KR101456509B1 - 중국 복전차로부터 분리된 금화균인 유로티움 크리스타텀 균주 - Google Patents

중국 복전차로부터 분리된 금화균인 유로티움 크리스타텀 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 중국 복전차로부터 분리된 금화균인 유로티움 크리스타텀(Eurotium cristatum) 균주(KACC93171P)에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 복전차로부터 분리되고 발효차의 종균으로 사용되는 신균주 유로티움 크리스타텀(Eurotium cristatum) 균주(KACC93171P)에 관한 것이다. 미생물 발효균의 일종인 금화균을 복전차로부터 단일클론으로 분리하고, 게놈(genomic) DNA로부터 유전자를 PCR 증폭하여 염기서열 분석함으로써 새로운 유전자 서열을 가진 금화균이라는 것을 확인하였고, 이를 종균으로 사용하여 온도, 습도 조절하에서 미생물 발효차인 금화차(golden flower tea)를 개발할 수 있다.

Description

중국 복전차로부터 분리된 금화균인 유로티움 크리스타텀 균주{Eurotium cristatum strain, golden flower fungi isolated from Chinese Fuzhuan brick-tea}
본 발명은 중국 복전차로부터 분리된 금화균인 유로티움 크리스타텀(Eurotium cristatum) 균주(KACC93171P)에 관한 것이다.
후발효차(post-fermented tea)란 미생물에 의해 자동 산화와 비효소적 산화가 일어나는 것으로 주로 아스퍼질러스 속(Aspergillus), 유로티움 속(Eurotium), 데바리오마이세스 속(Debaryomyces) 등의 미생물이 관여하는 것으로 알려져 있다. 이들 미생물에 의해 발효가 일어나는 차를 흑차(Dark green tea)라고 하며, 보이차(Pu'er tea), 흑모차(Raw dark green tea), 복전차(Fuzhuan brick-tea) 등이 있다. 금화균이란 중국 발효차 중에서 흑차 중의 하나인 고급 보이차, 복전차 등에서 자연 발생적으로 나타나는 유익한 노란색의 곰팡이균들 중에서, 황금색 꽃(golden flora)이 핀 것 같은 미생물 균총을 통칭하여 금화균이라 하고, 여기에는 유로티움 속(Eurotium)이 여기에 속한다. 이들 중 복전차는 호남성에서 예로부터 차가 아닌 약으로서 사용되어 왔는데 이질/설사에 효과가 있으며 항균작용이 뛰어난 것으로 보고되고 있다.
복전차의 제다공정은 모차인 흑모차(Raw dark green tea)로부터 증기를 쐬어 부드럽게 한 후 80도에서 밤새 퇴적하고 브릭 형태로 만든 후, 미생물발효를 15-17일 동안 지속시키고 건조한 후 6개월 정도 숙성시키는 과정이다. 대부분 중국의 고급 미생물 발효차는 자연발생적으로 균이 성장하기 때문에 발효조건을 만들어 주는 것이 관건이다. 그러나 한국의 기후와 온도, 습도에서는 자연적으로 고급 미생물 발효차를 만들기에는 한계가 있다.
한편, 한국특허출원 제10-2012-7009778호에서는 찻잎에 아스페르길루스 속 sp. (PK-1)균 [Aspergillus sp. (PK-1)], 아스페르길루스 속 sp. (AO-1)균 [Aspergillus oryzae (NBRS 4214) sp. (AO-1)], 아스페르길루스 속 sp. (SK-1)균 [Aspergillus awamori (NBRS 4122) sp. (SK-1)], 또는 유로티움 속 sp. (KA-1)균 [Eurotium sp. (KA-1)]으로부터 선택되는 1종을 배양함으로써 얻어지는 미생물 발효 찻잎에 추출 처리를 행하여, 각종 엑기스와 신규 폴리페놀 유도체를 포함하는 기능성 미생물 발효 차 추출 엑기스, 나아가서는 신규 폴리페놀 유도체 부화 기능성 발효 차 추출 엑기스에 대해 개시하고 있으나, 중국 복전차로부터 본 발명자들이 분리한 금화균에 대한 언급은 어디에도 없다.
