KR101445312B1

KR101445312B1 - 치료 유전자를 발현하는 신경줄기세포 및 이를 유효성분으로 포함하는 전이암의 치료용 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR101445312B1
Application number: KR1020120076875A
Authority: KR
Inventors: 최경철; 김승업; 이홍준; 이보림
Original assignee: 충북대학교 산학협력단; 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2012-07-13
Filing date: 2012-07-13
Publication date: 2014-10-02
Also published as: KR20140010576A

Abstract

본 발명은 치료 유전자를 발현하도록 유전적으로 변형된 신경줄기세포 및 이를 유효성분으로 포함하는 전이성 암의 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 치료유전자를 발현하는 신경줄기세포는 전이 암에 대한 선택적 치료효과가 매우 뛰어나, 전이암에 대한 세포 치료제로 개발될 수 있다.

Description

치료 유전자를 발현하는 신경줄기세포 및 이를 유효성분으로 포함하는 전이암의 치료용 약제학적 조성물{Human Neural Stem Cell Expressing Therapeutic Gene and Pharmaceutical Composition Comprising the Same for Treating Metastatic Cancer}

본 발명은 치료 유전자를 발현하도록 유전적으로 변형된 신경줄기세포 및 이를 유효성분으로 포함하는 전이성 암의 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

전이(metastasis)는 암세포가 초기 종양의 위치로부터 혈관 및 림프관을 통해 뇌, 간, 및 뼈와 같은 멀리 떨어진 기관 및 조직으로 서서히 이동하는 것을 의미한다. 전이는 암 환자에게서 90％ 이상의 치사율을 담당한다(1). 특히, 뇌 전이는 두개골내에서 가장 흔한 악성 종양으로서 전체 암환자의 10-40％에서 발생되는 것으로 나타나 있다(2). 뇌안에서의 전이는 중추신경계의 기능을 위태롭게 하기 때문에 전 세계적으로 암과 관련된 병적 상태 및 사망의 주요한 원인이 되고 있다(3). 암의 뇌 전이의 가장 흔한 원인암은 초기 폐암, 유방암 및 피부암이다(4). 가장 널리 퍼져 있는 암중의 하나인 폐암은 암 관련 사망의 주요한 원인이 되고 있다(5). 초기 폐암은 뇌 전이에 대해 가장 높은 전이성을 보이는 암으로서, 모든 폐암 환자의 약 40％가 뇌 전이로 발전되고, 그 다음으로 유방암이 뇌 전이성이 높은 것으로 나타나 있다(6).

이러한 암의 뇌 전이를 치료하기 위한 치료법으로는 외과수술, 화학치료 및 방사선치료가 사용되고 있으나, 이러한 치료법들은 신경계에서 많은 부작용을 일으킨다(7). 따라서, 폐암의 치료에서 뇌 전이는 가장 중요하고 해결하기 어려운 문제가 되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 전이암을 선택적으로 치료할 수 있는 줄기세포를 이용한 세포치료제를 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 치료유전자를 발현하도록 유전적으로 변형된 줄기세포를 성공적으로 제작하였으며, 전이암을 갖는 동물모델을 이용한 실험에서 이 줄기세포가 전이성 암에 대한 치료적 효과가 매우 뛰어남을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 치료유전자를 발현하는 줄기세포를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 치료유전자를 발현하는 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 전이성 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 치료 유전자를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 발현벡터로 형질전환되어 상기 치료유전자를 발현하는 줄기세포를 제공한다.

본 명세서에서 용어 “줄기세포”는 증식을 계속하는 능력, 즉 자기복제능력을 가지고 있으며, 다양한 타입의 특정 세포 타입으로 분화할 수 있는 분화능을 갖는 세포를 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 상기 치료유전자가 도입되는 줄기세포는 신경줄기세포이며, 보다 바람직하게는 인간 유래 신경줄기세포이다.

본 명세서에서 용어 “신경줄기세포”는 상기한 줄기세포로서 중추신경계를 구성하는 신경세포(neuronal cell), 성상교세포(astrocyte), 희돌기교세포(oligodendrocyte) 등의 세포로 분화할 수 있는 다분화능력을 가진 미분화세포를 의미한다.

