KR101408304B1 - Method for Preparing 2,3-butanediol from Commercial carbon source by Transformed Klebsiella pneumoniae - Google Patents
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Abstract
본 발명은 2,3-부탄다이올의 제조방법에 관한 것으로, 보아 상세하게는 (a) 크렙시엘라의 wabG를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 불활성화 하는 단계; (b) 아세토락테이트 디카르복실라아제(acetolactate decarboxylase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 아세토락테이트 신타아제(acetolactate synthase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 발현 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계; (c) 상기 재조합 벡터를 상기 크렙시엘라에 도입하여 형질전환 크렙시엘라를 제조하는 단계; (d) 상기 형질전환 크렙시엘라를 배양 배지에서 배양하여 2,3-부탄다이올을 제조하는 단계; 및 (e) 상기 2,3-부탄다이올을 수득하는 단계를 포함하는 형질전환 크렙시엘라(Klebsiella)를 이용한 2,3-부탄다이올의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 본 발명은 종래의 기술보다 경제적인 산업용 탄소원을 이용하여 경제적으로 2,3-부탄다이올을 제조할 수 있다.The present invention relates to a process for preparing a 2,3-butanediol, and more particularly, to a process for producing 2,3-butanediol, comprising: (a) inactivating a nucleotide sequence encoding a wabG of Kepsilaella; (b) preparing a recombinant vector by inserting a nucleotide sequence encoding acetolactate decarboxylase and a nucleotide sequence encoding acetolactate synthase into an expression vector; (c) introducing the recombinant vector into the Klebsiella to prepare a transformed Klebsiella; (d) culturing the transformed Krepsiella in a culture medium to produce 2,3-butanediol; And (e) obtaining the 2,3-butanediol. The method for producing 2,3-butanediol using the transformed Klebsiella . According to the present invention, 2,3-butanediol can be produced economically using an industrial carbon source which is more economical than the conventional art.
Description
본 발명은 형질전환 크렙시엘라 뉴모니아를 이용하여 산업용 탄소원으로부터 2,3-부탄다이올의 제조방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a process for the production of 2,3-butanediol from industrial carbon sources using a transformed Klebsiella lunomycota.
지구온난화 및 원유 보유량의 부족으로 인해, 재생 가능한 원료로부터 생물학적 방법을 이용하여 연료 및 화학물질을 생산하기 위한 바이오매스 전환과정 및 전략이 세계적으로 개발되고 있다. 예컨대, 2,3-부탄다이올(butanediol; BDO)는 화학 물질의 공급원료, 액체 연료 및 생합성 기본요소로 다양하게 사용되는 경제적으로 중요한 원료이다. 탈수반응은 2,3-BDO를 액체 연료의 첨가제로 사용되는 메틸에틸 케톤으로 전환할 수 있고, 2,3-BDO는 합성 고무의 중요 기본요소인 1,3-부타디엔(butadiene)으로 전환할 수 있다. 산업적으로 이용할 수 있는 2,3-BDO의 생물학적 제조는 애로박터 애로제네스(Aerobacter aerogenes), 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 및 바실러스 폴리믹사(Bacillus plymyxa)를 포함하는 몇몇 미생물의 2,3-BDO 생합성 경로를 통해 달성되어왔다. 크렙시엘라는 폭넓은 기질 스펙트럼 및 배양 적응성을 갖으며, 2,3-BDO의 효율적으로 생산하는 것으로 보고된다. 크렙시엘라는 2,3-BDO 생합성을 위한 유망한 미생물이지만, 크렙시엘라 독성, 낮은 생산성, 이성체 분리 및 글루코오스와 같은 고가의 탄소원 요구와 같은 단점이 있다.Due to global warming and lack of crude oil reserves, biomass conversion processes and strategies for producing fuels and chemicals from renewable raw materials using biological methods are being developed globally. For example, 2,3-butanediol (BDO) is an economically important raw material that is widely used as a feedstock for chemical feedstocks, liquid fuels, and biosynthetic bases. The dehydration reaction can convert 2,3-BDO to methyl ethyl ketone, which is used as an additive in liquid fuels, and 2,3-BDO can be converted to 1,3-butadiene, an essential element of synthetic rubber. have. Biological production of industrially available 2,3-BDO is accomplished using the Aerobacter aerogenes , Klebsiella pneumoniae) and has been achieved by the 2,3-BDO biosynthetic pathway of some micro-organisms containing poly miksa Bacillus (Bacillus plymyxa). Klebsiel has a broad substrate spectrum and culture adaptability and is reported to produce 2,3-BDO efficiently. Krebsia is a promising microorganism for 2,3-BDO biosynthesis, but has disadvantages such as Klebsiella toxicity, low productivity, isomer isolation and expensive carbon source requirements such as glucose.
하지만 크렙시엘라 뉴모니에는 기회감염성 특성을 가지고 있으며, 병원 감염의 주요 원인 균이다. 호흡기 감염을 통해 폐렴을 유발하고 균혈증, 요로감염, 상처감염을 일으킨다. 이러한 여러 가지 질병을 일으키는 크렙시엘라의 병원성을 제거한다면 2,3-부탄다이올 생산에 있어서 안전하게 이용할 수 있을 것이다. 크렙시엘라가 가지는 병원성의 주원인은 캡슐 폴리사카라이드(Capsulpolysaccharide), 리포폴리사카라이드(Lipopolysacchardie), 편모(Fili)등이 있다. 이 중 리포폴리사카라이드(Lipopolysacchardie)는 외막의 구성성분 중에 하나이고 내독소를 가지며 여러 가지 화학적인 공격으로부터 크렙시엘라를 보호 하는 역할을 한다.
However, Klebsiella pneumoniae has opportunistic infectivity and is a major cause of hospital infection. It causes pneumonia through respiratory infections and causes bacteremia, urinary tract infections, and wound infections. Removing the virulence of Klebsiella, which causes these various diseases, will be safe for use in 2,3-butanediol production. Capsulpolysaccharide, Lipopolysacchardie, and Fili are the main pathogenic agents of Klebsiella. Of these, lipopolysaccharide is one of the constituents of the outer membrane, has endotoxin, and protects Krebscheiler from various chemical attacks.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.
본 발명자들은 천연 원유 감소로 인한 에너지 위기를 극복하기 위해 경제적이고 생물학적인 방법을 이용하여 2,3-부탄다이올을 제조하는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 2,3-부탄다이올을 생성하는 크렙시엘라의 wabG 유전자를 불활성화하고, 아세토락테이트 디카르복실라아제(acetolactate decarboxylase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 및 아세토락테이트 신타아제(acetolactate synthase)를 코딩하는 뉴클레오다이드가 삽입된 발현 벡터를 도입한 형질전환 크렙시엘라를 개발하고, 산업용 탄소원을 이용하여 2,3-부탄다이올을 제조함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present inventors have sought to develop a method for producing 2,3-butanediol using economical and biological methods to overcome the energy crisis due to the reduction of natural crude oil. As a result, the wabG gene of Krebsiella producing 2,3-butanediol was inactivated, and nucleolide and acetolactate synthase encoding acetolactate decarboxylase were inactivated, And a 2,3-butanediol using an industrial carbon source. The present invention has been completed based on this finding.
따라서, 본 발명의 목적은 2,3-부탄다이올의 제조방법을 제공하는 데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a process for producing 2,3-butanediol.
본 발명의 다른 목적은 2,3-부탄다이올을 제공하는 데 있다.
Another object of the present invention is to provide 2,3-butanediol.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 형질전환 크렙시엘라(Klebsiella)를 이용한 2,3-부탄다이올의 제조방법을 제공한다:According to one aspect of the present invention, the present invention provides a process for preparing a 2,3-butanediol using a transformed Klebsiella comprising the steps of:
(a) 크렙시엘라의 wabG를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 불활성화 하는 단계;(a) inactivating a nucleotide sequence encoding a wabG of Kepsilaella;
(b) 아세토락테이트 디카르복실라아제(acetolactate decarboxylase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 아세토락테이트 신타아제(acetolactate synthase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 발현 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계;(b) preparing a recombinant vector by inserting a nucleotide sequence encoding acetolactate decarboxylase and a nucleotide sequence encoding acetolactate synthase into an expression vector;
(c) 상기 재조합 벡터를 상기 크렙시엘라에 도입하여 형질전환 크렙시엘라를 제조하는 단계.(c) introducing the recombinant vector into the Klebsiella to produce a transformed Klebsiella.
(d) 상기 형질전환 크렙시엘라를 배양 배지에서 배양하여 2,3-부탄다이올을 제조하는 단계; 및(d) culturing the transformed Krepsiella in a culture medium to produce 2,3-butanediol; And
(e) 상기 2,3-부탄다이올을 수득하는 단계.
(e) obtaining the 2,3-butanediol.
본 발명자들은 천연 원유 감소로 인한 에너지 위기를 극복하기 위해 경제적이고 생물학적인 방법을 이용하여 2,3-부탄다이올을 제조하는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 2,3-부탄다이올을 생성하는 크렙시엘라의 wabG 유전자를 불활성화하고, 아세토락테이트 디카르복실라아제(acetolactate decarboxylase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 및 아세토락테이트 신타아제(acetolactate synthase)를 코딩하는 뉴클레오다이드가 삽입된 발현 벡터를 도입한 형질전환 크렙시엘라를 개발하고, 산업용 탄소원을 이용하여 2,3-부탄다이올을 제조하였다.