따라서, 본 발명자들은 미생물 발효균의 일종인 금화균을 복전차로부터 단일클론으로 분리하고, 게놈(genomic) DNA로부터 유전자를 PCR 증폭하여 염기서열 분석함으로써 새로운 유전자 서열을 가진 금화균이라는 것을 확인하였고, 이를 종균으로 사용하여 온도, 습도 조절 하에서 미생물 발효차인 금화차(golden flower tea)를 개발하고자 하였다.
본 발명의 목적은 복전차로부터 분리되고 발효차의 종균으로 사용되는 신균주 유로티움 크리스타텀(Eurotium cristatum) 균주(KACC93171P)를 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 복전차로부터 분리되고 발효차의 종균으로 사용되는 신균주 유로티움 크리스타텀(Eurotium cristatum) 균주(KACC93171P)를 제공한다. 상세하게는, 상기 발효차는 금화차인 것을 특징으로 하고, 상기 균주를 이용하여 제조된 발효차에는 카테킨(Catechin) 함량이 증진된 것을 특징으로 한다.
“카테킨(Catechin)”은 폴리페놀 일종으로 흔히 녹차의 떫은 맛 성분으로 알려져 있다. 카테킨은 발암억제, 동맥경화, 혈압상승 억제, 혈전예방, 항바이러스, 항비만, 항당뇨, 항균, 해독작용, 소염작용, 충치예방, 구갈방지, 장내 세균총 정상화 등 다양한 효과가 있다. 카테킨의 항산화 작용과 노화의 근본적 요소인 자유라디컬 제거기능은 비타민C와 비타민E에 비해 강력한 활성산소 제거효과를 가지고 있으며, 항산화작용으로 인하여 저밀도지단백(low density lipoprotein) 산화와 같은 심혈관계 보호효과가 있는 것으로 보고되고 있다.
본 발명의 유로티움 크리스타텀(Eurotium cristatum) 균주(KACC93171P)는 중국 복전차에서 분리되었으며, 후술하는 실시예의 방법에 따라 스크리닝 및 동정하였다. 미생물의 동정은 그의 형태학적, 생리학적 및 생화학적 특성을 기초로 하여 이루어졌다.
본 발명은 중국 복전차로부터 분리된 금화균인 유로티움 크리스타텀 균주(KACC93171P)에 관한 것으로서, 미생물 발효균의 일종인 금화균을 복전차로부터 단일클론으로 분리하고, 게놈(genomic) DNA로부터 유전자를 PCR 증폭하여 염기서열 분석함으로써 새로운 유전자 서열을 가진 금화균이라는 것을 확인하였고, 이를 종균으로 사용하여 온도, 습도 조절하에서 미생물 발효차인 금화차(golden flower tea)를 개발할 수 있다. 상기 금화차는 이질, 설사를 멈추는 민간약 대용으로도 사용되어 질 수 있으며 나아가 항당뇨나 항암효과를 가지는 기능성 식품으로의 개발 가능성이 있다.
도 1은 금화균 분리재료로 사용한 중국복전차(A)와 분리한 금화균을 48시간(B), 72시간(C) 배양한 페트리디쉬(petridish)와 이의 확대사진을 나타낸다. 또한, 200배 확대한 주사전자현미경(SEM) 사진(D)으로서, 폐쇄자낭과(cleistothecium)와 균사를 관찰할 수 있다.
도 2는 두 개의 페트리디쉬로부터 분리한 예비 금화균총의 게놈 DNA(total genomic DNA)의 사진(A)과 이를 주형으로 하여 PCR 증폭시킨 β-튜불린(β-Tubulin) 유전자 및 RNA 폴리머라제(Polymerase) II 유전자를 전기영동한 결과(B)를 보여주고 있다.
도 3은 염기서열분석을 통해 얻어진 β-튜불린(β-Tubulin) 유전자(A) 및 RNA 폴리머라제(Polymerase) II 유전자(B)를 나타낸다. 각 유전자에 사용된 포워드(Forward) 및 리버스(Reverse) 프라이머는 박스로 표시하였다.