신경줄기세포의 구체적인 분리 방법은 미국등록특허 5,654,183에 개시되어 있고, 이 문헌은 본 명세서 참조로써 삽입된다. 신경줄기세포는 bFGF (basic fibroblast growth factor), EGF (epidermal growth factor), 또는 FGF (fibroblast growth factor)의 생장 인자를 적합한 농도 범위 예컨대 5-100 ng/㎖의 범위로 배지에 첨가하여 배양할 수 있다.

본 발명에서의 신경줄기세포는 네스틴 (nestin), NF-L (neurofilament low-molecular-weight protein), NF-H (neurofilament high-molecularweight protein) 및 GFAP (glial fibrillary acidic protein)으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 신경줄기세포 마커 단백질 존재의 확인에 의해 동정될 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 상기 치료유전자가 도입되는 줄기세포는 인간의 조직으로부터 분리 및 배양된 초대 배양 줄기세포(primary cultured neural stem cell)일 수 있으며, 또는 상기 초대 배양 줄기세포에 종양 유전자(예컨대, v-myc 유전자)를 발현 가능한 형태로 포함한 벡터를 도입하여 확립된 불사멸화된 줄기세포주일 수 있다.

본 발명의 줄기세포는 치료유전자를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 발현벡터로 형질전환되어 치료유전자를 발현하도록 유전적으로 변형(genetically modified)된 줄기세포이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명에서 상기 치료유전자는 비독성-프로드럭(non-toxic prodrug)을 독성의 물질로 전환시키는 활성을 갖는 효소/프로드럭 치료 시스템 또는 유전자-지시 효소 프로드럭 치료(gene-directed enzyme prodrug therapy)을 구성하는 유전자를 포함한다.

바람직하게는, 본 발명에서 상기 치료 유전자는 박테리아 사이토신 디아미나아제(bacteria cytosine deaminase), 효모 사이토신 디아미나아제(yeast cytosine deaminase), 카르복실 에스터라아제(carboxyl esterase), 또는 상기 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나아제(HSV-TK)이다.

본 발명에서 상기 사이토신 디아미나아제(cytosine deaminase, CD)는 사이토신을 기질로 하여 아미노기를 가수분해함으로써 우라실(uracil)을 생성하는 반응을 촉매하는 효소이다. 사이토신 디아미나아제는 무독성의 전구약물인 5-플루오로사이토신(5-fluorocytosine, 5-FC)을 반응물로 탈아미노기 반응에 의해 5-플루오로우라실(5-fluorouracil, 5-FU)을 생성하고, 생성된 5-FU는 DNA의 합성을 저해함으로써 빠르게 세포 분열하는 암세포에 특이적 독성을 나타낸다.

본 발명에서 상기 카르복실 에스터라아제(carboxyl esterase, CE)는 카르복실 에스테르(carboxylic ester) 결합을 절단하여 알코올과 카르복실산을 형성하는 반응을 촉매하는 효소이다. 카르복실 에스터라아제는 프로드럭-가수분해 효소로서 작용하여, 예컨대 치료적 활성의 카르바메이트(carbamate) 또는 에스터 프로드럭(ester prodrug)의 활성화를 촉진하는 효소이다.

본 발명에서 상기 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나아제(HSV-TK)는 프로드럭인 간시클로버(ganciclovir, GCV)를 반응물로 하여 이의 5′탄소 위치에 인산기를 도입하는 반응을 촉매하는 효소이며, 5′-인산화된 간시클로버는 트리포스페이트-간시클로버(triphosphate-ganciclovir, GCV-TP)로 전환되고, GCV-TP는 DNA 합성을 차단함으로써 암세포 특이적인 세포 독성을 나타낸다.

상기 치료유전자 또는 효소/프로드럭 치료 시스템 또는 유전자-지시 효소 프로드럭 치료에 관한 내용은 문헌 Clinical Cancer Research Vol. 7, 3314-3324, Nov 2001에 상세히 설명되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 줄기세포에는 상기 치료유전자 이외에 항종양 유전자가 추가로 도입될 수 있다. 상기 항종양 유전자로는 예컨대, 암세포의 사멸(apoptosis)을 유도하는 활성을 갖는 TRAIL(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand) 유전자를 들 수 있다.

