KR101409493B1 - 에드와드 균에 결합하는 펩티드, 그의 제조방법 및 이를 이용한 에드와드 균의 검출방법 - Google Patents

에드와드 균에 결합하는 펩티드, 그의 제조방법 및 이를 이용한 에드와드 균의 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 에드와드 균 (Edwardsiella tarda)에 결합하는 펩티드, 그의 제조방법 및 이를 이용한 에드와드 균의 검출방법에 관한 것으로, 상기 펩티드를 이용할 경우 항체를 이용하는 것에 비해 경제적이고 간편하게 에드와드 균을 검출할 수 있는 장점이 있다.

Description

에드와드 균에 결합하는 펩티드, 그의 제조방법 및 이를 이용한 에드와드 균의 검출방법{Edwardsiella tarda-binidng peptides, their preparation method and a method of detecting Edwardsiella tarda using the peptides}
본 발명은 에드와드 균 (Edwardsiella tarda)에 결합하는 펩티드, 그의 제조방법 및 이를 이용한 에드와드 균의 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 에드와드 균에 결합하는 특성을 가짐으로써 에드와드 균 항체를 대신할 수 있는 펩티드, 그의 제조방법 및 상기 펩티드를 이용하여 에드와드 균을 검출하는 방법에 관한 것이다.
그람 음성균으로 운동성이 있는 단간균인 에드와드 균 (Edwardsiella tarda)은 자연계에 널리 분포하는 장내 세균이며 우리나라 양식장에 가장 많은 어병인 에드와드 병을 일으키는 원인 균이다.
이와 같은 박테리아를 검출하기 위해서는 일반적으로 고체 배지에 배양한 후 형성된 군체의 수를 세는 방법이 사용되는데 2-7일 정도의 시간이 소요되기 때문에 신속한 검사가 불가능한 문제점이 있다. 이 때문에, 신속한 검사를 위해서는 박테리아 내부에 있는 ATP라는 화학물질의 양을 측정하는 방법이 사용되기도 하는데, 이 방법으로는 박테리아 종류의 구별이 곤란한 문제점이 있다. 이에, 최근에는 박테리아를 실시간에 검출하기 위한 바이오센서에 대한 연구가 많이 진행되고 있다.
바이오센서는 분석 대상 박테리아와 특이적으로 결합할 수 있는 바이오 인터페이스 (bio-interface)와 결합에 반응하여 신호를 발생하는 신호 변환기 (signal transducer)로 구성되어 있다. 바이오 인터페이스로는 대개 면역 단백질인 항체가 많이 사용되는데 항체는 친화도와 특이성이 높은 장점이 있는 반면에 분자량이 크고, 화학적인 처리가 어렵고, 변질되기 쉽고, 가격이 비싸다는 문제점이 있다.
에드와드 균과 관련하여, 대한민국 특허출원 제10-1997-0051986호 ‘에드와드병의 감염에 대한예방백신 및 이를 이용하여 넙치의 에드와드병 감염을 예방하는 방법’에는 에드와드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda) 항원을 포함하는 에드와드병 감염에 대한 예방 백신이 기재되어 있으나, 에드와드 균에 결합하는 펩티드, 그의 제조 방법 및 상기 펩티드를 이용하여 에드와드 병을 치료하는 방법은 아직까지 시사되거나 암시된 바 없다. 이에, 본 발명자들은 에드와드 균에 결합하는 펩티드를 연구하여 밝혀내어 상기한 문제점을 해결한 에드와드 균의 검출 방법을 제공하게 됨으로써 본 발명에 이르게 되었다.
본 발명의 목적은 에드와드 균에 결합하는 펩티드를 제공하는 한편, 이를 이용하여 신속하고 간단하면서도 경제적으로 에드와드 균을 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩티드를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명에서는 에드와드 균과 결합하는 것을 특징으로 하는, TLYPLDR (ET-01)과 WVWPARL (ET-02) 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 펩티드가 제공된다.
