KR101426996B1

KR101426996B1 - 테트라케라 스캔덴스 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 항바이러스 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101426996B1
Application number: KR20120080407A
Authority: KR
Inventors: 유지창
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2012-07-24
Filing date: 2012-07-24
Publication date: 2014-08-05
Also published as: US20140030364A1; KR20140014450A; US20140370127A1; US9084758B2

Abstract

본 발명은 테트라케라 스캔덴스(Tetracera scandens) 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 독성 및 부작용이 적으며, 효과적으로 역전사효소 활성을 억제하여 DNA 합성을 억제하기 때문에 다양한 종류의 RNA 바이러스에 의한 감염의 예방 또는 치료에 이용할 수 있다.

Description

테트라케라 스캔덴스 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 항바이러스 조성물 및 이의 용도{Antiviral compositions comprising ethanol extract of Tetracera scandens and using the same}

본 발명은 테트라케라 스캔덴스(Tetracera scandens) 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 항바이러스 조성물 및 이의 용도 등에 관한 것이다.

RNA 바이러스(RNA virus)란, RNA를 유전자로 갖고 있는 바이러스를 의미하며, mRNA가 되는 (+)사슬 RNA(positive sense RNA), 상보가닥의 (-)사슬 RNA(negative sense RNA), 또는 2중 가닥의 RNA(double strand RNA)를 유전자로서 가지고 있다. (+)사슬 RNA의 경우에는 숙주 세포에 감염 시 바로 번역(translation) 과정을 거쳐 단백질을 생산할 수 있으며, (-)사슬 RNA의 경우에는 RNA 중합효소(polymerase)에 의하여 (+)사슬 RNA로 전환된 후 번역 과정을 거치게 되기 때문에, (+)사슬 RNA를 가지고 있는 바이러스의 경우에는 감염 속도가 빠른 편이다. 또한, RNA 바이러스는 RNA를 유전자로 가지고 있기 때문에 DNA 중합효소(polymerase)에 의한 교정(proof-reading) 단계가 없어 DNA 바이러스에 비하여 돌연변이(mutation) 발생률이 현저히 높다. 따라서 최근에도 SARS, hepatitis C, polio 등 인체에 질병을 유발하는 신종 RNA 바이러스들이 속출하고 있는 실정이며, 신종 RNA 바이러스에 대한 백신을 만드는데도 한계가 있다. 현재 상용화되어 있는 항바이러스제로는 iododeoxyuridine(IDU), 아시클로버(acyclovir, ACV), azidothymidine(AZT) 등과 같은 뉴클레오사이드(nucleoside) 유도체나 인터페론(interferon, IFN)과 같은 단백질들이 존재하지만, 상기 항바이러스제에 대한 세포독성, 간독성, 내성유발 등 여러 가지 부작용에 대해 계속적으로 보고되고 있다. 따라서 효과가 탁월하며 부작용이 적은 바이러스 감염의 예방 또는 치료용제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