본 발명에서 치료유전자를 줄기세포로 도입시키는데 사용되는 벡터는 바람직하게는 다음의 벡터가 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다: (ⅰ) 아데노바이러스 벡터; (ⅱ) 레트로바이러스 벡터; (ⅲ) 아데노-연관 바이러스 벡터; (ⅳ) 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터; (v) SV 40 벡터; (ⅵ) 폴리오마 바이러스 벡터; (ⅶ) 파필로마 바이러스 벡터; (ⅷ) 피카르노바이러스 벡터; (ⅸ) 벡시니아 바이러스 벡터; (ⅹ) 헬퍼 의존성 아데노바이러스 벡터.

본 발명의 벡터에 포함되는 진핵세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, Adeno 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 벡터에 사용될 수 있는 프로모터는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있고, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열이 포함되며, 예를 들어 SV40 polA 서열 및 BGH polA 서열 등이 있다.

본 발명에서 이용되는 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 앰피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 푸로마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

하기 본 발명의 구체적인 일 실시예에 의하면, 치료유전자로서 효모 사이토신 디아미나아제를 포함하는 발현 벡터를 사용하였으며, 이 벡터의 구체적인 구성은 도 6에 개시되어 있다.

본 발명의 벡터를 줄기세포내로 운반하는 방법은 공지된 트랜스펙션(transfection) 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell 22, 479 (1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology 52, 456 (1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J. 1, 841 (1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10, 87 (1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol. 5, 1188-1190 (1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9568-9572 (1990)) 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 벡터의 도입에 의해 형질전환된 줄기세포를 선별하는 단계는 상술한 선택표지에 의해 발현되는 표현형(phenotype)을 이용하여, 용이하게 실시할 수 있다. 예컨대, 상기 선택표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 치료 유전자를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 발현벡터로 형질전환되어 상기 치료유전자를 발현하는 줄기세포의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 전이암의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 치료유전자가 도입되어 치료유전자를 발현하는 줄기세포는 본래의 줄기세포의 자가재생능력을 통해 계속하여 증식하면서 투여되는 프로드럭을 항암활성을 갖는 물질로 전환시킴으로써 암세포의 사멸을 유도한다.

또한, 하기 본 발명의 구체적인 일 실시예에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 줄기세포는 전이된 암을 향한 이동특성, 즉 종양지향성(tumor-tropism)을 보유함으로써, 전이된 암에 대한 뛰어난 치료 효능을 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 전이 암은 뇌로 전이된 암이다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 의하면, 상기 뇌로 전이된 암은 유방암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구 흑색종, 자궁육종, 난소암, 직장암, 항문암, 대장암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 연조직종양, 요도암, 전립선암, 기관지암, 또는 골수암의 뇌 전이암이며, 더욱 바람직하게는, 폐암, 유방암 또는 피부암의 뇌 전이암이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 전형적으로 세포를 포함하는 현탁액 형태의 주사제로 제조될 수 있다. 주사에 적합한 제약 형태는 용액 또는 분산액의 즉시 준비가 가능한 멸균 수성 용액 또는 분산액을 포함한다. 모든 경우에 주사액 형태의 제약제는 멸균되어야 하며, 주사가 용이할 정도로 유동성을 갖는 것이 바람직하다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분인 줄기세포 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.