도 4는 염기서열분석이 완료된 분리 금화균의 β-튜불린(β-Tubulin) 유전자 염기서열과 이미 등록되어 있는 유로티움(Eurotium) 속 β-튜불린(β-Tubulin) 유전자 염기서열을 활용하여 작성된 유전계통도(Phylogenetic tree)를 나타낸다.
도 5는 제조된 금화차의 카페인, 카테킨 함량 비교 결과를 ppm 단위로 표시하였다. 총 카테킨 함량은 EGC(에피갈로카테킨), EC(에피카테킨), EGCG(에피갈로카테킨 갈레이트), ECG(에피카테킨 갈레이트)의 합으로 나타내었다.
이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1 > 중국 복전차로부터 균주 분리 및 배양
금화현상이 발현된 중국 호남성 악양다창 복전차를 서울시 종로구 인사동 휴다인에서 구입하여 일부분을 0.85% 생리식염수와 혼합하여 균질화하여 진균류와 효모의 배양에 사용되는 PDA(Potato Dextrose Agar) 평판배지에 균질화된 용액을 1 mL씩 분주하고, 10개의 평판배지에 접종 한 후 25℃에서 배양하여 24시간 간격으로 생육상태 확인한다. 접종 후 72시간이 지나면 평판배지에 노란색 또는 황색의 포자가 형성되며 이를 금화균(E. cristatum)으로 판단하였다(도 1). 이때 금화균으로 판단된 포자를 1백금이 채취하여 다시 10개의 PDA 평판배지에 스트리킹한 후 25℃에서 배양한다. 이와 같은 방법을 72시간 간격으로 반복하고, 금화균으로 판단되는 노란색 또는 황색의 포자가 형성된 배지를 1-2개씩 분리하여 냉장 보관한다.
< 실시예 2 > 분리 균주 동정을 위한 PCR 증폭 및 염기서열 분석
평판배지에서 자란 금화균 2g을 유리봉으로 긁어모아 다음과 같은 방법으로 금화균 게놈(genomic) DNA를 분리한다. 분리한 금화균 게놈(genomic) DNA를 1% 아가로스(Agarose) 겔을 만들어 80V에서 1시간 전기영동을 수행하여, 사진으로 DNA 분리 여부를 확인한다(도 2A). 분리한 금화균 게놈(genomic) DNA 50ng을 주형으로 사용하여 이미 알려진 유로티움 크리스타텀(Eurotium cristatum) NRRL4222 균주의 잘 보존된 β-튜불린(β-Tubulin) 유전자와 RNA 폴리머라제(Polymerase) II 유전자를 주형으로 프라이머를 합성하여 PCR을 수행한다(표 1).
금화균 유전자 증폭에 사용된 유전자 및 프라이머
β-튜불린(β- Tubulin )
(E. cristatum NRRL4222 균주)		 RNA 폴리머라제 ( Polymerase ) II
(E. cristatum NRRL 4222 균주)
Forward Primer
(5' → 3')		 5'-TGGTATGTCTGCATTATAATCAGA-3'
(서열번호 1)		 5'-ACCCGTGTCACCCGTGATCTTCAA-3'
(서열번호 3)
Reverse Primer
(5' → 3')		 5'-CCAGTTGTTCCAGGCACCGGACTG-3'
(서열번호 2)		 5'-CTCACGGATATCCCGAACCAAACT-3'
(서열번호 4)
프라이머를 합성한 후 PCR의 수행조건은 표 2와 같다. PCR은 20ul premix kit(Accu PowerTM Bioneer)과 Takara® PCR Thermal cycler Dice 기기를 사용하여 수행하였다.
증폭에 사용된 PCR 조건
구 분 온도 및 시간 조건 사이클 수
( cycle number )
변성(Denaturation) 94℃ 4min 1
결합(Annealing) 94℃ 1min
48℃ 1min
72℃ 1min		 40
연장(Extention) 72℃ 10min 1
PCR로 증폭된 DNA는 전기영동을 하여 확인하였다(도 2B). 확인된 PCR DNA 절편을 T/A 클로닝벡터(pGEMTeasy)에 클로닝하여 DNA 염기서열을 분석하였다(도 3). 분석한 β-튜불린(β-Tubulin) 유전자와 RNA 폴리머라제(Polymerase) II 유전자의 크기는 각각 400 base pair(bp), 600 bp 이었다. 각각은 서열번호 5 및 서열번호 6으로 나타냈다.