한편, 테트라케라 스캔덴스(Tetracera scandens)는 오아과(Dilleniaceae)에 속하는 화훼식물(flowering plant)로서 베트남에서 주로 서식하고 있으며, 다양한 효능에 대하여 연구가 되고 있다. 예를 들어 테트라케라 스캔덴스는 염증 반응에 약리적 효과가 있다고 보고된 바가 있으며(Biol. Pharm. Bull. (2004) 27: 1414), 추출물에 포함되어 있는 4H-크로멘-4-온 유도체는 포도당 흡수를 증가시킨다는 것이 개시된 바 있다(국내등록특허 10-0979459). 그러나 테트라케라 스캔덴스(Tetracera scandens)가 바이러스의 역전사효소(reverse transcriptase) 활성을 억제하여 항바이러스 효과를 나타낸다는 것에 대해서는 전혀 보고된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 테트라케라 스캔덴스의 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 테트라케라 스캔덴스(Tetracera scandens) 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 에탄올은 10% 내지 100% 에탄올인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물은 RNA 바이러스의 역전사효소(reverse transcriptase)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 바이러스는 RNA 바이러스(RNA virus)인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 RNA 바이러스는 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 인간면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus), 코로나 바이러스(corona virus) 및 담배모자이크바이러스(Tobacco mosaic virus)로 이루어진 군으로 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 테트라케라 스캔덴스(Tetracera scandens) 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 테트라케라 스캔덴스(Tetracera scandens) 에탄올 추출물이 바이러스의 역전사효소(reverse transcriptase) 활성을 억제하여 바이러스 감염에 의한 질환을 예방 또는 치료하는데 사용할 수 있는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 테트라케라 스캔덴스(Tetracera scandens) 에탄올 추출물은 식물 추출물이기 때문에 독성 및 부작용이 적으며, 효과적으로 역전사효소 활성을 억제하여 DNA 합성을 억제하기 때문에 다양한 종류의 RNA 바이러스에 폭넓게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1 은 테트라케라 스캔덴스 에탄올 추출물의 세포독성을 GLO assay를 통하여 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2 는 테트라케라 스캔덴스 에탄올 추출물의 항바이러스 활성을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3 은 테트라케라 스캔덴스 에탄올 추출물의 역전사효소 활성 억제능을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4 는 테트라케라 스캔덴스 에탄올 추출물의 세포내 역전사효소 활성 억제능을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.

본 발명자들은 효과가 탁월하며 부작용이 적은 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물에 대하여 연구한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명자들은 민간요법에서 사용되고 있는 테트라케라 스캔덴스(Tetracera scandens)의 약리 작용 및 효과를 연구하기 위하여, 테트라케라 스캔덴스(Tetracera scandens)를 에탄올(Ethanol)에 침지시켜 에탄올 추출물을 수득하였다.

본 발명의 일 실시예에서는 상기 에탄올 추출물이 바이러스의 역전사효소(reverse transcriptase) 활성을 억제하는 것을 확인하였으며(실시예 4 참조), 다른 실시예에서는 숙주 세포에서 독성을 나타내지 않으며 효과적으로 바이러스의 역전사효소 활성을 억제하여 바이러스의 증식을 억제한다는 것을 확인하였다(실시예 3 및 5 참조).

상기 결과들을 통하여, 본원 발명의 테트라케라 스캔덴스 에탄올 추출물은 다양한 종류의 RNA 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료에 적용될 수 있을 것으로 기대된다. 이에 본 발명은 테트라케라 스캔덴스(Tetracera scandens) 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 에탄올(ethanol)의 농도에는 제한이 없으나, 바람직하게는 10% 내지 100%이고, 더욱 바람직하게는 60% 내지 80%이다. 또한 상기 조성물은 바이러스의 역전사효소(reverse transcriptase) 활성을 억제하여 바이러스의 증식을 억제하기 때문에, 역전사효소를 이용하는 모든 RNA 바이러스에 적용가능하다. 바람직하게는 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 인간면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus), 코로나 바이러스(corona virus), 담배모자이크바이러스(Tobacco mosaic virus) 등이다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 생리식염수, 폴리에틸렌글리콜, 에탄올, 식물성 오일, 및 이소프로필미리스테이트 등을 포함할 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 다른 측면은 테트라케라 스캔덴스 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 약제학적 유효량을 개체에 투여하여 바이러스 감염증을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명에서 개체란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간, 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다. 또한, 본 발명에서 약제학적 유효량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하게 조절될 수 있음은 당업자에게 명백하다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로, 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직하게는, 1일 0.001 내지 100 mg/체중kg으로, 보다 바람직하게는 0.01 내지 30 mg/체중kg으로 투여한다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 여러번 나누어 투여할 수도 있다. 본 발명의 테트라케라 스캔덴스 에탄올 추출물는 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%의 양으로 존재할 수 있다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여방법에는 제한이 없으며, 예를 들면, 경구, 직장, 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막, 또는 뇌혈관(intra cerbroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 테트라케라 스캔덴스 에탄올 추출물의 제조

