KR101442682B1

KR101442682B1 - 미생물의 세포 내 대사 프로파일을 위한 추출 및 분석 방법

Info

Publication number: KR101442682B1
Application number: KR1020120038484A
Authority: KR
Inventors: 이진원; 박창훈; 여명수; 이수진; 김보림
Original assignee: 서강대학교산학협력단
Priority date: 2012-04-13
Filing date: 2012-04-13
Publication date: 2014-09-19
Also published as: KR20130115815A

Abstract

본 발명은 (a) 미생물의 바이오매스를 냉장 메탄올(cold methanol)에 현탁한 다음 동결시키는 단계; (b) 상기 동결된 바이오매스를 해동시키는 단계; (c) 상기 단계 (a) 및 (b)를 반복하여 상기 바이오매스로부터 누출된 대사물의 현탁액을 얻는 단계; 및 (d) 상기 대사물의 현탁액에 대하여 매스 스펙트로미트리(mass spectrometry) 분석을 실시하여 상기 미생물의 세포 내 대사물을 동정하는 단계를 포함하는 미생물의 세포 내 대사 프로파일(intracellular metabolic profile)을 얻는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 따르면, 본 발명은 고생산 및 고수율의 대사 프로파일을 제공할 수 있다.

Description

미생물의 세포 내 대사 프로파일을 위한 추출 및 분석 방법{Method for Extracting and Analysing of Intracellular Metabholic Profile in Microorganisms}

본 발명은 미생물의 세포 내 대사 프로파일을 위한 추출 및 분석 방법에 관한 것이다.

최근, 세포 시스템에 관한 연구가 점점 보편화되고 세포의 성장 기술 및 생산 과정을 최적화를 향상시킴으로 생산이 증가되었다. 세포 성장은 초기에 대사 공학에 의해 증대되었고, 응용 생물학적 제법의 발전을 통해 생산성이 증대되었다. 세포 성장을 증진시키기 위해서는, 생합성 반응, 에너지 대사 및 보충대사반응과 밀접하게 연과되어 있기 때문에 탄소대사에 대한 이해가 중요하다. 예컨대, 중추 탄소대사의 이해 및 K. oxytoca의 인-비보 동역학과 관련된 이해를 통해 생합성과정의 중간 대사 단계를 조작하여 2,3-부탄다이올의 생산을 증가시켰다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 미생물을 배양하여 미생물 내의 대사산물을 수득하기위해 세포내 대사산물을 추출하는 최적화된 방법을 조사하고자 노력하였다. 그 결과, 냉각 메탄올을 이용하는 경우, 타 추출방법과 비교하여 세포내 대사물질을 고수율로 수득할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 세포 내 대사 프로파일을 얻는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 미생물의 세포 내 대사 프로파일(intracellular metabolic profile)을 얻는 방법을 제공한다:

본 발명자들은 미생물을 배양하여 미생물 내의 대사산물을 수득하기위해 세포내 대사산물을 추출하는 최적화된 방법을 조사하고자 노력하였다. 그 결과, 냉각 메탄올을 이용하는 경우, 타 추출방법과 비교하여 세포내 대사물질을 고수율로 수득할 수 있음을 규명하였다.

본 발명의 미생물의 세포 내 대사 프로파일을 얻는 방법을 각각의 단계로 나누어 상세하게 설명하면 다음과 같다:

단계 (a): 동결 단계

본 발명에 따르면, 미생물의 바이오매스를 냉장 메탄올(cool methanol)에 현탁한 다음 동결시킨다.

바람직하게는, 상기 미생물은 크렙시엘라(Klebsiella) 종이고, 상기 크렙시엘라 종은 크렙시엘라 그래눌로마티스(Klebsiella granulomatis), 크렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 크렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 크렙시엘라 테리제나(Klebsiella terrigena) 및 크렙시엘라 플랜티콜라(Klebsiella planticola)를 포함하며, 가장 바람직하게는 크렙시엘라 옥시토카이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 미생물 바이오매스는 회분 배양 방식으로 5.0 L 생물반응기를 이용하여 2.0 L의 배지로, 10시간 배양한 후에 채취된 미생물 바이오매스이다. 채취된 미생물은 채취 즉시 60% 메탄올(-40℃)과 혼합하고 냉장 원심분리를 실시하여 상층액을 제거한 세포물을 -80℃에 보관하여 다음 과정을 진행한다.

