KR101401471B1

KR101401471B1 - 잣잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품

Info

Publication number: KR101401471B1
Application number: KR1020120027987A
Authority: KR
Inventors: 이미영; 김효준; 채성욱; 최고야; 이혜원
Original assignee: 한국 한의학 연구원
Priority date: 2012-03-19
Filing date: 2012-03-19
Publication date: 2014-06-03
Also published as: KR20130106237A; WO2013141569A2; WO2013141569A3

Abstract

본 발명은 퇴행성 근육질환의 예방 또는 치료에 효과적인 천연 추출물로서, 잣잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.

Description

잣잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품{Pharmaceutical composition and functional food for prevention or treatment of degenerative muscle disease comprising the extract of pinus koraiensis needles}

본 발명은 잣잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 근육질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

미토콘드리아는 지속적인 융합과 분열을 반복하며 세포질에 그물망 형태로 존재하면서, 세포 호흡을 통하여 세포의 생존에 필요한 에너지를 생산하는 세포내 소기관이다. 미토콘드리아는 세포내 에너지 대사의 중추이므로 미토콘드리아의 기능 이상은 다양한 질병을 유발한다. 미토콘드리아의 기능 이상에 의해 발생하는 질병으로는 파킨슨병, 헌팅턴병과 같이 노화에 따라 흔하게 발생 할 수 있는 발병률이 높은 질병이 있고, Barth syndrome, Leigh syndrome, MELAS syndrome과 같은 발병률이 낮은 희귀 질병 등이 있다.

미토콘드리아의 기능 이상에 의해 발생하는 이러한 질환들은 세포의 에너지공급 체계에 이상이 발생하는 것으로 대부분 근 질환과 뇌질환을 동반한다. 따라서 미토콘드리아의 기능과 안정성 조절에 관한 연구는 미토콘드리아의 기능 이상에 의한 질병의 예방과 치료에 매우 중요하다.

미토콘드리아를 구성하고 있는 단백질은 약 1500종이며 미토콘드리아는 세포내 다른 소기관들과 달리 자신의 고유한 유전정보를 가지고 있다. 즉, 핵에 존재하며 세포의 모든 유전정보를 담고 있는 게놈 DNA(genomic DNA) 이외에 미토콘드리아는 메트릭스에 자신의 고유한 유전정보를 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 형태로 가지고 있다. mtDNA의 크기는 약 1600kbp이며 그 안에 미토콘드리아 호흡 복합체를 구성하는 13종의 단백질을 암호화하고 있다. 따라서 미토콘드리아 호흡 복합체는 genomic DNA와 mtDNA의 두 유전물질로부터 만들어진 단백질들에 의해 구성되어 지므로 다른 세포소기관보다 복잡한 조절기작에 의해 그 형성과정이 조절된다.

따라서 미토콘드리아와 핵 사이의 신호전달이 미토콘드리아의 형성과 기능 조절에 매우 중요한 역할을 할 것으로 보이며 그 매개체 역할을 할 수 있는 단백질에 대한 연구가 요청된다.

이에 본 발명자는, 이상과 같은 퇴행성 근육질환을 예방 또는 치료하기 위한 천연 약재를 연구하던 중, 잣잎 추출물이 퇴행성 근육질환 치료의 지표가 되는 미토콘드리아 기능저하 억제효능 및 미토콘드리아 재생 활성화 효과가 있어, 퇴행성 근육질환을 예방 또는 치료 효능이 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 퇴행성 근육질환을 예방 또는 치료할 수 있는 잣잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물 및 건강기능식품을 제공하기 위한 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 잣잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 근육질환 예방 또는 개선용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "추출물"은, 잣잎으로부터 액체의 용매를 사용하여 추출된 특정 성분을 의미한다. 상기 용매로는 물, C_1-4 알코올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 유효성분을 효율적으로 추출하기 위하여 에탄올로 추출하는 것이 바람직하다. 에탄올의 농도는 10 내지 90%가 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 잣잎 추출물은, 잣나무 잎을 추출한 것으로 추출방법은 초음파 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 및 증기 추출로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다. 유효성분을 효율적으로 추출하기 위해서 초음파 추출법을 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 용어 "퇴행성 근육질환"은, 진행성 근력 저하 및 위축을 보이고, 병리학적으로 근육섬유의 괴사 및 재생을 특징으로 하는 퇴행성 근육병을 의미한다. 근세포막에 존재하는 특정 단백이 소실되어 근세포막의 안정성에 관여한다고 알려져 있는 구성 단백질인 디스트로핀-당단백질 복합체등이 제대로 형성되지 못하여 근세포막의 손상으로 근육섬유의 괴사와 퇴행과정을 거쳐 결국 근력저하 및 우축이 발생하게 되는 질환이다. 상기 퇴행성 근육질환의 예로는, 지대형 근육퇴행위축, 안면견갑상완 근육퇴행위축 또는 근이영양증 등이 있다.