The present inventors have sought to develop a method for producing 2,3-butanediol using economical and biological methods to overcome the energy crisis due to the reduction of natural crude oil. As a result, the wabG gene of Krebsiella producing 2,3-butanediol was inactivated, and nucleolide and acetolactate synthase encoding acetolactate decarboxylase were inactivated, Was introduced, and 2,3-butanediol was prepared by using an industrial carbon source.
본 발명의 2,3-부탄다이올 제조방법을 각각의 단계로 나누어 상세하게 설명하면 다음과 같다:
The process for preparing 2,3-butanediol of the present invention will be described in detail as follows:
단계(a): wabG 의 불활성화 Step (a): deactivation of wabG
먼저, 크렙시엘라(Klebsiella) 종의 wabG를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 불활성화한다. 상기 wabG는 크렙시엘라의 외막을 구성하는 성분 중 하나인 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)의 코어(core) 생합성에 괸련된다.First, the nucleotide sequence encoding the wabG of Klebsiella species is inactivated. The wabG is involved in the core biosynthesis of lipopolysaccharide, which is one of the components constituting the outer membrane of Krebs cell.
불활성화 대상이 되는 wabG는 다양한 크렙시엘라에서 발견되고 동정되었다. 하기의 실시예에서는 서열목록 제1서열의 크렙시엘라 뉴모니에 의 wabG가 예시되어 있으나, 이외에도 다양한 wabG가 본 발명에 포함된다. 예를 들어, GenBank 접근번호 JN377744 (Klebsiella pneumoniae), 접근번호 NC_013508(Edwardsiella tarda), 접근번호 A6RW62(Botryotinia fuckeliana), 접근번호 NC_014378(Acetohalobium arabaticum) 및 접근번호 JH417870(Yokenella regensburgei)에 개시된 wabG가 본 발명에서 불활성화 대상이 될 수 있다.The wabG to be inactivated was found and identified in various Klebsiella . In the following examples, wabG of Kepsiella annumi of the first sequence of SEQ ID NO: 2 is exemplified, but various wabGs are included in the present invention. For example, GenBank accession number JN377744 ( Klebsiella pneumoniae ), Accession No. NC_013508 ( Edwardsiella tarda ), accession number A6RW62 ( Botryotinia fuckeliana), access number NC_014378 (Acetohalobium arabaticum) and access number JH417870 (Yokenella The wabG disclosed regensburgei) may be inactivated in the subject invention.
본 명세서에서 wabG를 언급하면서 사용되는 용어, “불활성화(inactivation)”란 유전자의 전사 또는 해독, 유전자 산물의 활성의 손상(impairment)을 초래하는 wabG의 지놈 열상에서의 변형(modifications)을 의미한다. 이런 유전자 변형은 wabG 코딩 서열의 불활성화뿐만 아니라 이의 프로모터의 불활성화도 포함될 수 있다. 효모 지놈 상에서 목적한 유전자만의 특이적 불활성화는 코딩하는 유전자의 전체 또는 하나 이상의 부분 영역에서 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 통하여 돌연변이시킴으로서 가능하다. 예들 들어, 유전자의 결실 및 유전자로의 이형 서열(heterogenous sequence)의 삽입은 유전자의 절단(truncation), 넌센스 돌연변이(nonsense mutation), 프레임쉬프트 돌연변이(frameshift mutation), 미스센스 돌연변이(missense mutation) 등을 초래할 수 있다. 이러한 유전자의 특이적 불활성화는 당 분야에서 확립된 방법을 통하여 수행할 수 있다.The term " inactivation " as used herein in reference to wabG refers to modifications in the genomic lobes of wabG that result in transcription or translation of the gene or impairment of activity of the gene product . Such genetic modification may include not only inactivation of the wabG coding sequence but also inactivation of its promoter. The specific inactivation of only the gene of interest in the yeast genome is possible by mutation through substitution, insertion, deletion, or a combination thereof in all or at least one subdomain of the coding gene. For example, deletion of a gene and insertion of a heterogenous sequence into a gene can be accomplished by truncation of a gene, nonsense mutation, frameshift mutation, missense mutation, etc. . Specific deactivation of these genes can be accomplished through methods established in the art.
본 명세서에서 wabG를 언급하면서 사용되는 용어, “결실(deletion)”은 wabG의 기능을 상실케 하는 모든 결실 변이를 포함하는 의미를 갖는다. 예를 들어, wabG 유전자의 결실은 wabG 코딩 서열의 부분 결실 또는 전체 결실을 모두 포함한다.The term " deletion " as used herein in reference to wabG has the meaning of including all deletion mutations that disrupt the function of wabG . For example, deletion of the wabG gene includes both partial deletion or complete deletion of the wabG coding sequence.
이러한 wabG 코딩 서열의 결실은 당업계에 공지된 다양한 변이유발(mutagenesis) 방법을 통하여 실시할 수 있다. 예컨대, wabG 코딩 서열의 결실은 PCR 돌연변이 유발법 및 카세트 돌연변이 유발법으로 실시할 수 있다(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)).Deletion of such wabG coding sequences can be accomplished through a variety of mutagenesis methods known in the art. For example, deletion of the wabG coding sequence can be carried out by PCR mutagenesis and cassette mutagenesis (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual , 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)).
바람직하게는, 상기 크렙시엘라는 크렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniase), 크렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 크렙시엘라 그래눌로마티스(Klebsiella granulomatis) 또는 크렙시엘라 테리제나(Klebsiella terigena), 보다 바람직하게는, 크렙시엘라 뉴모니에 또는 크렙시엘라 옥시토카이고, 보다 더 바람직하게는, 크렙시엘라 뉴모니에이다.Preferably, the Klebsiella is named Klebsiella < RTI ID = 0.0 > pneumonia , Klebsiella < RTI ID = 0.0 > oxytoca), keurep when Yes in Ella clematis (Klebsiella granulomatis) or keurep when Ella Terry agent or press (Klebsiella terigena , more preferably, Klebsiella pneumoniae, or Klebsiella oxytocar , and even more preferably Klebsiella pneumoniae.
바람직하게는, wabG 유전자를 불활성화한 크렙시엘라 변이 균주는 캡슐 폴리사카라이드(capsule polysaccharide)가 없다.Preferably, the Klebsiella mutant strain inactivating the wabG gene lacks a capsule polysaccharide.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 wabG 유전자가 결실된 크렙시엘라 변이 균주는 크렙시엘라 야생형과 비교하여, 군집 형태가 균일하지 않고 캡슐 폴리사카라이드가 결실된다.According to a preferred embodiment of the present invention, the Klebsiella mutant strain in which the wabG gene of the present invention is deleted has a less uniform cluster structure and deletion of the capsular polysaccharide as compared with the Klebsiella wild type strain.
바람직하게는, 상기 wabG를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 불활성화된 크렙시엘라는 비병원성이다.
Preferably, the nucleotide sequence encoding the wabG is non-pathogenic, called inactivated Klebsiella.
단계 (b): 재조합 벡터의 제조 Step (b): Preparation of recombinant vector
본 발명의 meso-2,3-부탄다이올을 제조하기 위한 두 번째 단계로, 크렙시엘라의 아세토락테이트 디카르복실라아제(acetolactate decarboxylase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 아세토락테이트 신타아제(acetolactate synthase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 발현 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조한다.Two acetolactate decarboxylase nucleotide sequence and acetolactate synthase encoding (acetolactate decarboxylase) in a second step, when keurep Ella for the manufacture of a mes o-2,3- butane diol according to the invention ( acetolactate synthase) is inserted into an expression vector to prepare a recombinant vector.
본 발명에서 크렙시엘라에 도입하고자 하는 효소는 아세토락테이트 디카르복실라아제 및 아세토락테이트 신타아제이다. 바람직하게는, 상기 아세토락테이트 디카르복실라아제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제2서열이고, 상기 아세토락테이트 신타아제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제3서열이다.The enzymes to be introduced into Klebsiella in the present invention are acetolactate decarboxylase and acetolactate synthase. Preferably, the nucleotide sequence encoding the acetolactate decarboxylase is SEQ ID NO: 2, and the nucleotide sequence encoding the acetolactate synthase is SEQ ID NO: 3.
본 발명에서 이용되는 뉴클레오타이드 서열은 상기 언급된 서열 이외에 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl . Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio . 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res . 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl . BioSci . 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol . 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol . Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.The nucleotide sequence used in the present invention is interpreted to include a nucleotide sequence that exhibits substantial identity to the nucleotide sequence in addition to the above-mentioned sequence. The above substantial identity is determined by aligning the nucleotide sequence of the present invention with any other sequence as much as possible and analyzing the aligned sequence using algorithms commonly used in the art to obtain a minimum of 80% Homology, more preferably at least 90% homology, and most preferably at least 95% homology. Alignment methods for sequence comparison are well known in the art. Various methods and algorithms for alignment are described by Smith and Waterman, Adv . Appl . Math. 2: 482 (1981) ; Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio . 48: 443 (1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31 (1988); Higgins and Sharp, Gene 73: 237-44 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-3 (1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res . 16: 10881-90 (1988); Huang et al., Comp. Appl . BioSci . 8: 155-65 (1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol . 24: 307-31 (1994). The NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol . Biol. 215: 403-10 (1990)) is accessible from National Center for Biological Information (NBCI) It can be used in conjunction with sequence analysis programs such as blastx, tblastn and tblastx. BLSAT is available at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. A method for comparing sequence homology using this program can be found at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html.