상기 -80℃에 보관된 미생물 바이오매스를 해동하여 냉장 메탄올에 현탁한다.

본 발명의 미생물 바이오매스에 첨가되는 메탄올의 분자식은 CH₃OH로, 하이드록시메탄(Hydroxymethane), 메틸 알코올(Methyl alcohol), 메틸 하이드레이트(Methyl hydrate), 메틸 하이드록사이드(Methyl hydroxide). 메틸릭 알코올(Methylic alcohol), 메틸올(Methylol) 및 목정(Wood alcohol)과 동일한 의미를 갖는다.

바람직하게는, 본 발명의 단계(a)의 메탄올은 -80℃ 내지 -30℃ 상태의 냉장된 형태이다. 보다 바람직하게는, -70℃ 내지 -40℃ 메탄올이고, 가장 바람직하게는 -60℃ 내지 -40℃ 메탄올이다.

본 발명의 미생물 바이오매스의 세포내 대사산물을 추출하기 위해 처리되는 냉장 메탄올은 100 (vol/vol%) 메탄올이다.

상기 냉장 메탄올이 첨가된 미생물 바이오매스를 액체 질소를 이용하여 동결한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 현탁한 미생물 바이오매스가 첨가된 냉장 메탄올이 든 튜브를 액체질소에 담궈 동결한다.

단계 (b): 해동 단계

이어, 상기 동결괸 바이오매스를 해동한다.

바람직하게는, 단계 (b)의 해동은 드라이아이스 상에서 실시한다.

단계 (c): 대사물의 현탁액을 얻는 단계

상기 단계 (a) 및 (b)를 반복하여 상기 바이오매스로부터 누출된 대사물의 현탁액을 얻는다.

단계 (a)의 동결 및 단계 (b)의 해동을 반복하여 남아있는 세포 내 대사물질이 세포 외로 새어나오도록 한다.

바람직하게는 상기 단계 (a) 및 (b)의 반복은 1-10 차례 실시하고, 보다 바람직하게는, 1-6 차례 실시하며, 가장 바람직하게는 2-5차례 실시한다.

바람직한 구현예에 따르면, 상기 과정을 통해 수득한 세포내 대사물질의 용해물을 -80℃에 보관한다.

단계 (d): 대사물을 동정하는 단계

마지막으로, 상기 대사물의 현탁액에 대하여 매스 스펙트로미트리(mass spectrometry) 분석을 실시하여 상기 미생물의 세포 내 대사물을 동정한다.

바람직하게는, 본 발명의 단계 (c) 및 단계 (d) 사이에 상기 대사물의 현탁액을 여과하는 과정을 추가적으로 포함하며 상기 단계 (d)는 상기 여과 과정을 거친 대사물의 현탁액을 이용한다.

본 발명의 미생물 바이오매스로부터 추출한 세포내 대사물은 바람직하게는, 3-포스포글리세린산염(3-phosphoglycerate; 3-PG), 아세틴-코엔자임 A(acetyl-coenzyme A; AcCoA), 프럭토즈 6-포스페이트(fructose 6-phosphate; F6P), 프럭토즈 1,6-비스포스페이트(fructose 1,6-bisphosphate; FBP), 글루코즈 1-포스페이트(glucose 1-phosphate; G1P), 글루코오즈 6-포스페이트(glucose 6-phosphate; G6P), 포스포에놀피루브산(phosphoenolpyruvate; PEP), α-케토글루타레이트(α-ketoglutarate; α-KG), 글리세롤 3-포스페이트(glycerol 3-phosphate; G3P), NAD(Nicotinamide Adenine Dinucleotide), NADH(Nicotinamide Adenine Dinucleotide reduced form), NADP(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate), NADPH(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate reduced form), ADP(Adenosine Diphosphate), AMP(Adenosine Monophosphate), ATP(Adenosine Triphosphate), 글리세레이트(glycerate), 시트레이트(citrate), 글루타메이트(glutamate) 및 말레이트(malate)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사물이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법을 이용하여 동정한 대사물은 고온 에탄올 추출방법, 메탄올-클로로포름 추출방법, 열수 추출방법, 수산화칼륨 추출방법 및 과염소산 추출방법과 비교하여 높은 수율을 보여준다.