상기 용어 "약제학적으로 허용되는"은 사람에게 투여되었을 때 알레르기 반응이나 유사한 불리한 반응을 야기하지 않는다는 것을 의미한다. 이러한 담체로는 특정 용매, 분산매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수지연제 등을 포함한다. 약제학적으로 활성인 물질에 이러한 매질 및 제제를 사용하는 것은 당업계에 공지되어 있다. 약제학적 조성물의 담체는, 예를 들어 물, 식염수, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌글리콜 및 액상 폴리에틸렌글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및 식물유를 함유하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해 유동성이 유지될 수 있다. 미생물 오염을 막기 위해 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제가 포함될 수 있으며, 당 또는 염화나트륨 등의 등장제도 포함될 수 있다. 또한, 체내 투여시 흡수작용을 연장시키기 위해 조성물에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴를 포함시킬 수 있다. 멸균 주사 용액은 필요에 따라 상기 언급된 여러 다른 성분들을 가진 적합한 용매에 필요한 양의 활성물질을 혼합한 다음, 여과 및 멸균하여 제조된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 바람직하게는 비경구, 복강내, 진피내, 근육내, 정맥내 경로로 투여될 수 있으며, 보다 바람직하게는 암의 전이 부위인 뇌 부위에 직접 주입에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 제형과 양립되는 방식으로 치료적으로 효과적인 양으로 투여된다. 또한, 치료될 대상의 상태 또는 조건에 따라 투여량을 조절할 수 있다. 수성의 주사 용액으로 비경구 투여하기 위하여, 용액은 필요에 따라 적합하게 완충되어야 하며, 먼저 액체 희석제를 충분한 식염수 또는 글루코오스로 등장성으로 만든다. 이들 특수한 수성 용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하, 진피내 및 복강내 투여에 적합하다. 이와 관련하여, 본 조성물에 사용될 수 있는 담체 및 제제, 매질에 대한 내용은 당업계에 공지되어 있다 ("Remington's Pharmaceutical Sciences", 1995, 15판 참조).

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a)' 치료 유전자를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 발현벡터로 형질전환되어 상기 치료유전자를 발현하는 줄기세포 및 (b)' 프로드럭(pro-drug)을 포함하는 전이암의 치료용 키트를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 치료유전자는 박테리아 사이토신 디아미나아제(bacteria cytosine deaminase), 효모 사이토신 디아미나아제(yeast cytosine deaminase), 카르복실 에스터라아제(carboxyl esterase), 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나아제(HSV-TK)이다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 프로드럭은 5-플루오로사이토신(5-FC) 또는 간시클로버(GCV)이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 줄기세포에는 상기 치료유전자 이외에 항종양 유전자가 추가로 도입될 수 있다. 상기 항종양 유전자로는 예컨대, 암세포의 사멸(apoptosis)을 유도하는 활성을 갖는 TRAIL(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand) 유전자를 들 수 있다.

본 발명의 상기 전이암의 치료용 키트에서 치료유전자를 발현하는 줄기세포에 관한 내용은 상술한 줄기세포 및 약제학적 조성물에 관한 발명에서 설명된 내용과 동일하므로 중복하여 설명하지 않는다.