또한, 본 발명에서는 에드와드 균에 Ph.D-7 파지-펩티드 문고를 첨가하여 바이오패닝 (biopanning) 과정을 반복하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 펩티드의 제조방법이 제공된다.
또한, 본 발명에서는 상기 펩티드를 이용하는 것을 특징으로 하는 에드와드 균의 검출 방법이 제공된다.
또한, 본 발명에서는 상기 펩티드를 형광물질, 방사성 물질 또는 효소와 결합시켜서 사용하는 것을 특징으로 하는 에드와드 균의 검출 방법이 제공된다.
마지막으로, 본 발명에 따르면, 상기 펩티드를 형광물질과 결합시킨 후에 형광 편광 (fluorescence polarization)시키는 것을 특징으로 하는 에드와드 균의 검출 방법이 제공된다.
본 발명의 펩티드를 이용할 경우 종래의 박테리아 군체 개체수를 세는 방법에 비해 신속하게 에드와드 균을 검출할 수 있으며, 균의 종류 또한 확인할 수 있고, 항체를 이용하는 경우보다 더 간단하고 경제적으로 에드와드 균을 검출할 수 있는 효과가 있다. 그 결과, 넙치 등을 비롯한 어종의 양식업에 크게 기여하는 산업적 효과도 갖는다.
도 1은 섬유상 박테리오파지의 구조를 나타낸다.
도 2는 바이오패닝의 원리를 나타낸 그림이다.
도 3은 Ph.D-7 파지-펩티드 문고에서의 무작위 아미노산 서열의 구조를 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 바이오패닝 방법을 나타낸다.
도 5는 필터와 페록시다아제를 이용한 펩티드들의 에드와드 균에 대한 친화도 측정 결과를 나타낸다.
도 6은 필터와 포스파타아제를 이용한 펩티드들의 에드와드 균에 대한 친화도 측정 결과를 나타낸다.
도 7은 필터와 포스파타아제를 이용한 ET-02 펩티드의 에드와드 균과 대장균에 대한 친화도 측정 결과를 나타낸다.
도 8a는 자성 비드, ET-02 펩티드, 포스파타아제를 이용한 에드와드 균의 검출 방법을 나타낸 것이다.
도 8b는 자성 비드, ET-02 펩티드, 포스파타아제를 이용한 에드와드 균의 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 형광 물질을 붙인 ET-02 펩티드를 이용하여 형광 편광 (fluorescence polarization) 방법으로 에드와드 균을 검출한 결과이다.
본 발명에 따르면, 파지-펩티드 문고를 검색하는 단계, 에드와드 균에 파지-펩티드 문고를 첨가하여 바이오패닝 (biopanning) 과정을 반복하는 단계, 바이오패닝 과정에서 회수된 펩티드 중 발생 빈도가 높은 펩티드의 염기 서열을 확인하는 단계를 포함하는 방법에 의해 본 발명의 펩티드를 제공한다.
파지-펩티드 문고 기술은 M13이나 fd와 같은 섬유상 박테리오파지 (filamentous bacteriophage)의 껍질 단백질 (coat protein)에 무작위 아미노산 서열의 펩티드를 나타낸 박테리오파지들로 이루어진 집단으로부터 특정 목표 분자에 결합하는 리간드를 검색하는 기술이다. 도 4는 섬유상 박테리오파지의 구조를 나타내는데, coat protein 가운데 protein 3의 N-말단 부분에 무작위 아미노산 서열의 펩티드를 나타낸 구조를 볼 수 있다.
본 발명에 따르면, 에드와드 균에 결합하는 펩티드를 찾기 위해 무작위 아미노산이 7개인 Ph.D-7 파지-펩티드 문고를 검색하였다. Ph.D-7은 7개의 잔기로 이루어진 펩티드가 일직선으로 나열된 것이다. Ph.D-7의 무작위 아미노산 서열 부분은 도 3에 나타나 있으며 X로 표시된 부분이 무작위 서열이다.
