KR101437582B1 - 오공을 유효 성분으로 하는 신경 질환의 예방, 개선 및 치료용 조성물 - Google Patents

오공을 유효 성분으로 하는 신경 질환의 예방, 개선 및 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신경 질환의 예방, 개선 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 오공(蜈蚣, Scolopendra subspinipes mutilans)을 유효 성분으로 하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 신경 질환의 예방, 개선 및 치료용 조성물은 β-Ⅲ tubulin과 GAP 43의 mRNA 및 단백 발현의 촉진 효능, pErk1/2의 단백 발현의 촉진 효능, 신경돌기의 생장 촉진 효능을 보유하는 특징을 가지고 있다.
본 발명에 따른 신경 질환의 예방, 개선 및 치료용 조성물은, 구체적으로는, NGF(Neuro growth factor) 3~7 ng/ml와 오공 용액 6~14 mg/ml를 함유하는 것을 기술적 특징으로 하고 있다.
또한 흰목이버섯 또는 치자의 추출물 3~10 ng/ml와 오공 용액 6~14 mg/ml를 함유하는 것을 기술적 특징으로 하고 있다.
또한 노루궁뎅이버섯, 명일엽, 홉 또는 울금의 추출물 3~15 ng/ml와 오공 용액 6~14 mg/ml를 함유하는 것을 기술적 특징으로 하고 있다.

Description

오공을 유효 성분으로 하는 신경 질환의 예방, 개선 및 치료용 조성물{A COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF NEUROLOGICAL DISEASE CONTAINING SCOLOPENDRA SUBSPINIPES MUTILANS}
본 발명은 신경 질환의 예방, 개선 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 오공(蜈蚣, Scolopendra subspinipes mutilans)을 유효 성분으로 하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 신경 질환의 예방, 개선 및 치료용 조성물은 β-Ⅲ tubulin과 GAP 43의 mRNA 및 단백 발현의 촉진 효능, pErk1/2의 단백 발현의 촉진 효능, 신경돌기의 생장 촉진 효능을 보유하는 특징을 가지고 있다.
본 발명에 따른 신경 질환의 예방, 개선 및 치료용 조성물은, 구체적으로는, NGF(Neuro growth factor) 3~7 ng/ml와 오공 용액 6~14 mg/ml를 함유하는 것을 기술적 특징으로 하고 있다.
또한 흰목이버섯 또는 치자의 추출물 3~10 ng/ml와 오공 용액 6~14 mg/ml를 함유하는 것을 기술적 특징으로 하고 있다.
또한 노루궁뎅이버섯, 명일엽, 홉 또는 울금의 추출물 3~15 ng/ml와 오공 용액 6~14 mg/ml를 함유하는 것을 기술적 특징으로 하고 있다.
현대 사회에서는 고령화와 불규칙한 식습관 및 스트레스 등 다양한 원인으로 인해 신경계 손상이 유발될 수 있다. 신경계의 손상으로 인한 신경 질환은 중추신경계에서 말초신경계에 이르기까지 그 종류가 다양하고 광범위하며, 신경 재생이 어렵기 때문에 치료가 어렵고 재발이 쉬우며 만성 질환으로 이어지기 쉽다.
신경 손상의 증상으로는 마비, 발작 등으로 나타나며, 대표적인 질환은 뇌졸중, 뇌경색, 알츠하이머, 파킨슨병, 소아마비 등의 질환이 있다. 이러한 질환을 치료하기 위한 기존의 치료제는 대부분의 경우 손상된 신경을 재생하기 보다는 더 이상 손상이 진행되지 않도록 유지하는 목적을 갖고 있다.
예를 들어, 뇌졸중, 뇌경색 등의 일부 신경계 질환에 혈전용해제 등의 국소적인 치료가 실행되고 있다. 또한 희토류에 속하며 산화 및 세포자살(Apoptosis)을 방지하는 효능이 있는 세리아를 3 nm 크기의 나노 입자로 제작하여 뇌에 적용하는 기술이 개발되고 있다.
그런데 혈전용해제는 발병 후 3~4시간 이내에만 유효하며, 치료 성공률은 12% 정도에 불과하다는 단점이 있다. 또한 세리아를 나노 입자로 제작하여 생체 내에 적용하는 기술에는 위험성이 있을 수 있다. 즉 나노 입자는 표면 반응력이 높고 세포막을 투과하는 것이 가능해 호흡기나 피부로 외부에서 쉽게 인체에 유입될 수 있다. 따라서 나노 입자가 혈액을 타고 체내 곳곳으로 이동하면서 뇌 또는 심혈관계 질환을 일으킬 수 있다.
한편 기존의 연구와는 달리 신경 재생에 관한 연구와 시도가 다양하게 진행되고 있는데, 신경 분화 연구와 줄기세포를 이용한 신경 질환 연구가 활발하게 진행 중이다.
즉 신경은 다양한 경로와 여러 가지 요소로 신경 돌기를 발생시키는데, 여러 물질을 이용하여 신경 분화를 유도함으로써 신경 질환의 예방, 개선 및 치료 효능을 갖도록 할 수 있는 연구가 진행 중이다.
이에 따라 본 출원인은 천연 유래의 물질을 활용하여 부작용 및 세포독성이 동반되지 않으며, β-Ⅲ tubulin과 GAP 43의 mRNA와 단백질 발현을 촉진하고, pErk1/2의 단백질 발현을 촉진함으로써 효과적으로 신경 질환을 예방, 개선 및 치료할 수 있는 조성물을 안출하였다.
본 발명은 오공을 PC12 세포의 β-Ⅲ tubulin, GAP 43, Erk1/2, pErk1/2에 실험한 결과에 근거하고 있는바, 이하에서 본 발명에 사용된 실험 관련 기전에 대하여 간략히 서술한다.
PC12 세포 (rat adrenal pheochromocytoma cell)는 신경분화 연구에 주로 사용되는 세포주이다. 흰쥐의 부신 수질의 크롬 친화성 세포에서 유래하였으며, 크롬 친화성 세포는 신경외배엽에서 기원한다. 이 세포는 신경성장인자 (neuronal growth factor, NGF)를 처리하면, 신경세포로 분화하며, 신경전달물질인 도파민이 증가하고 신경돌기(neurite) 및 시냅스 소포(synaptic vesicle)가 형성된다는 연구 결과가 있다.
NGF는 뉴로트로핀(neurotrophin)의 한 종류로서, tyrosine kinase receptor TrkA와 결합하여 인산화 상태인 phosphorylates TrkA로 활성화되며 Ras(renin angiotensin system protein), Raf(protein-serine/threonine kinases) 활성을 거친다. Ras, Raf가 활성됨에 따라 MAPK(Mitogen-activated protein kinase)가 인산화되어 활성되며, 신경기능은 MAPK 집합체중 하나인 Erk1/2에 의해 조절된다. 인산화되어 활성화된 pErk1/2은 세포분화와 세포생존에 관여하며 세포생장을 조절하고 신경가소성(neural plasticity)과 관련된 기능을 가진다. 신경가소성은 인간의 두뇌가 경험에 의해 변화되는 능력을 말한다.