본 발명의 미생물의 세포 내 대사 프로파일을 얻는 방법은 세포 내 대사물질의 추출 효율을 높이기 위해 다른 용매를 이용한 추출방법을 추가적으로 포함할 수 있다.

바람직하게는, 상기 방법은 미생물 대상물 중에서 G1P(glucose 1-phosphate) 및 NADPH의 분석을 위하여 상기 미생물의 바이오매스의 과염소산(perchloric acid) 추출 단계를 추가적으로 포함한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 미생물의 세포 내 대사 프로파일(intracellular metabolic profile)을 얻는 방법을 제공한다.

(b) 본 발명은 고생산 및 고수율의 대사 프로파일을 제공할 수 있다.

(c) 본 발명은 원하는 세포내 대사물질에 대한 최적의 추출방법을 모색하여 최고 수율의 방법을 구축할 수 있다.

도 1은 회분식 배양의 성장 프로파일을 보여준다. ●는 건조중량을 나타내며, 위를 향하는 화살표는 샘플링을 의미한다. 세포외 대사물질인 글루코오즈(□), 숙신산(△), 젖산(▼), 포름산(◁), 아세트산(▶), meso-2,3-부탄다이올(▲), R,R-2,3-부탄다이올(▽) 및 에탄올(◀)의 농도 프로파일을 나타낸다.
도 2는 (a) ME, (b) BE, (c) MC, (d) HW, (e) PH 및 (f) PA 추출방법에 대한 UPLC/Q-TOF-MS ES-총 이온 크로마토그램을 보여준다.
도 3은 크렙시엘라 옥시토카의 세포내 대사물질의 농도를 나타낸다. 배양 후 10시간에 샘플을 수득하여 각 추출방법[냉장 매탄올(검정색), 고온 에탄올(회색), 메탄올-클로로포름(백색), 열수(사선), 수산화칼륨(가로줄) 및 과염소산(교차줄)]별로 나타낸다.
도 4는 20 대사물질에 대한 추출 효율의 최대값 및 중간값을 보여준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 방법

실험재료

사용 균주는 Klebsiella oxytoca(하기 ‘K. oxytoca'라고 함, ATCC 43863)로 ATCC(American Type Culture Collection)에서 주문하여 사용하였다. 분석에 사용된 세포 외 대사물질[글루코오즈, 젖산, 피루브산, 숙신산, (R,R)-2,3부탄다이올, (meso)-2,3부탄다이올 및 에탄올] 과 세포 내 대사물질 [3-포스포글리세린산염(3-phosphoglycerate; 3-PG), 아세틴-코엔자임 A(acetyl-coenzyme A; AcCoA), 프럭토즈 6-포스페이트(fructose 6-phosphate; F6P), 프럭토즈 1,6-비스포스페이트(fructose 1,6-bisphosphate; FBP), 글루코즈 1-포스페이트(glucose 1-phosphate; G1P), 글루코오즈 6-포스페이트(glucose 6-phosphate; G6P), 포스포에놀피루브산(phosphoenolpyruvate; PEP), α-케토글루타레이트(α-ketoglutarate; α-KG), 글리세롤 3-포스페이트(glycerol 3-phosphate; G3P), NAD(Nicotinamide Adenine Dinucleotide), NADH(Nicotinamide Adenine Dinucleotide reduced form), NADP(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate), NADPH(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate reduced form), ADP(Adenosine Diphosphate), AMP(Adenosine Monophosphate), ATP(Adenosine Triphosphate), 글리세레이트(glycerate), 시트레이트(citrate), 글루타메이트(glutamate) 및 말레이트(malate)] 의 표준 물질은 Sigma(미국) 또는 Fluka(미국)에서 구입하였다. 고순도 용제 및 시약을 사용하여 LC/MS(Liquid Chromatography/Mass Spectrometry) 분석을 실시하였다