바이오패닝은 특정 목표 분자에 결합하는 파지를 찾는 방법이다. 바이오패닝 방법의 원리는 이하에 기재된 바와 같다(도 2 참고). 목표 분자가 부착되어 있는 고체 표면에 파지-펩티드 문고를 넣어 결합시킨 후 씻어내면 결합성이 있는 파지들만 남게 된다. 결합한 파지들을 다시 회수하여 숙주 박테리아에 감염시키면 같은 성질을 갖는 파지들이 증폭되고, 증폭된 파지를 이용하여 앞의 과정을 반복하게 되면 특이적으로 결합하는 파지의 비율이 높아져서 마침내는 원하는 펩티드만을 분리할 수 있게 된다. 바이오패닝을 통해 목표 분자에 결합하는 파지를 찾으면 그 파지에 표현된 펩티드의 아미노산 서열은 protein 3의 유전자인 gene 3 앞에 삽입된 DNA의 염기서열로부터 추정할 수 있다.
본 발명에 따르면, 에드와드 균에 결합하는 펩티드를 찾기 위해 도 4에 나타낸 것처럼 먼저 에드와드 균에 파지-펩티드 문고를 더하여 결합시키고 원심분리를 하여 에드와드 균만 가라앉혔다. 용액 중의 결합하지 않은 파지를 제거하고 완충용액으로 에드와드 균을 씻어주었다. 그리고 마지막으로 에드와드 균에 결합한 파지를 회수하여 대장균에서 증폭하였다.
상기와 같은 바이오패닝 과정을 4회 반복한 후 3회와 4회에 회수된 파지 가운데 14개와 10개를 각각 무작위로 선별하여 펩티드에 대한 암호를 가지고 있는 염기서열을 결정하였다. 그 결과 발생 빈도가 높은 펩티드로 TLYPLDR (ET-01)과 WVWPARL (ET-02) 서열이 확인되었다. 이와 같이 반복된 바이오패닝 과정을 통해 발생 빈도가 높아진 아미노산 서열은 에드와드 균에 결합하는 특성이 우수하다는 것을 의미한다.
상기로부터 수득된 본 발명의 펩티드는 에드와드 균을 검출하는데 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 펩티드의 제조
약 109 cfu 정도의 에드와드 균을 포함하는 PBS (phosphate-buffered saline)에 Ph.D-7 파지 펩티드 문고 10 μl (2×1013 pfu/ml, 2×109 independent sequences)를 더하여 실온에서 1시간 동안 흔들어주며 결합시켰다. 원심분리로 에드와드 균을 가라앉힌 후 상층액을 제거하고 에드와드 균을 PBS로 2회 씻어주었다. 마지막으로 0.2 M glicine-HCl, pH 2.2 완충용액 1 ml을 넣어 에드와드 균에 결합한 파지들을 해리시켰다. 원심분리 후 상층액을 새로운 튜브로 옮기고 1 M Tris-Cl, pH 9.6 완충용액을 0.15 ml 넣어 중화시켰다. 중화시킨 용액 1 ml에 액체 배지에서 배양한 Escherichia coli (E. coli) XL1-blue 30 ml을 더하여 파지를 증폭시켰다. 중화시킨 나머지 용액으로는 회수된 파지의 수를 결정하였다. 파지를 증폭한 후 원심분리 하여 침전된 세포는 제거하고 상층액에 있는 파지를 다음 바이오패닝에 사용하였다.