본 발명에서는 잣잎 추출물을 함유하는 조성물이 퇴행성 근육질환 예방 또는 치료에 효과가 있음을 확인하였다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 퇴행성 근육질환 치료의 지표가 되는 미토콘드리아 기능저하 억제효능 및 미토콘드리아 재생 활성화 효과를 확인함으로써, 퇴행성 근육질환의 예방 또는 치료 효능이 있음을 확인하였다.

본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은, 상기 잣잎 추출물을 포함하는 조성물의 투여로 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는, 상기 잣잎 추출물을 포함하는 조성물의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 조성물은 투여를 위하여, 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형제제는 상기 잣잎 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 상기 잣잎 추출물의 일일 투여량은 바람직하게는 1 ㎎/㎏ 내지 500 ㎎/㎏이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 잣잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 근육질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

상기 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 주스 및 과일 주스 및 야체 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강기능식품은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알콜 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.

또한 상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 과한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산 칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류들을 들 수 있다.

이때, 건강기능식품을 제조하는 과정에서 음료를 포함한 식품에 첨가되는 본 발명에 따른 추출물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있으며, 바람직하게는 식품 100 중량%에 1 내지 15 중량% 포함되도록 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명은 퇴행성 근육질환의 예방 또는 치료에 효과적인 천연 추출물로서, 퇴행성 근육질환의 예방 또는 치료 조성물로 약학적으로 이용 가능할 뿐 아니라 건강기능식품으로서도 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은, 본 발명의 일 실시예에 따른 대조군 및 약재 투여군의 혈중 인슐린 농도 수치 비교 그래프를 나타낸 것이다.
도 2는, 본 발명의 일 실시예에 따른 조직염색을 이용한 대조군 및 약재 투여군의 미토콘드리아 활성 비교 분석 영상을 나타낸 것이다.
도 3은, 본 발명의 일 실시예에 따른 대조군 및 약재 투여균의 미토콘드리아 재생 조절 단백질 발현량을 통한 활성효과 그래프를 나타낸 것이다.
도 4는, 본 발명의 일 실시예에 따른 대조군 및 약제 투여군의 미토콘드리아 재생 전사인자 발현량을 통한 활성평가 그래프를 나타낸 것이다.

이하, 하기 제조예 및 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 : 잣잎 추출물 제조

충청북도 제천시에 자생하는 잣잎을 수집하여 이하의 추출물을 제조하였다.

1) 추출단계

잣잎을 마쇄기로 분쇄한 후 70% 에탄올로 2시간 동안 초음파 추출하여 에탄올 추출물을 제조하였다.

2) 농축, 건조단계

상기 에탄올 추출액을 원심분리한 후 상등액을 감압 상태에서 농축한 후 동결건조 하였다.

실험예 1): 실험동물 및 시료투여

자연노화에 의한 퇴행성 질환연구는 수십년의 기간이 소요될 뿐 아니라 개인 체질 및 생활 방식에 따라서 많은 편차가 존재하기 때문에 고지방식이에 의한 비만 생쥐(DIOM-Diet induced obesity mouse)모델을 사용하여 실험에 이용하였다.

가) 실험동물

비만을 유도하여 근육조직의 미토콘드리아 기능개선에 대한 효능을 평가하였다. 8주령의 C57BL/6 마우스를 코아텍으로부터 구입하여 1주 동안 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 사육환경은 명암주기 12시간(07:00-19:00/조명시간)으로 유지하였다.

나) 시료투여

상기 실시예에서 제조한 잣잎 추출물을 시료로 사용하였다. 시료투여는 대조군(control), 고지방 식이군(high fat induce obesity), 시료 투여군(PKL) 2개의 군으로 나누어 실험하였다. 시료투여는 마우스존대를 이용하여 경구투하였고, 투여기간은 총 8주로 주 8일 동안 투여하였다. 고지방식이는 대조군 및 실험군에 8주 동안 자유급식 하였고, 고지방 식이(Rodent Diet with 60% Kcal Fat, Research Diets, USA)를 중앙실험동물을 통하여 구입하였다. 구체적인 시료투여 조건은 하기의 표 1과 같다.

실험군	고지방식이	용량
대조군	○	자외선 멸균수: 200㎕/day
시료 투여군(PKL-100)	○	시료 100 ㎎/㎏ + 자외선 멸균수:200㎕/day
시료 투여군(PKL-300)	○	시료 300 ㎎/㎏ + 자외선 멸균수:200㎕/day

실험예 2): 미토콘드리아 기능개선 평가

상기 실시예 1에서 제조한 잣잎 추출물의 미토콘드리아 기능개선 효능을 하기와 같이 분석하였다.