Erk1/2(Extracellular signal-regulated kinase1/2)는 MAPK 집합체 중 하나로 세포내 신호전달체계에 관여한다. Erk1/2는 세포내 신호전달과정에서 G-단백 결합 수용기, 허혈, 염증 반응, 성장인자, 사이토카인 등 다양한 자극에 의하여 활성화되며 인산화된 형태인 pErk1/2 단백으로 전환된다. 따라서 pErk1/2는 세포내 신호전달체계에 있어 다양한 기능들을 조절한다.
튜블린(tubulin)은 미세소관의 주요 구성요소이며 세포 소기관의 유사 분열과 세포질 분열에 관여하는 GTP 의존 단백이며, β-Ⅲ tubulin은 초기 신경상피세포에서 발현하기 때문에 신경특이적표지인자 (neurospecific marker)로 사용된다.
GAP 43 (Growth Associated Protein 43)은 신경돌기와 전 시냅스 말단의 구성요소이며 배 발달 시기 중 신경돌기가 생장할 때 높은 발현을 보이기 때문에 신경세포 성장과 신경가소성에 관여하는 인자로 사용된다.
한편 신경 질환의 예방, 개선 및 치료와 관련된 선행 기술을 살펴보면, 대한민국 공개특허공보 제10-2012-0114800호에는 두부질환 또는 족부질환 예방 및 치료용 약학 조성물과 이를 이용한 기구에 관하여 기재되어 있다.
개략적으로 살펴 보면, 생지황, 숙지황, 당귀, 흑미자, 목단피, 측백엽, 만형자, 웅황, 백계자, 욱리인, 백작약, 창이자, 석결명, 현삼, 천궁, 방풍, 강활, 홍화, 도인, 천마, 황련, 토별충, 전충, 오공, 백지, 형개, 선학초, 하고초, 산조인, 석고, 사인, 승마, 황백, 구감초, 세신, 국화, 유향, 몰약 및 빙편을 포함하는 한약제제 혼합물의 열수 추출물 또는 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하며 중풍, 두통, 불면증, 우울증, 건망증, 심신불안, 신경쇠약, 두부 공혈부족, 탈모, 어지러움증, 이명 등의 두부질환 또는 족부질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 모자, 버선 등의 도구에 함유하는 기술에 관하여 기재되어 있다.
본 발명의 목적은, 오공을 유효 성분으로 함유하여 천연 유래의 물질을 활용하여 부작용 및 세포독성이 없이 신경 질환을 예방, 개선 및 치료하는 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 목적은, 오공을 유효 성분으로 함유하여 신경돌기의 신장을 촉진함으로써 신경 질환을 예방, 개선 및 치료하는 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 목적은, 오공을 유효 성분으로 함유하여 β-Ⅲ tubulin과 GAP 43의 mRNA 발현을 촉진하여 신경 질환을 예방, 개선 및 치료하는 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 목적은, 오공을 유효 성분으로 함유하여 β-Ⅲ tubulin과 GAP 43의 단백 발현을 촉진하여 신경 질환을 예방, 개선 및 치료하는 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 목적은, 오공을 유효 성분으로 함유하여 pErk1/2의 단백 발현을 촉진하여 신경 질환을 예방, 개선 및 치료하는 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 천연 유래의 물질을 활용하여 부작용 및 세포독성이 없이 신경 질환을 예방, 개선 및 치료하는 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은 신경돌기의 신장을 촉진하여 신경 질환을 예방, 개선 및 치료하는 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은 β-Ⅲ tubulin과 GAP 43의 mRNA 발현을 촉진하여 신경 질환을 예방, 개선 및 치료하는 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은, β-Ⅲ tubulin과 GAP 43의 단백 발현을 촉진하여 신경 질환을 예방, 개선 및 치료하는 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은, pErk1/2의 단백 발현을 촉진하여 신경 질환을 예방, 개선 및 치료하는 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명에 따른 조성물은 식품학적으로 허용되는 첨가제를 이용하여 건강기능식품으로 제조하여 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물을 이용한 건강기능식품은, 기능성 음료, 건강보조식품, 차, 과자류 등과 같이 다양한 형태로 제공될 수 있다.
본 발명이 약학적 조성물로 이용되기 위하여는 약제학적 분야에서의 공지의 방법에 의해 제조될 수 있으며, 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 또한 이들은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 유효 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 물활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도 등에 따라 적절히 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 가축용 사료로 적용될 수 있으며, 이 경우 사료에서 허용되는 첨가 또는 추가제를 이용하여 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물을 이용하여 환, 과립, 음료, 타블렛, 캅셀 등의 제형을 제조할 수 있으며, 이 경우에 각 제형을 제조하기 위하여 첨가제가 추가될 수 있음은 물론이다.
본 발명에 따른, 오공을 유효 성분으로 함유하여 신경 질환을 예방, 개선 및 치료하는 조성물은 천연 유래의 물질을 활용하여 부작용 및 세포독성이 없는 효과를 보유하고 있다.
본 발명에 따른, 오공을 유효 성분으로 함유하여 신경 질환을 예방, 개선 및 치료하는 조성물은 신경돌기의 신장을 촉진하는 효과를 보유하고 있다.
본 발명에 따른, 오공을 유효 성분으로 함유하여 신경 질환을 예방, 개선 및 치료하는 조성물은 β-Ⅲ tubulin과 GAP 43의 mRNA 발현을 촉진하는 효과를 보유하고 있다.
본 발명에 따른, 오공을 유효 성분으로 함유하여 신경 질환을 예방, 개선 및 치료하는 조성물은 β-Ⅲ tubulin과 GAP 43의 단백 발현을 촉진하는 효과를 보유하고 있다.
본 발명에 따른, 오공을 유효 성분으로 함유하여 신경 질환을 예방, 개선 및 치료하는 조성물은 pErk1/2의 단백 발현을 촉진하는 효과를 보유하고 있다.
도 1은 오공 용액을 농도별로 PC12 세포에 처리한 결과 및 NGF와 오공 용액을 혼합하여 농도별로 PC12 세포에 처리한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 NGF를 농도별로 PC12 세포에 처리했을 때 PC12 세포의 신경분화 및 신경돌기 길이변화의 양상을 나타낸 사진과 그래프이다.
도 3은 오공 용액을 농도별로 PC12 세포에 처리했을 때 PC12 세포의 신경분화 및 신경돌기 길이변화의 양상을 나타낸 사진과 그래프이다.
도 4는 NGF와 오공 용액을 함께 농도별로 PC12 세포에 처리했을 때 PC12 세포의 신경분화 및 신경돌기 길이변화의 양상을 나타낸 사진과 그래프이다.
도 5는 PC12 세포에서의 신경돌기 분화에 의한 β-Ⅲ tubulin과 GAP 43 mRNA 발현 양상을 나타낸 사진과 그래프이다.
도 6은 PC12 세포에서의 신경돌기 분화에 의한 β-Ⅲ tubulin과 GAP 43 단백 발현 양상을 나타낸 사진과 그래프이다.
도 7은 PC12 세포에서의 신경돌기 분화에 의한 pErk1/2 및 Erk1/2의 단백 발현 양상을 나타낸 사진과 그래프이다.