이와 동일한 방법으로 바이오패닝을 4회 반복한 후 3회와 4회에 회수된 파지 가운데 14개와 10개를 각각 무작위로 선별하여 파지를 배양하였다. 배양된 파지로부터 DNA를 분리하고 각 DNA의 gene 3 앞에 삽입된 무작위 염기서열을 결정하여 아미노산 서열로 전환한 결과 3회에 WVWPARL (ET-02) 서열이 2회 나타났고 TLYPLDR (ET-01) 서열은 3회와 4회에 한 번씩 나타났다. 처음 사용한 Ph.D-7 문고에는 2×109 종류의 파지가 있으며 파지의 수는 2×1012 개이기 때문에 한 종류 파지의 수는 약 1,000개가 된다. 이 가운데서 10개의 파지를 임의로 선택했을 때 동일한 파지가 두 번 선택될 확률은 2.5×10- 17 으로 극히 낮다. 따라서 3회 또는 4회의 바이오패닝 이후에 ET-01과 ET-02 서열이 2회씩 나타났다는 것은 그 서열을 갖는 파지들이 다른 파지들에 비해 훨씬 강하게 증폭되었다는 것을 의미한다. 그리고 이 파지들이 에드와드 균에 결합하는 성질을 기준으로 바이오패닝을 했을 때 강하게 증폭되었다는 사실은 이 파지들이 에드와드 균에 잘 결합하는 특성을 가지고 있음을 보여준다.
에드와드 균에 대한 친화도 확인
ET-01과 ET-02 두 종류 펩티드의 에드와드 균에 대한 친화도를 확인하기 위해 각 펩티드의 아미노산 서열의 카르복시 말단에 두 개의 글리신 잔기와 한 개의 리신 잔기를 추가하고 마지막 리신 잔기의 아미노기에 비오틴 기를 더한 펩티드를 합성하였다. 즉 ET-01은 TLYPLDRGGK-biotin의 서열이 되고 ET-02는 WVWPARLGGK-biotin의 서열이 되었다.
스트렙트아비딘 (streptavidin, StAv) 단백질과 퍼옥시다아제 (horseradish peroxidase, HRP) 효소를 화학결합으로 연결시킨 StAv-HRP 단백질에 위에서 합성한 두 가지 펩티드를 각각 넣어주었다. 그 결과 비오틴과 스트렙트아비딘 단백질 사이의 강한 결합에 의해 ET01-StAv-HRP 단백질 또는 ET02-StAv-HRP 단백질이 만들어졌다.
다음으로 ET01-StAv-HRP 단백질 또는 ET02-StAv-HRP 단백질을 에드와드 균과 섞어 결합시킨 후 0.45 μm의 구멍을 갖는 필터를 이용하여 걸러주었다 (도 5의 3번과 5번 시료). 단백질들은 필터의 구멍보다 작기 때문에 필터를 빠져나가지만 에드와드 균은 구멍보다 커서 빠져나가지 않는다. 따라서 에드와드 균에 결합한 ET01-StAv-HRP 단백질 또는 ET02-StAv-HRP 단백질만 필터에 남고 에드와드 균에 결합하지 않은 ET01-StAv-HRP 단백질 또는 ET02-StAv-HRP 단백질은 모두 필터를 빠져나가게 된다. 따라서 필터에 남아있는 HRP 효소 활성을 측정하면 ET-01 또는 ET-02 펩티드가 에드와드 균에 결합하는 활성이 있는지 확인할 수 있다. HRP 효소 활성은 루미놀과 과산화수소를 넣고 반응 결과 발생하는 빛의 세기를 측정함으로써 평가하였다.
도 5의 1번은 StAv-HRP 단백질과 에드와드 균을 직접 섞어 StAv-HRP 단백질과 에드와드 균 사이의 비특이적인 결합 정도를 평가하기 위한 비교치이고, 2번과 4번은 각각 ET01-StAv-HRP 단백질 또는 ET02-StAv-HRP 단백질이 에드와드 균에 결합하지 않은 상태로 필터에 얼마나 남는지 평가하기 위한 비교치이다. 이 실험을 3회 수행하였으며 그래프에는 평균치와 표준편차를 나타내었다.