상기 유전자들의 유사성을 확인하기 위해 결정된 염기서열을 유전자 data base에서 Blast 분석(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 수행한 결과 유로티움 크리스타텀(Eurotium cristatum)과 가장 유사성이 높음을 알 수 있었다. β-튜불린(β-Tubulin)의 경우 유로티움 크리스타텀(Eurotium cristatum)과는 1개의 염기서열(1 bp)가 상이하였으며, RNA 폴리머라제(Polymerase) II 경우에는 3개의 염기서열(3 bp)이 다름을 알 수 있었다.
이렇게 분석된 금화균 β-튜불린(β-Tubulin) 유전자 염기서열이 기존에 알려진 유로티움 속(Eurotium)의 β-튜불린(β-Tubulin) 유전자와 얼마나 상이한지 조사하기 위해서, Multiple Sequence Alignment(다중염기서열정렬)를 Clustalw(http://www.genome.jp/tools/clustalw/) 프로그램을 활용하여 분석 한 후 UPGMA(Unweighted Pair Group Method using arithmetic Algorithm, 비가중산술결합법) 방식을 사용하여 유전계통도를 작성하였다. 그 결과, 본 발명에서 분리한 금화균은 유로티움 속(Eurotium) 중에서도 유로티움 크리스타텀(Eurotium cristatum)과 가장 유사하였으며, 유로티움 크리스타텀(Eurotium cristatum)의 아종(subspecies, E. cristatum sp.)으로 사료된다.
이에 본 발명자들은 상기 균주를 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하였다(수탁번호; KACC93171P).
< 실시예 3 > 분리 균주를 이용한 금화차 제조
미생물발효차인 금화차를 제조하기 위해서는 모차가 필요한데 본 발명에서 사용된 모차로서는 녹차, 황차, 발효차 등을 사용하였다. 먼저 분리한 유로티움 크리스타텀(Eurotium cristatum)을 액체나 고체배지에 접종한 후 72시간 이상 배양하고, 이를 종균으로 사용하여 차 잎에 처리한 미생물 발효차인 금화차(golden flower tea)를 제조하였다. 이렇게 제조된 금화차의 의 카테킨-카페인(Catechin-Caffeine) 함량을 HPLC 크로마토그램(Chromatogram)으로 분석하였다. 먼저 차 시료 0.1 g에 증류수 50 ml를 희석하여 80℃로 고정된 환류냉각추출기에서 1시간 동안 중탕추출 한 다음 Whatman® No.2 여과지에 여과시킨다. 여과된 액에 에틸아세테이트(EtOAc) 50 ml를 가하여 분액여두로 혼합한 다음 상층액을 수거한다. 상층액을 감압농축 한 후 농축물을 메틸알콜(MeOH) 5 ml로 용해시킨 후 0.45 μm 주사기로 필터링한 후 10 μl를 HPLC에 주입시켜 분석한다. 기기 분석조건은 다음과 같다(표 3).
금화차의 카페인 및 카테킨 함량 비교를 위한 HPLC 조건
HPLC operation conditions
Item Condition
Column TOSHO ODS-80Tm(4.6×150 mm)
Wave length 280 nm
Flow rate 1 mL/min
Injection volume 10 μL
Oven temperature 40℃
Mobile phase Solvent A: 0.2% H3PO4
Solvent B: 100% Acetonitrile
Time (min) Solvent A (%) Solvent B (%)
0 85 15
7 85 15
15 0 100
15.05 85 15
20 85 15
상기 금화차(golden flower tea)의 카테킨-카페인(Catechin-Caffeine) 함량을 HPLC 크로마토그램(Chromatogram)으로 분석한 결과, 차 잎에 상기 균주를 처리하지 않은 일반 차 보다 카테킨(Catechin)의 함량이 200～300ppm 높게 나타났으며 총 카테킨(Total Catechin)의 함량은 약 4,900ppm 높게 나타남을 확인 할 수 있었다. 이는 상기 균주가 특이적으로 일반 차 보다 카테킨(Catechin)의 함량을 약 8% 이상 증가시키는 것으로 사료 된다 (표 4 및 도 5).