도 1은 본 발명의 실험 계획을 보여준다. 인간비소세포폐암 A549 세포주(1 X 10⁵ 세포를 포함하는 10μl 생리식염수)를 7 주령의 SCID 마우스의 뇌에 이식하였다(n = 17). 이식한 후에 4주 및 6주 시점에서 HB1.F3.yCD 세포 (1 X 10⁵ 세포를 포함하는 10μl 생리식염수) 및 5-FC (100μl 생리식염수내의 500 mg/kg/day)를 각각 반대측 뇌 부위와 복강으로 주입하였다. 마우스는 3개의 군으로 나누었다. 그룹 1은 음성 대조군으로서 10 또는 100μl의 생리식염수로 처리한 그룹이고, 그룹 2는 HB1.F3.yCD 세포로 처리하였으나 5-FC를 포함하지 않는 100μl의 생리식염수를 주입한 그룹이며, 그룹 3은 HB1.F3.yCD 세포 및 5-FC (100μl의 생리식염수내의 500 mg/kg/day)으로 처리한 그룹이다. 최후의 5-FC 주입 후 2일 시점에서, 폐암세포로 처리한 모든 마우스를 희생시켰다.
도 2는 5-FC 및 5-FC가 인간 폐암세포의 생존율에 미치는 영향을 측정한 결과이다.
도 2의 패널 A: A549 폐암세포(A549, 1 X 10⁵ 세포/웰) 6-웰 플레이트에 24시간 동안 접종하고, 접종 후, 5-FC 및 5-FU (0.5 mmol/l)를 폐암세포에 처리하고 4일간 배양하였다. 각 웰을 현미경으로 관찰하였다. 확대율 x100.
도 2의 패널 B는 A549 폐암세포(5 X 10³ 세포/웰) 96-웰 플레이트에 24시간 동안 접종하였다. 0.01, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 및 1.0 mmol/l의 농도의 5-FU를 배양한 96-웰 플레이트에 4일간 처리하였다. 4일 후에, MTT 분석을 행하여 세포 생존율을 측정하였다. *P<0.05 vs. 음성대조군.
도 3은 HB1.F3.yCD 세포의 인 비트로 치료 효과를 보여준다. A549 폐암 세포(4 X 10³ 세포/웰)을 96-웰 플레이트에서 1일간 배양하였다. HB1.F3.yCD 세포(8 X 10³ 세포/웰)를 이식한 후, 다양한 농도 0, 100, 200, 300, 400 및 500μg/ml의 5-FC를 각 웰에 4일간 첨가하였다. 세포 생존율은 MTT 분석으로 측정하였다. *P<0.05 vs. 대조군(0 μg/ml).
도 4는 뇌로의 폐암세포 전이를 향한 줄기세포의 인 비보 이동능을 보여준다. 위쪽 패널은 HB1.F3.yCD 및 5-FC로 처리된 뇌 조직을 헤마톡실린 및 에오신 염색을 통해 관찰한 사진이다. 아래쪽 패널은 A549 폐암세포 및 HB1.F3.yCD로 주입한 후의 뇌 조직을 형광분석을 통해 관찰한 사진이다. 줄기세포의 이동 효과를 관찰하기 위해, 뇌 섹션을 형광분석용 DAPI 염색을 행하였다. 붉은색은 전-염색된(pre-stained) HB1.F3.yCD; 파란색은 염색된 뇌 및 HB1.F3.yCD 세포; 검은색 및 흰색의 점선은 종양과 정상뇌세포 사이의 경계; 검은색 화살표는 H&E 염색에 의한 종양조직; 하얀색 화살표는 이동된 줄기세포를 각각 나타낸다.
도 5는 HB1.F3.yCD 세포의 인 비보 치료 효능을 측정한 결과이다. 마우스뇌의 오른쪽 반구에서 종양이 형성된 후에, CM-DiI으로 전-염색한 HB1.F3.yCD 세포를 뇌의 반대쪽 부분에 이식하였다. 세포 이식 2일후에, 5-FC (500 mg/kg/day)을 SCID 마우스의 복강내로 주입하였다. 적출한 뇌는 종양 형성에 프로드럭 5-FC의 존재하의 HB1.F3.yCD 세포에 의해 미치는 영향을 측정하였다. 이미지에서 검은색 점선의 직사각형 영역을 현미경으로 확대하여 관찰한 사진을 오른쪽 패널에 나타내었다. 검은색 화살표는 이식된 A549 폐암세포이고 회색 화살표는 사멸하는 폐암세포이다.
도 6은 yCD cDNA를 레트로바이러스 벡터 pLPCX의 다중클로닝자리에 라이게이션시켜 제조한 yCD 발현 벡터 pLPCX-yCD 벡터의 구체적인 구성을 보여준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 방법

1. 세포배양

A549 인간 비소세포성 폐암 세포주는 한국세포주은행 (Korean cell line bank, KCLB, 서울, 한국)으로부터 구입하였다. 이 세포주는 10％(v/v) 열-불활성화된 우태아혈청(FBS; Hyclone Laboratories), 1％ 페니실린 및 1％ 스트렙토마이신 (Cellgro Mediatech, Manassas, VA, USA), 1％ HEPES (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), 및 Plasmocin (Invivogen, San Diego, CA, USA)을 포함하는 Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM; Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA)에서 배양하였다. 유전적으로 변형시킨 줄기세포 HB1.F3.yCD도 상기와 동일한 배지에서 배양하였다.

2. 줄기세포 HB1.F3.yCD의 제작

yCD 과발현 인간 신경줄기세포 세포주 (HB1.F3.yCD)를 제조하기 위해, 먼저 yCD cDNA를 레트로바이러스 벡터 pLPCX의 다중클로닝자리에 라이게이션시켰다(도 6). PT67 암포트로픽 패키징 세포주(amphotropic packaging cell line)를 재조합 레트로바이러스 벡터로 감염시키고, 패키징 세포의 상등액을 취하여 F3 세포에 가하였다. 안정하게 형질 전환된 콜로니를 푸로마이신(puromycin) 내성 여부에 의해 선별하였다.