배양 조건

전 배양은 12시간, 교반속도 200 rpm, 배양 온도는 37℃로 200 ㎖ LB 배지를 이용하여 500 ㎖ 플라스크에서 수행하였다. 본 배양인 회분 배양은 5.0 L 생물반응기를 이용하여 2.0 L의 작업량으로 다음과 같은 조성의 최소배지를 이용하여 진행하였다:

2.90 g/L K₂HPO₄, 11.30 g/L KH₂PO₄, 6.60 g/L (NH₄)₂SO₄, 0.25 g/L MgSO₄·7H₂O, 0.05 g/L FeSO₄·7H₂O, 0.001 g/L ZnSO₄·7H₂O, 0.0014 g/L MnSO₄·7H₂O, 0.001 g/L, CaCl₂·2H₂O, 0.1 ㎖/L HCl, 20 g/L 글루코오즈. 주입 공기는 1.5 L/분이고 2 M NaOH를 이용하여 pH 6.5로 조절하였다. 또한 주기적으로 거품억제제(anti-foam)을 주입하여 거품에 의한 공정의 방해 요인을 제거하였다.

샘플링 및 퀀칭

본 배양이 시작된 후 10시간 후에 배양 균주 채취를 하였다. 10 ㎖ 병(vial)을 이용 채취된 균주는 같은 부피의 60% 메탄올(-40℃)에 바로 투입하였다. 결과의 유의성을 위해, 각 세포 내 대사물질 추출방법 당 4 차례 샘플을 준비하였다. 메탄올에 담겨진 샘플은 냉동 원심분리기를 이용하여 10분 동안 30,000×g, -9℃ 조건으로 원심분리를 실시하였다. 상층액을 제거하고 원심분리된 세포물질을 액체질소에서 처리한 후 -80℃에서 세포내 대사물질 추출방법 시행 전까지 보관하였다.

추출방법

(1) 냉장 메탄올 추출법(Cool Methanol Extraction; ME)

퀀칭(Quenching) 단계에서 보관된 세포물질에 1 ㎖의 100% 메탄올(-50℃)을 첨가하여 부유시킨 후 액체질소를 첨가하여 냉각하였다. 이 용액을 드라이아이스를 이용하여 해동하였다. 이 같이 냉각-해동 과정을 3회 반복 하여 실시, 세포 내 대사물질들이 세포 외부로 새어 나오게 하였다. 속도 16,000×g, 온도 -9℃, 시간 5분의 조건으로 원심분리를 실시하였다. 상층액(세포 내 대사물질이 녹아있는)은 드라이아이스를 이용하여 보관하고 500 ㎕ 100% 메탄올(-50℃)을 첨가하여 원심분리물을 부유시켜 상기 서술된 냉각-해동 과정을 반복하여 남아있을지 모를 세포내 대사물질을 추출하였다. 이 같은 과정을 통해 수득한 세포내대사물질이 녹아있는 액체는 -80℃에서 UPLC/Q-TOF-MS 분석을 위한 샘플 처리 전까지 보관하였다.

(2) 고온 에탄올 추출법(Boiling Ethanol Extraction; BE)

퀀칭 단계에서 준비된 세포물질에 1 ㎖ 100% 에탄올(90℃)을 주입한 후 열혼합기(Thermomixer, Eppendorf, 독일)를 이용하여 10분 동안 90℃에서 반응하였다. 그 후 5분동안 얼음에서 냉각하였다. 16,000×g, 0℃의 조건에서 5분동안 원심분리를 실시하여 부유물은 제거하였다. 이 같은 과정을 통해 수득한 세포내 대사물질이 용해된 액체를 -80℃에서 UPLC/Q-TOF-MS 분석을 위한 샘플 처리 전까지 보관하였다.