상기 유전자들은 발현 벡터 내부에 도입되어 대장균에서 발현되게 된다. 본 명세서에 있어서, 용어 "발현 벡터"는 발현 벡터의 전사에 제공되는 추가단편에 작동가능하게 연결된 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 그와 같은 추가단편은 프로모터 및 종료암호 서열을 포함한다. 발현 벡터는 하나 이상의 복제 개시점, 하나 이상의 선택마커, 폴리아데닐화 신호 등을 또한 포함한다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 또는 둘 다의 요소를 함유한다.The genes are introduced into the expression vector and expressed in E. coli. As used herein, the term "expression vector" is a linear or circular DNA molecule consisting of a fragment encoding a polypeptide of interest operably linked to an additional fragment provided in the transcription of the expression vector. Such additional fragments include promoter and termination coding sequences. The expression vector also includes at least one replication origin, at least one selection marker, a polyadenylation signal, and the like. Expression vectors are generally derived from plasmid or viral DNA, or contain both elements.
본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. The vector system of the present invention can be constructed through various methods known in the art, and specific methods for this are disclosed in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) This document is incorporated herein by reference.
본 발명의 meso-2,3-부탄다이올의 제조에 관여하는 효소들을 코딩하는 각각의 뉴클레오타이드 서열들은 발현 조절서열에 작동가능하게 연결되어 발현 벡터 내에 삽입될 수 있다. 상기에서 '작동가능하게 연결된다(operably linked to)'는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 또한, '발현 조절 서열(expression control sequence)'이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 개시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.Each nucleotide sequence encoding enzymes involved in the production of the meso -2,3-butanediol of the present invention can be inserted into an expression vector operably linked to an expression control sequence. The term 'operably linked to' as used herein means that one nucleic acid fragment is combined with another nucleic acid fragment so that its function or expression is affected by other nucleic acid fragments. Also, an " expression control sequence " means a DNA sequence that regulates the expression of a nucleic acid sequence operably linked to a particular host cell. Such regulatory sequences include promoters for initiating transcription, any operator sequences for regulating transcription, sequences encoding suitable mRNA ribosome binding sites, and sequences controlling the termination of transcription and translation.
본 발명의 벡터는 전형적으로 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli(예, HB101, BL21, DH5α 등)가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다. The vector of the present invention can typically be constructed as a vector for expression. When the vector of the present invention is an expression vector and a prokaryotic cell is used as a host, a strong promoter capable of promoting transcription (such as a tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pL 貫 promoter, pR 貫 promoter, rac5 Promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter, and T7 promoter), a ribosome binding site for initiation of detoxification, and a transcription / translation termination sequence. Promoter and operator site of the E. coli tryptophan biosynthetic pathway (Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158: 1018-1024 (1984)) when E. coli (e.g. HB101, BL21, ) And the left promoter of phage lambda (pL lambda promoter, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14: 399-445 (1980)).
한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pUC18, pTrc99A, pSTV28, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pET22b, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUCP19 등), 파지(예: λgt4?λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나, 바람직하게는 pUC18를 개량하여 사용한다.The vectors that can be used in the present invention include plasmids such as pUC18, pTrc99A, pSTV28, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8 / 9, pUC6, pBD9, pHC79 , such as pIJ61, pLAFR1, pHV14, pET22b, pGEX series, pET series and pUCP19), phage (such as λgt4? B,? -charon,?? z1 and M13) However, it is preferable to use pUC18 in an improved manner.
본 발명의 발현 벡터는 프로모터서열 및 발현 대상 유전자(구조 유전자)의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기서열들이 5'-3' 순서대로 연결되는 것이 바람직하다.The expression vector of the present invention includes the promoter sequence and the nucleotide sequence of the gene to be expressed (structural gene), and it is preferable that the sequences are linked in the order of 5'-3 '.
바람직하게는, 상기 발현 벡터는 lac 프로모터 서열, 아세토락테이트 디카르복실라아제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 아세토락테이트 신타아제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 작동적으로(operatively) 결합된다.Preferably, the expression vector is operatively linked to a la c promoter sequence, a nucleotide sequence encoding acetolactate decarboxylase, and a nucleotide sequence encoding acetolactate synthase.
한편, 본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.On the other hand, the vector of the present invention includes, as a selection marker, an antibiotic resistance gene commonly used in the art, for example, ampicillin, gentamicin, carbinicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, And resistance genes for tetracycline.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 사용된 선택표지는 카나마이신이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the selectable marker used in the present invention is kanamycin.
본 발명의 벡터는 아세토락테이트 디카르복실라아제 유전자 및 아세토락테이트 신타아제 유전자가 효소 과발현 기능을 포함하여 최소한의 길이를 가지도록 RBS(Ribosomal binding site) 및 효소발현에 꼭 필요한 부분을 포함하는 염기서열만을 서열로 정하여 삽입시키는 것이 숙주세포의 대사부담(metabolic burden)을 줄이는 측면에서 바람직하며, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 pUC18에 카나마이신 내성 유전자를 도입하여 사용하였다.
The vector of the present invention includes a ribosomal binding site (RBS) and an essential part for enzyme expression so that the acetolactate decarboxylase gene and the acetolactate synthase gene have an enzyme over-expression function and have a minimum length It is preferable that only the nucleotide sequence be inserted as a sequence in terms of reducing the metabolic burden of the host cell. According to a preferred embodiment of the present invention, the present invention uses a kanamycin resistance gene introduced into pUC18.
단계 (c): 형질전환 크렙시엘라의 제조 Step (c): Preparation of transformed Krebsiella
이어, 상기 단계 (a)의 wabG를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 불활성화된 크렙시엘라에 상기 단계 (b)의 재조합 벡터를 도입하여 형질전환 크렙시엘라를 제조한다.Then, the recombinant vector of step (b) is introduced into Klebsiella in which the nucleotide sequence encoding wabG of step (a) is inactivated to prepare a transformed Klebsiella.
본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, CaCl2 방법(Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac. Sci . USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol . Biol ., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic . Acids Res ., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다.Methods for delivering the vector of the present invention into a host cell can be carried out using a CaCl 2 method (Cohen, SN et al., Proc . Natl . Acac. Sci . USA , 9: 2110-2114 SN et al, Proc Natl Acac Sci USA, 9: 2110-2114 (1973); and Hanahan, D., J. Mol Biol, 166:....... 557-580 (1983)) and electroporation method (Dower, WJ et al., Nucleic Acids Res . , 16: 6127-6145 (1988)).
본 발명의 아세토락테이트 디카르복실라아제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 알코올 디히드로제나아제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환 될 수 있는 크렙시엘라은, wabG를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 불활성화된 크렙시엘라 뉴모니에, wabG를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 불활성화된 크렙시엘라 옥시토카, wabG를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 불활성화된 크렙시엘라 그래눌로마티스 또는 wabG를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 불활성화된 크렙시엘라 테리제나를 이용할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
Klebsiella, which can be transformed by a recombinant vector comprising a nucleotide sequence encoding an acetolactate decarboxylase of the present invention and a nucleotide sequence encoding an alcohol dihydrogenase, comprises a nucleotide sequence encoding wabG Inactivated Klebsiella lunomycetes include Klebsiella oxytoca, in which the nucleotide sequence encoding wabG is inactivated, Klebsiella granulomatis, in which the nucleotide sequence encoding wabG is inactivated, or the nucleotide sequence encoding wabG But is not limited to, an inactivated Klebsiella terrigenase.
단계 (d): 2,3- 부탄다이올의 제조 Step (d): Preparation of 2,3- butanediol
본 발명의 형질전환 크렙시엘라를 배양배지에서 배양하여 2,3-부탄다이올을 제조한다.The transformed Krepsiella of the present invention is cultured in a culture medium to prepare 2,3-butanediol.
본 발명의 주요한 특징 중 하나는 상기 배양배지는 탄소원, 질소원 및 에너지원을 포함하며, 상기 탄소원은 카사바(cassava), 당밀(molasses) 및 글리세롤로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 탄소원이다.One of the main characteristics of the present invention is that the culture medium comprises a carbon source, a nitrogen source and an energy source, and the carbon source is at least one carbon source selected from the group consisting of cassava, molasses and glycerol.
바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 배양배지는 탄소원으로 카사바, 당및 또는 글리세롤을 포함하고, 보다 바람직하게는, 10-200 g/l 탄소원을 포함한다.. 크렙시엘라 뉴모니에는 대사 경로가 잘 발달된 균주로 혐기성 상태 및 호기성 상태일 때 각각 다른 경로가 활성화된다. 혐기성 상태에서 배양할 때는 글리세롤로부터 3-HPA(3-Hydroxypro;ionaldehyde)를 거쳐 1,3-PDO(1,3-propanediol)를 주로 생산하며, 호기성 상태에서는 피루브산을 거쳐 2,3-BDO를 주로 생산한다. 이것은 글루코오스를 탄소원으로 배양했을 때, 1,3-PDO를 거의 생산하지 않는 것과 가장 크게 구분되는 차이점이라 할 수 있다.