도 5에 있는 실험 결과를 보면 1번 시료에서는 약간의 빛이 발생하여 StAv-HRP 단백질과 에드와드 균 사이에 약간의 비특이적인 결합이 있는 것을 알 수 있다. 2번과 4번 시료에서는 거의 빛이 검출되지 않아 ET01-StAv-HRP 단백질 또는 ET02-StAv-HRP 단백질이 에드와드 균에 결합하지 않은 상태로는 필터에 거의 남지 않는다는 것을 알 수 있다. 3번 시료는 1번 시료에 비해 약간 높게 나타났는데 이는 ET01이 에드와드 균에 결합하는 활성이 있기는 하지만 친화도가 그렇게 높지 않음을 의미한다. 마지막으로 5번 시료는 발생한 빛의 세기가 현저하게 강하게 나타나 ET-02가 에드와드 균에 잘 결합하는 것을 확인할 수 있었다.
두 펩티드의 친화도를 더 분명하게 확인하기 위해 HRP 효소를 염기성 포스파타아제 (alkaline phosphatase, AP) 효소로 바꿔 도 5에서 수행한 것과 동일한 실험을 수행하였다 (도 6 참조). 이 실험에서 AP 효소 활성은 p-nitrophenol phosphate를 더하여 반응시킨 후 405 nm에서 흡광도를 측정함으로써 평가하였다.
이 두 번째 실험에서도 역시 도 6에 있는 것처럼 ET-02가 에드와드 균에 대해 뚜렷한 친화도를 가지고 있는 것으로 확인되어 이후에는 ET-02에 대한 실험을 진행하였다.
에드와드 균에 대한 특이성 확인
ET-02 펩티드가 에드와드 균에만 특이적으로 결합하는 활성을 가지고 있는지 확인하기 위해 에드와드 균과 동일한 그람 음성균인 대장균을 대상으로 도 6에서 수행한 것과 동일한 실험을 수행하였다 (도 7 참조). 여기에서 2번과 3번 시료는 대장균을 대상으로 한 실험이고 4번과 5번은 에드와드 균을 대상으로 한 실험이다.
도 7을 보면 에드와드 균과 ET02-StAv-Ap을 섞어준 5번 시료는 여전히 다른 비교치에 비해 현저하게 높은 값을 보여주지만 대장균과 ET02-StAv-Ap을 섞어준 3번 시료는 비교치와 큰 차이가 없어 ET-02가 에드와드 균에 특이적으로 결합한다는 것을 알 수 있었다.
실험예 : 포획비드와 검출표지를 이용한 에드와드 균 검출
에드와드 균에 결합하는 ET-02 펩티드는 항체에 비해 친화도는 낮지만 안정성이 높고, 경제적이고, 화학적인 조작이 쉽고, 분자량이 작은 장점을 가지고 있기 때문에 도 8a와 같이 펩티드를 포획 자성비드와 검출 표지 양쪽에 모두 사용하는 검출방법에 응용할 수 있다. 포획 자성비드는 자성 비드 (magnetic bead)에 ET-02 펩티드를 고정시킨 것으로 시료에 섞여 있는 에드와드 균을 분리해내는 전처리에 사용된다. 검출 표지는 ET-02 펩티드를 효소와 연결시킨 것으로 에드와드 균에 결합하여 에드와드 균을 검출할 때 사용되는 표지이다.
에드와드 균과 같은 박테리아는 표면에 동일한 분자가 반복하여 분포하고 있기 때문에 한 개의 박테리아에 여러 개의 펩티드가 결합하는 다가 결합 (multi-valent binding)을 할 수 있다. 따라서 한 개의 자성 입자에 여러 개의 ET-02 펩티드를 고정시켜 사용하면 여러 개의 펩티드가 동시에 결합하기 때문에 자성 입자와 에드와드 균 사이의 친화도가 높아진다.