3. 5-FC와 5-FU가 폐암세포 성장에 미치는 영향 측정

5-FC 및 5-FU의 폐암세포 성장에 미치는 영향을 확인하기 위해, A549 세포(1 X 10⁵ 세포/웰)을 5％ FBS를 포함하는 상술한 배지가 채워져 있는 6-웰에 접종하였다. 폐암세포를 24시간 배양한 후에, 5-FC (0.5 mmol/l; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 5-FU (0.5 mmol/l; Sigma-Aldrich)를 각 웰에 4일간 첨가하였다. 첨가후에 결과는 IX71 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)를 사용하여 관찰하였다. 다음으로, 폐암세포의 성장에 대해 다양한 농도의 5-FU(0.005-1.0 mmol/l)가 미치는 영향을 확인하기 위해, 먼저 5 X 10³ A549 세포를 96-웰 플레이트에서 1일간 배양하였다. 다양한 농도의 5-FU을 각 웰에 첨가하여 4일간 배양하고, 세포 생존능 분석을 행하였다. 간략히 설명하면, 10 μl의 5 mg/ml MTT[3-(4-,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] 스톡 용액을 PBS(phosphate-buffered saline)에 용해시킨 후 각 웰에 첨가하고, 웰-플레이트를 37℃ 암실에서 4시간 인큐베이션하였다. 형성된 불용성 포르마잔(formazan) 결정을 100㎕ DMSO(dimethyl sulfoxide; Junsei Chemical, Co., Ltd., Tokyo, Japan)에 녹이고, Versamax ELISA microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 실험은 2회 반복 실시하였다(n = 6).

4. HB1.F3.yCD의 인 비트로 치료 효과

HB1.F3.yCD의 인 비트로 치료 효과를 확인하기 위해, A549 세포(4X10³)를 96-웰 플레이트에 배양하고 37℃에서 하루 동안 인큐베이션하였다. HB1.F3.yCD 세포(8X10³)를 24시간 인큐베이션한 후에 A549와 공동배양하였다. 공동배양 1일 후에 식염수에 희석시킨 5-FC (100, 200, 300, 400, 및 500 μg/㎖)을 배양 웰에 첨가하고 4일간 배양하였다. 세포생존율을 확인하기 위해 MTT 용액을 각 웰에 첨가하여 4시간 인큐베이션하고, 540nm 에서 흡광도를 측정하였다. 실험은 2회 반복하였다.

5. 암의 뇌전이 동물모델 제작

모든 동물은 24-26℃ 및 40-60％의 상대습도에서 12 h 명/암 사이클 및 환기조건에서 순응시켰다. 7주령의 수컷 중증복합면역결핍 마우스(severe combined immunodeficiency mouse, NOD/SCID) 15마리를 한국생명공학연구원(KRIBB, Ochang, Korea)에서 구입하였다. SCID 마우스를 마취시킨 후에, 마우스의 우반구의 백질에 1.0X10⁵의 폐암세포 A549를 2 mm [anterior/posterior (AP) + 1.0 mm, medial/lateral (ML) + 1.7 mm, dorsal/ventral (DV) -3.2 mm]의 깊이로 주사하여 폐암의 뇌 전이 동물 모델을 제작하였다.

6. HB1 .F3. yCD 의 인 비보 치료 효과

폐암세포를 뇌에 이식하고 4주 후에, 멸균한 0.85％ 생리식염수(10μl)(그룹 1) 또는 HB1.F3.yCD (1X10⁵ 세포/10μl의 식염수)(그룹 2 및 3)를 반대쪽 반구의 백질 부분에 2 mm [anterior/posterior (AP) +1.0 mm, medial/lateral (ML) -1.7 mm, dorsal/ventral (DV) -3.2 mm]의 깊이로 투여했다.