도 8은 NGF와 오공 용액을 함께 농도별로 PC12 세포에 처리했을 때 신경돌기 변화에 대한 U0126의 효과를 나타낸 사진과 그래프이다.
도 9는 NGF와 오공 용액을 함께 농도별로 PC12 세포에 처리했을 때 pErk1/2 단백 발현에 대한 U0126의 효과를 나타낸 사진과 그래프이다.
본 명세서 및 청구 범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
따라서 본 명세서에 기재된 실시예, 참조예 및 도면에 기술된 사항은 본 발명의 가장 바람직한 일 예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
제조예 1. 오공 용액의 제조
오공(Scolopendra subspinipes mutilans)은 절족동물 다족류 중 오공과(Scolopendridae)에 속하는 왕지네의 머리에 있는 독을 제거하고 추출, 가공한 것이다. 오공은 중추억제, 항경련, 해열, 진통, 진정, 소염, 면역조절, 항균 등의 기능이 있으며, 심혈관 계통 질환에 효과가 있다고 알려져 있다.
오공의 성분은 지질 18.7%, 단백 63.4%, 아미노산 11.9%로 구성된다. 오공 아미노산의 성분을 살펴보면, 알라닌(alanine) 16.95%, 글리신(glycine) 15.41%, 글루타민(glutamine) 13.48%, 알리닌(arinine) 7.73%, 프롤린(proline) 6.72%, valie 5.85%, 루신(leucine) 5.73%, 트레오닌(threonine) 4.83%, 아스파르긴(aspargine) 3.91%, 이솔루신(isoleucine) 3.68%, 세린(serine) 3.22%, 라이신(lysine) 3.19%, 트립토판(trytophane) 2.34%, 페닐알라닌(phenylalanine) 2.07%, 메티오닌(methionine) 1.68%, 티로신(tyrosine) 1.64%, 히스티딘(histidine) 0.98%, 시스테인(cysteine) 0.59% 등이다.
오공의 아미노산 성분 중 글리신, 글루타민, 아스파라긴산(asparagusic acid), 글루탐산(glutamic acid), 타우린(taurine), g-아미노부틸산(g-aminobutyric acid) 등은 신경돌기의 분화를 촉진하며, MEK(MAPK/EPK kinase)에서 트레오닌과 타이로신(tyrosine) 인산화를 통해 Erk를 활성화시킨다.
오공 용액의 제조 과정은 다음과 같다.
① 오공을 건조한 후 분쇄하거나, 분쇄 후 용매에 용해시킨 용액을 농축, 건조, 분쇄하여 분말로 제조한다.
② 분말로 제조된 오공을 물 또는 유기용매에 용해하여 용액으로 제조한다.
여기에서, 오공 분말과 용매의 중량비는 임의로 조정될 수 있다.
제조예 2. NGF 생성 촉진 물질 및 NGF 유사 물질의 추출물 제조
체내에서 조직의 성장을 촉진하는 인자에는 여러 가지가 있으며, NGF(Neuro growth factor, 신경 성장 인자)는 그 중 하나이다. NGF는 신경 세포와 신경 조직의 분화, 성장을 유도하는 사이토카인성의 펩티드 인자이다.
118개의 아미노산 잔기로 구성되어 있으며, α, β 및 γ의 3개의 subunit가 비공유결합한 이량체 단백질로 전체 분자량은 13,259이다. β unit는 모든 신경에서 성장작용을 촉진시키며, β unit의 구조는 인슐린의 구조와 유사한 것으로 알려져 있다. α 및 γ unit는 그 역할과 구조가 아직 알려져 있지 않다.
NGF는 fibroblast나 keratocyte와 같은 신경말단에서 생성되고, 신경 말단으로부터 세포체로 역행성 이동을 한다. NGF는 사람을 비롯한 동물의 혈장이나 기타 조직세포에 존재한다. NGF가 존재하는 장소의 예로 뱀의 독과 쥐의 턱밑샘을 들 수 있다.
NGF는 신경세포의 발생을 촉진하는 작용, 신경세포의 생존을 유지하는 작용, 신경의 기능을 회복하여 뇌의 노화를 방지하는 작용 등 기억력과 학습력 개선에 효과가 있다. 따라서 알츠하이머형 치매, 당뇨병 합병증에 의한 신경장해 등의 신경 질환의 예방 및 치료에도 효과가 큰 물질이다.
노루궁뎅이버섯, 명일엽, 홉, 울금의 추출물에는 NGF의 생성을 촉진하는 물질이 함유되어 있으며, 흰목이버섯, 치자의 추출물에는 NGF와 유사한 물질이 함유되어 있다. 이들 중 1종 이상의 소재를 선별하여 각 소재의 유효 물질을 추출하였다.
이하에서, 추출 대상으로 사용된 소재에 대하여 간략히 설명하고자 한다.
먼저, 노루궁뎅이버섯(Hericium erinaceum)은 산호침버섯과에 속하며, 한국, 일본,중국에 서식한다. 졸참나무, 떡갈나무 등 활엽수의 줄기에서 자라며, 버섯갓의 지름은 약 5∼20cm 이다. 여름에서 가을까지 졸참나무·떡갈나무 등 활엽수의 줄기에 한 개씩 자란다. 버섯갓의 모양은 구형 혹은 달걀형이며 윗면에는 털이 있고 옆면과 아랫면에는 무수한 바늘이 늘어져 있다.
바늘은 길이 1∼5cm, 굵기 1mm 정도로 끝이 뾰족하다. 세로로 자르면 윗부분은 다공질의 살덩어리이고 아랫부분은 바늘 무리로 되어 있다. 처음에 흰색이지만 나중에 노란색 또는 엷은 황토색으로 변하며, 조직은 부드럽다. 바늘 표면에 자실층이 발달하고 구형의 홀씨가 생긴다. 홀씨는 길이 5.5∼7.5㎛, 너비 5∼6.5㎛로 미세한 돌기가 있으며 홀씨 무늬는 흰색이다.
항염, 항균, 면역력 증진 등의 기능이 있으며, 소화기계의 암, 치매, 당뇨, 고혈압, 소화불량 등에 효과가 있다.
명일엽(Angelica keiskei)은 미나리과에 속하며 일본의 관동 동부, 기이반도에 걸친 태평양 연안, 이두칠도 등에 분포한다. 따뜻한 곳에서 잘 자라는 특성이 있다. 명칭의 유래는 잎줄기를 따내면 다음날 새잎이 나올 정도로 생육이 왕성하여 명일엽(明日葉)이라는 이름으로 부르게 되었다고 한다.
명일엽은 채소용으로 재배되는 대형 여러해살이풀로 높이가 약 1미터이며, 줄기는 곧게 자라서 가지가 갈라진다. 잎은 짙은 초록색으로 윤기가 있다. 줄기나 잎을 자르면 노란 즙이 나온다. 가을에 연노란색의 작은 꽃이 복산형꽃차례로 피며, 향기가 독특하다. 꽃이 지면 약간 편평하고 긴 타원형의 열매가 달린다.
항암작용, 이뇨작용, 완하작용, 강심작용, 모세혈관강화 등의 기능이 있으며 당뇨, 간염, 고혈압, 빈혈, 신경통 등에 효과가 있다.