또한 ET-02를 포함하는 포획 자성 비드를 에드와드 균을 포함하는 시료에 넣어주면 한 개의 에드와드 균에 여러 개의 포획 자성 비드가 결합할 수 있다. 그러나 크기가 큰 자성 비드를 사용할 경우 비드들 사이의 입체적 장애로 인하여 자성 비드가 모든 결합자리에 결합하지 못하고 결과적으로 비어있는 결합자리들이 남게 된다. 여기에 ET-02를 포함하는 검출 표지를 넣어주면 비어있는 결합자리에 검출 표지들이 추가로 결합할 수 있다. 포획 비드들이 결합하고 남은 자리에 검출 표지들이 결합하기 위해서는 비드들로 인한 입체적 장애를 피하여 결합해야 하기 때문에 분자량이 작은 ET-02 펩티드는 항체에 비해 유리한 특성을 갖는다.
ET-02 펩티드를 이용하여 위의 방법으로 에드와드 균을 검출할 수 있는지 확인하기 위해 ET-02 펩티드를 자성 비드에 고정시킨 포획 비드와 ET-02 펩티드를 AP 효소에 연결시킨 검출 표지를 제조하였다. 다음으로 도 8b의 1번 시료와 같이 에드와드 균과 포획 비드 그리고 검출 표지를 모두 섞어 결합시키고 자석을 이용하여 포획 비드를 회수하였다. 그리고 회수한 포획 비드에 p-nitrophenol phosphate를 넣어 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 2번 시료는 ET-02가 없는 자성 비드를 사용한 비교치, 3번 시료는 에드와드 균을 넣지 않은 비교치, 4번 시료는 ET-02가 없는 AP 효소를 사용한 비교치이다. 도 8b의 그래프에서 볼 수 있는 것처럼 1번 시료에서만 흡광도가 높게 나타나 에드와드 균에 포획비드와 검출표지가 모두 결합했음을 확인할 수 있다.
실험예 2 : 형광 편광 방법을 이용한 에드와드 균 검출에 응용
에드와드 균에 결합하는 펩티드는 분자량이 작기 때문에 항체에는 적용하기 어려운 형광 편광 (fluorescence polarization)과 같은 검출 방법을 적용할 수도 있다.
형광 편광의 원리는 다음과 같다. 수직 면 편광 (plane polarized light)으로 형광 분자를 들뜨게 했을 때 만약 분자가 들뜬 상태에서 움직이지 않는다면 방출되는 형광은 처음 들뜨게 했던 빛과 동일한 수직면으로 진동하는 면 편광이 나오게 된다. 반면에 들뜬 분자가 회전을 하면 방출된 빛은 다른 면으로 진동하게 된다. 만약 형광 분자로부터 방출되는 형광을 측정할 때 수직면으로 진동하는 형광과 수평면으로 진동하는 형광을 측정한다면 움직이지 않는 분자는 수직면으로 진동하는 형광만 측정될 것이다. 이러한 현상을 형광 편광 (fluorescence polarization, FP)이라고 한다. 반면에 회전을 하는 분자는 수직면으로 진동하는 형광과 수평면으로 진동하는 형광이 모두 측정된다. 분자가 크면 느리게 움직이기 때문에 수평면으로 진동하는 형광에 비해 수직면으로 진동하는 형광의 비율이 커지지만, 분자가 작을 때는 빠르게 움직이기 때문에 수직면으로 진동하는 형광과 수평면으로 진동하는 형광의 비율이 비슷해진다.
수직면으로 진동하는 형광의 세기를 V라고 하고 수평면으로 진동하는 형광의 세기를 H라고 하면 형광 편광, FP는 다음 식과 같이 계산되고 그 단위로는 P (polarization unit)가 사용되지만 편의를 위해 일반적으로는 1000분의 1 단위인 mP가 사용된다.