According to a preferred embodiment, the culture medium of the invention comprises cassava, sugar and / or glycerol, more preferably 10-200 g / l carbon source as the carbon source. Klebsiella pneumoniae has a metabolic pathway Well - developed strains, different pathways are activated in anaerobic and aerobic conditions. When cultured under anaerobic conditions, 1,3-PDO (1,3-propanediol) is mainly produced from glycerol via 3-HPA (3-Hydroxypro), and 2,3-BDO is produced through pyruvic acid Production. This is the most significant difference from the fact that when glucose is cultured as a carbon source, it hardly produces 1,3-PDO.
단계 (e): 2,3- 부탄다이올의 수득 Step (e): yield of 2,3-butane diol
마지막으로, 본 발명의 형질전환 대장균을 배양하여 제조된 meso-2,3-부탄다이올을 수득한다.Finally, a meso -2,3-butanediol prepared by culturing the transformed E. coli of the present invention is obtained.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 meso-부탄다이올 제조방법을 통해 제조되는 2,3-부탄다이올 수율은 0.2-0.4이다.
According to a preferred embodiment of the present invention, the yield of 2,3-butanediol prepared by the meso -butane diol production process of the present invention is 0.2-0.4.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 제조된 2,3-부탄다이올을 제공한다.
According to another aspect of the present invention there is provided a 2,3-butanediol produced by the process of the present invention.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다: The features and advantages of the present invention are summarized as follows:
(a) 본 발명은 비병원성 크렙시엘라(Klebsiella)를 제조하고, 아세토락테이트 카르복실라아제 및 아세토락테이트 신타아제를 크렙시엘라에 도입하여 형질전환 크렙시엘라에 의한 meso-2,3-부탄다이올의 생산을 가능하게 하였다.(a) Preparation of non-pathogenic Klebsiella , introduction of acetolactate carboxylase and acetolactate synthase into Klebsiella , production of meso -2,3- Butanediol. ≪ / RTI >
(b) 본 발명의 재조합 대장균은 산업용 탄소원을 포함하는 배양배지에 배양하여 보다 경제적인 2,3-부탄다이올의 생산이 가능하며, 비병원성 크렙시엘라를 통해 보다 안전하게 이용할 수 있다.(b) The recombinant E. coli of the present invention can be produced in a culture medium containing an industrial carbon source to produce more economical 2,3-butanediol and can be used more safely through non-pathogenic Klebsiella.
(c) 본 발명은 화학공업에 유용한 기초가 될 플랫폼용 화합물인 2,3-부탄다이올을 생물학적 제조방법을 통해 대량 생산하는 것은 친환경적이며 경제적으로도 큰 강점을 갖출 수 있을 것으로 기대된다.
(c) It is expected that mass production of 2,3-butanediol, which is a platform compound which will be a useful base in the chemical industry, through a biological production method will have great advantages in terms of environmentally and economically.
도 1은 wabG 유전자의 제거 과정을 나타낸 도식도이다.
도 2는 크렙시엘라 뉴모니에 KCTC 2242의 wabG 유전자가 제거된 것을 전기영동을 통해 확인한 결과이다.
도 3은 크렙시엘라의 2,3-부탄다이올(2,3-butanediol; 2,3-BDO) 생산경로를 나타낸다.
도 4는 크렙시엘라의 기질에 따른 대사 경로를 나타낸다.
도 5는 pUC18 벡터에 카나마이신 유전자를 도입한 벡터 지도를 나타낸다. 카나마이신 유전자가 도입된 벡터를 pUC18K로 명명하였다.
도 6은 pUK18C 벡터에 budB 및 budA 유전자를 도입한 재조합 벡터의 지도를 나타낸다. pSB4로 명명하였다.
도 7은 크렙시엘라 뉴모니에 KCTC 2242 wabG의 글리세롤 원액을 탄소원으로 첨가하여 비연속식 배양한 결과를 보여준다.
도 8은 크렙시엘라 뉴모니에 KCTC 2242 wabG::pUC18K::budB::budA의 글리세롤 원액을 탄소원으로 첨가하여 비연속식 배양한 결과를 보여준다.
도 9은 크렙시엘라 뉴모니에 KCTC 2242 wabG의 당밀을 탄소원으로 첨가하여 비연속식 배양한 결과를 보여준다.
도 10은 크렙시엘라 뉴모니에 KCTC 2242 wabG의 카바사를 탄소원으로 첨가하여 비연속식 배양한 결과를 보여준다.
도 11은 80 g/L 글리세롤 원액을 탄소원으로 첨가하여 크렙시엘라 뉴모니에 KCTC 2242 wabG를 비연속식 배양한 발효 결과를 보여준다.
도 12은 80 g/L 글리세롤 원액을 탄소원으로 첨가하여 크렙시엘라 뉴모니에 KCTC 2242wabG::pUC18K::budB::budA를 비연속식 배양한 발효 결과를 보여준다.FIG. 1 is a schematic diagram showing the removal process of the wabG gene.
FIG. 2 shows the result of electrophoresis of
3 shows the production route of 2,3-butanediol (2,3-BDO) by Krebshiella.
Figure 4 shows the metabolic pathway according to the substrate of Krebs.
5 shows a vector map obtained by introducing the kanamycin gene into the pUC18 vector. The vector into which the kanamycin gene was introduced was named pUC18K.
6 shows a map of a recombinant vector into which the budB and budA genes are introduced into the pUK18C vector. pSB4.
Fig. 7 shows the result of culturing the
Figure 8 shows that
Figure 9 shows that
Figure 10 shows that
11 shows the result of fermentation in which
12 shows the result of fermentation of
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .
실시예 1: Example 1: wabGwabG 유전자 결실 Gene deletion
선형 유전자 제작Linear gene production
양쪽에 34 bp(base pair)의 FRT(Flip-Recombinase Targets) 염기서열 및 20 bp의 클로람페니콜의 염기서열을 갖는 프라이머(표 1) 및 클로람페니콜 저항성 염기서열을 갖는 pKOV 플라스미드를 주형으로 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하여 FRT-클로람페니콜-FRT를 갖는 카세트(FCF)를 제작하였다. 클로람페니콜은 상동재조합이 제대로 이루어졌는지 확인하기 위한 항생제저항성 단백질이고, FRT는 목표 유전자를 불활성화(knock-out) 시킨 후 클로람페니콜 유전자를 결실 해주는 역할을 한다(도 1). FCF를 제작하기 위한 중합효소연쇄반응 조건은 먼저 95℃에서 5분 반응 후 95℃ 30초, 66℃에서 55초 및 72℃에서 60초 반응을 25회 반복 하였다. 891 bp의 염기서열을 갖는 FCF를 T-벡터에 삽입 후 wabG의 시작 부분과 끝 부분에 상보적인 각각 50 bp 염기서열과, FRT와 상동 하는 염기서열을 가진 프라이머(표 1)로 중합효소 연쇄 반응을 하여 wabG 유전자 결실에 필요한 선형 유전자(WFCFW)를 제작하였다. 반응 조건은 95℃에서 5분 반응 후 95℃에서 30초, 65.2℃에서 60초 및 72℃에서 60초 반응을 25번 반복하였다. 얻어진 WFCFW는 991 bp의 염기서열을 갖는다.Primers (Table 1) having a base sequence of FRP (Flip-Recombinase Targets) of 34 bp (base pair) and chloramphenicol of 20 bp on both sides and a pKOV plasmid having a chloramphenicol resistant base sequence were used as a template for polymerase chain reaction PCR) was performed to prepare a cassette (FCF) having FRT-chloramphenicol-FRT. Chloramphenicol is an antibiotic resistance protein to confirm homologous recombination, and FRT knock-out the target gene and then deletion of the chloramphenicol gene (FIG. 1). The polymerase chain reaction conditions for preparing FCF were as follows: 95 ° C for 5 minutes, followed by 95 ° C for 30 seconds, 66 ° C for 55 seconds, and 72 ° C for 60 seconds. After insertion of the FCF having the nucleotide sequence of 891 bp into the T-vector, PCR was carried out using a primer (Table 1) having a 50 bp base sequence complementary to the start and end portions of wabG and a base sequence homologous to FRT (WFCFW) for the deletion of the wabG gene. The reaction conditions were 95 ° C for 5 minutes, followed by 95 ° C for 30 seconds, 65.2 ° C for 60 seconds, and 72 ° C for 60 seconds. The obtained WFCFW has a base sequence of 991 bp.