(3) 메탄올/클로로포름 추출(Methanol/Chloroform Extraction; MC)

퀀칭 단계에서 준비된 세포물질을 1 ㎖ 메탄올/클로로포름 용액(2:1 v/v)을 첨가하여 부유시키고 냉장 메탄올을 이용한 세포내 대사물질 추출방법에서 사용한 냉각-해동 과정을 진행하였다. 그리고 얼음에서 냉각시킨 0.25 ㎖ 0.5 mM 트리신(tricine)을 주입하였다. 샘플을 교반하여 혼합한 후 상분리가 일어나는 과정을 거쳤다. 상층인 메탄올층을 수집하여 얼음 상에 냉각시키고 하층에 0.25 ㎖ 얼음-냉각 0.5 mM 트리신을 주입하여 다시 상분리를 실시하였다. 상층인 메탄올층은 얼음 상에서 냉각시키고 미리 수득한 메탄올층과 혼합하였다. 메탄올층을 16,000×g, 0℃의 조건에서 10분 동안 원심분리를 실시하여 상층액을 수득하고 -80℃에서 UPLC/Q-TOF-MS 분석을 위한 샘플 처리 전까지 보관하였다.

(4) 열수 추출(Hot Water Extraction; HW)

퀀칭 단계에서 준비된 세포물질에 정제수(de-ionized water) 1 ㎖를 첨가한 후 열혼합기를 이용하여 95℃에서 5분동안 반응하였다. 이후 얼음 상에서 냉각하고 9,500×g, -9℃의 조건에서 5분동안 원심분리를 실시하여 상층액을 -80℃에서 UPLC/Q-TOF-MS 분석을 위한 샘플 처리 전까지 보관하였다.

(5) 수산화칼륨 추출(Potassium Hydroxide Extraction; PH)

퀀칭 단계에서 준비된 세포물질에 1 ㎖ 0.25 M KOH(80℃)을 첨가하여 부유시키고 열혼합기를 이용하여 80℃에서 10분동안 반응하였다. 그리고 5분동안 얼음 상에서 냉각하였다. 20,000×g, 0℃의 조건에서 10분 동안 원심분리를 실시하고 상층액을 수득하여 1 ㎖ 0.25 M 과염소산를 첨가하여 중화반응을 진행하였다. 중화반응 후 원심분리를 실시하여 상층액을 -80℃에서 UPLC/Q-TOF-MS 분석을 위한 샘플 처리 전까지 보관하였다.

(6) 과염소산 추출(Perchloric Acid Extraction; PA)

퀀칭 단계에서 준비된 세포물질을 1 ㎖ 냉각된 0.25M 과염소산(perchloric acid)를 첨가하여 냉장 메탄올을 이용한 세포내 대사물질 추출방법에서 사용한 냉각=해동 과정을 진행하였다. 16,000×g, 0℃의 조건으로 원심분리를 5분 동안 실시한 후 상층액을 수득하고 KOH를 주입하여 중화반응을 진행하였다. 또다시 원심분리하여 상층액을 -80℃에서 UPLC/Q-TOF-MS 분석을 위한 샘플 처리 전까지 보관하였다.

여과

6가지의 세포내 대사물질 추출방법을 이용하여 수득한 세포내 대사물질이 용해되어 있는 액상을 아미콘 울트라프리-MC 초여과 팁(Amicon Ultrafree-MC ultrafilter tips, Millipore Co., 미국)을 이용하여 9,100×g, 4℃의 조건에서 원심분리를 2시간 동안 진행하여 여과 추출 하였다.

세포외 대사물질 농도의 측정

세포외 대사물질인 글루코오즈, 젖산, 포름산염 및 아세테이트의 농도는 HPLC(high-performance liquid chromatography, UV 730D 검출기, RI 750F 모니터; 영진, 대한민국)를 이용하여 측정하였다. 사용한 컬럼은 아미넥스(Aminex) HPX-87H, 300 ㎜×7.8 ㎜(Bio-Rad, 미국)을 사용하였고 이동상은 55℃에서 흐름 속도 0.6 ㎖/분의 조건으로 0.005 N H₂SO₄을 사용하였다.