홉(Humulus lupulus)은 뽕나무과에 속하는 다년생 만성초본이며, 유럽과 온대 아시아에 분포한다. 뿌리가 크고 강하며, 심은 지 2년 정도 되면 높이가 2 m 이상 되고, 완전히 다 크면 5 m 이상이 되며, 지름은 4∼8 ㎝가 된다. 잎은 마주나며 서너 조각으로 갈라져 있으나 모양은 착생 장소에 따라 다르며, 잎 가장자리에는 톱니가 있다. 줄기는 오른쪽으로 돌면서 기어오르며, 15 m 이상 자란다. 줄기에는 많은 마디가 있으며, 육각형이고 속이 비어 있다. 줄기의 색은 초록색, 붉은 자색, 붉은 녹색으로 품종에 따라 다르며, 마디 사이는 25 ㎝ 내외이고 마디의 잎겨드랑이에서 마주보기로 잎줄기가 뻗어 나간다. 이 잎줄기의 잎겨드랑이에서 많은 뭉치꽃이 난다.
수꽃은 줄기 끝이나 잎겨드랑이에서 생기며, 5개의 수술과 5개의 꽃받침을 갖는 황록색의 작은 꽃이고 마치 이삭과 같은 모양을 하고 있다. 암꽃은 10∼20개 정도 모여서 뭉치꽃을 이룬다. 뭉치꽃의 내포(內苞) 밑부분에는 황금색의 알갱이가 있는데, 이것을 루풀린(lupulin) 또는 홉가루라 한다. 루풀린은 건조하면 약간 붉은색을 띠며 굳어진 뒤에 쉽게 떨어진다.
홉에는 소화 촉진, 수면유도, 진정, 청혈, 간 기능 강화, 심장 기능 강화, 항암 등의 기능이 있다.
울금(Cucuma aromatica)은 생강과에 속하며 한국, 일본, 인도, 중국, 인도네시아에 분포한다. 동남아시아가 원산지이다. 뿌리는 굵고 튼튼하며 긴 달걀형의 덩이뿌리 형태를 이루고 있다. 덩이줄기는 난원 모양으로 측생하며 뿌리줄기는 원주 모양이고 단면은 황색이다. 높이는 50~150 cm까지 자란다. 잎은 기부에서 나오며 끝이 뾰족한 타원형이며 4~8개가 다발 모양으로 나온다. 비늘 모양으로 겹쳐진 꽃턱잎 안에 흰색 또는 연노란색의 꽃이 4~6월에 개화한다.
울금에는 담즙분비촉진, 이뇨, 해열, 항노화 등의 작용이 있으며, 급성 및 만성 담낭염, 담도염, 담석증, 소화불량, 간질, 당뇨 등에 효과가 있다.
흰목이버섯(Fremella fuciformis)은 흰목이과에 속하며 한국, 일본, 중국 및 열대지방에 분포한다. 여름에서 가을에 죽은 활엽수 가지에서 잘 자라며, 지름은 약 6~12cm 정도이다. 자실체는 겹꽃모양 혹은 국화꽃모양으로 끝은 물결 모양이다. 반투명의 아교질이며 색은 연한 분홍색 또는 연한 적갈색이다. 표면은 평활하고 백색이며 자실체의 끝은 물결모양이다. 자실체는 겹꽃모양, 국화꽃모양이며 반투명의 아교질이다.
흰목이버섯은 항산화 기능이 있는 linoleic acid 등 약용성분이 다량 함유되어 있다. 뇌세포 보호, 항암, 방사능 치료 부작용 감소 등의 기능이 있으며, 폐렴, 폐암, 위염, 변비, 생리불순, 고혈압 등에 효과가 있다.
치자는 꼭두서니과에 속하는 치자나무(Gardenia Jasminoides)의 열매이다.
치자나무는 원산지가 중국이며, 한국의 제주도, 일본, 중국, 대만, 인도 등에 분포한다. 나무의 높이는 1~2 m이며 작은 가지에 짧은 털이 있다. 잎은 마주나고 긴 타원형으로 윤기가 나며, 가장자리가 밋밋하고 짧은 잎자루와 뾰족한 턱잎이 있다. 꽃은 흰색으로 6~7월에 개화하며 가지 끝에 1개씩 달린다. 열매는 달걀형 혹은 타원형이며 길이 2 cm 정도로, 9월에 황홍색으로 익는다. 열매 안에는 노란 과육과 종자가 있다.
치자에는 혈압강하, 항균, 항염, 해열, 이뇨, 진정 등의 기능이 있으며, 간염, 황달, 염좌, 심근염 등에 효과가 있다.
상기 소재 중 1종 이상의 추출물은 증류수 또는 유기용매로 추출할 수 있으며, 유기용매로 분획 추출을 할 수도 있다. 유기용매를 사용할 시에 일 예로 에탄올을 쓸 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 소재 중 1종 이상의 추출물을 제조하는 방법에는 탈지법, 냉침법, 온침법, 여과침출법, 초임계유체추출법, 열수추출법 등이 있으며, 일 예로 열수추출법을 들 수 있다. 열수추출 방법은 소재를 증류수와 혼합하여, 80~90 ℃의 온도로 가열하여 추출하는 방법이다.
여기에서, 추출 대상은 상기 소재에만 한정되는 것은 아니며, 추출 방법 또한 열수추출에만 한정되는 것은 아니다.
제조예 3. 신경 질환의 예방, 개선 및 치료를 위한 조성물의 제조
(1) NGF(Neuro growth factor)(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 3~7 ng/ml와 오공 용액 6~14 mg/ml를 함유하는 신경 질환의 예방, 개선 및 치료용 조성물을 제조한다. NGF의 구입처는 위에 한정되지 않는다.
(2) 흰목이버섯 및/또는 치자의 추출물(NGF 유사물질) 3~10 ng/ml와 오공 용액 6~14 mg/ml를 함유하는 신경 질환의 예방, 개선 및 치료용 조성물을 제조한다.
(3) 노루궁뎅이버섯, 명일엽, 홉 및/또는 울금의 추출물(NGF 생성 촉진물질) 3~15 ng/ml와 오공 용액 6~14 mg/ml를 함유하는 신경 질환의 예방, 개선 및 치료용 조성물을 제조한다.
실험예 1. 오공에 대한 PC12 세포생존율
1-1. 실험 준비
1) 세포배양
본 실험에서 사용한 PC12 세포주는 흰쥐 부신 수질의 크롬 친화성 세포종에서 유래하였으며, 한국세포주은행(KCLB, Korea)으로부터 분양받았다.
PC12 세포를 35~40 ℃, 3~6% CO2로 유지되는 세포배양기에서 5~15% Horse serum (HS)과 4~6% Fetal bovine serum (FBS)이 포함된 RPMI 1640 (Gibco BRL, USA) 배지에 48시간 주기로 계대배양 하였다.
2) NGF 및 오공 용액 처리
① 24 well plate에 10 μ/ml의 laminin solution을 넣은 후, 3~5 ℃에서 보관하였다.
② 24시간 후 laminin soultion을 제거하고 멸균된 3차 증류수로 씻은 후, PC12 세포를 1~3% HS와 0.5~2% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지에서 각 well 당 5 × 103개씩 분주하여 배양하였다.