상동재조합의Homologous recombination 효율을 높이기 위한 To increase efficiency 레드Red 람다Lambda (( RedRed lambdalambda ) 재조합) Recombination
세포 내부로 유입된 선형 유전자의 분해를 방지하고 상동재조합 효율을 높여주는 알파, 베타 및 감마 단백질을 발현하는 플라스미드인 pRedET를 사용하였다(Daiguan Yu, Hilary M. Ellis, E-Chiang Lee, Nancy A. Jenkins, Neal G. Copeland, and Donald L. Court. PNAS May 23, 2000 vol. 97 no. 11 5978-5983). 이러한 pRedET 플라스미드를 이용하여 돌연변이를 제조하기 위해 야생 크렙시엘라에 pRedET를 형질전환 하였다. 이를 위해서 크렙시엘라 뉴모니에(klebsiella pneumoniae , KCTC 2242)를 37℃ 및 광학 밀도(600 nm) 에서 0.2-0.3이 될 때 까지 배양하였고, 액체 LB 배지의 총량에 0.7 mM이 되도록 에틸렌디아민사아세트산(EDTA)을 첨가하였다. 에틸렌디아민사아세트산을 첨가할 경우, 전기천공법 효율이 높아지게 된다(Fournet-Fayard, S., B. joly, and C.Forestier J. Microbiol Meth, 1995. 24: p.49-54). 배양한 크렙시엘라 뉴모니에를 10% 글리세롤이 포함되어있는 차가운 멸균수로 3번 세척하여 불순물을 제거하고 마지막 세척은 40 ㎕의 차가운 멸균수에 담겨 있는 크렙시엘라 뉴모니에에 150 ng pRedET를 혼합하여 냉각된 전기천공법용 큐벳에 넣은 후 1.8 ㎸, 5 msec의 펄스를 주었다. 30℃에서 한 시간 동안 배양 후 테트라사이클린(3 ㎍/㎖)을 포함하는 고체 LB 배지에 도말하여 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 30℃의 테트라사이클린을 포함하는 LB 배지에 배양하는 이유는 pRedET 플라스미드가 테트라사이클린 저항성을 갖으며 30℃에서 복제되기 때문이다. 다음으로 알파, 베타 및 감마 단백질을 발현하기 위해 pRedET 플라스미드로 형질전환된 크렙시엘라를 액체 LB 배지에 넣고 600 nm 광학 밀도가 0.2-0.3 값이 될 때까지 배양하였다. 이때 액체 LB 배지의 총량에 0.5%에 해당하는 L-아라비노스(L-arbinose)를 첨가하여 주었다. 그 후 pRedET로 형질전환 때와 마찬가지의 과정으로 150 ng의 WFCFW와 혼합한 후 상기 언급한 조건으로 전기 천공법을 실시하였다. 37℃에서 3시간 동안 배양 후 클로람페니콜(20 ㎍/㎖)을 포함하는 고체 LB 배지에 도말하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 클로람페니콜 배지에서 자란 크렙시엘라 뉴모니에를 다시 클로람페니콜(20 ㎍/㎖)을 포함하는 액체 배지에 배양 후 지노믹 DNA 추출 키트를 사용하여 지노믹 DNA 추출하고 중합효소 연쇄 반응을 통해 돌연변이를 확인하였다.
PRedET, a plasmid expressing alpha, beta and gamma proteins, which prevents degradation of the linear gene introduced into the cell and enhances homologous recombination efficiency, was used (Daiguan Yu, Hilary M. Ellis, E-Chiang Lee, Nancy A. Jenkins, Neal G. Copeland, and Donald L. Court, PNAS May 23, 2000 vol 97, No. 11, 5978-5983). These pRedET plasmids were used to transform pRedET into wild Klebsiella to produce mutants. For this purpose, Klebsiella pneumoniae , KCTC 2242) were cultured at 37 ° C and optical density (600 nm) until the concentration reached 0.2-0.3, and ethylendiamine acetic acid (EDTA) was added to the total amount of liquid LB medium to 0.7 mM. When ethylenediamine acetic acid is added, the efficiency of the electroporation method becomes high (Fournet-Fayard, S., B. joly, and C. Forestier J. Microbiol Meth, 1995. 24: p.49-54). The cultured Klebsiella pneumoniae was washed three times with cold sterilized water containing 10% glycerol to remove impurities. To the final wash, Klebsiella pneumoniae in cold sterilized water was added with 150 ng pRedET Were mixed and placed in a cooled cuvette for electroporation, and 1.8 kV and 5 msec pulses were applied. After culturing at 30 DEG C for one hour, the cells were plated on solid LB medium containing tetracycline (3 mu g / mL) and cultured at 30 DEG C for 16 hours. The reason for culturing in LB medium containing tetracycline at 30 ° C is because the pRedET plasmid has tetracycline resistance and is replicated at 30 ° C. Next, Krepsiella transformed with pRedET plasmid was added to liquid LB medium to express alpha, beta and gamma proteins and cultured until the optical density at 600 nm reached a value of 0.2-0.3. At this time, L-arabinose (L-arbinose) corresponding to 0.5% was added to the total amount of the liquid LB medium. Then, 150 ng of WFCFW was mixed with pRedET in the same manner as in the transformation, and electroporation was performed under the above conditions. After culturing at 37 占 폚 for 3 hours, the cells were plated on solid LB medium containing chloramphenicol (20 占 퐂 / ml) and cultured at 37 占 폚 for 16 hours. After culturing in a liquid medium containing chloramphenicol (20 μg / ml), chloramphenicol grown in chloramphenicol medium was again subjected to genomic DNA extraction using a genomic DNA extraction kit and mutagenesis was confirmed by polymerase chain reaction .
FRTFRT -클로람페니콜-- chloramphenicol - FRTFRT 의 결실Fruit of
크렙시엘라 뉴모니에 돌연변이에 삽입되어있는 FRT-클로람페니콜-FRT의 결실을 위해 플립파아제 재조합 효소를 발현 하는 707-Flpe 플라스미드(Thomas Schlake and Jurgen Bode' Biochemistry 1994, 33, 12746-12751)를 사용하였다. 크렙시엘라 뉴모니에에 pRedET을 형질 전환했던 방법과 동일하게 707-Flpe 플라스미드 및 WFCFW가 삽입 된 크렙시엘라 뉴모니에를 형질전환 하고 30℃에서 한 시간 배양 후 테트라사이클린(3 ㎍/㎖)을 포함하는 고체 배지에 도말 하였다. 707-Flpe는 30℃에서 복제가 되기 때문에 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 이렇게 자란 크렙시엘라 뉴모니에 돌연변이의 군집을 따서 항생제가 첨가되지 않은 1 ㎖ 액체 LB 배지에 접종 후 3시간 동안 배양하였다. 배양한 크렙시엘라 뉴모니에 돌연변이을 다시 37℃에서 16시간 동안 배양 하는데 이는 플립파아제 재조합 효소가 37℃에서 발현이 되기 때문이다. 배양한 크렙시엘라 뉴모니에 돌연변이의 일부를 클로람페니콜이 들어있는 액체 LB 배지에 배양 후 자라지 않는 것을 확인하고 지노믹 DNA 추출 키트를 이용하여 지노믹 DNA를 추출하였다. 중합효소연쇄반응을 통해 클로람페니콜 저항성 유전자가 결실 되었는지 확인 하였다(도 2).
A 707-Flpe plasmid (Thomas Schlake and Jurgen Bode 'Biochemistry 1994, 33, 12746-12751) expressing a flippase recombinant enzyme was used for the deletion of FRT-chloramphenicol-FRT inserted in mutation in Klebsiella pneumoniae Respectively. After transforming pRedET with Krebsiella nymoniee, Krebsiella pneumoniae inserted with the 707-Flpe plasmid and WFCFW was transformed and cultured at 30 ° C for one hour. Then, tetracycline (3 μg / ml) . ≪ / RTI > The 707-Flpe was cultured at 30 ° C for 16 hours because it replicates at 30 ° C. The mutant clones were grown in 1 ml of LB medium without antibiotics and incubated for 3 hours. The mutant is cultured again at 37 DEG C for 16 hours in the cultured Krepsiella nemonyi because the flippase recombinase is expressed at 37 < 0 > C. A portion of the mutation in the cultured Krebshiella pneumoniae was cultured in liquid LB medium containing chloramphenicol, and then it was confirmed that it did not grow, and genomic DNA was extracted using a genomic DNA extraction kit. The polymerase chain reaction confirmed the deletion of the chloramphenicol resistance gene (Fig. 2).
실시예Example 2: 2: budAbeha 유전자 및 Gene and budBbudB 유전자 도입 Gene introduction
실시예 1에 의해 제조된 크렙시엘라 뉴모니에 KCTC 2242 wabG의 발효를 통해 2,3-부탄다이올(BDO) 생산성이 가장 뛰어난 크렙시엘라 뉴모니에 KCTC 2242 wabG::pUC18K::budB::budA를 선정하였다. 표적 유전자들만 특이적으로 증폭하도록 제작된 프라이머(primer)를 사용하여 증폭하였다. 이 유전자들은 budA는 780 bp, budB는 1536bp의 크기로 증폭되었다. 각각의 중합효소연쇄반응은 통상적인 반응조건[10 mM Tris-HCl(pH9.0), 50 mM KCI, 0.1% 트리톤 X-100, 2 mM MgSO4, Taq DNA 중합효소(DaKaRa)] 하에서 95℃/5분(변성), 66℃/1분(어닐링), 72℃/1분(신장)로 1회 수행한 후, 95℃/1분(변성), 66℃/30초(어닐링) 및 72℃/1분(신장)로 30회 반복 수행하였다. 마지막 단계로 안정적인 신장을 위해 95℃/1분(변성), 66℃/1분(어닐링) 및 72℃/5분(신장) 반응하였다. 중합효소연쇄반응 후 증폭된 DNA는 0.8% 아가로즈 젤 상에서 확인 후 정제하여 T-vector 클로닝에 이용하였다. pGEM-T easy 벡터(DaKaRa, 일본)에 라이게이션을 수행하여 재조합 플라스미드인 pGEM-T::budA 및 pGEM-T::budB, pGEM-T::budA::budB를 제작하였다. 상기 재조합 플라스미드들은 대장균 (E. coli DH5a 컴피턴트 세포, RBS)에서 형질 전환하여 형질전환 균주를 제조하였다. 재조합 플라스미드인 pGEM-T::budA, pGEM-T::budB 및 pGEM-T::budA::budB를 대장균과 크렙시엘라의 셔틀 벡터인 pUC18K를 제한효소들로 37℃ 항온수조(water bath)에서 약 2시간 반응하였다. 여기서 사용한 pUC18K는 기존의 pET28a벡터에 카나마이신에 저항성을 갖는 유전자를 클로닝한 후 pUC18벡터에 삽입하여 제작하였다. 위의 열거한 제한효소들로 각각의 DNA 절편들을 절단한 뒤 pUC18K 벡터의 다중삽입부위(multicloning site)에 T4 라이게이즈 (Dakara)를 이용, 16℃에서 반응, 라이게이션을 하여 재조합 플라스미드를 완성하였다. 각 단계마다 삽입된 유전자의 삽입여부를 확인하기 위해 대장균 (E. coli DH5a competentcell, RBS)에 형질 전환 시킨 후 재조합 플라즈미드를 추출하여 이를 다시 원래 삽입부위의 제한효소로 처리하여 잘린 DNA 조작의 크기를 0.8% 아가로즈 젤 상에서 전기영동하여 비교하는 방법을 사용하였다. The
증폭된 산물을 제한효소들을 이용하여 pUC18K 벡터에 도입하여 pUC18K::budA::budB 제조하였다. budB는 피루브산을 아세토락테이트로 전환시키는 아세토락테이트 신타아제(acetolactate synthase)를 코딩하며, budA는 아세토락테이트를 아세토인으로 전환시키는 아세토락테이트 디카르복실라아제(acetolactate decarboxylase)를 코딩한다(도 3 내지 도 6).