테트라케라 스캔덴스(Tetracera scandens)의 에탄올 추출물을 제조하기 위하여, 테트라케라 스캔덴스 30~40g을 70% 에탄올(Ethanol) 100mL에 침지시킨 후, 3일간 배양하였다. 그리고 상기 배양액을 스피드백(speed bag)을 이용하여 40℃에서 24시간 동안 건조시켜, 테트라케라 스캔덴스 에탄올 추출물 200g을 제조하였다. 그리고 제조된 에탄올 추출물은 40mg 당 DMSO 500uL를 첨가하여 20uM의 농축액으로 보관하였다.

실시예 2. 테트라케라 스캔덴스 에탄올 추출물의 세포독성 확인

테트라케라 스캔덴스 에탄올 추출물의 세포독성을 확인하기 위하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 추출한 테트라케라 스캔덴스 에탄올 추출물을 각각 0.4, 4, 40, 및 400ug/mL의 농도로 0.5% DMSO(dimethyl sulfoxide)에 희석한 후에 T-임파구 세포인 MT-4 세포주(1X10⁴ cells)에 처리하고 37℃, 5% CO₂ 조건에서 3일간 배양한 후, 세포의 생존률을 Cell Titer-Glo assay kit를 이용하여 측정하였다. 대조군으로는 0.5% DMSO만을 처리한 MT-4 세포를 사용하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 테트라케라 스캔덴스 에탄올 추출물의 농도에 따라 세포 독성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 추출물 농도 4ug/mL까지는 세포에 독성을 나타내지 않았지만, 400ug/mL의 농도에서는 평균 90%의 세포가 사멸하였으며, CC₅₀(cell cytotoxicity concentration)은 평균 40ug/mL인 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 테트라케라 스캔덴스 에탄올 추출물의 항바이러스 활성 측정

테트라케라 스캔덴스 에탄올 추출물의 항바이러스 활성을 측정하기 위하여, MT-4 세포주(2X10⁵ cells)에 실시예 1과 동일한 방법으로 추출한 테트라케라 스캔덴스 에탄올 추출물을 각각 0, 0.4 및 4ug/mL의 농도로 처리한 후에, Nef 단백질을 EGFP 단백질로 치환한 인간면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV) 20,000pg을 감염시키고 37℃, 5% CO₂ 조건에서 3일간 배양하였다. 그리고 배양된 세포를 6,000rpm으로 3분 동안 원심분리하여 세포만 수득하고, 수득된 세포의 녹색형광 단백질(green fluorescence protein, GFP)의 형광세기 측정 및 HIV-1 p24 Antigen Capture Assay kit(Advanced BioScience Laboratories)를 이용하여 바이러스 감염정도를 확인하였고, MTT assay를 이용하여 세포의 생존률을 측정하였다. 음성 대조군으로는 0.5%의 DMSO를, 양성 대조군으로는 3'-Azido-3'-deoxy-thyminine(AZT) 1nM을 사용하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2A 및 B에 나타난 바와 같이, 세포의 생존률에 영향을 주지 않으면서 1nM의 AZT를 처리한 양성 대조군의 경우에는 항바이러스의 활성이 49.8%로 나타났고, 에탄올 추출물을 0.4ug/mL 처리한 시료는 34.7%, 4ug/mL 처리한 시료는 86.8%의 항바이러스 활성을 나타내었다. 또한 도 2C에 나타난 바와 같이, 테트라케라 스캔덴스 에탄올 추출물의 농도에 따라 세포 독성이 증가하며, IC₅₀(half maximal inhibition concentration)은 2.0~2.5ug/mL인 것을 확인할 수 있었으며, 6ug/mL의 농도에서는 거의 100%에 가까운 항바이러스 활성을 나타냄을 확인하였다.