UPLC /Q- TOF - MS 측정

세포내 대사물질의 농도를 측정하기 위해, 워터스 액퀴티 UPLC 시스템(Waters Acquity UPLC^TM system, Waters, 영국)을 사용하였다. 사용한 컬럼은 액퀴티 HSS T3 컬럼(Acquity HSS T3 column, 1.8 ㎛, 2.1 ㎜×150㎜; Waters, 영국)이다. 오븐의 온도는 35℃이고, 자동-샘플러의 온도는 4℃의 조건으로 진행하였다. 이동상으로는 (A) 5 mM 트리부틸암모늄 아세테이트(tributylammonium acetate in water) 및 (B) 메탄올을 사용하였다. 사용한 질량분석기mass spectrometry는 워터스 제노 Q-TOP/MS(Waters Xevo^TM Q-TOF/MS; Waters Corp., 영국)이었으며, 이온화는 음성 전기분무(negative electrospray; ESI) 방식를 이용하였다. 질량 범위는 m/z 50 내지 1000 Da으로 0.3 초 스캔시간으로 설정하였다. ESI 소스 상태는 다음과 같다: 캐필러리 전압, 3.0 kV; 샘플링 콘, 30 V; 추출 콘, 3.0 V; 소스 온도, 100℃; 탈용매화 온도, 350℃. 탈용매화 및 콘 가스(cone gas)로는 질소를 사용하였으며 흐름 속도는 500 L/h 이였다. 충돌 에너지(collision energy)는 3 eV 이었다. 결과의 정확도를 높이기 위해 LockSpray^TM 를 사용하였다.

세포내 대사물질의 부피

세포내 대사물질의 농도를 구하기 위해 세포내 대사물질의 부피를 결정 하였다. 세포내 대사물질의 농도는 세포내 물질의 부피로 나누어서 mM 단위로 치환될 수 있다. 본 연구에서는 K. oxytoca의 세포내 대사물질 부피로 보고되어있는 1.67 ㎖/㎎ 건조중량 수치를 이용하여 정량 분석에 사용하였다.

결과

회분식배양의 성장 프로필

K. oxytoca의 회분식배양 특성분석을 위해 2시간 단위로 샘플을 채취하고 세포 양 및 세포외 대사물질 농도를 분석하였다(도 1). 도 1에서 세포건조중량 분석을 통해 K. oxytoca가 접종 후 8시간까지 지수생장을 하였고 그 이후에는 정지상에 도달한 것을 알 수 있었다. 생장과 관련된 생산물인 숙신산, 젖산, 포름산 및 아세테이트의 농도는 세포 건조 질량과 유사한 경향을 보이는 것을 확인하였다. 또한 지수생장이 끝나는 시점에서 배지 내의 모든 글루코오즈를 완전히 소모한 것을 확인 하였다.

UPLC /Q- TOF - MS 측정

UPLC 시스템은 K. oxytoca의 세포내 대사물질의 효과적이고 편리한 분석을 위해 사용되었다. 특히 UPLC 총이온 크로마토그램(Total Ion Chromatograms; TICs)을 비교함으로써 6가지 세포내 대사물질 추출 방법의 추출물질과 추출물의 상대적인 차이를 확인 할 수 있었다(도 2). 분석된 20가지의 K. oxytoca 세포내 대사물질은 각 표준물질의 절편 이온(fragment ions), 체류 이온(retention ions) 및 마커 이온(marker ions)의 accurate mass로 확인 되었고 각 물질의 분석특성은 표 2에 나타내었다(표 1 및 표 2).

세포내 대사물질의 농도

6가지 세포내 대사물질 추출방법의 비교를 위하여 모든 추출은 동일한 샘플을 이용해 시행하였다. 또한 각 추출방법은 신뢰도와 효율성을 위하여 3번 반복하여 수행하였다(도 3). 도 3은

추출방법의 영향

추출물의 완벽성을 갖추고 세포내 효소 및 화학물질에 의한 전반적인 변화 및 열에 의한 변성이 일어나지 않게 하는 것이 효율적인 세포내 대사물질의 추출방법이다. 이러한 효율적인 방법에 대한 연구를 위해 본 연구에서는 6가지의 세포내 대사물질 추출방법을 시행하여 분석하여 K. oxytoca에 가장 적합한 추출방법을 확인하고자 하였다. 각 추출방법의 효율도를 평가하기위하여 다음과 같은 두 가지의 효율도 계산법을 사용하였다(공식 1 및 공식 2).