The amplified product was introduced into pUC18K vector using restriction enzymes to prepare pUC18K :: budA :: budB . budB encodes acetolactate synthase, which converts pyruvic acid to acetolactate, and budA , which encodes acetolactate decarboxylase, which converts acetolactate to acetone ( 3 to 6).
실시예Example
3: 3:
탄소원별
현재 실험실에서 많이 사용하는 탄소원인 글루코오스(glucose)는 2,3-BDO(2,3-butanediol)을 생산하기에 고효율 기질이나 단가가 높아 경제성 측면에선 최적의 탄소원이라고 할 수 없다. 산업용 탄소원으로 사용하기 위해서는 단가가 저렴하면서도 높은 생산성이 가능해야한다. 산업용으로 많이 사용되는 탄소원으로 첫 번째는 글리세롤(glycerol)을 꼽을 수 있는데, 특히 글리세롤 원액(crude glycerol)의 경우에는 산업용 폐기물로 글루코오스는 물론이고 정제된 글리세롤보다도 저렴해 각광받는 탄소원이다. 크렙시엘라 뉴모니에는 글리세롤 대사경로가 잘 발달된 균주로 혐기성 상태 및 호기성 상태일 때 각각 다른 경로가 활성화된다. 혐기성 상태에서 배양할 때는 글리세롤로부터 3-HPA(3-Hydroxypropionaldehyde)를 거쳐 1,3-PDO(1,3-propanediol)를 주로 생산하며, 호기성 상태에서는 피루브산를 거쳐 2,3-BDO를 주로 생산한다. 이것은 글루코오스를 탄소원으로 배양했을 때 1,3-PDO를 거의 생산하지 않는 것과 가장 크게 구분되는 차이점이라 할 수 있다. 대장균의 경우에는 상대적으로 크렙시엘라보다 글리세롤 흡수 능력이 떨어지며, 주로 호기성 상태일 경우에 글리세롤 대사경로가 작동하고 혐기성 상태일 경우에는 pH를 낮춰주면 글리세롤 흡수는 가능하나 성장하는데 오랜 시간이 걸린다. 글리세롤 이외에도 전분질계 바이오매스인 카사바(cassava, Sigma Aldrich) 및 당질계 바이오매스인 당밀(molasses, GS 칼텍스)가 산업용 탄소원으로 사용이 가능하다. 카사바를 탄소원으로 이용하는 경우에는 글루코오스를 많이 함유하고 있어 글루코오스를 탄소원으로 이용했을 때 만큼의 2,3-BDO 생산이 가능하나 전분질계라 점도가 높아 많은 양을 넣고 발효를 진행하는데 어려움이 있으며, 당밀을 탄소원으로 이용하는 경우에는 2,3-BDO 생산수율이 글루코오스보다 떨어지며 유기산이 많이 생산되는 단점이 있다.
Glucose, which is a carbon source widely used in laboratories, is not an optimal carbon source in terms of economy because of high efficiency substrate and high unit cost to produce 2,3-butanediol. In order to be used as an industrial carbon source, it is necessary to have low productivity and high productivity. Glycerol is one of the most commonly used carbon sources for industrial use. In particular, crude glycerol is an industrial waste and is a carbon source that is cheaper than purified glycerol as well as glucose. Klebsiella pneumoniae is a well-developed glycerol metabolic pathway, and its pathway is activated when anaerobic and aerobic. When cultured under anaerobic conditions, 1,3-PDO (1,3-propanediol) is mainly produced from glycerol via 3-HPA (3-Hydroxypropionaldehyde) and 2,3-BDO is mainly produced through pyruvic acid in aerobic condition. This is the most significant difference from the fact that when glucose is cultured as a carbon source, it produces little 1,3-PDO. In the case of Escherichia coli, the glycerol absorption capacity is lower than that of Krebsiella. In the case of aerobic condition, the glycerol metabolic pathway operates. In the anaerobic state, if the pH is lowered, glycerol absorption is possible but it takes a long time to grow. In addition to glycerol, starchy biomass cassava (Sigma Aldrich) and carbohydrate biomass (molasses, GS Caltex) can be used as industrial carbon sources. When cassava is used as a carbon source, it contains a large amount of glucose, and 2,3-BDO can be produced as much as when glucose is used as a carbon source. However, since the viscosity of starchy base is high, it is difficult to carry out fermentation by adding a large amount of glucose. When used as a carbon source, the production yield of 2,3-BDO is lower than that of glucose and there is a disadvantage that many organic acids are produced.
탄소원의Carbonic 종류에 따른 2,3- However, BDOBDO 생산 production
크렙시엘라 뉴모니에 KCTC 2242 wabG::pUC18K::budB::budA에 대한 산업용 균주로서의 유용성을 확인하기 위하여 산업용 탄소원을 이용하여 발효실험을 수행했다. 발효실험의 배지 조성은 표 2과 같으며, 비연속식 배양법으로 5 L 발효기에 2 L의 배지 부피로 200 rpm, pH 5.5(고정) 조건에서 실시하였다. 첫 번째로 가격이 저렴하고 산업 공정에서 많이 배출되는 글리세롤 원액을 탄소원으로 이용하여 비연속식 배양을 진행하였다. 배지 조성과 배양 조건은 기존의 비연속식 배양와 동일하며 글리세롤 원액은 우선 시범적으로 40 g/L 첨가하였다. 생장은 O.D(Optical density) 600 ㎚에서 12시간 동안 12-14 정도로 하였고, 이는 글루코오스를 탄소원으로 할 때와 비슷한 수치이다. 발효 샘플을 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)로 분석한 결과는 도 7과 같이 12-18시간 안에 넣어준 탄소원을 모두 소모하였고 13-16 g/L 정도의 2,3-BDO를 생산하였다. 이는 수율로 환산하며 약 0.34-0.40 g/g에 해당하며 글루코오스를 탄소원으로 배양한 결과와 비슷한 경향성을 보인다. 또한 budA 및 budB 유전자가 삽입된 재조합 벡터를 형질전환하지 않은 균주와 형질전환한 균주를 비교해 볼 때 글루코오스를 탄소원으로 사용하였을 때와 유사하게 벡터를 삽입한 균주의 2,3-BDO 생산성이 더 향상되었다. 이 결과를 통해 개량 균주가 산업용 균주로서 산업용 탄소원을 이용하여 2,3-BDO를 생산할 수 있음이 확인되었다.Fermentation experiments were carried out using industrial carbon sources to confirm the utility of
다음으로 당질계 바이오매스인 당밀을 탄소원으로 첨가하여 크렙시엘라 뉴모니에 KCTC 2242 wabG::pUC18K::budB::budA의 발효 실험을 진행하였다. 우선적으로 당밀을 통해 2,3-BDO 생산이 가능한지를 알아보기 위하여 크렙시엘라 뉴모니에 KCTC 2242 wabG를 사용하였다. 실험은 비연속식 배양으로 진행하였고, 조건은 기재된 방법과 동일하다. 실험 결과 당밀은 48시간 동안 25 g/L 정도의 탄소원을 소모하고 8 g/L 2,3-BDO를 생산했으며, 수율은 0.32% 정도였다(도 9). 이는 글리세롤 원액을 탄소원으로 첨가한 경우와 비교하면 수율은 비슷하나 글리세롤 원액의 경우는 12-18시간 동안 첨가된 탄소원을 전부 소모하고 2,3-BDO를 생산한 반면 당밀는 48시간 동안 첨가된 탄소원의 절반만을 소모하였다. 마지막으로 전분질계 바이오매스인 카바사를 탄소원으로 하여 동일한 조건에서 발효를 진행하였다. 발효 결과 카바사는 48시간 동안 17 g/L 정도의 탄소원을 소모하고 4 g/L 2,3-BDO를 생산했으며, 수율은 0.24% 정도였다(도 10). 이 결과는 당밀보다 생산성이나 수율 측면에서 비교적 낮았다. 따라서 경제성 측면에서 봤을 때 빠른 시간 동안 소모할 수 있는 글리세롤 원액이 크렙시엘라 뉴모니에 KCTC 2242 wabG::pUC18K::budB::budA의 발효에는 당밀이나 카바사보다 더 효율적이라 할 수 있다.
