 나타난 바와 같이, 식물체 내에 바이러스가 효과적으로 감염되었다는 것을 확인하였다. 상기 결과들을 통하여, 본 발명에서 제조된 토마토황화잎말림바이러스 DNA-A 감염성 클론은 토마토 뿐만 아니라 담배에서도 효과적으로 병증을 유발시킬 수 있다는 것을 확인하였으며, 이를 통해 토마토황화잎말림바이러스 DNA-A의 기주 범위에 속하는 식물들에서 효과적으로 감염 증상을 유발할 수 있다는 것을 확인하였다.
3-2.
무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의
베타위성
DNA
의 감염성 확인
실시예 2-2의 방법으로 제조된 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타위성 DNA 감염성 클론의 감염성을 확인하기 위하여, 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타위성 DNA 감염성 클론을 포함하는 아그로박테리움 배양액을 이용하여 담배(Nicotiana benthamiana)와 토마토(Solanum lycopersicum)에 실시예 3-1과 동일한 방법으로 감염시켰다. 또한 베타위성 DNA는 DNA-A와 상호작용하여 복제가 되는 것으로 알려져 있기 때문에, 다른 담배 또는 토마토에는 실시예 2-1의 방법으로 제조된 토마토황화잎말림바이러스 DNA-A 및 베타위성 DNA 감염성 클론을 함께 감염시킨 후, 감염된 식물들을 배양하여 식물에서의 감염성 여부를 확인하였다. 3주 배양 후에는 식물의 게놈 DNA를 추출하여 서던블롯(southern blot)을 수행하여 바이러스가 식물 체내에 제대로 감염되었는지 확인하였다. 그 결과는 도 7 및 도 8에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타위성 DNA 감염성 클론만을 이용하여 감염시킨 담배 및 토마토에서는 식물체 내에서 바이러스의 복제가 일어나지 않았지만, 베타위성 DNA 및 토마토황화잎말림바이러스 DNA-A를 함께 감염시킨 담배 및 토마토에서는 바이러스의 복제가 일어나 효과적으로 질병을 유발시킬 수 있다는 것을 확인하였다. 또한 도 8에서 나타난 바와 같이, DNA-A 만을 감염시킨 식물체보다 베타위성 DNA를 함께 감염시킨 식물체에서 더 심한 감염 증상이 유도된 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통하여, 본 발명에서 제조된 토마토황화잎말림바이러스 DNA-A 감염성 클론 및 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타위성 DNA 감염성 클론을 이용하면 다양한 식물체에서 효과적으로 감염증을 유발시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration
<120> Viral genome sequences of Tomato yellow leaf curl virus Korea
isolate DNA-A and Honeysuckle yellow vein mosaic virus Korea
isolate beta-satellite DNA and infection systems to plants using
the same
<130> PB13-11800
<160> 12
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 2774
<212> DNA
<213> Tomato yellow leaf curl virus DNA-A
<400> 1
gttgaaatga atcggtgtcc ctcaaagctc tatggcaatc ggtgtatcgg tgtcttactt 60
atacctggac acctaatggc tatttggtaa tttcatgaat gttcattgta attcaaaatt 120
caaaaatcaa atcattaaag cggccatccg tataatatta ccggatggcc gcgccttttc 180
cttttatgtg gtccccacga gggttacaca gacgtcaccg tcaaccaatc aaattgcatc 240
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tgcaatatgt gggacccact tcttaatgag tttcctgaat ctgttcacgg atttcgttgt 360
atgttagcta ttaaatattt gcagtccgtc gaggaaactt acgagcccaa tacattgggc 420
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aatggaaatg atgtcgtggt tcattagaaa tggcctctgg ctgtgttctg ttatcttgaa 1560
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taatgcgggt ctacgtcatc aatgacgttg taccacgcat cattgctgta cacctttggg 2040
cttaggtcta gatgtccaca taaataatta tgtgggccta gagacctggc ccacattgtt 2100
ttccctgttc tgctatcacc ctcaatgaca atacttatgg gtctccatgg ccgcgcagcg 2160
gaagacacga cgttctcggc gacccactct tcaagttcat ctggaacttg attaaaagaa 2220
gaagaaagaa atggagaaac ataaacttct aaaggaggac taaaaatcct atctaaattt 2280
gaacttaaat tatgaaattg taaaatatag tcctttgggg ccttctcttt taatatattg 2340
agggcctcgg atttactgcc tgaattgagt gcttcggcat atgcgtcgtt ggcagattgc 2400
tgacctcctc tagctgatct gccatcgatt tggaaaactc caaaatcaat gaagtctccg 2460
tctttctcca cgtaggtctt gacatctgtt gagctcttag ctgcctgaat gttcggatgg 2520
aaatgtgctg acctgtttgg ggataccagg tcgaagaacc gttggttctt acattggtat 2580
ttgccttcga attggataag cacatggaga tgtggttccc cattctcgtg gagttctttg 2640
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tcctctttag agagagaaca attgggatat gttaggaaat aatttttggc atatatatta 2760
aataaacgag gcat 2774
<210> 2
<211> 1344
<212> DNA
<213> Honeysuckle yellow vein mosaic virus beta-satellite DNA
<400> 2
gctagccacc ctttatttct gaaagaaaat agaaaaaaaa aagaaaaatg gaatcaaaga 60
gaaaagaaaa ttaaaacaaa aaaaagaacc caacacaaaa atagacaaat aaacagagaa 120
aagaacactt attccggcat aaagggagcg cagctcaagt gtcaataaaa aaaatagaaa 180
agaaatggag aaaaaaaaaa gaagaaaaaa gaaataattg aacgaagtga aaataaaatt 240
aaaataaaaa taagaaaata attaaatgaa gcccataatt aaaaaccatg tagccctgga 300