(단위: ppm)
　 EGC EC EGCG ECG Caffeine Total Catechin
금화차 대조군1 6103.42 3381.39 27093.68 8334.60 6943.99 51857.08
금화차2 7074.18 3695.33 30818.89 8612.67 6606.96 56808.04
1. 금화균을 처리하지 않은 차, 2. 금화균을 처리한 차

EGC(에피갈로카테킨), EC(에피카테킨), EGCG(에피갈로카테킨 갈레이트), ECG(에피카테킨 갈레이트)
농업생명공학연구원 KACC93171P 20130118
<110> Institute of Hadong Green Tea <120> Eurotium cristatum sp. strain, golden flower fungi isolated from Chinese Fuzhuan brick-tea <130> DP-2013-0004 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-tubulin forward primer <400> 1 tggtatgtct gcattataat caga 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-tubulin reverse primer <400> 2 ccagttgttc caggcaccgg actg 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA polymerase II forward primer <400> 3 acccgtgtca cccgtgatct tcaa 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA polymerase II reverse primer <400> 4 ctcacggata tcccgaacca aact 24 <210> 5 <211> 412 <212> DNA <213> Eurotium cristatum sp. <400> 5 tggtatgtct gcattataat cagagtcgga tttagtgata tactaacagt atcacaggca 60 gactatctcc ggcgagcacg gtctcgacgg ctctggtgtg taagtacagt cgggtctccg 120 ggatggatgc gtatcggata tggatatcta aatggattgc agctacaatg gctcctccga 180 cctccaattg gagcgtatga acgtctactt caacgaggtt tgcttaattc attcgtgttt 240 atgcggaaaa cagttctgac agtgacaggc ctccaacaac aaatatgtcc cccgtgccgt 300 cctcgtcgac cttgagcccg gtaccatgga cgccgtccgt gacggtccct tcggtcagct 360 cttccttccc gacaacttcg tcttcggtca gtccggtgcc tggaacaact gg 412 <210> 6 <211> 599 <212> DNA <213> Eurotium cristatum sp. <400> 6 acccgtgtca cccgtgatct tcaacggtac gtgcaaagat gcgtggaaac aaaccgtgag 60 atctacttga acattggtat caaggccagc accttgaccg aggtttgaaa tatgctttgg 120 ccacgggtaa ctggggtgaa cagaagaagg cggctagtgc aaaggcaggt gtgtcgcagg 180 tgctgagtcg atacacatat gcttttacct tgtcgcatct tggtcggaca aacaccccaa 240 ttggtcgtga cggaaagatc gccaaaccgc gacaacttca caacacccac tggggtttgg 300 tgtgtccagc agaaactcca gaaggtcaag cttgtggtct ggtcaagaac ctggcactta 360 tgtgttacat taccgttggt acgcctagcg agcctattat cgacttcatg attcagcgga 420 acatggaagt tctcgaagag ttcgaacctc aagttacgcc taatgccacc aaggtctttg 480 tcaacggtgt ctgggttggt attcaccggg actctgcgca tctggtgaac accatgcttg 540 ccttgcgtcg gcgcaacatg atttcgcacg aagttagttt ggttcgggac atccgtgag 599

Claims (3)

  1. 복전차로부터 분리되고 발효차의 종균으로 사용되며, 상기 발효차의 카테킨(Catechin) 함량을 증진시키는 신균주 유로티움 크리스타텀(Eurotium cristatum) 균주(KACC93171P).
  2. 제1항에 있어서, 상기 발효차는 금화차인 것을 특징으로 하는 신균주 유로티움 크리스타텀(Eurotium cristatum) 균주(KACC93171P).
  3. 삭제
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