Next, fermentation experiments of
크렙시엘라
다양한 산업용 탄소원을 이용하여 크렙시엘라 뉴모니에 KCTC 2242 wabG::pUC18K::budB::budA의 발효를 진행한 결과 글리세롤 원액이 글루코오스을 탄소원으로 이용한 경우의 2,3-BDO 생산 효율과 유사한 효율을 나타냄을 확인하였다. 2,3-BDO 생산성을 높이기 위해 글리세롤 원액의 농도를 80 g/L로 증가시켜 동일한 균주로 같은 조건에서 비연속식 배양을 진행하고 생산성 증가 여부를 확인하였다(도 11 및 도 12). 실험 결과는 HPLC로 분석하였고, 분석결과 넣어준 탄소원은 42-48시간 사이에 모두 소모되었고, 2,3-BDO 생산량은 31-34 g/L로 수율은 0.38-0.42% 정도였다. 이는 글루코오스를 넣고 발효를 진행했을 때와 유사한 정도의 생산성이며 글리세롤 원액 80 g/L가 생장에 저해를 일으키지 않으며 이에 따라 생산량이 증가됐음을 확인했다. 이를 통해 더 많은 양의 글리세롤 원액을 이용하여 발효를 진행하여 최대 생산량을 확인하고 산업용 탄소원을 이용한 배양 조건을 최적화 할 예정이다.
As a result of the fermentation of
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.
<110> Industry-University Cooperation Foundation Sogang University <120> Method for Preparing 2,3-butanediol from Commercial carbon source by Transformed Klebsiella pneumoniae <130> PN120261 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1128 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae wabG <400> 1 atgagtaaat tcaggctggc tctggtgcgg cagaagtacc gcccggacgg cggcgcagaa 60 cggtttgtct cccgcgcgct ggaagccctc gacagcagtc atctgcaact gaacgtcatc 120 acccgcgaat ggcaggggcc ggtgaaaccg gactggcaga tccatatctg taacccacgt 180 aaatgggggc gcatcagccg cgagcgcggc tttgccaacg ccgcgcgcgc gctctggcag 240 cgcgagtcct tcgacctggt gcagagccat gaacgtattc ccggctgcga tctctaccgc 300 gctggcgatg gcgttcatcg ccgctggctg cagcagcgct cgcgcatttt accggcctgg 360 aaaagccgcc tgctgttcgc cgaccgttac caccgctacg tcatgcaggc ggagcgcgag 420 atgtatgaag actcacacct gcgcggggtg atctgcaacg ccgagatgat caagcgcgag 480 atcatcgaag actttggcct gccggcggag aagatccacg ttatttataa cgccattgat 540 aaccagcgct tcctgccgcc ggacgaagag acctttgccg ccttacgcgc caaatggcag 600 ctaccgctgc aggcgacctg cctgatctac gtcggctccg gctttgagcg caaggggctg 660 gcggcggcga tccgcgccat cgctcccacc gatcgctacc tgctggtggt cggcaaagat 720 aaggatcagc ctcgctatca ggcgctggcg aagagcctga actgtgaagc gcgggtgcgc 780 ttcttcggca tgcagtcgga gacattgccc ttctatcaaa tggccgatgg tctgttgctg 840 ccgaccctct acgatccgtt ccccaacgtc atcctcgagg caatggcctg cggtctgccg 900 gtgatcacca ctaccggctg cggcggggcg gagtttatcg tcgacggcca caacggttac 960 gtctgcgacg ctctggatat cccggcgcta cagcaggcgg taatggccct gcccgcgcgc 1020 gcgctgggct ccgcgcaagg cggtcacgcc cgcgagcgca ttatggcctg caccagcgag 1080 cgactctcaa cccagctgct ttctctttat caggatctgg tgaattaa 1128 <210> 2 <211> 780 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae budA <400> 2 atgaatcatt ctgctgaatg cacctgcgaa gagagtctat gcgaaaccct gcgggcgttt 60 tccgcgcagc atcccgagag cgtgctctat cagacatcgc tcatgagcgc cctgctgagc 120 ggggtttacg aaggcagcac caccatcgcc gacctgctga aacacggcga tttcggcctc 180 ggcaccttta atgagctgga cggggagctg atcgccttca gcagtcaggt ctatcagctg 240 cgcgccgacg gcagcgcgcg caaagcccag ccggagcaga aaacgccgtt cgcggtgatg 300 acctggttcc agccgcagta ccggaaaacc tttgaccatc cggtgagccg ccagcagctg 360 cacgaggtga tcgaccagca aatcccctct gacaacctgt tctgcgccct gcgcatcgac 420 ggccatttcc gccatgccca tacccgcacc gtgccgcgcc agacgccgcc gtaccgggcg 480 atgaccgacg tactcgacga tcagccggtg ttccgcttta accagcgcga aggggtgctg 540 gtcggcttcc ggaccccgca gcatatgcag gggatcaacg tcgccgggta tcacgagcat 600 tttattaccg atgaccgcaa aggcggcggt cacctgctgg attaccagct cgaccacggg 660 gtgctgacct tcggcgaaat tcacaagctg atgatcgacc tgcccgccga cagcgcgttc 720 ctgcaggcta atctgcatcc cgataatctc gatgccgcca tccgttccgt agaaagttaa 780 780 <210> 3 <211> 1584 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae budB <400> 3 atgaaaacac gaaaaattgg actggctaac tatctggcct acggcgcggg cgattttctc 60 ggcgccggca cgacggcgtt aaccgccgca tggctgctct acttttacac gaccttttgc 120 ggactgaccc cgattgaggc cacgcttatt tttgctgccg cccgcgtgct ggacgcggtg 180 gtaagcccgc tgatgggctt tctcaccgat aactttggca ccacctggct tggtaagcgc 240 ttcggccgca gaaaattctt tattctgctc ggcatcccct gcgtattcag ctattcagcg 300 atgtgggtcg gcgagatggg cttctggtac tacctggcga cctatctgct gtttgatatg 360 gtctatacca tgattctggt gccctatgag acgctggtgc cggagatgac cgatgacttt 420 aaacagaaaa ccaaattctc cggcgcgcgc atttcgatgg cgcagatgtc ggcgatttta 480 gcctccttcc tgccggggat ccttctctcc tggctcggca aagataatgc cagctcgttc 540 ttctatgcca gtctggtgtt ctcggtgctg tgcgcggtga tgctgactct ggtctggtgt 600 ttcacctggg aacgaccgcg ggaggcgtgg tcggaagcgg ccctgcgggc ggaagcggaa 660 aaacaaaact taacccttgc tcagagcctc aatcgcctgg tgattgagct gagttctacg 720 ctgcggataa aaattttccg ccagcacctc ggcatgtatc tggggggcta tatcgcccag 780 gacgtcttca atgccgtgtt tacctattac gtggtctttg ttctgatgca ggaagccgcc 840 gtcgcctcga acctgctggg gacgatggcc atcttccagt ttattgcggt aatcgccatg 900 atcccgctgt gcattcgttt tggccccgcg ccgtcgtacc gcatggtggt ggtcctgttt 960 ggcctgagct cactctccta cgcgctgctc tattacgccg gactgagcga cgtctattcc 1020 ttattgctgc tcatctctgc tgtcgccgga ctgggacgcg gcgggataaa ttacgtaccg 1080 tggaatacct acacctatat tgccgacgtc gacgaagcga tcaccggcca gcgccgggag 1140 gggatttttg ccggcatcat gactctgacc cgcaaagcct cgcaggcggg ggcggtgatg 1200 ctggtgggga tcattatgca gttgtcgggg tttgtttccg ggcaaaaaat acagcctgaa 1260 ggggtcagcc ataccattct gctgatcctc agcgtcggca ctctggtggt gttagcctgc 1320 ggcttcctcg tctcgctgcg cttcaaactc aacctgcaca cccacagcgt cctgcgcagc 1380 gagaccctca gaatgcgcga gctcggctac gctcagtcgg aacagaccag tgcggaacac 1440 cgtgcggtgg tcgagctgct ggcggggatg ccttacgact gtctgtgggg caataacaat 1500 attggctatc tgaatcgtca taaacctgct gccccggcgc tcattaaggg cggcgctttg 1560 aattcgacat atacccgagg ttaa 1584 <110> Industry-University Cooperation Foundation Sogang University <120> Method for Preparing 2,3-butanediol from Commercial carbon source by Transformed Klebsiella pneumoniae <130> PN120261 <160> 3 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 1128 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae wabG <400> 1 atgagtaaat tcaggctggc tctggtgcgg cagaagtacc gcccggacgg cggcgcagaa 60 cggtttgtct cccgcgcgct ggaagccctc gacagcagtc atctgcaact gaacgtcatc 120 acccgcgaat ggcaggggcc ggtgaaaccg gactggcaga tccatatctg taacccacgt 180 aaatgggggc gcatcagccg cgagcgcggc tttgccaacg ccgcgcgcgc gctctggcag 240 cgcgagtcct tcgacctggt gcagagccat gaacgtattc ccggctgcga tctctaccgc 300 gctggcgatg gcgttcatcg ccgctggctg cagcagcgct cgcgcatttt accggcctgg 360 aaaagccgcc tgctgttcgc cgaccgttac caccgctacg tcatgcaggc ggagcgcgag 420 atgtatgaag actcacacct gcgcggggtg atctgcaacg ccgagatgat caagcgcgag 480 atcatcgaag actttggcct gccggcggag aagatccacg ttatttataa cgccattgat 540 aaccagcgct tcctgccgcc ggacgaagag acctttgccg ccttacgcgc caaatggcag 600 ctaccgctgc aggcgacctg cctgatctac gtcggctccg gctttgagcg caaggggctg 660 gcggcggcga tccgcgccat cgctcccacc gatcgctacc tgctggtggt cggcaaagat 720 aaggatcagc ctcgctatca ggcgctggcg aagagcctga actgtgaagc gcgggtgcgc 780 ttcttcggca