aaaagcccaa ataaatacac ggcccatgac ccaagttgaa gttgactgtt catcataatt 360
acaataatgc catgcccccc agtgcccccc aattgccccc cgattcaatc gggggacact 420
tatccgtaca ttttaattgg acaagaatac ccctgaaaag cagagataac aggcgcgtgg 480
gagtgctctg taaaagtgct tttctctctc ctcaaacccc ccggagacga tgatcggagg 540
ccttccggtc atcattttcc gacacgcgcg gcagtgcgaa cacggatgtg ggcaaaccac 600
tacgctacgc agcagcctta gctacgccgg agcctagctc gccaccgtta taatattacc 660
ggtggcgagt tgggggacgc gggggaaagg tgggccccac ctttctgtat aagtttggtt 720
tattgcattt ggagtccctg tactttgtct tattcatttt tacaccctaa aaatgaattt 780
aatcaagaat aaaaataaaa ttaatcatta attttattta cacggagata tgcaatacat 840
tgcttatcgt agtacatggt atttatacgg tgtatgtatt tcgtacaaca tatctatcta 900
ctgtatctac ccccatatca cttaaccagt gcatcatcac catatcaatt gaatcaatca 960
tctcttcttg tttgaaattg gagatgtctg aatcatcgta catcaattcc agtgtatccc 1020
tgattagctc ctctgtcccg ttgaagtcga atggtggaac catttggacg tatgtgtatg 1080
gtatgttgca gcggatacct gtcagtactg gttgatttgt tgagtatacc tggacttgca 1140
ctctgatgaa ctgttggagc cttacgtcta taatgaactt gattccgtta ccgttgttat 1200
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tggtgatctg tgggttgtgt gtctcaattt ggtccatgta tttgtgctta tttgttcttg 1320
gaagtattgt ttcctattaa tttt 1344
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TYLCV-1mer-S
<400> 3
agatctttag ctgcctgaat gttcgg 26
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TYLCV-1mer-A
<400> 4
gagctcaaca gatgtcaaga cctacgt 27
<210> 5
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TYLCV-0.7mer-S
<400> 5
gagctcttag ctgcctgaat gttcgg 26
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 6
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<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TYLCV C1
<400> 7
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TYLCV V2
<400> 8
tgtattgggc tcgtaagttt 20
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HYVMVb-1-S
<400> 9
agatctcacc ctttatttct gaaagaa 27
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HYVMVb-1-A
<400> 10
ggtnaccnnn nnngctagca aaattaatag gaaacaatac tt 42
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HYVMVb-2-S
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gctagccacc ctttatttct gaaagaa 27
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HYVMVb-2-A
<400> 12
ggtnaccaaa attaatagga aacaatactt 30
Claims (5)
- 서열번호 2의 염기서열을 포함하는, 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스(Honeysuckle yellow vein mosaic virus)의 베타위성 DNA.
- 제 1 항의 DNA를 포함하는, 재조합 플라스미드.
- 제 2 항의 재조합 플라스미드로 형질전환된, 대장균 DH5α(Escherichia coli DH5α).
- pCAMBIA1303 벡터에 제 1 항의 DNA를 삽입한 재조합 플라스미드로 형질전환된, 농업유전자원센터(KACC)에 수탁번호 KACC95114P로 기탁된 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens).
- 삭제
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
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| KR1020130161195A KR101457310B1 (ko) | 2013-12-23 | 2013-12-23 | 국내 토마토황화잎말림바이러스의 ｄｎａ-ａ 유전자 및 무늬인동황화잎맥모자이크바이러스의 베타 위성 ｄｎａ 유전자, 및 이를 이용한 식물체 감염시스템 |
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Family Applications (1)
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| KR20110131159A (ko) * | 2011-11-18 | 2011-12-06 | 최창원 | 토마토황화잎말림바이러스 씨4 유전자의 대장균내 발현 및 씨4재조합단백질에 대한 다클론항체 생산법 |
-
2013
- 2013-12-23 KR KR1020130161195A patent/KR101457310B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| KR20110131159A (ko) * | 2011-11-18 | 2011-12-06 | 최창원 | 토마토황화잎말림바이러스 씨4 유전자의 대장균내 발현 및 씨4재조합단백질에 대한 다클론항체 생산법 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| NCBI의 database accession JN680149.1 GI:354334910(2011.10.30.) * |
| Sung Oh, 배재대학교 석사학위논문 (2012년 2월) * |
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| KR20140012004A (ko) | 2014-01-29 |
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