HB1.F3.yCD 세포는 투여전에 CellTracker™ CM-DiI (Invitrogen Life Technologies)와 미리 인큐베이션시켰다. 간략히 설명하면, 줄기세포를 5μM CM-DiI와 함께 37℃에서 5분간 처리하여 염색시킨 후, 염색 안정화를 위해 4℃에서 15분간 방치하였다. PBS에서 2회 세척한 후, 정해진 수의 줄기세포를 뇌에 주입하였다. 줄기세포를 뇌에 주입하고 2일 후에, 복강을 통해 0.85％ 생리식염수(100 ㎕; 그룹 1 및 그룹 2) 또는 5-FC (500 mg/kg/day; 그룹 3)을 매일 투여하였다. 총 15 마리의 마우스는 3개의 그룹으로 나누었다(그룹당 n=5). 그룹 1 음성대조군으로서 줄기세포를 주입하지 않고 대신 10 ㎕의 생리식염수를 투여하였다. 그룹 2는 HB1.F3.yCD 투여 2일 후 5-FC가 포함하지 않은 100 ㎕의 생리식염수만을 복강을 통해 매일 주입하였다. 그룹 3는 HB1. F3.yCD 투여 2일 후 5-FC (500 mg/kg/day)를 포함하는 100 ㎕의 생리식염수를 복강을 통해 매일 주입하였다. 5-FC를 최후로 주입한 후 2일 시점에서 마우스를 모두 희생시키고 뇌를 적출하였으며, 조직 고정을 위해 10％ 중성 포르말린에 보관하였다. 이종이식 동물 모델를 사용하는 인 비보 실험 계획은 도 1에 도시하여 나타내었다.

7. 조직병리학적 분석 및 형광 분석

실험동물로부터 적출한 뇌는 조직 탈수를 위해 우선 4-6 mm-두께로 자르고, 10％ 노말 포르말린 용액(Sigma-Aldrich)에서 고정시킨 후, 파라핀으로 포매하고, 조직 절편기를 사용하여 5μm 두께로 박절하여 조직절편을 제작하였다. 일반적인 프로토콜을 거친 후 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)을 사용하여 조직을 염색하고, 모델 BX51 현미경(Olympus)을 사용하여 관찰하였다. 형광분석을 통해 줄기세포의 종양지향성(tumor-tropism) 효과를 확인하기 위해 CM-DiI 전-염색한(pre-stained) HB1.F3.yCD를 마우스의 뇌에 주입하였다. 상술한 실험과정을 통해 뇌 절편을 제작한 후에, 각 절편을 10％ 노말 포르말린 용액으로 10분간 처리하고, PBS로 2회 세척하였다. DAPI(4', 6-diamidino-2-phenylindole) 용액을 각 절편에 첨가하고 37℃ 암실에 10분간 인큐베이션하였다. 염색한 절편은 IX71 역상 현미경(Olympus)을 사용하여 관찰하였다.

8. 통계분석

각 실험의 데이터는 평균±표준편차로 표시하였다. 각 그룹에서의 유의성을 평가하기 위해, GraphPad Prism software (v5.0; GraphPad Software, San Diego, CA, USA)를 사용하여 one-way ANOVA Tukey's 테스트에 의해 통계분석을 행하였다. P<0.05을 통계적으로 유의성을 갖는 것으로 하였다.

실험결과

1. 폐암세포에 대한 5- FC 및 5- FU 의 세포독성 효과

본 발명자들은 6-웰 플레이트 배양 시스템에서, 폐암세포의 생존율에 대해 5-FC 및 5-FU가 미치는 영향을 확인하였다. 폐암세포 A549를 0.5 mmol/l의 5-FC로 처리하였을 때 세포의 성장에 아무런 변화가 없었다(도 2의 패널 A). 그러나, 0.5 mmol/l의 5-FU로 처리한 경우에는 폐암세포의 성장이 현저하게 억제되었다(도 2의 패널 A). 다양한 농도, 0.01, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 및 1.0 mmol/l에서의 5-FU의 영향을 확인하기 위해, A549 세포를 96-웰 플레이트에 배양한 후에 세포 생존율을 MTT 분석방법으로 측정하였다. 폐암세포의 성장은 용량 의존적 방식으로 억제됨이 관찰되었고, 도 2의 패널 B에서 확인되는 바와 같이 세포의 생존율은 거의 80％ 까지 억제되었다.

2. HB1 .F3. yCD 및 5- FC 의 치료적 효능

상술한 5-FU가 A549 세포 성장에 미치는 영향에 대한 결과에 기초하여, 암세포 및 줄기세포를 동일한 웰에 접종하는 공동-배양 시스템을 채용하고, 세포의 생존율은 MTT 분석법으로 측정하였다. 5-FC 및 HB1.F3.yCD의 존재하에서는 A549 폐암세포의 생존율이 20-40％ 감소하였고, HB1.F3.yCD 및 500㎍/㎖의 5-FC가 존재하는 경우에 최대억제율을 나타내었다(도 3). 그러나, HB1.F3.yCD의 부존재하에서는 5-FC의 최대투여량(500μg/ml)을 주입한 경우라도 A549 폐암세포의 성장은 변화가 없었다.