(공식 1)

(공식 2)

그리고 이에 대한 결과를 도 4에 나타내었다. 과염소산을 이용한 추출방법의 경우 모든 세포내 대사물질에서 1에 가까운 효율도(vs 최대값)를 얻을 수 있었다. 냉장 메탄올, 메탄올/클로로포름 또는 열수를 이용한 추출방법의 경우 유사한 효율도를 보이는 것을 확인 하였다. 또한 이 세 추출방법은 거의 완벽에 가까운 추출결과를 나타내었다. 그러나 냉장 메탄올을 이용한 추출방법의 경우 추출의 안정도로 이해 될 수 있는 효율도(vs. 중간값)가 1에 가까운 것으로 나타나 다른 추출방법에 비해 추출의 안정도가 뛰어난 것을 확인 하였다(도 4).

고찰

6 가지 세포내 대사물질 추출방법에서 가장 많은 수의 대사물질을 추출한 방법은 냉장 메탄올, 메탄올/클로로포름 또는 열수를 이용한 방법으로 조사한 20가지 물질 중 18개의 대사물질을 추출할 수 있었다. 그 다음은 17개의 대사물질을 추출해낸 고온 에탄올 및 과염소산을 이용한 추출방법이었다. 추출된 대사물질의 농도를 조사 결과 냉장 메탄올을 이용한 추출 방법이 다른 추출 방법보다 분석 안정성이 높았다. 그러나 세포내 대사물질인 G1P 및 NADPH의 경우 냉장 메탄올을 이용한 방법에서는 추출되지 않았다. 과염소산을 사용한 추출방법은 UPLC/Q-TOF/MS를 이용한 분석의 경우 다른 방법보다 G1P 및 NADPH의 농도가 높이 나왔다. 따라서 세포내 대사물질의 전반적인 추출을 할 경우 과염소산의 동시 사용을 고려해야 한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

크렙시엘라 옥시토카의 세포 내 대사 프로파일(intracellular metabolic profile)을 얻는 방법:
(a) 크렙시엘라 옥시토카의 바이오매스를 -80℃ 내지 -30℃의 100 % 냉장 메탄올(cold methanol)에 현탁한 다음 동결시키는 단계;
(b) 상기 동결된 바이오매스를 해동시키는 단계;
(c) 상기 단계 (a) 및 (b)를 1-10 차례 반복하여 상기 바이오매스로부터 누출된 대사물의 현탁액을 얻는 단계; 및
(d) 상기 대사물의 현탁액에 대하여 매스 스펙트로미트리(mass spectrometry) 분석을 실시하여 상기 크렙시엘라 옥시토카의 세포 내 대사물을 동정하는 단계; 상기 대사물은 3-포스포글리세린산염(3-phosphoglycerate; 3-PG), 아세틴-코엔자임 A(acetyl-coenzyme A; AcCoA), 프럭토즈 6-포스페이트(fructose 6-phosphate; F6P), 프럭토즈 1,6-비스포스페이트(fructose 1,6-bisphosphate; FBP), 글루코즈 1-포스페이트(glucose 1-phosphate; G1P), 글루코오즈 6-포스페이트(glucose 6-phosphate; G6P), 포스포에놀피루브산(phosphoenolpyruvate; PEP), α-케토글루타레이트(α-ketoglutarate; α-KG), 글리세롤 3-포스페이트(glycerol 3-phosphate; G3P), NAD(Nicotinamide Adenine Dinucleotide), NADH(Nicotinamide Adenine Dinucleotide reduced form), NADP(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate), NADPH(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate reduced form), ADP(Adenosine Diphosphate), AMP(Adenosine Monophosphate), ATP(Adenosine Triphosphate), 글리세레이트(glycerate), 시트레이트(citrate), 글루타메이트(glutamate) 및 말레이트(malate)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사물이다.
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제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 동결은 액체 질소를 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 해동은 드라이아이스 상에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
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제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c) 및 (d) 사이에 상기 대사물의 현탁액을 여과하는 과정을 추가적으로 포함하며 상기 단계 (d)는 상기 여과 과정을 거친 대사물의 현탁액을 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
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제 1 항에 있어서, 상기 방법은 미생물 대사물 중에서 G1P(glucose 1-phosphate) 및 NADPH의 분석을 위하여 상기 미생물의 바이오매스의 과염소산(perchloric acid) 추출 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.