③ PC12 세포를 24시간 배양한 후에 NGF 및 오공 용액을 단독 또는 혼합하여 농도별로 처리하였으며 3~4일 후 배지를 교환해 주고 4~6일간 배양하여 세포의 신경돌기 성장을 비교하였다.
3) 통계 처리
실험 결과의 통계 처리는 평균 표준편차(S.D.)로 나타내었으며 통계학적 유의성은 SPSS (version 10.0, SPSS Inc., USA)를 이용하여 ANOVA test로 검증하였다.
1-2. 실험 과정
1) MTT assay 실행
PC12 세포의 세포생존율을 측정하기 위해 MTT assay를 시행하였다.
① 24 well plate에 PC12 세포를 well 당 5 × 103개씩 분주하여 24시간 배양하였다.
② plate를 2그룹으로 나누어 한 그룹은 오공 용액 처리 실험군, 한 그룹은 오공 용액과 NGF를 함께 처리한 처리 실험군으로 설정하였다. 오공 용액 처리 실험군 plate 중 한 개는 대조군으로 설정하여 어떤 처리도 하지 않았다. 오공 용액 처리 실험군 plate에 오공 용액을 처리하였다.
③ 오공 용액과 NGF를 함께 처리한 처리 실험군 plate에 NGF 5 ng를 처리한 후, 오공 용액 5, 10, 50, 100, 200 mg/ml를 처리하였다. 오공 용액과 NGF를 함께 처리한 처리 실험군 plate 중 한 개를 대조군으로 설정하여 오공 용액을 처리하지 않았다.
④ 1일 후, 3일 후, 5일 후마다 4~6 mg/ml MTT 용액을 배양액에 1:8~12의 비율로 섞고 3시간 후, MTT 용액이 포함된 배지를 제거하고 Dimethyl sulfoxide (DMSO) 용액을 첨가하여 formazan을 용해시켰다.
⑤ 분광광도계 (ELISA reader; Molecular Devices, Inc.)로 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 측정한 값은 정상 세포의 값과 비교하여 백분율(%)로 계산하였다.
1-3. 실험 결과
도 1은 오공 용액을 농도별로 PC12 세포에 처리한 결과 및 NGF와 오공 용액을 혼합하여 농도별로 PC12 세포에 처리한 결과를 나타낸 그래프이다.
오공 용액을 농도별로 처리한 결과를 보면, 오공 용액 처리 1일 후에는 오공 용액 5 mg/ml 처리군이 오공 용액 10 mg/ml 처리군보다 세포생존율 수치가 더 높았으며, 오공 용액 100 mg/ml 처리군이 오공 용액 200 mg/ml 처리군보다 수치가 더 높게 나타나 모든 실험군에서 유의적 변화가 발견되지 않았다.
3일 후에는 오공 용액의 처리 농도를 높임에 따라 세포생존율 수치가 점점 올라가다가, 오공 용액 50 mg/ml, 100 mg/ml, 200 mg/ml을 처리했을 때에는 수치가 동일한 경향을 보였다. 오공 용액 5 mg/ml 처리군은 대조군과 차이를 보이지 않았으며, 오공 용액 10 mg/ml 처리군은 대조군보다 10.35±3.52 %, 50 mg/ml 처리군은 15.21±4.86 %, 100 mg 처리군은 15.63±4.18 %, 200 mg/ml 처리군은 15.42±2.96 % 증가하여 유의한 차이를 보였다.
5일 후에는 오공 용액을 5 mg/ml 처리했을 때에는 세포생존율 수치가 올라갔으나, 오공 용액의 처리 농도를 높임에 따라 오히려 세포생존율 수치가 점점 감소하는 경향을 보였다.
오공 용액과 NGF를 함께 처리한 결과를 보면, 오공 용액과 NGF를 함께 처리한 1일 후에는 오공 용액과 NGF를 함께 처리한 군은 대체적으로 대조군보다 더 세포생존율 수치가 낮으며, 오공 용액 100 mg/ml와 NGF 5 ng/ml를 함께 처리한 군만 대조군과 수치가 유사했다.
3일 후에는 오공 용액과 NGF를 함께 처리한 군의 세포생존율 수치가 대체적으로 대조군보다 더 높았다. 오공 용액 5 mg/ml와 NGF 5 ng/ml를 함께 처리한 군에서 수치가 크게 높아졌다가 오공 용액 10 ng/ml와 NGF 5 ng/ml를 함께 처리한 군과, 오공 용액 50 ng/ml와 NGF 5 ng/ml을 함께 처리한 군에서는 낮아졌다. 오공 용액 100 mg/ml와 NGF 5 ng/ml을 함께 처리한 군에서는 수치가 다시 급격히 높아졌다가 오공 용액 200 ng/ml와 NGF 5 ng/ml을 함께 처리한 군에서는 다소 낮아지는 경향을 보였다.
5일 후에는 오공 용액과 NGF를 함께 처리한 군의 세포생존율 수치가 대체적으로 감소하였으나, 1일 후의 수치보다는 높았다. 오공 용액 5 mg/ml와 NGF 5 ng/ml를 함께 처리한 군을 제외한 모든 처리군에서 대조군과 유사한 수치를 보였다.
오공 용액 처리군과 오공 용액과 NGF를 함께 처리한 군을 비교해 보면, 두 그룹 모두 처리 1일 후와 3일 후에는 대체적으로 세포생존율의 수치가 대조군보다 낮거나 유사하다. 두 그룹의 처리 2일 후에는 오공 용액 처리군이 더 유의적으로 수치가 증가한다.
NGF와 오공 용액을 함께 처리하였을 때보다 오공 용액을 단독 처리하였을 때의 세포생존율이 대체적으로 조금 더 높으나, 오공 용액의 농도가 100 mg/ml 이상 높아지면 오히려 세포독성이 나타나 신경돌기 형성을 저해하고 세포손상을 유발한다.
실험예 2. NGF 를 처리한 PC12 세포의 신경분화 및 신경돌기 길이변화
2-1. 실험 준비
실험예 1-1과 동일한 과정으로 실행하였다.
2-2. 실험 과정
① PC12 세포에 오공 용액 및 NGF를 처리하고 5일 후 각 well마다 임의로 세 부분을 선택하여 현미경 사진으로 기록하였다.
② 신경돌기가 있는 세포들을 선택하여 image J (NIH, USA)를 이용하여 각각의 신경돌기 길이를 측정한 후 평균값을 구하고, 오공 용액 및 NGF의 농도별로 비교하였다.
하나의 세포에서 여러 개의 신경돌기가 자라거나 가지(branch)를 형성했을 경우 이들을 모두 신경돌기 길이로 합산하였다.
2-3. 실험 결과
도 2는 NGF를 농도별로 PC12 세포에 처리했을 때 PC12 세포의 신경분화 및 신경돌기 길이변화의 양상을 나타낸 사진과 그래프이다.