3. HB1 .F3. yCD 세포의 인 비보 이동성

뇌로 전이된 폐암세포를 향한 HB1.F3.yCD 세포의 이동성(migratory property)를 확인하였다. 폐암세포 A549을 뇌의 오른쪽 반구에 이식하여 폐암세포의 뇌로의 전이와 유사한 환경을 유도하였다. 폐암세포를 뇌에 이식하고 4주 후에 CM-DiI 전-염색한 HB1.F3.yCD 세포(1.0 X 10⁵세포)를 뇌의 왼쪽 반구 2mm [anterior/posterior (AP) +1.0 mm, medial/lateral (ML) -1.7 mm, dorsal/ventral (DV) -3.2 mm]의 깊이로 투여했다. DAPI 대조염색을 행하고, CM-DiI-표지된 줄기세포의 이동을 형광현미경을 통해 추적하였다. 형광분석에 의해, 붉은색 염색된 HB1.F3.yCD 세포는 뇌의 반대측에서 관찰되었는데(도 4), 이는 인 비보에서 주입된 HB1.F3.yCD 세포가 뇌에 이식된 A549 폐암세포를 향해 이동특성을 갖는다는 것을 보여준다.

4. HB1 .F3. yCD 세포의 인 비보 치료 효능

마우스 뇌에서의 HB1.F3.yCD 세포의 치료적 효능을 확인하기 위해, 이종이식 동물모델을 사용하였다(9, 16). 최후의 5-FC 주입을 행한 후 2일 시점에서, 폐암세포를 갖는 SCID 마우스의 뇌를 적출하여 조직학적 분석 및 형광분석을 행하였다. HB1.F3.yCD를 투여하였으나 5-FC를 주입하지 않은 경우 또는 5-FC를 주입하였으나 HB1.F3.yCD를 투여하지 않는 경우에서는 뇌에 이식된 폐종양 덩어리는 축소되어 있지 않았다. 이와는 대조적으로, 5-FC (500 mg/kg/day)의 존재하에서 HB1.F3.yCD를 투여한 경우에는 폐종양 조직이 현저하게 감소되어 있는 것이 관찰되었다(도 5).

조직학적 분석에 의해 관찰된 바에 의하면, 이식된 폐암세포와 정상 마우스 뇌 세포는 구분이 가능하였고, 정상 뇌세포와 비교하여 폐암세포에서 세포질에 대한 핵의 비율이 증가하였다. 또한, 5-FC의 존재하에서 yCD를 발현하는 HB1.F3.yCD 세포에 의해, 형성된 종양 조직내에서 폐암세포의 밀도도 현저하게 감소하였다(도 5).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

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(a) 치료 유전자를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 발현벡터로 형질전환되어 상기 치료유전자를 발현하는 줄기세포의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 비소세포 폐암 또는 비소세포 폐암의 뇌 전이암의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물로서,
상기 치료유전자는 박테리아 사이토신 디아미나아제(bacteria cytosine deaminase)이고, 상기 줄기세포는 인간 초대 배양 신경줄기세포에 v-myc 종양 유전자를 발현가능한 형태로 포함한 벡터를 도입하여 확립한 인간 신경줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
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(a)' 치료 유전자를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 발현벡터로 형질전환되어 상기 치료유전자를 발현하는 줄기세포; 및 (b)' 프로드럭(pro-drug)을 포함하는 비소세포 폐암 또는 비소세포 폐암의 뇌 전이암의 치료용 키트로서,
상기 치료 유전자는 박테리아 사이토신 디아미나아제(bacteria cytosine deaminase)이고, 상기 줄기세포는 인간 초대 배양 신경줄기세포에 v-myc 종양 유전자를 발현가능한 형태로 포함한 벡터를 도입하여 확립한 인간 신경줄기세포이고, 상기 프로드럭은 5-플루오로사이토신(5-FC)인 것을 특징으로 하는 키트.
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