가)실험방법

미토콘드리아의 관찰은 절취한 양측 대퇴근의 중앙부를 0.5㎝ 두께로 횡절 절단하여 근육편을 만들었으며 근형질내에 ice crystal 형성을 방지할 목적으로 액체 질소에 4분간 급속 냉동시켰고 -20℃ cryostat(Leica CM 1800, Germany)에 이전 보관한 후 30분 이내에 10㎛ 두께로 박절하여 실온에서 20분간 건조시킨 이후 10㎖의 phosphate buffer(0.2M, pH 7.6)와 10㎖의 0.2M sodium succinate 및 20㎖의 nitroblue tetrazolium(1㎎/㎖)이 함유된 기질액에서 37℃로 25분간 반응시켰다.

상기 제조된 미토콘드리아의 기능 회복을 확인하기 위하여 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 측정법을 이용하여 혈중내 인슐린 량을 Spectra MAX340으로 측정하였다.

RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 실험 기법을 이용하여 미토콘드리아 재생(Mitochondria-biogenesis)을 확인하기 위하여 전사인자(Transcription factor)인 NRF-1(R-TTGATGGACACTTGGGTAGCTT, F-CCCACAGGACCTAGTATATGCG)발현 및 동물조직에 있는 mtDNA(R-TGTCAGATATGTCCTTCA, F-TGCTTAACTCTGCAGGCGRATG) 총량을 정량하여 미토콘드리아 재생(Mitochondria-biogenesis)을 최종 확인하였다. 미토콘드리아 재생(Mitochondria-biogenesis)의 조절 인자인 SirT-1, PCG-1a 확인을 위하여 근육조직으로부터 단백질을 분리하여 Western-bloting을 하였다.

상기 실험결과는 평균±표준편자로 나타내었고, 각 실험군 간의 유의성 검증은 Graphpad Prism 5.0 software(Gaph pad, CA, USA)를 사용하여 p<0.01 수준에서 실시하였다(one-way analysis of variace(ANOVA) followed by Tukey's multiple comparison test).

나) 실험 결과

① 혈중 인슐린과 미토콘드리아 기능 개선 평가

도 1을 통해 고지방 식이만 섭취한 대조군은 혈중의 인슐린 수치가 높게 나타났지만 고지방 식이 섭취와 더불어 잣잎 추출물(PKL) 투여군은 대조군보다 혈중의 인슐린 수치가 유의적으로 낮아졌음을 확인할 수 있었다(p<0.05).

② 근육조직에서의 미토콘드리아 기능 개선 평가(조직염색)

잣잎 추출물의 투여에 따른 미토콘드리아 기능향상을 확인하기 위해 미토콘드리아의 respiratory chain 과 TCA 회로에 중요한 역할을 하는 SDH(succinate dehydrogenase)효소를 염색을 하여 CCD카메라로 확인하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 조직염색을 이용한 영상분석 결과 대조군인 고지방식이 섭취군과 고지방식이와 더불어 잣잎 추출물(PKL)을 경구투여한 군의 미토콘드리아 Proliferation이 증가함을 확인할 수 있었다. 따라서 잣잎 추출물은 미토콘드리아 기능 저하를 억제함을 확인할 수 있었다.

③ 근육조직에서의 미토콘드리아 재생(Mitochondrial biogenesis) 조절 단백질 확인

근육조직에서의 미토콘드리아 재생 조절 단백질 발현량을 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 대조군인 고지방식이 섭취군과 고지방식이와 더불어 잣잎 추출물(PKL)을 경구 투여군 간의 SirT-1의 발현량이 농도 의존적으로 늘어났으며 SirT-1에 의해 활성을 보이는 PGC-1a도 대조군인 고지방식이 섭취군보다 고지방식이와 더불어 잣잎 추출물(PKL)을 경구 투여한 그룹에서 단백질 합성을 확인할 수 있었다.

④ 근육조직에서의 미토콘드리아 재생(Mitochondria-biogenesis) 전사 인자 확인

근육 조직에서의 미토콘드리아 재생 전사인자 발현량을 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 대조군인 고지방식이 섭취군과 고지방식이와 더불어 잣잎 추출물(PKL) 투여군에서 미토콘드리아 재생(Mitochondria biogenesis) 전사인자의 발현량과 더불어 총 미토콘드리아 DNA량도 농도 의존적으로 늘어나는 것을 확인하였다. 따라서 PKL 약재 추출물이 미토콘드리아 재생(Mitochondria biogenesis) 조절단백질인 SirT-1 및 PGC-1a에 의하여 미토콘드리아 전사(Transcription)을 유도하여 미토콘드리아 기능회복과 더불어 미토콘드리아 총량도 늘렸음을 확인하였다.

Claims

물, C_1-4 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 제조되는 잣잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 근육질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 C_1-4 알코올은 에탄올인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 추출은 초음파 추출, 상온추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 증기 추출인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
물, C_1-4 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 제조되는 잣잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 근육질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
삭제
제5항에 있어서, 상기 C_1-4 알코올은 에탄올인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
제5항에 있어서, 상기 추출은 초음파 추출, 상온추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 증기 추출인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.