PC12 세포에 NGF의 농도를 각각 0, 5, 20, 30, 50 ng/ml 처리하고 5일간 배양하여 NGF만을 처리한 세포의 신경분화를 관찰하고 신경돌기 길이를 비교하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
관찰 결과 대조군은 신경분화가 없었으며 신경돌기 또한 관찰되지 않았다. 5 ng/ml의 NGF를 처리한 세포군에서는 일부 신경돌기가 관찰되었으나, 신경돌기 길이의 평균이 1.66±0.41 m로 통계적으로 유의한 결과를 보이지 않았다.
PC12 세포의 형태학적 신경분화 및 신경돌기는 NGF 20 ng/ml 이상 처리군에서 관찰되었다. NGF 20 ng/ml 처리군의 신경돌기 길이 평균은 37.85±2.57 m이며, 30 ng/ml일 때는 48.69±3.51 m이었다. 또한 50 ng/ml일 때는 76.18±3.54 m로, 이들 결과는 대조군에 비해 신경돌기의 평균 길이가 유의하게 길어진 것이 관찰되었다.
실험예 3. 오공 용액 을 처리한 PC12 세포의 신경분화 및 신경돌기 길이변화
3-1. 실험 준비
실험예 1-1과 동일한 과정으로 실행하였다.
3-2. 실험 과정
실험예 2-2와 동일한 과정으로 실행하였다.
3-3. 실험 결과
도 3은 오공 용액을 농도별로 PC12 세포에 처리했을 때 PC12 세포의 신경분화 및 신경돌기 길이변화의 양상을 나타낸 사진과 그래프이다.
PC12 세포에 오공 용액의 농도를 각각 0, 5, 10, 20, 30, 50 mg/ml 처리하고 5일간 배양하여 오공 용액만을 처리한 세포의 신경분화 형태와 신경돌기 평균 길이를 농도별로 비교하였다. 어떤 처리도 하지 않은 군을 대조군으로 설정하였다.
관찰 결과 대조군은 신경분화가 없었으며 신경돌기 또한 관찰되지 않았다. 오공 용액 5 mg/ml 처리군과 10 mg/ml 처리군 역시 신경분화가 없었으며 신경돌기 또한 관찰되지 않았다. PC12 세포에서의 신경분화 및 신경돌기는 오공 용액 20 mg/ml 이상 처리군에서 관찰되었다. 오공 용액 20 mg/ml 처리군에서 신경돌기의 평균 길이는 0.95±0.05 m이며, 30 mg/ml 처리군에서는 1.42±0.11 m, 50 mg/ml 처리군에서는 2.47±0.25 m로 대조군에 비해 신경돌기의 평균 길이가 유의하게 길어진 것이 관찰되었다.
실험예 4. 오공 용액 과 NGF 를 함께 처리한 PC12 세포의 신경돌기 길이변화
4-1. 실험 준비
실험예 1-1과 동일한 과정으로 실행하였다.
4-2. 실험 과정
실험예 2-2와 동일한 과정으로 실행하였다.
4-3. 실험 결과
도 4는 NGF와 오공 용액을 함께 농도별로 PC12 세포에 처리했을 때 PC12 세포의 신경분화 및 신경돌기 길이변화의 양상을 나타낸 사진과 그래프이다.
PC12 세포에 오공 용액 0, 5, 10, 20, 30, 50 mg/ml와 NGF 5 ng/ml를 각각 혼합하여 처리하고 5일간 배양하여 오공 용액과 NGF를 함께 처리한 세포의 신경분화 형태와 신경돌기 평균 길이를 농도별로 비교하였다. 대조군은 NGF 5 ng/ml를 단독 처리하였다.
PC12 세포의 신경분화 형태는 대조군을 비롯한 모든 군에서 관찰되었다. 대조군의 신경돌기 평균 길이는 1.38±0.55 m였으며, 오공 용액 5 mg/ml와 NGF 5 ng/ml를 함께 처리한 군의 신경돌기 평균 길이는 20.54±2.85 m로 대조군에 비해 유의적 차이를 보이지 않았다.
신경돌기가 가장 길었던 군은 오공 용액 10 mg/ml와 NGF 5 ng/ml를 함께 처리한 군으로, 신경돌기의 평균 길이는 157.77±10.72 m였다. 또한 오공 용액 20 mg/ml와 NGF 5 ng/ml를 함께 처리한 군 신경돌기의 평균 길이는 74.33±5.13 m였으며, 오공 용액 30 mg/ml와 NGF 5 ng/ml를 함께 처리했을 때는 85.49±8.42 m, 오공 용액 50 mg/ml와 NGF 5 ng/ml를 함께 처리한 군은 75.75±12.45 m의 평균 길이를 보였다.
신경돌기의 길이는 NGF 5 ng/ml와 오공 용액 10 mg/ml을 함께 처리했을 때, 50 ng/ml의 고농도 NGF를 단독 처리했을 때보다 약 두 배 이상(207.10±7.13%) 길었다.
따라서 오공 용액과 NGF를 함께 처리하면 상승효과가 일어나 NGF를 단독 처리하였을 때보다 더 효과적으로 신경돌기를 신장시킨다.
실험예 5. 신경돌기 분화에 의한 β-Ⅲ tubulin 과 GAP 43 mRNA 발현
5-1. 실험 준비
실험예 1-1과 동일한 과정으로 실행하였다.
5-2. 실험 과정
신경 세포의 분화와 신경돌기 생성을 분자생물학적 수준에서 측정하기 위하여 신경특이적표지인자 (neurospecific marker)인 β-Ⅲ tubulin과, 신경돌기성장및 신경가소성에 관여하는 GAP 43의 mRNA 발현을 RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, 역전사-중합 연쇄 반응)을 이용하여 측정하였다.
① PC12 세포를 PBS로 세척 후 Trizol (invitrogen Life Technology Co., USA)로 분쇄하고 원심분리기를 이용하여 RNA층을 분리하였다.
② 분리된 RNA층에 chloroform을 첨가하여 혼합 후 원심분리시켜 단백을 제거하였다.
③ 단백이 제거된 세포들에 isopropanol을 첨가하고 원심분리하여 전체 RNA(1 μg)를 분리하고, NanoDrop-1000 분광광도계 (NanoDrop, Netherland)로 정량하였다.
④ RT-PCR을 시행하기 위해 전체 RNA에 oligonucleotide dT primer (Promega, USA)와 RNA premix (Bioneer, Korea)를 넣고 40~45 ℃에서 1~2시간 반응시킨 후 60~75 ℃에서 10~20분간 불활성화시켜 cDNA를 역전사시켰다.
⑤ 역전사된 cDNA에 0.1~0.3 mol/L primer를 주입하고 PCR Master Mix (Promega, USA)을 이용하여 유전자를 증폭하였다. primer는 하기의 [표 1]의 조성에 따라 제작하였다. 여기서 대조군으로는 GADPH를 설정하였다. GADPH는 대표적인 house keeping gene으로, house keeping gene은 어느 조건에서나 발현 정도가 일정한 gene을 일컫는다.
또한 각 primer의 중합효소 반응은 하기의 [표 2]의 조건에서 실행하였다.