tgcagtcgga gacattgccc ttctatcaaa tggccgatgg tctgttgctg 840 ccgaccctct acgatccgtt ccccaacgtc atcctcgagg caatggcctg cggtctgccg 900 gtgatcacca ctaccggctg cggcggggcg gagtttatcg tcgacggcca caacggttac 960 gtctgcgacg ctctggatat cccggcgcta cagcaggcgg taatggccct gcccgcgcgc 1020 gcgctgggct ccgcgcaagg cggtcacgcc cgcgagcgca ttatggcctg caccagcgag 1080 cgactctcaa cccagctgct ttctctttat caggatctgg tgaattaa 1128 <210> 2 <211> 780 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae budA <400> 2 atgaatcatt ctgctgaatg cacctgcgaa gagagtctat gcgaaaccct gcgggcgttt 60 tccgcgcagc atcccgagag cgtgctctat cagacatcgc tcatgagcgc cctgctgagc 120 ggggtttacg aaggcagcac caccatcgcc gacctgctga aacacggcga tttcggcctc 180 ggcaccttta atgagctgga cggggagctg atcgccttca gcagtcaggt ctatcagctg 240 cgcgccgacg gcagcgcgcg caaagcccag ccggagcaga aaacgccgtt cgcggtgatg 300 acctggttcc agccgcagta ccggaaaacc tttgaccatc cggtgagccg ccagcagctg 360 cacgaggtga tcgaccagca aatcccctct gacaacctgt tctgcgccct gcgcatcgac 420 ggccatttcc gccatgccca tacccgcacc gtgccgcgcc agacgccgcc gtaccgggcg 480 atgaccgacg tactcgacga tcagccggtg ttccgcttta accagcgcga aggggtgctg 540 gtcggcttcc ggaccccgca gcatatgcag gggatcaacg tcgccgggta tcacgagcat 600 tttattaccg atgaccgcaa aggcggcggt cacctgctgg attaccagct cgaccacggg 660 gtgctgacct tcggcgaaat tcacaagctg atgatcgacc tgcccgccga cagcgcgttc 720 ctgcaggcta atctgcatcc cgataatctc gatgccgcca tccgttccgt agaaagttaa 780 780 <210> 3 <211> 1584 <212> DNA <213> Klebsiella pneumoniae budB <400> 3 atgaaaacac gaaaaattgg actggctaac tatctggcct acggcgcggg cgattttctc 60 ggcgccggca cgacggcgtt aaccgccgca tggctgctct acttttacac gaccttttgc 120 ggactgaccc cgattgaggc cacgcttatt tttgctgccg cccgcgtgct ggacgcggtg 180 gtaagcccgc tgatgggctt tctcaccgat aactttggca ccacctggct tggtaagcgc 240 ttcggccgca gaaaattctt tattctgctc ggcatcccct gcgtattcag ctattcagcg 300 atgtgggtcg gcgagatggg cttctggtac tacctggcga cctatctgct gtttgatatg 360 gtctatacca tgattctggt gccctatgag acgctggtgc cggagatgac cgatgacttt 420 cgcgatgtc gcctccttcc tgccggggat ccttctctcc tggctcggca aagataatgc cagctcgttc 540 ttctatgcca gtctggtgtt ctcggtgctg tgcgcggtga tgctgactct ggtctggtgt 600 ttcacctggg aacgaccgcg ggaggcgtgg tcggaagcgg ccctgcgggc ggaagcggaa 660 aaacaaaact taacccttgc tcagagcctc aatcgcctgg tgattgagct gagttctacg 720 ctgcggataa aaattttccg ccagcacctc ggcatgtatc tggggggcta tatcgcccag 780 gacgtcttca atgccgtgtt tacctattac gtggtctttg ttctgatgca ggaagccgcc 840 gtcgcctcga acctgctggg gacgatggcc atcttccagt ttattgcggt aatcgccatg 900 atcccgctgt gcattcgttt tggccccgcg ccgtcgtacc gcatggtggt ggtcctgttt 960 ggcctgagct cactctccta cgcgctgctc tattacgccg gactgagcga cgtctattcc 1020 ttattgctgc tcatctctgc tgtcgccgga ctgggacgcg gcgggataaa ttacgtaccg 1080 tggaatacct acacctatat tgccgacgtc gacgaagcga tcaccggcca gcgccgggag 1140 gggatttttg ccggcatcat gactctgacc cgcaaagcct cgcaggcggg ggcggtgatg 1200 ctggtgggga tcattatgca gttgtcgggg tttgtttccg ggcaaaaaat acagcctgaa 1260 ggggtcagcc ataccattct gctgatcctc agcgtcggca ctctggtggt gttagcctgc 1320 ggcttcctcg tctcgctgcg cttcaaactc aacctgcaca cccacagcgt cctgcgcagc 1380 gagaccctca gaatgcgcga gctcggctac gctcagtcgg aacagaccag tgcggaacac 1440 cgtgcggtgg tcgagctgct ggcggggatg ccttacgact gtctgtgggg caataacaat 1500 attggctatc tgaatcgtca taaacctgct gccccggcgc tcattaaggg cggcgctttg 1560 aattcgacat atacccgagg ttaa 1584
Claims (9)
(a) 크렙시엘라의 wabG를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 불활성화 하는 단계;
(b) 아세토락테이트 디카르복실라아제(acetolactate decarboxylase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 아세토락테이트 신타아제(acetolactate synthase)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 발현 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(c) 상기 재조합 벡터를 상기 크렙시엘라에 도입하여 형질전환 크렙시엘라를 제조하는 단계.
(d) 상기 형질전환 크렙시엘라를 배양 배지에서 배양하여 2,3-부탄다이올을 제조하는 단계; 및
(e) 상기 2,3-부탄다이올을 수득하는 단계.
A process for preparing 2,3-butanediol using a transformed Klebsiella comprising the steps of:
(a) inactivating a nucleotide sequence encoding a wabG of Kepsilaella;
(b) preparing a recombinant vector by inserting a nucleotide sequence encoding acetolactate decarboxylase and a nucleotide sequence encoding acetolactate synthase into an expression vector;
(c) introducing the recombinant vector into the Klebsiella to produce a transformed Klebsiella.
(d) culturing the transformed Krepsiella in a culture medium to produce 2,3-butanediol; And
(e) obtaining the 2,3-butanediol.
The method of claim 1, wherein said Krebsia is Klebsiella pneumonia , Klebsiella < RTI ID = 0.0 > as oxytoca), keurep when Ella Yeah press Matisse (Klebsiella granulomatis or Klebsiella terigena. < Desc / Clms Page number 13 >
2. The method of claim 1, wherein the nucleotide sequence encoding wabG of step (a) is the first sequence of the sequence listing and the nucleotide sequence encoding the acetolactate decarboxylase of step (b) is the second sequence of SEQ ID NO: , And the nucleotide sequence encoding acetolactate synthase is SEQ ID No. 3.
The method of claim 1, wherein said capsule polysaccharide is not present.
The method according to claim 1, wherein said Krebsia is non-pathogenic.
The recombinant vector according to claim 1, wherein the recombinant vector is characterized in that it is operatively linked to a lac promoter sequence, a nucleotide sequence encoding acetolactate decarboxylase, and a nucleotide sequence encoding acetolactate synthase How to.
The method according to claim 1, wherein the culture medium of step (d) comprises a carbon source, a nitrogen source, and an energy source, and the carbon source includes at least one carbon source selected from the group consisting of cassava, molasses and glycerol How to.
8. The method of claim 7, wherein the culture medium comprises glycerol at 50-100 g / l.
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---|---|---|---|
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KR101747285B1 (en) * | 2015-11-10 | 2017-06-14 | 고려대학교 산학협력단 | Recombinant Microorganism for Producing 1,3-Propanediol Without Ability of Producing 2,3-Butanediol |
-
2012
- 2012-05-29 KR KR1020120057013A patent/KR101408304B1/en active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
Title |
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Org Biomol Chem., Vol. 7, No. 19, pages 3914-3917 (2009.10.07.) * |
Cited By (1)
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KR101747285B1 (en) * | 2015-11-10 | 2017-06-14 | 고려대학교 산학협력단 | Recombinant Microorganism for Producing 1,3-Propanediol Without Ability of Producing 2,3-Butanediol |
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