실시예 4. 테트라케라 스캔덴스 에탄올 추출물의 역전사효소 활성 억제능 확인

테트라케라 스캔덴스 에탄올 추출물이 항바이러스 효과를 나타내는 원인을 찾기 위하여, 바이러스의 역전사효소(reverse transcriptase) 활성 억제능을 확인하였다. HIV 역전사효소(3 unit)에 테트라케라 스캔덴스 에탄올 추출물을 0, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 및 16ug/mL 처리하고, Enzchek Reverse Transcriptase assay kit(Invitrogen)를 이용하여 HIV 역전사효소의 활성을 측정하였다. 음성 대조군으로는 0.5%의 DMSO를, 양성 대조군으로는 AZT, AZTTP, Efavirenz, 및 Etravirine을 사용하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 에탄올 추출물의 농도가 증가함에 따라 역전사효소의 활성이 억제되며, IC₅₀(half maximal inhibition concentration)은 0.7ug/mL인 것을 확인할 수 있었으며, 4ug/mL의 농도에서는 거의 100%에 가까운 역전사효소 활성 억제능을 나타냄을 확인하였다. 대조군으로 사용한 AZTTP, Efavirenz, 및 Etravirine의 경우에는 농도에 따라 억제능이 증가하였으나, 인산화되지 않은 AZT의 경우에는 역전사효소의 활성을 억제하지 못하는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 본원 발명의 테트라케라 스캔덴스 에탄올 추출물은 RNA 바이러스 역전사효소의 활성을 억제하여 항바이러스 효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 테트라케라 스캔덴스 에탄올 추출물의 세포내 역전사효소 활성 억제능 확인

테트라케라 스캔덴스 에탄올 추출물이 세포 내에서도 역전사효소의 활성을 효과적으로 억제하는지 확인하기 위하여, MT-4 세포주(5X10⁵ cells)에 실시예 1과 동일한 방법으로 추출한 테트라케라 스캔덴스 에탄올 추출물을 각각 0, 0.31, 0.63, 1.25, 2.5, 5, 및 10ug/mL의 농도로 처리한 후에, Nef 단백질을 EGFP 단백질로 치환한 인간면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV) 100,000pg을 감염시키고 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 그리고 DNeasy mini kit(Qiagen)를 이용하여 배양된 세포에서 DNA를 추출한 후에, Light Cycler 480(Roche), SYBR Green I Master mix(Roche) 및 HIV-1 특이적 LTR 프라이머(Forward: 5'-GATCTGAGCCTGGGAGCTCTC-3', Reverse: 5'-CCTTTCGCTTTCAAGTCCCTGTTC-3')를 이용하여 Quantitative DNA-PCR(polymerase chain reaction)을 수행하여, 바이러스의 cDNA 양을 측정하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 테트라케라 스캔덴스 에탄올 추출물의 농도에 따라 바이러스의 cDNA 합성이 감소한 것을 확인할 수 있었으며, 2.5ug/mL의 농도에서는50% 정도로 cDNA의 합성이 감소된 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과들을 통하여, 본원 발명의 테트라케라 스캔덴스 에탄올 추출물은 세포 내에서 효과적으로 바이러스의 역전사효소의 활성을 억제하여 cDNA의 합성을 억제하고, 최종적으로 바이러스의 증식을 억제한다는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통하여 본원 발명의 테트라케라 스캔덴스 에탄올 추출물을 바이러스 감염의 예방 또는 치료에 사용가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

Claims

테트라케라 스캔덴스(Tetracera scandens) 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는, RNA 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 에탄올은 10% 내지 100% 에탄올인 것을 특징으로 하는, RNA 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 RNA 바이러스의 역전사효소(reverse transcriptase)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, RNA 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 RNA 바이러스는 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 인간면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus), 코로나 바이러스(corona virus) 및 담배모자이크바이러스(Tobacco mosaic virus)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, RNA 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물.