⑥ 증폭된 유전자, 즉 중합반응물을 1~3 % agarose gel을 이용하여 90~110 V에서 15~25분간 전기영동한 후 FluorChem E Digital Darkroom system (SelectScience, UK)으로 컴퓨터에 저장하였다.
primer Nucleotide sequence(5'-3') 온도(℃) 생성물 크기(bp)
Rat GAPDH F ATG CCA TCA CTG CCA CTC AG 55.5 21.5
R GCA TGT CAG ATC CAC AAC GG 55.8
β-Ⅲ tubulin F TCC CCA ACA ACG TCA AGG TA 54.9 199
R TCC ATC TCA TCC ATG CCT TC 54.4
GAP 43
 F AAG ATG GTG TCA AAC CGG AG 53.6 182
R CTT CTC CAC ACC ATC AGC AA 53.1
여기에서, F는 앞방향(Forward)을 뜻하며, R은 뒷방향(Reverse)을 뜻한다.

primer
 단계별 조건
사이클 수
1단계 조건 2단계 조건 3단계 조건
온도 시간 온도 시간 온도 시간
β-Ⅲ tubulin 94 ℃ 30초 55 ℃ 30초 72 ℃ 30초 32
GAP 43 " " " " " " "
GAPDH 94 ℃ 30초 55 ℃ 30초 72 ℃ 30초 28
여기에서, GAP 43의 조건은 β-Ⅲ tubulin의 조건과 동일하다.
5-3. 실험 결과
도 5는 PC12 세포에서의 신경돌기 분화에 의한 β-Ⅲ tubulin과 GAP 43 mRNA 발현 양상을 나타낸 사진과 그래프이다.
NGF와 오공 용액 모두 처리하지 않은 대조군의 RT-PCR 발현값을 기준값 1로 설정하고 각 군의 발현값과 비교하여 β-Ⅲ tubulin의 mRNA 발현양을 측정하고 결과값을 얻었다.
발현양 측정 결과, NGF 5 ng/ml 처리군은 대조군과 비교하여 1.99±0.20배 이상 유의한 증가를 보였으며, 오공 용액 10 mg/ml 처리군은 1.26±0.14배로 대조군과 유사한 차이를 보였다.
유의한 차이를 보였던 실험군은 NGF 5 ng/ml와 오공 용액 10 mg/ml 처리군으로, 대조군에 비해 2.57±0.23배 이상 증가하였다. 이는 NGF 5 ng/ml 처리군보다 1.24±0.06배 이상 증가했음을 보여준다.
GAP 43의 mRNA 발현양 측정 결과 NGF 5 ng/ml 처리군은 대조군과 비교했을 때 대조군의 2.90±0.16배 이상 증가하였으며, 오공 용액 10 mg/ml 처리군은 1.08±0.15배로 대조군과 유사하였다.
유의한 차이를 보였던 실험군은 NGF 5 ng/ml와 오공 용액 10 mg/ml 처리군으로, 대조군에 비해 4.82±0.35배 이상 증가하였다. 이는 NGF 5 ng/ml 처리군과 비교하였을 때 mRNA 발현양이 1.66±0.12배 이상 증가했음을 보여준다.
β-Ⅲ tubulin과 GAP 43의 mRNA의 양은 오공 용액과 NGF를 함께 처리한 군과 NGF만 처리한 군을 비교했을 때 오공 용액과 NGF를 함께 처리한 군이 더 유의적으로 증가하였다.
따라서 NGF를 단독 처리하였을 때보다 오공 용액과 NGF를 함께 처리하였을 때 더 효과적으로 β-Ⅲ tubulin과 GAP 43의 mRNA를 발현시킨다.
실험예 6. 신경돌기 분화에 의한 β-Ⅲ tubulin 과 GAP 43의 단백 발현
6-1. 실험 준비
실험예 1-1과 동일한 과정으로 실행하였다.
6-2. 실험 과정
1) Western blot 검사
β-Ⅲ tubulin 단백의 발현양상을 분석하기 위해 β-Ⅲ tubulin 항체를 사용하여 Western blot을 실행하였다.
단백의 분리는 PRO-PREP protein extraction solution (iNtRON, USA)으로 실행되었으며, 단백을 분리한 후 정량은 Nanodrop으로 실행하였다. 전기영동은 sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 방법으로 실행하였다. 그 방법은 다음과 같다.
① 단백에 sample buffer (0.125 M Tris, pH 6~7, 1~3 % SDA, 20~30 % glycerol, bromophenol blue, 2-mercaptoethanol)를 섞어 끓는 물에서 진탕 후 5~15% polyacrylamide gel에 전기영동하였다. 전기영동시 mini gel 전기영동장치 (SE 600, Hofer, USA)를 이용하였고, 90~110V의 전압으로 1~3시간 진행하였다.
② 전기영동 후 단백 transfer 장치 (Semiphor, Phamacia Bio., USA)를 이용하여 110~130mA에서 1~3시간 동안 gel의 단백을 0.4~0.5 m의 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막 (Millipore Co., USA)으로 옮겼다.
③ PVDF 막으로 옮긴 gel 단백의 일차항체의 비특이적 결합을 차단하기 위하여 0.03~0.1% Tween-20-TBS (TBS-T)에 4~6% Skim milk를 녹인 blocking buffer에 PVDF 막을 넣어 1~2시간 동안 반응시켰다.
④ 반응시킨 blocking buffer에 일차항체인 β-Ⅲ tubulin (1:1000), GAP43 (1:500) (abcam, USA), Erk1/2 (1:1000), pErk1/2 (Upstate, USA)를 각각 4 ℃에서 overnight 하였다.
⑤ overnight된 Erk1/2와 pErk1/2를 0.03~0.1% TBS-T로 3회 세척한 후, 이차항체인 anti-rabbit conjugated HRP (Santa Cruze, USA)를 TBS-T 용액에 1:4000~6000으로 희석하여 1~2시간 동안 반응시켰다.
⑥ 반응시킨 anti-rabbit conjugated HRP를 TBS-T로 3회 세척한 후 enhanced chemiluminescent (ECL)을 방법으로 특이적 단백을 관찰하였다.
⑦ 관찰된 단백의 발현 정도를 분석하기 위해 FluorChem E Digital Darkroom system (SelectScience, UK)으로 컴퓨터에 저장하였다.
6-3. 실험 결과
도 6은 PC12 세포에서의 신경돌기 분화에 의한 β-Ⅲ tubulin과 GAP 43 단백 발현 양상을 나타낸 사진과 그래프이다.
PC12 세포에서의 β-Ⅲ tubulin 발현 양상을 알아보기 위하여 β-Ⅲ tubulin 항체를 이용하여 Western blot을 실행하였으며, 그 결과 단백 양은 50 kDa로 나타났다. 대조군인 Actin의 단백 양을 기준값 1로 설정하고 대조군과 각 군의 발현값을 상대 비교하의 발현 양상을 관찰하였다.
NGF 5 ng/ml 처리군은 대조군과 비교했을 때 대조군의 2.47±0.34배 이상의 유의한 증가를 보였으며, 오공 용액 10 mg/ml 처리군은 2.04±0.29배 증가하였다. NGF 5 ng/ml와 오공 용액 10 mg/ml 처리군은 3.98±0.36배 이상 발현이 증가하였다. NGF 5 ng/ml와 오공 용액 10 mg/ml 처리군이 NGF 5 ng/ml 처리군보다 1.61±0.15배 이상 증가하였음을 알 수 있다.