만약 검출하려고 하는 분석물질은 크고 이 분석물질에 결합하는 리간드는 작다면 형광물질을 연결시킨 리간드를 분석물질에 결합시킨 후 형광 편광을 측정하여 분석물질을 검출할 수 있다. 작은 리간드가 큰 분석물질에 결합하면 움직임이 느려져 형광편광 값이 증가하기 때문이다. 그러나 리간드가 항체처럼 너무 크면 분석물질에 결합하지 않은 상태에서도 이미 형광 편광 값이 거의 최고치에 도달하기 때문에 분석물질에 결합해도 형광 편광의 변화를 관찰할 수 없다. 이 형광 편광 방법은 용액 중에서 일어나는 결합을 직접 측정할 수 있으며 매우 간편하고 측정 시간이 짧다는 장점이 있다.
ET-02 펩티드를 형광 편광 측정에 응용하기 위해 ET-02의 아미노 말단에 플루오레신(fluorescein)을 연결한 형광 ET-02 펩티드를 합성하였다. 에드와드 균을 4.1×106 cfu/ml부터 1.7×104 cfu/ml까지 차례로 25분의 4씩 묽혀 4개의 튜브에 100 μl씩 넣고 각 튜브에 형광 ET-02 펩티드를 최종 농도가 100 nM이 되도록 넣었다. 펩티드가 에드와드 균에 결합하도록 1시간 동안 반응시킨 후 퍼킨 엘머 사의 빅터3 (Victor3) 리더로 이 네 가지 혼합물의 형광 편광을 측정하였다. 그리고 ET-02의 에드와드 균에 대한 특이성을 확인하기 위해 대장균과 여시니아 (Yersinia enterocolitica) 균을 이용하여 동일한 실험을 수행하였다. 그 결과 도 9에 있는 것처럼 에드와드 균의 농도에 비례하여 형광 편광이 증가하였다. 그 이유는 에드와드 균이 많을수록 에드와드 균에 결합한 형광 ET-02 펩티드가 많아지게 되고 결과적으로 형광 ET-02 펩티드들의 움직임이 느려지기 때문이다. 그러나 대장균과 여시니아 균을 이용한 실험에서는 형광 편광 값의 변화가 에드와드 균에 비해 현저하게 낮게 나타나 ET-02 펩티드을 이용하여 에드와드 균을 선택적으로 검출할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명은 에드와드 균의 검출에 이용할 수 있다. 그 결과, 넙치 등을 비롯한 어종의 양식업에 크게 기여하는 산업적 효과를 갖는다.

Claims (8)

  1. 에드와드 균과 결합하는 것을 특징으로 하는 WVWPARL (ET-02) 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 형광물질 또는 효소를 고정시킨 청구항 1 기재의 펩티드를 에드와드 균을 포함하는 시료에 넣어서 결합시키는 단계;
    에드와드 균에 결합한 펩티드는 통과시키지 않고 에드와드 균에 결합하지 않은 자유로운 펩티드는 통과시키는 필터를 이용하여 상기 시료로부터 상기 자유로운 펩티드를 제거하는 단계; 및
    상기 필터에 남은 펩티드에 고정된 형광물질 또는 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 에드와드 균의 검출 방법.
  6. 형광물질 또는 효소를 고정시킨 청구항 1 기재의 펩티드를 에드와드 균을 포함하는 시료에 넣어서 결합시키는 단계;
    원심분리를 통해 에드와드 균을 침전시키는 단계; 및
    상기 침전에 남은 펩티드에 고정된 형광물질 또는 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 에드와드 균의 검출 방법.
  7. 청구항 5 또는 청구항 6에 있어서,
    형광물질을 고정시킨 펩티드를 에드와드 균과 결합시킨 후에 형광 편광 (fluorescence polarization)이 일어나는 정도를 측정하는 것을 특징으로 하는 에드와드 균의 검출 방법.
  8. 청구항 1 기재의 펩티드 다수를 고정시킨 자성 입자를 에드와드 균을 포함하는 시료에 넣어 결합시키는 단계; 및
    자석을 이용하여 상기 시료로부터 자성 입자를 회수하는 것을 특징으로 하는 에드와드 균의 분리 방법.
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screening of edwardsiella tarda-binding peptides from a peptide library display on bacteriophage. 한국생화학분자생물학회 (2008). *

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