GAP 43 단백의 발현 양상을 알아보기 위하여 GAP 43 항체를 이용하여 Western blot을 실행하였으며, 그 결과 단백 양은 43 kDa로 나타났다. 대조군의 단백 양을 기준값 1로 설정하고 대조군과 각 군의 발현값을 상대 비교하여 발현 양상을 관찰하였다.
NGF 5 ng/ml 처리군은 대조군과 비교했을 때 대조군의 2.95±0.54배 이상의 유의한 증가를 보였으며, 오공 용액 10 mg/ml 처리군은 1.26±0.15배로 대조군과 비슷한 차이를 보였다. NGF 5 ng/ml와 오공 용액 10 mg/ml 처리군은 대조군에 비해 5.93±0.48배 이상 현저한 발현 증가를 보였다. NGF 5 ng/ml 처리군보다 2.01±0.16배 이상 발현이 증가되었음을 알 수 있다.
실험예 7. 신경돌기 분화에 의한 pErk1 /2 및 Erk1 /2의 단백 발현
7-1. 실험 준비
실험예 1-1과 동일한 과정으로 실행하였다.
7-2. 실험 과정
실험예 6-2와 동일한 과정으로 실행하였다.
7-3. 실험 결과
도 7은 PC12 세포에서의 신경돌기 분화에 의한 pErk1/2 및 Erk1/2의 단백 발현 양상을 나타낸 사진과 그래프이다.
PC12 세포에서의 pErk1/2 단백 발현 양상을 알아보기 위하여 Western blot 검사를 실행하였으며, 그 결과 분자량 44 kDa과 분자량 42 kDa에서 각각 pErk1과 pErk2 단백으로 분리되었으며 대조군 pErk1/2 단백 발현으로 상대 비교하여 각각 실험군에 대한 발현값을 얻었다.
NGF 5 ng/ml 처리군은 대조군과 비교했을 때 대조군의 1.95±0.11배 이상 증가하여 유의적인 결과를 보였으며, 오공 용액 10 mg/ml 처리군은 1.75±0.19배 증가하였다. NGF 5 ng/ml와 오공 용액 10 mg/ml 처리군은 대조군에 비해 2.98±0.41배 이상 발현해 현저한 증가를 보였다. 이는 NGF 5 ng/ml 처리군보다 NGF 5 ng/ml와 오공 용액 10 mg/ml 처리군에서 1.53±0.21배 이상 발현이 증가하였음을 보여준다.
한편 Erk1/2 단백 발현은 모든 실험군에서 유사한 발현양을 보였다.
따라서 β-Ⅲ tubulin과 GAP 43의 단백의 양은 NGF를 단독 처리하였을 때보다 오공 용액과 NGF를 함께 처리하였을 때 더 유의적으로 증가한다.
실험예 8. 오공 용액 과 NFG 에 의한 신경돌기 변화에 대한 U0126 의 효과
8-1. 실험 준비
실험예 1-1과 동일한 과정으로 실행하였다.
8-2. 실험 과정
실험예 2-2와 동일한 과정으로 실행하였다.
8-3. 실험 결과
도 8은 NGF와 오공 용액을 함께 농도별로 PC12 세포에 처리했을 때 신경돌기 변화에 대한 U0126의 효과를 나타낸 사진과 그래프이다. U0126은 MEK의 억제제이다.
U0126 40~60 μM을 1~2시간 동안 전처리한 후 오공 용액과 NFG를 처리한 PC12 세포를 5일간 배양하여 신경돌기 변화를 관찰하고 평균 길이를 측정하였다.
그 결과 NGF 20 ng/ml 처리군의 신경돌기 길이는 32.98±4.88 m이었으며, U0126 50 μM를 전처리한 군의 평균 길이는 3.89±1.02 m로 측정되었다. U0126을 전처리했을 때 신경돌기 길이가 유의하게 감소됨을 보였다.
오공 용액 10 mg/ml와 NGF 5 ng/ml를 함께 처리한 군의 신경돌기 평균 길이는 152.23±7.51 m이었으며, U0126를 전처리한 군에 오공 용액 10 mg/ml와 NGF 5 ng/ml를 함께 처리한 군의 신경돌기 평균 길이는 2.13±0.35 m로 측정되었다. 역시 U0126을 처리할 경우 신경돌기 길이가 유의하게 감소됨을 보였다.
실험예 9. 오공 용액과 NGF 에 의한 pErk1 /2 및 Erk1 /2 단백 발현에 대한 U0126의 효과
9-1. 실험 준비
실험예 1-1과 동일한 과정으로 실행하였다.
9-2. 실험 과정
실험예 6-2와 동일한 과정으로 실행하였다.
9-3. 실험 결과
도 9는 NGF와 오공 용액을 함께 농도별로 PC12 세포에 처리했을 때 pErk1/2 단백 발현에 대한 U0126의 효과를 나타낸 사진과 그래프이다.
오공 용액 10 mg/ml와 NGF 5 ng/ml를 함께 처리한 PC12 세포에 U0126 50 μm를 처리하여 pErk1/2 단백 발현에 대한 U0126의 효과를 알아보았다. 오공 용액과 NGF를 모두 처리하지 않은 실험군을 대조군으로 설정하였다.
오공 용액과 NGF를 함께 처리한 실험군은 pErk1/2 단백 발현이 대조군과 비교하여 2.86±0.11배 증가하였으며 U0126을 처리한 실험군은 pErk1/2 단백 발현이 0.05±0.03배로 현저하게 감소하였다.
한편 Erk1/2 단백 발현은 모든 실험군에서 유사한 발현양을 보였다.
따라서 U0126은 신경돌기의 신장을 저해하며, 또한 Erk1/2 및 pErk1/2의 mRNA와 단백 발현을 저해한다.
실험예 1 내지 실험예 9의 실험 결과를 종합하여 최종적으로 다음과 같은 결론을 도출할 수 있다. 오공은 단독 약물로서는 신경세포 분화가 미약하나, 신경성장인자인 NGF를 저농도로 함께 처리할 경우 신경돌기의 길이가 현저히 증가한다.
또한 신경특이적표지인자 발현을 관찰하여 신경세포의 형태와 특징을 모두 확인한바, 오공은 MEK 및 Erk 1/2 신호전달계를 통해 신경세포로 유도된다고 할 수 있다.

Claims (5)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. NGF(Neuro growth factor) 3~7 ng/ml와 오공 용액 6~14 mg/ml를 함유하고 있는 신경 손상 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물이되,
    상기 조성물은 β-Ⅲ tubulin과 GAP 43의 mRNA 및 단백 발현의 촉진 효능, pErk1/2의 단백 발현의 촉진 효능, 신경돌기의 생장 촉진 효능을 보유하는 것을 특징으로 하고,
    흰목이버섯, 치자, 노루궁뎅이버섯, 명일엽, 홉 또는 울금의 추출물이 선택적으로 추가되는 것을 특징으로 하는 신경 손상 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품 조성물.
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Journal of Pharmacy and Pharmacology. Vol. 58, No, 7, pp.989-996(2006) *
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Nature Medicine. Vol. 11, No, 5, pp.551-555(2005.05.) *
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